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Developmental Biology

बॉटलनोज़ डॉल्फिन (Tursiops truncatus) शुक्राणु: Collection, Cryopreservation, और Heterologous इन विट्रो निषेचन

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55237
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 4, 5, 1, 1, 2
1Department of Animal Reproduction, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), 2Department of Animal Medicine and Surgery, School of Veterinary Medicine, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Physiology, Faculty of Veterinary Science, University of Murcia, Campus Mare Nostrum, 4Mundomar, Benidorm, 5Veterinary Services, L'Oceanográfic, Ciudad de las Artes y las Ciencias, Junta de Murs i Vals, s/n, 46013

Summary

यहां, हम प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक डॉल्फिन शुक्राणु संग्रह, cryopreservation, और heterologous आईवीएफ गोजातीय अंडाणुओं का उपयोग कर प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है उपस्थित ।

Abstract

cryopreserved डॉल्फिन शुक्राणु के उपयोग जलीय पार्क के बीच आनुवंशिक सामग्री के आदान प्रदान की सुविधा और अध्ययन के लिए प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ शुक्राणु बनाता है समुद्री स्तनधारी प्रजनन की हमारी समझ को आगे । Heterologous आईवीएफ, मुताबिक़ आईवीएफ के लिए एक प्रतिस्थापन, एक शुक्राणु प्रजनन क्षमता का परीक्षण करने के लिए साधन प्रदान कर सकता है; gamete फिजियोलॉजी और शीघ्र भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए; और मूल्यवान डॉल्फिन अंडाणुओं, जो प्राप्त करने के लिए मुश्किल है के उपयोग से बचने के लिए । यहां, हम वर्तमान प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और cryopreserve डॉल्फिन शुक्राणु । वीर्य का संग्रह प्रशिक्षित डॉल्फिन पर मैनुअल उत्तेजना द्वारा किया जाता है । Cryopreservation एक TRIS egg-ग्लिसरॉल के साथ जर्दी आधारित भरनेवाला का उपयोग कर पूरा किया है । इसके अलावा, हम एक प्रोटोकॉल है कि heterologous आईवीएफ डॉल्फिन शुक्राणु और गोजातीय अंडाणुओं का उपयोग का वर्णन करता है और जो पीसीआर का उपयोग करने के परिणामस्वरूप भ्रूण की संकर प्रकृति की पुष्टि पेश करते हैं । Heterologous निषेचन निषेचन पर सवाल उठाती है और एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है gamete फिजियोलॉजी और जल्दी भ्रूण विकास का अध्ययन । इसके अलावा, heterologous आईवीएफ की सफलता के लिए इस तकनीक की क्षमता को प्रदर्शित करता है डॉल्फिन शुक्राणु खाद, जो आगे की परीक्षा के लायक है निषेचित परीक्षण ।

Introduction

सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकियों खराब जंगली जानवरों में विकसित कर रहे हैं, समुद्री स्तनधारी सहित । संवेदनशील तरीकों का अभाव शुक्राणु निषेचन सफलता का आकलन करने के लिए ऐसी डॉल्फिन के रूप में प्रजातियों में प्रजनन प्रौद्योगिकियों के धीमी गति से विकास में योगदान देता है । यह हाल ही में जब तक कि बॉटलनोज़ डॉल्फिन (Tursiops truncatus) के बुनियादी लाभदायक मापदंडों1,2की सूचना दी गई थी । हालांकि, गतिशीलता और आकृति विज्ञान जैसे चर, हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, प्रजनन क्षमता पर सीमित जानकारी देते हैं । शुक्राणु की गुणवत्ता का सबसे अच्छा संकेतक निषेचन क्षमता का मूल्यांकन है ।

हाल ही में, हमारे समूह के लिए एक विधि इस्तेमाल किया डॉल्फिन शुक्राणु का आकलन करने के लिए पुरुष परमाणु गठन और/या संकर भ्रूण के गठन का आकलन द्वारा क्षमता निषेचन heterologous आईवीएफ zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं का उपयोग कर के बाद3। डॉल्फिन का उपयोग-गोजातीय heterologous आईवीएफ मुताबिक़ आईवीएफ पर महत्वपूर्ण लाभ है, के रूप में यह डॉल्फिन अंडाणुओं प्राप्त करने की कठिनाई पर काबू पाने और अच्छी तरह से परीक्षण के उपयोग की सुविधा इन विट्रो गोजातीय oocyte परिपक्वता प्रणालियों । आदेश में प्रजातियों विशिष्टता से बचने के लिए, heterologous निषेचन आम तौर पर जिला के अभाव में किया जाता है । हालांकि यह acrosome की क्षमता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है-प्रतिक्रिया शुक्राणु vitelline झिल्ली के साथ फ्यूज, यह अंय निषेचन से संबंधित सुविधाओं के मूल्यांकन बिगड़ जाती है । प्रक्रिया zona बरकरार अंडाणुओं का उपयोग करता है और निंनलिखित मापदंडों के मूल्यांकन की अनुमति देता है: शुक्राणु zona बंधन और लगाव, पैठ, polyspermy, परमाणु गठन, और संकर भ्रूण दरार ।

यहां, हम शुक्राणु संग्रह के लिए कई प्रोटोकॉल मौजूद, बुनियादी शुक्राणु विश्लेषण, शुक्राणु ठंड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुरुष परमाणु और/या संकर भ्रूण गठन का आकलन द्वारा डॉल्फिन शुक्राणु कार्यशीलता के मूल्यांकन के बाद heterologous आईवीएफ का उपयोग zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं.

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Protocol

< p class = "jove_content" > आचार कथन: सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित Instituto Nacional de Investigaci & #243; n y Tecnolog & #237; अ Agraria y Alimentaria (िनिा). सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया गया, के रूप में प्रजनन के अध्ययन के लिए सोसायटी द्वारा अपनाया, और समुद्री स्तनधारियों की देखभाल के लिए पशु कल्याण अधिनियम के लिए.

< p class = "jove_title" > 1. डॉल्फिन शुक्राणु संग्रह और Cryopreservation

  1. वडा
    1. बनाओ फ्रट मध्यम (हेपरिन-और hypotaurine-मुक्त) । तैयार फ्रट-TALP मध्यम 25 मिमी बिकारबोनिट, 22 मिमी सोडियम स्तनपान, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 6-मिलीग्राम/एमएल फैटी एसिड मुक्त BSA, और 10 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन (पीएच ७.४) के साथ पूरक ।
      नोट: उपयोग के दिन इस माध्यम को तैयार करें और इसे ३८.५ & #176 पर रखें; C, 5% कं 2 के वातावरण के अंतर्गत, और हवा में उपयोग करने से पहले कम से 2 h के लिए अधिकतम आर्द्रता के साथ ।
    2. तैयार TRIS अंडे की जर्दी-आधारित बफर । भंग ३०.२८ g/l Tris, १६.७५ g/l साइट्रिक एसिड, १२.५ g/l फ्रुक्टोज, और ०.५ g/l streptomycin में ultrapure पानी (pH ७.३, परासरणीयता = ३१० mOsm/ 20% अंडे की जर्दी जोड़ें (v/
  2. स्वैच्छिक वीर्य संग्रह के लिए पूल के किनारे के पास पृष्ठीय recumbence में झूठ करने के लिए एक सिद्ध प्रजनन पुरुष बॉटलनोज़ डॉल्फिन ट्रेन.
    नोट: पुरुष डॉल्फिन 6 महीने से अधिक सकारात्मक सुदृढीकरण द्वारा प्रशिक्षित किया जाना चाहिए, जैसा कि पहले वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > ४ .
  3. जननांग नाली से लिंग की स्वैच्छिक बाहर निकालना करने के लिए डॉल्फिन के जननांग नाली के कपाल क्षेत्र पर दबाव धीरे से विभिन्न स्पर्श उत्तेजना प्रदर्शन.
  4. एक पूर्ण निर्माण को प्राप्त करने के बाद, एक बाँझ कंटेनर में लिंग टिप प्रत्यक्ष बोल पड़ना प्राप्त करने के लिए.
  5. बनाए रखने के शुक्राणु नमूना & #160; पर ३७ & #176; ग तक विश्लेषण । दोहराएँ चरण १.३ और १.४ लगातार बोल पड़ना संग्रह के लिए, एक नया propylene ग्लास हर बार का उपयोग कर.
  6. तुरंत संग्रह के बाद, एक स्नातक ग्लास सिलेंडर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित पहले गर्म करने के लिए ३७ & #176; ग. का मूल्यांकन रंग, पीएच, और osmolarity (एक माइक्रो-osmometer का उपयोग) बोल पड़ना के.
  7. में शुक्राणु की एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए, जोड़ें 10 & #181; l शुक्राणु निलंबन की एक eppendorf ट्यूब से युक्त ९० & #181 आसुत जल का; l निर्धारित शुक्राणु एकाग्रता का प्रयोग एक शुक्राणु गिनती चैंबर.
    नोट: मूल्यांकन के दौरान, ३७ पर बोल पड़ना के बाकी रखें & #176; ग.
  8. गतिशीलता पैरामीटर्स का मूल्यांकन करें ।
    1. ले 10 & #181; शुक्राणु के नमूने के एल और यह एक पूर्व गर्म शुक्राणु कक्ष में जगह है ।
    2. एक कंप्यूटर की सहायता शुक्राणु विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर गतिशीलता का मूल्यांकन, पहले बॉटलनोज़ डॉल्फिन के लिए मान्य, शुक्राणु का आकलन करने के लिए गतिशीलता < सुप वर्ग = "xref" > २ .
      नोट: यदि आवश्यक हो, शुक्राणु गतिशीलता के पर्याप्त दृश्य के लिए फ्रट मध्यम (हेपरिन-और hypotaurine मुक्त) के साथ शुक्राणु का नमूना पतला । मूल्यांकन के दौरान, नमूना बनाए रखने पर ३७ & #176; C एक गरम माइक्रोस्कोप स्टेज पर.
  9. ले 20 & #181; शुक्राणु नमूना के एल और व्यवहार्यता और शुक्राणु आकृति विज्ञान का मूल्यांकन पहले वर्णित के रूप में < सुप वर्ग = "xref" > ५ .
  10. एक केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए शुक्राणु के नमूने हस्तांतरण । 5 मिनट के लिए २५० x g पर शुक्राणु नमूना केंद्रापसारक । के बाद शुक्राणु एकाग्रता का निर्धारण एक मतगणना कक्ष का उपयोग कर, शुक्राणु एकाग्रता को समायोजित करने के लिए ४०० x 10 6 शुक्राणु/mL.
    नोट: यदि आवश्यक हो, एक ही बोल पड़ना की एक अतिरिक्त मात्रा से अलग लाभदायक प्लाज्मा के साथ केंद्रित बोल पड़ना से गोली पतला केंद्रापसारक (२५० x g, 10 मिनट) ।
    1. के पाठ्यक्रम पर 5 मिनट, धीरे पतला शुक्राणु नमूना 1:1 (v/वी) एक TRIS अंडे की जर्दी के साथ आधारित बफर १.५% ग्लिसरॉल युक्त । शुक्राणु युक्त ट्यूब प्लेस पर 5 & #176; ग के लिए 1 ज 30 min.
    2. एक TRIS अंडे की जर्दी के साथ शुक्राणु निलंबन के एक दूसरे कमजोर पड़ने-आधारित ग्लिसरॉल युक्त बफर एक 3% अंतिम ग्लिसरॉल एकाग्रता और २०० x 10 के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 6 शुक्राणु/ 5 & #176 पर शुक्राणु सस्पेंशन को बनाए रखना 10 min.
      3. के लिए C
  11. ०.२५ मिलीलीटर तिनके में शुक्राणु निलंबन लोड । गर्मी-तिनके सील । एक रैक ४.५ सेमी में भूसे के लिए तरल नाइट्रोजन के ऊपर रखें 10 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन में तिनके डुबकी और मूल्यांकन तक स्टोर.
< p class = "jove_title" > 2. Heterologous इन विट्रो निषेचन का प्रयोग Zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं

  1. तयारी
    1. धुंधला समाधान और बढ़ते माध्यम तैयार ।
      1. आसुत जल के 1 मिलीलीटर में Hoechst के 1 मिलीग्राम भंग करके Hoechst स्टॉक समाधान तैयार करते हैं । कर 30 & #181; L aliquots और उन्हें अंधेरे में रख-20 & #176; ग तक उपयोग । 25 & #181 जोड़कर दाग समाधान तैयार करें; Hoechst स्टॉक समाधान के एल फॉस्फेट बफर खारा के 5 मिलीलीटर (पंजाब) के साथ पूरक 1 g/l PVA । अच्छी तरह मिलाएं और 4 & #176 पर अंधेरे में रखें; C जब तक उपयोग.
      2. ग्लिसरॉल के ६.२५ मिलीलीटर और ६.२५ & #181 के साथ पंजाब के ६.२५ मिलीलीटर मिश्रण से बढ़ते माध्यम तैयार; Hoechst स्टॉक समाधान के एल । अच्छी तरह मिलाएं और 4 & #176 पर अंधेरे में रखें; C जब तक उपयोग.
    2. oocyte कलेक्शन और इन विट्रो निषेचन के लिए माध्यम तैयार करते हैं ।
      1. गेन्तमयसीं की ०.५ एमएल को ०.९% NaCl आसुत जल जोड़कर खारा समाधान तैयार करें ।
      2. 10 एनजी/एमएल एपिडर्मल वृद्धि फैक्टर (EGF) और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) TCM-१९९ के 10 मिलीलीटर को जोड़कर शेयर परिपक्वता माध्यम तैयार करते हैं । ३८.५ & #176 पर दोनों मीडिया को बनाए रखने; सी, 5% सह 2 के एक वातावरण के तहत, और हवा में उपयोग करने से पहले कम से कम 2 ज के लिए अधिकतम आर्द्रता के साथ.
  2. में अंडाशय को खारा समाधान में कसाईखाना पर इकट्ठा 33-35 & #176; ग और उन्हें संग्रह से 4 ज के भीतर प्रयोगशाला में परिवहन ।
  3. एक बार प्रयोगशाला में, अंडाशय के मलबे और रक्त को हटाने के लिए तीन बार धो लें खारा समाधान पहले गर्म करने के लिए ३७ & #176; ग. इस प्रक्रिया के दौरान ३७ & #176; c पर अंडाशय खारा समाधान में बनाए रखें ।
  4. महाप्राण 2 से 8 मिमी कूप एक 18G सुई और एक 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ । ५० मिलीलीटर ट्यूबों में aspirated तोंसिल्लितिस तरल पदार्थ ले लीजिए ।
  5. अंडाणुओं युक्त फुफ्फुसीय द्रव की अनुमति के लिए लगभग 15 मिनट के लिए खड़े ३७ & #176; C, जब तक कोशिकाओं तलछट । एक पाश्चर पिपेट के साथ ट्यूब के supernatant निकालें और फिर से पंजाब में गोली सस्पेंड ।
  6. पुनर्प्राप्त मेघपुंज-oocyte परिसरों (COCs) में ९० mm व्यंजन के तहत एक stereomicroscope.
  7. COCs को तीन बार पंजाब में और एक बार परिपक्वता माध्यम में धो लें ।
  8. हस्तांतरण आकृति सामान्य COCs करने के लिए 4-अच्छी तरह से बर्तन, प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त ५०० परिपक्वता माध्यम की मिलीलीटर, के समूहों में ५० COCs प्रति.
    नोट: यहां तीन कुएं & #8211; heterologous आईवीएफ के लिए एक अच्छी तरह से, एक नियंत्रण मुताबिक़ आईवीएफ के लिए अच्छी तरह से, और एक parthenogenetic नियंत्रण & #8211 के रूप में अच्छी तरह से केवल परिपक्व COCs युक्त; इस्तेमाल किया गया ।
  9. COCs के लिए 24 ज पर ३८.५ & #176; सी, 5% सह 2 के एक वायुमंडल के तहत और अधिकतम आर्द्रता के साथ हवा में.
  10. मध्यम और घनत्व ढाल तैयार करते हैं.
    1. निषेचन मध्यम (फ्रट) तैयार करने के लिए, पूरक फ्रट-TALP मध्यम के साथ 25 मिमी बिकारबोनिट, 22 मिमी सोडियम स्तनपान, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 6 मिलीग्राम/एमएल फैटी एसिड मुक्त BSA, और 10 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन । ३८.५ & #176; C में, 5% कं 2 के वातावरण के तहत, और उपयोग करने से पहले ंयूनतम 2 h के लिए अधिकतम आर्द्रता के साथ हवा में बनाए रखें ।
    2. 15 मिलीलीटर ट्यूब और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए धुलाई समाधान के 3 मिलीलीटर के लिए घनत्व ढाल मध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़कर घनत्व ढाल तैयार करते हैं । उन पर बनाए रखें ३८.५ & #176; ग म कम 1 h
  11. धो इन विट्रो परिपक्व अंडाणुओं में दो बार फ्रट माध्यम.
  12. अंडाणुओं 4-अच्छी तरह से व्यंजन, प्रत्येक अच्छी तरह से फ्रट के २५० मिलीलीटर में ५० COCs युक्त हस्तांतरण । ३८.५ & #176 पर 4-अच्छी तरह से व्यंजन बनाए रखें, 5% कं 2 के एक वायुमंडल के तहत, और अधिकतम आर्द्रता के साथ हवा में, जबकि निषेचन के लिए शुक्राणु तैयार करना ।
  13. गल एक जल स्नान में डॉल्फिन शुक्राणु युक्त एक जमे हुए भूसे पर ३७ & #176; C for ५० s.
    नोट: मुताबिक़ आईवीएफ के लिए गोजातीय वीर्य समानांतर में संसाधित किया जाना चाहिए, मुताबिक़ गोजातीय आईवीएफ के लिए मानक प्रोटोकॉल का पालन ।
  14. ले 10 & #181; शुक्राणु के नमूने के एल और यह एक पूर्व गर्म शुक्राणु गिनती चैंबर में जगह है । एक कंप्यूटर की सहायता शुक्राणु विश्लेषण प्रणाली का उपयोग कर गतिशीलता का मूल्यांकन, पहले प्रजातियों के लिए मांय है, के लिए होना चाहिए शुक्राणु गतिशीलता का आकलन करें । इस समय के दौरान शुक्राणु का नमूना बनाए रखें ३८.५ & #176; C.
  15. (step 2.10.2) घनत्व ढाल ट्यूब करने के लिए शुक्राणु के नमूने जोड़ें । २५० x g.
    16. पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक
  16. सावधानी से एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर supernatant निकालें । गोली युक्त ट्यूब के लिए धुलाई समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें । Re-धीरे मिश्रण से गोली निलंबित.
  17. २५० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ३०० के शुक्राणु की मात्रा को एक पाश्चर पिपेट के साथ supernatant निकालें & #181; L.
  18. Add 5 & #181; l के शुक्राणु सस्पेंशन का एक microcentrifuge युक्त ९५ & #181; l आसुत जल का. ३८.५ पर शुक्राणुओं को बनाये रखें & #176; ग. कक्ष मतगणना कक्ष को 10 & #181 के साथ भरें; 1:20 शुक्राणु कमजोर पड़ने और एकाग्रता को मापने के एल. फ्रट माध्यम की मात्रा की गणना करें जिसे जोड़ा जाना आवश्यक है १०० & #181; शुक्राणु के L को प्राप्त करने के लिए 2 x 10 6 शुक्राणु/एमएल.
  19. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए गणना फ्रट और शुक्राणु की मात्रा में जोड़ें और धीरे एक पाश्चर पिपेट.
    20. का उपयोग कर मिश्रण
  20. Add २५० & #181; शुक्राणु-फ्रट निलंबन के एल 4-अच्छी तरह से फ्रट माध्यम युक्त पकवान के लिए परिपक्व अंडाणुओं के साथ एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 1 x 10 6 शुक्राणु/एमएल
  21. सह gametes के लिए 18 ज पर ३८.५ & #176; ग, 5% कं 2 के एक वातावरण के तहत, और हवा में अधिकतम आर्द्रता के साथ ।
  22. 5% FCS के साथ पूरक सिंथेटिक oviductal द्रव पर आधारित संस्कृति माध्यम तैयार करते हैं । 3 मिलीलीटर खनिज तेल के साथ कवर ३५ मिमी के व्यंजन में सिंथेटिक oviductal द्रव संस्कृति बूंदों के 25 & #181; L तैयार करें । ३८.५ & #176; C में, 5% कं 2 के वातावरण के तहत, और उपयोग करने से पहले ंयूनतम 2 h के लिए अधिकतम आर्द्रता के साथ हवा में बनाए रखें ।
  23. पर २.५ एच पद सह-मशीनीकरण, पकवान से 20 अंडाणुओं निकालें; शेष अंडाणुओं में एक ही स्थिति के तहत मशीन में बनाए रखें ।
    1. निकाले शिथिल संलग्न & #160; शुक्राणु द्वारा जोरदार pipetting अंडाणुओं के माध्यम से एक संकीर्ण-बोर पाश्चर पिपेट 10 बार.
    2. फिक्स 20 अंडाणुओं में ५० & #181; l के लिए ०.५% glutaraldehyde 30 min. अंडाणुओं के लिए पंजाबियों में धो 5 मिनट के लिए अंडाणुओं स्थानांतरण ५०-& #181; 15 मिनट के लिए Hoechst धुंधला समाधान के एल और 5 मिनट के लिए पंजाब में अंडाणुओं धो लो ।
    3. अंडाणुओं व्यक्तिगत रूप से 2 & #181; L की बूंदों को बढ़ते माध्यम से 10 अंडाणुओं प्रति स्लाइड की दर से स्थानांतरण । धीरे से एक coverslip और नेल पॉलिश के साथ सील के साथ कवर ।
    4. epifluorescent प्रकाशिकी और उत्तेजना आवर्धन पर ३६१ एनएम 40x फिल्टर से सुसज्जित एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग गोजातीय अंडाणुओं से जुड़ी शुक्राणु की संख्या गिनती ।
  24. के बाद 12 सह के h-मशीन, 4-अच्छी तरह से बर्तन से 10 प्रकल्पित zygotes को दूर; बनाए रखने के शेष प्रकल्पित zygotes में एक ही परिस्थितियों के तहत मशीन ।
    1. 10 प्रकल्पित zygotes एक 15-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब पंजाब और भंवर के 2 मिलीलीटर के लिए धीरे से 2 मिनट के लिए मेघपुंज कोशिकाओं को दूर करने के लिए स्थानांतरण । पंजाब में दो बार धोएं, फिक्स, और दाग, जैसा कि पहले बताया गया है (step 2.23.2.)
  25. के बाद 18, 20, 22, और सह के 24 एच-मशीन, 4 से 10 प्रकल्पित zygotes हटाने-अच्छी तरह से बर्तन और भंवर, ठीक है, और उंहें दाग के रूप में पहले से वर्णित (कदम 2.23.2) । एक ही स्थिति के तहत मशीन में प्रकल्पित zygotes के बाकी बनाए रखें ।
    1. का मूल्यांकन परमाणु गठन और एक चरण के तहत polyspermy-कंट्रास्ट/मुताबिक़ के साथ धुंधला द्वारा दोनों heterologous और Hoechst आईवीएफ समूहों में epifluorescent माइक्रोस्कोप ।
    2. नमूना प्रति 10 बेतरतीब ढंग से चुना प्रकल्पित संकर zygotes में परमाणु गठन का मूल्यांकन । ४८८-एनएम आर्गन लेजर उत्तेजना और ५१५ ५३० एनएम का पता लगाने के लिए एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत परमाणु गठन की पुष्टि करें ।
    3. ऑप्टिकली खंड प्रकल्पित zygotes अनुक्रमिक (2 मिमी) और एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों को इकट्ठा । एक 3 डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर कल्पना ।
      4. सह के 24 ज के बाद
    4. , धो ५० प्रकल्पित zygotes पंजाब में चार बार और संस्कृति माध्यम में दो बार ।
  26. उन्हें 25 के समूहों में स्थानांतरित करने के लिए संस्कृति माध्यम के microdroplets पहले से तैयार है और equilibrated.
  27. मेन्टेन पर ३८.५ & #176; ग के एक वायुमंडल के अधीन 5% O 2 /5% कं 2 और हवा में अधिकतम आर्द्रता के साथ.
  28. के बाद 26 और सह के 28 एच-मशीन, बर्तन और भंवर से 10 प्रकल्पित zygotes हटाने, ठीक है, और उंहें दाग, के रूप में पहले वर्णित (चरण 2.23.2) ।
  29. संस्कृति के ४८ ज के बाद, एक stereomicroscope.
    30. के तहत दरार का निरीक्षण
  30. निकालें zona pellucida (जिला) द्वारा भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए एक 5 मिलीग्राम/एमएल चिढ़ाना समाधान ।
  31. व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक भ्रूण तीन बार पंजाब में धो लें । स्नैप-०.२ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में तरल नाइट्रोजन में उन्हें फ्रीज । उन पर दुकान-८० & #176; ग तक analysis.
< p class = "jove_title" > 3. पीसीआर

  1. सामग्री और रिएजेंट
    नोट: पीसीआर प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया एजेंट, सामग्री, और उपकरण सामग्री की तालिका में विस्तृत कर रहे हैं और एक पीसीआर ट्यूब रैक और micropipettes का एक सेट शामिल हैं (P2, P20, P200, P1000), १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, पीसीआर ट्यूबों और टोपियां, एक थर्मल साइकिल चालक, एक यूवी प्रकाशक, agarose जेल, और बफर (Tris बोराटे EDTA (TBE)) ।
    1. लिएर गल सब रिएजेंट बर्फ पर । प्रयोग के दौरान उंहें बर्फ में बनाए रखें । का प्रयोग करें deoxynucleotides (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP और dGTP), डॉल्फिन 18 एस राइबोसोमल प्रोटीन (डीक्यू 404537.1) के लिए संदर्भ जीन कोडिंग पर लक्ष्य प्राइमर; R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG और F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), डीएनए पोलीमरेज़, डीएनए पोलीमरेज़ के लिए 5x बफर, डीएनए टेम्पलेट, बाँझ पानी, और मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl 2 ५.० मिमी की एक अंतिम एकाग्रता पर).
    2. Agarose जेल आणि नमुना वडा.
      1. डॉल्फिन और गोजातीय शुक्राणु डीएनए नमूने तैयार करते हैं ।
        1. गल एक जल स्नान में प्रत्येक प्रजाति का एक जमे हुए भूसे पर ३७ & #176; C for ५० s. धुलाई समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें । 10 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक. supernatant निकालें । Add 30 & #181; l of सटेस lysis बफ़र (५० mm Tris-HCl, pH 8; 20 mm NaCl; और 1 mM ०.१% एसडीएस), 2 & #181; l of proteinase K (20 mg/मब), और 5 & #181; l of dithiothreitol (डीटीटी); अंतिम एकाग्रता: १५० मिमी । ५५ पर रात भर बनाए रखें & #176; ग. Add २०० & #181; ultrapure पानी के एल. 5 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक. supernatant रखो । एक spectrophotometer.
          2. का उपयोग डीएनए एकाग्रता उपाय
      2. डॉल्फिन शुक्राणु से डीएनए के धारावाहिक कमजोरियां प्रदर्शन ( यानी, ४०, 4, और ०.४ एनजी/ultrapure पानी के साथ जांच करने के लिए कि पीसीआर शर्तों में सक्षम हैं डॉल्फिन डीएनए की एक छोटी राशि का पता लगाने.
      3. गोजातीय शुक्राणु डीएनए ( यानी, ४,०००, ४००, ४०, और 4 एनजी/एमएल) ultrapure पानी के साथ जांच करने के लिए कि पीसीआर शर्तों गोजातीय डीएनए की एक छोटी राशि का पता लगाने में सक्षम है धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रदर्शन ।
      4. डॉल्फिन और गोजातीय भ्रूण तैयार करते हैं । बर्फ पर भ्रूण गल जाए. Add 8 & #181; L के १०० & #181; g/mL proteinase K और बनाए रखें रात भर में ५५ & #176; C. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, नमूनों पर जगह ९६ & #176; ग के लिए 5 min.
      5. तैयार 2% agarose जेल TBE बफर और जोड़ 20 & #181; न्यूक्लिक एसिड दाग के एल मानक तकनीकों का उपयोग कर ।
    3. पीसीआर वडा.
      1. लेबल पीसीआर ट्यूब (ओं): डॉल्फिन सीरियल कमजोर पड़ने (४०, 4, और ०.४ एनजी/एमएल), गोजातीय धारावाहिक कमजोर पड़ने (४,०००, ४००, ४०, और 4 एनजी/एमएल), मुताबिक़ गोजातीय दो सेल भ्रूण, दो सेल प्रकल्पित heterologous भ्रूण, और नकारात्मक नियंत्रण ।
      2. एक बाँझ १.५-एमएल microcentrifuge ट्यूब में एक मास्टर मिश्रण तैयार 25 & #181 की एक अंतिम मात्रा के लिए, प्रतिक्रिया प्रति एल.
        1. Add 5 & #181; 5x DNA पोलीमरेज़ फ्लेक्सी बफर, ०.५ & #181; l के dNTPs (10 मिमी) १.५ & #181; l के MgCl 2 (25 मि. मी.), ०.५ & #181; फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमरी के एल (10 & #181; M), १.५ & #181; l डीएनए टें पलेट (शुक्राणु) या 8 & #181; l के dna टें पलेट (दो सेल भ्रूण) , ०.०७ & #181; Taq पोलीमरेज़ के l थ, और बाँझ आसुत जल को 25 & #181 तक; l अंतिम आयतन. अच्छी तरह मिलाएं ।
  2. प्रवर्धन प्रोटोकॉल
    1. जगह ट्यूबों थर्मल साइकिल चालक में । निम्न प्रोग्राम का चयन करें: ९४ & #176; C for 3 min; ४० चक्र के ९४ & #176; ग के लिए 15 एस, ५९ & #176; ग के लिए 25 एस, ७२ & #176; ग के लिए 20 एस; और ७२ & #176; ग के लिए 5 min. program प्रारंभ करें.
    2. की दुकान पर ट्यूबों 4 & #176; ग. Add २.५ & #181; प्रत्येक पीसीआर उत्पाद पर 4 & #176 के लिए लोड हो रहा है बफर के एल, सी और लोड 15 & #181; एल मिश्रण के कुओं में 2% agarose जेल । पीसीआर अंशों का सटीक आकार अनुमान के लिए एक डीएनए सीढ़ी मार्कर का प्रयोग करें ।
    3. 15 मिनट के लिए ट्रो प्रदर्शन करने के लिए डीएनए प्रवास की अनुमति । एक यूवी प्रकाशक का उपयोग कर दृश्य बैंड.

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Representative Results

सभी परिणाम, सारणी, और आंकड़े (1 और 2) यहां प्रस्तुत की अनुमति के साथ reproduced थे3।

डॉल्फिन शुक्राणु ठंड और गल के बाद उच्च गतिशीलता है

जमे हुए-गल डॉल्फिन पड़ना प्रतिशत दिखाया (% ± एसडी) के ८४.५ ± ५.३ कुल gram and ६९.१ ± ५.१ प्रगतिशील gram शुक्राणु. गतिशीलता संदर्भ में, इन नंबरों उच्च गुणवत्ता cryopreserved शुक्राणु के प्रतिनिधि हैं ।

डॉल्फिन शुक्राणु zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं मर्मज्ञ और संकर भ्रूण के उत्पादन में सक्षम हैं

चित्र 1a और तालिका 1 शो डॉल्फिन शुक्राणु के बाद गोजातीय जिला से जुड़ी सह के २.५ एच-मशीन । डॉल्फिन शुक्राणु गोजातीय शुक्राणु (आंकड़ा 1b और तालिका 1) की तुलना में अधिक प्रतिशत पर संलग्न थे । दरअसल, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से पता चलता है कि डॉल्फिन शुक्राणु zona बरकरार गोजातीय शुक्राणु (चित्रा 1C) घुसना करने में सक्षम हैं, परमाणु गठन और दरार (चित्रा 1E और 1 तालिका) के लिए अग्रणी । इस फोकल माइक्रोस्कोपी (चित्रा 1 डी और चित्रा 1F) द्वारा की पुष्टि की गई । कोई polyspermy heterologous आईवीएफ समूह से अंडाणुओं में सह के 12 घंटे के बाद मनाया गया-मशीन (तालिका 1) । heterologous आईवीएफ में परमाणु गठन 24 ज, मुताबिक़ समूह है, जो सह के 18 ज में हुई की तुलना में एक लंबे समय में सबसे अधिक प्रतिशत-मशीन (1 टेबल) पर पहुंच गया । ४८ एच में दरार दर के बाद गर्मी मुताबिक़ आईवीएफ (1 टेबल) की तुलना में heterologous में कम था । ८.०% की एक सहज parthenogenetic सक्रियण दर ४८ h (तालिका 1) में गोजातीय परिपक्व निषेचित अंडाणुओं में मनाया गया ।

अंत में, पीसीआर परिणाम एक डॉल्फिन संदर्भ जीन की उपस्थिति का मूल्यांकन करके संकर भ्रूण में डॉल्फिन आनुवंशिक सामग्री की उपस्थिति (चित्रा 3) की पुष्टि की है कि राइबोसोमल 18 एस प्रोटीन (चित्रा 2) के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना ।

Figure 1
चित्रा 1: गोजातीय zona pellucida (जिला) से जुड़ी डॉल्फिन शुक्राणु । संलग्न डॉल्फिन (एक) और गोजातीय (ख) शुक्राणु के बाद २.५ के zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं के साथ सह-मशीन के एच । Gametes Hoechst के साथ दाग रहे थे और चरण के तहत visualized-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (40X आवर्धन) । शुक्राणु में एक डॉल्फिन एक गोजातीय oocyte ( सी और डी) और गोजातीय oocyte कोशिका (ई) में एक periviteline डॉल्फिन शुक्राणु सिर के स्थान पर है । छवियां एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत कब्जा कर लिया और प्रकल्पित युग्मनज (Hoechst धुंधला; 40X आवर्धन) के इक्वेटोरियल विमान के अनुरूप थे । दो pronuclei (च) के बाद एक चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत मनाया heterologous आईवीएफ के सह से मिलकर zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं के साथ डॉल्फिन शुक्राणु की मशीन (Hoechst धुंधलान; 40X आवर्धन; स्केल बार = 25 µm) । यह आंकड़ा अनुमति के साथ संदर्भ3 से पुनरुत्पादित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि ट्रो (2% agarose जेल ethidium ब्रोमाइड दाग) 18 एस डॉल्फिन जीन के लिए पीसीआर प्रवर्धन परिणाम दिखा । गलियाँ 1 to 30 show प्रकल्पित डॉल्फिन/गोजातीय संकर भ्रूण; गलियाँ एस 1 और S2 सुविधा 4 एनजी/एमएल और ०.४ एनजी/एमएल डॉल्फिन शुक्राणु डीएनए, क्रमशः; और गलियाँ C1 से C5 दो-सेल गोजातीय भ्रूण और एच2ओ (जल) (रिक्त नियंत्रण) सुविधा । तीर १९०-बीपी बैंड परिवर्धित 18 एस rDNA के लिए इसी इंगित करता है । यह आंकड़ा अनुमति के साथ संदर्भ3 से पुनरुत्पादित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: संकर भ्रूण के प्रतिनिधि छवियां । एक दो के प्रतिनिधि छवि-सेल संकर भ्रूण (एक) ४८ (Hoechst धुंधला; 40X आवर्धन) में मशीन के एच । unसना हुआ संकर ४८ मशीन के एच में भ्रूण, विभाजन के विभिंन चरणों में, stereomicroscope (ख) के तहत visualized । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: संलग्नक की दर, polyspermy, परमाणु गठन, और क्लीवेज निंनलिखित मुताबिक़ और heterologous गोजातीय अंडाणुओं और गोजातीय या डॉल्फिन शुक्राणु के साथ सह-मशीन, क्रमशः । चर ANOVA (Kruskal-वालिस और मान-Whitney परीक्षण) के साथ विश्लेषण किया गया । मान के रूप में व्यक्त कर रहे हैं मतलब ± SEM (सीमा) बारह की प्रतिकृति; n = अंडाणुओं या प्रकल्पित zygotes की कुल संख्या की जांच की । अनुमति के साथ संदर्भ3 से तालिका reproduced किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

कई अलग स्तनधारी प्रजातियों के लिए, जमे हुए गल शुक्राणु का उपयोग करने के लिए विविध लाभ कर रहे हैं । इनमें मूल्यवान आनुवंशिक सामग्री, विश्वव्यापी वितरण के लिए संभावित, संदूषण के कम जोखिम, और दशकों के लिए पुरुष gametes को संरक्षित करने की क्षमता को हस्तांतरित करने की क्षमता शामिल है । cryopreserved शुक्राणु का उपयोग बॉटलनोज़ डॉल्फिन के लिए आवश्यक है, क्योंकि इस प्रजाति के हवाले के परिशिष्ट द्वितीय के तहत संरक्षित है, जो परिवहन और विभिन्न जलीय पार्कों के बीच जानवरों के आदान प्रदान सीमा. डॉल्फिन परिवहन एक गतिविधि है कि साजो समस्याओं और खतरनाक जोखिम पैदा करता है । हालांकि, उंहें परिवहन से बचना भी परिणाम है, ऐसे पशुओं की एक बंदी आबादी को consanguinity शुरू करने के जोखिम के रूप में । एक समाधान शुक्राणु की cryopreservation है । कुछ लेखकों cryopreserved डॉल्फिन शुक्राणु5,7,8,9, बहुत उत्साहजनक परिणाम के साथ है । इसके अलावा, २००५ में, एक डॉल्फिन cryopreserved शुक्राणु का उपयोग कर कृत्रिम गर्भाधान द्वारा गर्भित बछड़े के पहले जंम10सूचना दी थी । कुछ साल बाद, यह सेक्स का उपयोग किया गया था-क्रमबद्ध शुक्राणु11।

डॉल्फिन शुक्राणु अलग तकनीक का उपयोग कर cryopreserved किया गया है, परिष्कृत विधियों से, जैसे एक प्रोग्राम फ्रीजर5, आम तरीकों के लिए, जैसे शुष्क बर्फ12 या तरल नाइट्रोजन वाष्पों2,9, 13. सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन वाष्प का उपयोग करने का मुख्य लाभ एक ही स्थान है जहां शुक्राणु निकाला जाता है पर cryopreserve करने के लिए संभावना है, अत्यधिक विशेष उपकरणों के उपयोग के बिना. शुक्राणु में polystyrene पर तिनके में जमे हुए तरल नाइट्रोजन वाष्प एक सरल, त्वरित, और सस्ती विधि13है । व्यवहार में, जब इस पद्धति डॉल्फिन पर इस्तेमाल किया गया है, शुक्राणु गतिशीलता ६५% था । हालांकि, यह एक मानकीकृत विधि स्थापित करने के लिए कितना मुश्किल है पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है: तकनीक बाहरी कारकों से प्रभावित हो सकता है, जैसे तापमान, आर्द्रता, polystyrene आकार, आदि. इसलिए, आगे के अध्ययन के लिए अनुकूलन और प्रक्रिया के मानकीकरण आवश्यक है क्रम में तरल नाइट्रोजन भाप विधि के साथ जमे हुए शुक्राणु का उपयोग करने की सफलता में सुधार करने के लिए ।

आदेश में एक ठंड प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, यह शुक्राणु के कार्यात्मक आकलन के लिए एक विश्वसनीय विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । आईवीएफ निषेचन के लिए शुक्राणु क्षमता के परीक्षण का एक अच्छा साधन है । आदर्श रूप में, डॉल्फिन अंडाणुओं आईवीएफ के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, लेकिन मुश्किल और श्रमसाध्य महिलाओं से अंडाणुओं प्राप्त करने की जरूरत प्रक्रियाओं एक महत्वपूर्ण बाधा का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसलिए, heterologous आईवीएफ का उपयोग करने की संभावना एक नया करने के लिए डॉल्फिन में निषेचन दक्षता परीक्षण का मतलब खुलता है । अंय प्रजातियों से अंडाणुओं heterologous डॉल्फिन आईवीएफ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । परिणाम बताते हैं कि heterologous आईवीएफ के बीच गोजातीय अंडाणुओं और डॉल्फिन शुक्राणु प्रदर्शन किया जा सकता है । जमे हुए और गल डॉल्फिन शुक्राणु zona बरकरार गोजातीय oocyte घुसना और एक संकर भ्रूण उत्पंन कर सकते हैं ।

एकत्रित, फ्रीज-गल के लिए प्रोटोकॉल के प्रस्तुत संयोजन, और गोजातीय अंडाणुओं के साथ heterologous आईवीएफ प्रदर्शन सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है और cryopreservation के अनुकूलन और मूल्यांकन के लिए एक प्रारंभिक कदम का प्रतिनिधित्व करता है डॉल्फिन शुक्राणु । इस बात पर ध्यान देना जरूरी है कि इन प्रक्रियाओं में अभी भी कई अनजाना हैं । हालांकि, डॉल्फिन वीर्य cryopreserve करने की क्षमता इसे सुलभ बनाता है और यह प्रयोगशालाओं में रखा जा करने के लिए अनुमति देता है । इससे वैज्ञानिक अध्ययन की सुविधा होगी और शुक्राणु के फिजियोलॉजी, रचना, और व्यवहार की बेहतर समझ पैदा हो सकेगी.

heterologous आईवीएफ द्वारा शुक्राणु का मूल्यांकन ठंड प्रोटोकॉल के अनुकूलन को कम कर सकते हैं, लेकिन यह भी भविष्य में परीक्षण और प्रजनन क्षमता के लिए पुरुषों का चयन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक महत्वपूर्ण विचार वास्तविक निषेचन संख्या और heterologous आईवीएफ मूल्यों के बीच संबंध है । इसके अलावा, और इन दो phylogenetically दूर प्रजातियों, गोजातीय और डॉल्फिन के बीच heterologous आईवीएफ की नवीनता के कारण, नई जैविक परिकल्पनाओं का निर्माण किया जा सकता है । कुल मिलाकर, इन प्रोटोकॉल डॉल्फिन और अंय समुद्री स्तनधारियों के प्रजनन पर अनुसंधान के लिए एक नया स्थान खुला ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

उनके काम स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया (AGL2015-70140-आर डी के लिए । Rizos, AGL2015-66145R को अ. एबल-अडाण और जे. एफ. Pérez-gutierrez) और Seneca फाउंडेशन ऑफ मर्सिया (अनुदान 20040/रोगाणु/16 to f. García-vazquez)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १२६ बॉटलनोज़ डॉल्फिन शुक्राणु फ्रोजन-गल शुक्राणु वीर्य विश्लेषण आईवीएफ निषेचन
बॉटलनोज़ डॉल्फिन (<em>Tursiops truncatus</em>) शुक्राणु: Collection, Cryopreservation, और Heterologous इन <em>विट्रो</em> निषेचन
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Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

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