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Developmental Biology

Bottlenose Delphin (Tursiops Truncatus) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung In Vitro

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55237
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 4, 5, 1, 1, 2
1Department of Animal Reproduction, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), 2Department of Animal Medicine and Surgery, School of Veterinary Medicine, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Physiology, Faculty of Veterinary Science, University of Murcia, Campus Mare Nostrum, 4Mundomar, Benidorm, 5Veterinary Services, L'Oceanográfic, Ciudad de las Artes y las Ciencias, Junta de Murs i Vals, s/n, 46013

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, die für Delphin Spermien Sammlung, Kryokonservierung und heterologen IVF-Leistung mit boviner Oozyten erfolgreich eingesetzt haben.

Abstract

Die Verwendung von kryokonservierten Delphin Spermien erleichtert den Austausch genetischen Materials zwischen Wasserparks und Spermien für Laboratorien für Studien zu unserem Verständnis der Meeressäuger Reproduktion weiter zugänglich macht. Heterologe IVF, Ersatz für homologe IVF, könnten ein Mittel, um die Spermien Fruchtbarkeit potenzielle testen; Gameten Physiologie und frühen Entwicklung des Embryos zu studieren; und die Verwendung von wertvollen Delphin Eizellen zu vermeiden, die schwer zu erhalten sind. Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, die erfolgreich eingesetzt haben, zu sammeln und Tiefgefrieren Delphin Spermien. Die Sammlung des Samens erfolgt durch manuelle Stimulation über ausgebildete Delphine. Die Kryokonservierung wird erreicht mit einem TRIS-Eigelb-Basis-Extender mit Glycerin. Darüber hinaus präsentieren wir ein Protokoll, beschreibt heterologen IVF mit Delphin Spermatozoa und boviner Oozyten und, überprüft die hybride Natur des entstehenden Embryos mittels PCR. Heterologen Befruchtung wirft Fragen auf Düngung und kann als Werkzeug verwendet werden, um die Gameten Physiologie und frühen Entwicklung des Embryos zu studieren. Darüber hinaus zeigt sich der Erfolg der heterologen IVF das Potential dieser Technik Delphin Sperma Düngung Kapazität, die weitere Prüfung lohnt zu testen.

Introduction

Techniken der assistierten Reproduktion sind schlecht in wilde Tiere, einschließlich Meeressäugern entwickelt. Der Mangel an sensiblen Verfahren zur Beurteilung der Spermien Düngung Erfolg trägt zu der langsamen Entwicklung der reproduktiven Technologien in Arten wie Delphin. Es war nicht bis vor kurzem, dass die bahnbrechenden Grundparameter der Große Tümmler (Tursiops Truncatus) gemeldeten1,2. Variablen wie Motilität und Morphologie, geben obwohl weit verbreitet, jedoch nur begrenzte Informationen über reproduktive Effizienz. Der beste Indikator für die Qualität der Spermien ist die Düngung Potenzialbeurteilung.

Vor kurzem herangezogen unsere Fraktion eine Methode zur Delphin Sperma Düngung Potenzial durch die Beurteilung der männlichen man Bildung und/oder hybride Embryo Bildung nach heterologen IVF mit Zona intakt boviner Oozyten3Beurteilung. Die Verwendung von Delphin-Rind heterologen IVF hat wichtige Vorteile gegenüber dem homologen IVF, wie es die Schwierigkeit, Delphin Eizellen überwindet und erleichtert die Verwendung von bewährten in Vitro boviner Oozyten Reifung Systeme. Zur Vermeidung von Arten Spezifität erfolgt in der Regel heterologen Befruchtung bei fehlender ZP. Obwohl es für die Bewertung der Fähigkeit von Akrosom reagierte Spermien mit der Dotterhäutchen Membran verschmelzen kann, beeinträchtigt es die Bewertung der anderen Features, die im Zusammenhang mit der Befruchtung. Das beschriebene Verfahren Zona intakte Eizellen verwendet und ermöglicht die Auswertung der folgenden Parameter: Sperma Zona Bindung und Anhaftung, eindringen, Polyspermy, man Bildung und hybride Embryo Spaltung.

Hier präsentieren wir Ihnen verschiedene Protokolle zur Spermiengewinnung, grundlegende Spermiogramm, Spermien Einfrieren sowie die Auswertung der Delphin-Sperma-Funktionalität durch die Beurteilung der männlichen man und/oder hybride Embryo Bildung nach heterologen IVF mit Zona intakt boviner Oozyten.

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Protocol

Ethik-Anweisung: die experimentellen Verfahren wurden geprüft und durch die institutionelle Animal Care and Use Committee des Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA) genehmigt. Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, wie von der Gesellschaft für die Studie der Reproduktion und dem Tierschutzgesetz für die Pflege von Meeressäugern angenommen.

1. Dolphin Spermiengewinnung und Kryokonservierung

  1. Vorbereitung
    1. stellen FERT Medium (Heparin und Hypotaurine-frei). Bereiten Sie FERT LEDIG-Medium ergänzt mit Bicarbonat 25 mM, 22 mM Natrium Laktat, 1 mM Natrium Pyruvat, 6 mg/mL Fettsäure-freie BSA und 10 mg/mL Heparin (pH 7,4).
      Hinweis: Dieses Medium am Tag der Verwendung vorbereiten und halten Sie es bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft.
    2. Bereiten TRIS Ei Eigelb-Puffer. Auflösen von 30,28 g/L Tris, 16,75 g/L Zitronensäure, Fructose 12,5 g/L und 0,5 g/L Streptomycin Reinstwasser (pH 7,3, Osmolalität = 310 mOsm/kg). Fügen Sie 20 % Eigelb (V/V).
  2. Zug eine bewährte Zucht männlichen Tümmler im dorsalen Recumbence nahe dem Rand des Pools für freiwillige Samengewinnung liegen.
    Hinweis: Sollte der männlichen Delphin über 6 Monate durch positive Verstärkung trainiert werden wie oben beschrieben 4.
  3. Führen verschiedene taktile Stimulationen durch leichtes Drücken auf den kranialen Bereich der genitalen Nut des Delphins zu entlocken Freiwilligen Extrusion des Penis aus der genitalen Nut.
  4. Nach dem Erreichen einer vollständigen Erektion, die Penis-Spitze direkt in einen sterilen Behälter, das Ejakulat zu erhalten.
  5. Pflegen die Spermaprobe bei 37 ° C bis die Analyse. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 und 1.4 für aufeinanderfolgende Ejakulat Sammlungen, mit einem neuen Propylen-Glas jedes Mal.
  6. Sofort nach der Entnahme, bestimmen die Lautstärke mit einem abgestuften Glaszylinder zuvor erwärmt, um 37 ° C. Evaluate die Farbe, pH und Osmolarität (mit einem Mikro-XR) des Ejakulats.
  7. Die Konzentration der Spermien im Ejakulat, auszuwertende 10 µL der Spermien Suspension hinzufügen ein Eppendorf-Röhrchen mit 90 µL destilliertes Wasser. Bestimmen die Samenzellenkonzentration mit einem Spermien zählen Kammer.
    Hinweis: Bei der Bewertung, halten Sie den Rest des Ejakulats bei 37 ° c
  8. Bewerten die Motilität Parameter.
    1. 10 µL der Spermaprobe nehmen und legen Sie sie in eine vorgewärmte Sperma Kammer.
    2. Bewerten die Motilität über eine EDV-gestützte Sperma-Analyse-System bereits für der Große Tümmler, überprüft die Spermien-Motilität- 2 objektiv beurteilen.
      Hinweis: Bei Bedarf verdünnen Sie die Spermaprobe mit FERT Medium (Heparin und Hypotaurine-frei) für die angemessene Visualisierung von der Beweglichkeit der Spermien. Bei der Auswertung erhalten die Probe bei 37 ° C auf einem beheizten Mikroskoptisch.
  9. 20 µL der Spermaprobe nehmen und bewerten die Lebensfähigkeit und Sperma Morphologie als zuvor beschriebenen 5.
  10. Übertragen die Spermaprobe in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Spermaprobe 250 X g für 5 min. Danach bestimmen die Samenzellenkonzentration mit einer Zählkammer, passen Sie die Samenzellenkonzentration bis 400 x 10 6 Spermien/mL.
    Hinweis: Bei Bedarf verdünnen Sie das Pellet aus konzentrierter Ejakulate mit isolierten Seminalplasma aus eine überschüssige Menge von der gleichen Ejakulat durch Zentrifugieren (250 X g, 10 min).
    1. Im Laufe von 5 min langsam verdünnte das Sperma Probe 1:1 (V/V) mit einem TRIS Ei Eigelb-basierte Puffer mit 1,5 % Glycerin. Das Rohr mit der Sperma-Aussetzung bei 5 ° C für 1 h 30 min.
    2. Führen eine zweite Verdünnung der Spermien Suspension mit einem TRIS Ei Eigelb-Puffer mit Glycerin um eine Konzentration von 3 % final Glycerin und eine Endkonzentration von 200 x 10 6 Spermien/mL zu erhalten. Pflegen die Sperma-Aussetzung bei 5 ° C für 10 min.
  11. Laden die Sperma-Suspension in 0,25 mL Strohhalme. Thermoklebende die Strohhalme. Ort die Strohhalme in einem Rack 4,5 cm über Flüssigstickstoff für 10 min. die Strohhalme in flüssigem Stickstoff eintauchen und bis zur Auswertung lagern.

2. Heterologe In Vitro Befruchtung mittels Zona intakt Bovine Eizellen

  1. Vorbereitung
    1. bereiten die Färbung Lösung und das Eindeckmittel.
      1. Bereiten Hoechst-Stammlösung von Hoechst 1 mg in 1 mL destilliertem Wasser auflösen. Machen Sie 30 µL-Aliquots zu und halten sie im Dunkeln bei-20 ° C bis zur Verwendung. Bereiten Sie Färbelösung durch Zugabe von 25 µL der Stammlösung Hoechst bis 5 mL des Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1 g/L PVA ergänzt. Gut mischen und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C halten.
      2. Vorbereiten Eindeckmedium durch das Mischen von 6,25 mL PBS mit 6,25 mL Glycerin und 6,25 µL der Stammlösung Hoechst. Gut mischen und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C halten.
    2. Das Medium für Sammlung und in-vitro- Befruchtung der Eizelle vorzubereiten.
      1. Bereiten Kochsalzlösung 0,9 % NaCl destilliertes Wasser 0,5 mL Gentamycin hinzu.
      2. Bereiten Sie das Lager Reifung Medium durch Zugabe von 10 ng/mL epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 10 % fetalen Kälberserum (FCS) auf 10 mL von TCM-199. Beide Medien bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft zu erhalten.
  2. Die Eierstöcke im Schlachthof in Kochsalzlösung bei 33-35 ° C zu sammeln und transportieren sie an das Labor innerhalb von 4 h aus Sammlung.
  3. Einmal im Labor, die Eierstöcke dreimal waschen, entfernen den Schmutz und Blut, mit Kochsalzlösung zuvor erwärmt bis 37 ° c halten die Eierstöcke in Kochsalzlösung bei 37 ° C während des Prozesses.
  4. Aspirat 2 bis 8 mm Follikel mit einer 18G Nadel und eine 10-mL-Spritze. Sammeln von angesaugte Follikelflüssigkeit in 50 mL Röhrchen.
  5. Ermöglichen die Follikelflüssigkeit mit den Eizellen für ca. 15 min bei 37 ° C, bis die Zellen Sediment stehen. Den Überstand des Rohres mit einer Pasteurpipette zu entfernen und wieder auszusetzen das Pellet in PBS.
  6. Erholen sich die Cumulus-Eizelle komplexe (CoC) in 90 mm Schalen unter einem Stereomikroskop.
  7. Waschen die COCs dreimal mit PBS-Puffer und einmal in Reifung Medium.
  8. Transfer morphologisch normalen COCs zum 4-wohlen Teller, jeweils gut 500 mL Reifung Medium, in Gruppen von 50 COCs pro Bohrloch.
    Hinweis: Hier, drei Brunnen – einen Brunnen für heterologe IVF, ein Steuerelement für homologe IVF und gut mit nur gereift COCs als Parthenogenetische Kontrolle – verwendet wurden.
  9. Brüten die CoC für 24 h bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und in der Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit.
  10. Bereiten das Medium und der Dichtegradient.
    1. Befruchtung Medium (FERT) vorbereiten, FERT LEDIG-Medium mit Bicarbonat 25 mM, 22 mM Natrium Laktat, 1 mM Natrium Pyruvat, 6 mg/mL Fettsäure-freie BSA und 10 mg/mL Heparin zu ergänzen. Bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft zu erhalten.
    2. Vorbereitung der Dichtegradient durch Zugabe von 1 mL der Dichte Gradienten Medium, um eine 15-mL-Tube und 3 mL Waschlösung, eine 15-mL-Tube. Pflegen sie bei 38,5 ° C für mindestens 1 h
  11. Waschen Sie sich die in-vitro- gereifte Eizellen zweimal in FERT Medium.
  12. Übertragen die Eizellen auf 4-wohlen Teller, jeweils gut 50 COCs in 250 mL FERT. 4-wohlen Teller bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und in Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit während der Vorbereitung der Spermien zur Befruchtung zu erhalten.
  13. Auftauen eine gefrorene Stroh mit Delphin Spermien in einem Wasserbad bei 37 ° C für 50 s.
    Hinweis: Rindersperma für homologe IVF muss parallel nach dem Standardprotokoll für die homologe bovine IVF verarbeitet werden.
  14. Nehmen 10 µL der Spermien probieren und legen Sie sie in eine vorgewärmten Spermien zählen Kammer. Bewerten Sie die Motilität mit eine EDV-gestützte Sperma-Analyse-System, zuvor validiert für die Arten, die Beweglichkeit der Spermien Objektiv zu beurteilen. Während dieser Zeit halten die Spermaprobe bei 38,5 ° c
  15. Die Spermaprobe hinzufügen das Dichte Gradienten Rohr (Schritt 2.10.2). Zentrifuge für 10 min bei 250 X g.
  16. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Pasteurpipette. Hinzugeben Sie 3 mL Reinigungslösung in das Röhrchen mit dem Pellet. Wieder aussetzen der Pellets durch sanft mischen.
  17. Zentrifuge für 5 min bei 250 X g. entfernen den Überstand mit einer Pasteurpipette Spermien Volumen von 300 µL.
  18. Hinzufügen 5 µL der Spermien Aussetzung zu einem Microcentrifuge 95 µL destilliertes Wasser enthält. Pflegen die Sperma-Aussetzung bei 38,5 ° C. füllen die Zellzählung Kammer mit 10 µL der 01:20 Sperma Verdünnung und messen die Konzentration. Berechnen Sie die Menge der FERT Medium, das 100 µL der Spermien, 2 x 10 6 Spermien/mL zu erhalten hinzugefügt werden muss.
  19. Eine 15-mL-Tube das berechnete FERT und Spermien Volumen hinzufügen und vorsichtig mischen mit einer Pasteurpipette.
  20. Fügen Sie 250 µL der Sperma-FERT Suspension in jede Vertiefung der 4-Well Schale mit FERT Mediums mit der gereiften Eizellen, eine Endkonzentration von 1 x 10 6 Spermien/mL zu erhalten.
  21. Co inkubieren der Gameten für 18 h bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und in Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit.
  22. Bereiten das Kulturmedium anhand der synthetischen oviductal Flüssigkeit mit 5 % FCS ergänzt. Bereiten Sie 25 µL der synthetischen oviductal Fluid Kultur Tröpfchen im 35-mm-Gerichte mit 3 mL Mineral Öl bedeckt. Bei 38,5 ° C, unter einer Atmosphäre von 5 % CO 2 und mit maximaler Feuchtigkeit für mindestens 2 Stunden vor Gebrauch in Luft zu erhalten.
  23. Auf 2,5 h Post Co Inkubationszeit, 20 Eizellen aus der Schale entfernen; die restlichen Eizellen in den Inkubator unter den gleichen Bedingungen zu erhalten.
    1. Entfernen Sie die lose beigefügten Spermatozoa durch kräftig pipettieren die Hälfte die Eizellen durch eine enge Bohrung Pasteurpipette 10mal.
    2. Fix den 20 Eizellen in 50 µL 0,5 % Glutaraldehyd für 30 min. Waschen die Eizellen mit PBS-Puffer für 5 min. Transfer die Eizellen zu 50 µL Hoechst Färbelösung für 15 min und waschen Sie die Eizellen mit PBS-Puffer für 5 min.
    3. Übertragen die Eizellen individuell auf 2 µL Tröpfchen Eindeckmedium mit einer Rate von 10 Eizellen pro Folie. Sanft mit einem Deckgläschen abdecken und mit Nagellack versiegeln.
    4. Die Anzahl der Spermien befestigt, die bovinen Eizellen mit dem Phasenkontrast-Mikroskop mit Epifluorescent Optik und 361 nm Anregung Filter bei 40 X Vergrößerung ausgestattet.
  24. Nach 12 h Co Inkubation, 4-wohlen Teller 10 mutmaßliche Zygoten entfernen; die übrigen mutmaßlichen Zygoten im Brutschrank unter den gleichen Bedingungen zu erhalten.
    1. Übertragung der 10 mutmaßliche Zygoten zu einer Zentrifuge 15 mL Röhrchen mit 2 mL PBS und Wirbel sanft für 2 min die Kumuluszellen entfernen. Waschen zweimal in PBS, Fix und Fleck, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.23.2.)
  25. Nach 18, 20, 22 und 24 h Co Inkubation, 10 entfernen Sie mutmaßliche Zygoten vom 4-wohlen Teller und Wirbel, reparieren und färben sie wie zuvor beschrieben (Schritt 2.23.2). Den Rest des mutmaßlichen Zygoten im Brutschrank unter den gleichen Bedingungen zu erhalten.
    1. Man Bildung und Polyspermy unter dem Mikroskop Phase-Kontrast/Epifluorescent in die homologen und heterologen IVF-Gruppen durch Färbung mit Hoechst zu bewerten.
    2. Bewertet man Bildung in 10 zufällig ausgewählte mutmaßlichen Hybrid Zygoten pro Probe. Bestätigt man Formation unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop bei 488 nm Argon Laser Erregung und 515 bis 530 nm Erkennung.
    3. Abschnitt optisch mutmaßliche Zygoten sequenziell (2 mm) und sammeln Bilder über eine imaging-Software. Mit einer 3D Analyse Software zu visualisieren.
    4. Nach 24 h Inkubation Co Waschen 50 mutmaßliche Zygoten viermal in PBS und zweimal in Kulturmedium.
  26. Übertragen Sie sie in Gruppen von 25 auf Microdroplets Kulturmedium zuvor vorbereitet und equilibriert.
  27. Pflegen bei 38,5 ° C unter einer Atmosphäre von 5 % O 2 / 5 % CO 2 und in der Luft mit maximalen Luftfeuchtigkeit.
  28. Nach 26 und 28 h Co Inkubation, Gerichte und Wirbel, Fix 10 mutmaßliche Zygoten entnehmen, und färben sie, wie zuvor beschrieben (Schritt 2.23.2).
  29. Nach 48 h Kultur, beobachten die Spaltung unter einem Stereomikroskop.
  30. Entfernen Sie die Zona Pellucida (ZP) durch Übertragung der Embryonen zu einer Protease-Lösung von 5 mg/mL.
  31. Individuell jedem Embryo dreimal waschen mit PBS-Puffer. Frieren sie Snap-in flüssigem Stickstoff in 0,2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Speichern sie bei-80 ° C bis zur Analyse.

3. PCR

  1. Materialien und Reagenzien
    Hinweis: die Reagenzien, Materialien und Geräte zur Durchführung der PCR-Protokoll sind detailliert in der Tabelle der Materialien und umfassen eine PCR-Rohr-Rack und eine Reihe von Mikropipetten (P2, P20, P200, P1000), 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, PCR-Röhrchen und Kappen, einem Thermocycler, ein UV-Strahler, Agarosegel und Puffer (Tris Borat EDTA (TBE)).
    1. Schonend auftauen alle Reagenzien auf Eis. Pflegen sie im Eis während des Experiments. Verwenden Sie Deoxynucleotides (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP und dGTP), Ziel Primer auf die Referenz gen Kodierung für das Delphin 18 S ribosomale Protein (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG und F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA-Polymerase, 5 X Puffer für die DNA-Polymerase DNA-Vorlage, steriles Wasser und Magnesiumchlorid (MgCl 2 um eine Endkonzentration von 5,0 mM).
    2. Agarose-Gel und Probe-Vorbereitung.
      1. Prepare Delphin und Rinder Samenzellen DNA Proben.
        1. Tauwetter eine gefrorene Stroh jeder Tierart in einem Wasserbad bei 37 ° C für 50 s. 3 mL Waschlösung hinzugeben. Zentrifuge bei 250 X g für 10 min. entfernen den überstand. Fügen Sie 30 µL STES Lyse Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; und 1 mM 0,1 % SDS), 2 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 5 µL Dithiothreitol (DTT); Endkonzentration: 150 mM. Pflegen Sie über Nacht bei 55 ° C. Fügen Sie 200 µL Reinstwasser. Zentrifuge bei 250 X g für 5 min. halten überstand. Die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer messen.
      2. Führen Sie serielle Verdünnungen der DNA von Delphin Spermien (d. h. 40, 4 und 0,4 ng/mL) mit Reinstwasser zu prüfen, ob die PCR-Bedingungen in der Lage sind eine kleine Menge von Dolphin DNA erkennen.
      3. Führen Sie serielle Verdünnungen der bovinen Samenzellen DNA (z. B. 4.000, 400, 40 und 4 ng/mL) mit Reinstwasser zu prüfen, ob die PCR-Bedingungen in der Lage, eine kleine Menge der bovinen DNA zu erkennen sind.
      4. Bereiten die Delphin und Rind Embryonen. Die Embryonen auf Eis auftauen. 8 µL 100 µg/mL Proteinase K hinzufügen und verwalten über Nacht bei 55 ° C. Um die Reaktion zu stoppen, legen Sie die Proben bei 96 ° C für 5 min.
      5. Zubereiten 2 % Agarose-Gel-TBE-Puffer und 20 µL der Nukleinsäure-Fleck mit Standardtechniken.
    3. PCR-Vorbereitung.
      1. Bezeichnung PCR Tube(n): Delphin Verdünnungsreihen (40, 4 und 0,4 ng/mL), bovine Verdünnungsreihen (4.000, 400 40 und 4 ng/mL), homologe bovine zwei-Zell-Embryo, zwei Zellen mutmaßlichen heterologen Embryonen und Negativkontrolle.
      2. Bereiten Sie eine master Mischung in einem sterilen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu einem Endvolumen von 25 µL pro Reaktion.
        1. Hinzufügen 5 µL 5 X DNA Polymerase Flexi Puffer, 0,5 µL von dNTPs (10 mM) 1,5 µL MgCl 2 (25 mM), 0,5 µL vorwärts- und Grundierung (10 µM), 1,5 µL DNA Schablone (Sperma) oder 8 µL DNA Schablone (zwei Zellen Embryonen) , 0,07 µL Taq Polymerase und steriles destilliertes Wasser bis zu einem 25 µL Endvolumen. Mischen Sie gut.
  2. Verstärkung Protokoll
    1. legen Sie die Rohre in den Thermocycler. Wählen Sie das folgende Programm: 94 ° C für 3 min; 40 Zyklen von 94 ° C für 15 s, 59 ° C für 25 s, 72 ° C für 20 s; und 72 ° C für 5 min. das Programm gestartet werden.
    2. Speichern die Rohre bei 4 ° C. hinzufügen 2.5 µL Ladepuffer zu jedem PCR-Produkt bei 4 ° C und Last 15 µL des Gemisches in die Vertiefungen der 2 % Agarose-Gel. Verwenden Sie einen DNA-Leiter-Marker für die genaue Größe Schätzung der PCR-Fragmente.
    3. Perform Elektrophorese für 15 min auf DNA-Migration zu ermöglichen. Mit einem UV-Strahler visualisiert.

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Representative Results

Alle Ergebnisse, Tabellen und Abbildungen (1 und 2) hier vorgestellt wurden mit Erlaubnis3wiedergegeben.

Delphin Spermien haben hohe Motilität nach Einfrieren und Auftauen

Die aufgetauten Delphin ejakuliert zeigte Prozentsätze (% ± SD) von 84,5 ± 5,3 Total bewegliche und 69,1 ± 5,1 progressiv bewegliche Spermien. Hinsichtlich der Motilität sind diese Zahlen repräsentativ für qualitativ hochwertige kryokonservierten Samenzellen.

Delphin Spermien sind in der Lage eindringende Zona intakt boviner Oozyten und Herstellung von Hybrid-Embryonen

Abbildung 1A und Tabelle 1 zeigen Delphin Spermien an die bovine ZP nach 2,5 h Co Inkubation befestigt. Delphin Spermien waren zu einem höheren Prozentsatz als bovinen Spermatozoen (Abbildung 1 b und Tabelle 1) befestigt. Fluoreszenz-Mikroskopie zeigt, dass Delphin Spermien Zona intakt bovinen Spermatozoen (Abbildung 1), führt zur Bildung von man und Spaltung (1E Abbildung und Tabelle 1) durchdringen können. Dies wurde durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 1 und Abbildung 1F) bestätigt. Keine Polyspermy wurde in Eizellen von der heterologen IVF-Gruppe nach 12 h Co Inkubation (Tabelle 1) beobachtet. Man Bildung in die heterologe IVF erreicht den höchsten Prozentsatz an 24 h, eine längere Zeit als in der homologe Gruppe, die um 18 Uhr Co Inkubation (Tabelle 1) aufgetreten. Die Spaltung in 48 h nach der Inkubation lag in der heterologen niedriger als die homologe IVF (Tabelle 1). Eine spontane parthenogenetisch Aktivierung Quote von 8,0 % verzeichneten bovine gereifte unbefruchtete Eizellen bei 48 h (Tabelle 1).

Zu guter Letzt die PCR-Ergebnisse bestätigte das Vorhandensein von Delphin genetisches Material in die Hybrid-Embryonen (Abbildung 3) durch die Auswertung der Anwesenheit von ein Delphin-Referenz-gen, das für die ribosomale 18 S kodiert Protein (Abbildung 2).

Figure 1
Abbildung 1: Dolphin Spermien befestigt, die bovine Zona Pellucida (ZP). Beigefügten Dolphin (A) und Rinder (B) Spermien nach 2,5 h Co Inkubation mit Zona intakt boviner Oozyten. Gameten waren fleckig mit Hoechst und visualisiert unter Phasenkontrast-Mikroskop (40 X Vergrößerung). Ein Delphin Spermien im Periviteline Raum eine boviner Oozyten (C und D) und ein decondensing Delfin-Spermien-Kopf im bovinen Eizelle Zytoplasma (E). Bilder unter einem confocal Mikroskop aufgenommen wurden und der Äquatorebene des mutmaßlichen Zygote (Hoechst beflecken; 40 X Vergrößerung) entsprechen. Zwei Vorkerne (F) unter dem Phase-Kontrast-Mikroskop beobachtet, nach 24 Stunden der heterologen IVF bestehend aus Co Inkubation von Delphin Spermien mit Zona intakt boviner Oozyten (Hoechst beflecken; 40 X Vergrößerung; Maßstabsleiste = 25 µm). Die Figur wurde von Referenz3 mit Erlaubnis reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: repräsentative Elektrophorese (2 % Agarose-Gel Interkalation Bromid gebeizt) der PCR-Amplifikation Suchergebnisse für 18 S-Delphin-gen. Bahnen 1 bis 30 zeigen mutmaßlichen Delphin/Rinder-Hybrid-Embryonen; die Bahnen S1 und S2 verfügen über 4 ng/mL und 0,4 ng/mL Delphin Samenzellen DNA, bzw.; und Gassen C1 bis C5 verfügen über zwei Zellen Rinderembryonen und H2O (Wasser) (Blindkontrolle). Der Pfeil zeigt die 190-bp-Band entspricht der verstärkten 18 S rDNA. Die Figur wurde von Referenz3 mit Erlaubnis reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: repräsentative Bilder von Hybridembryos. Repräsentatives Bild eines zwei Zellen Hybriden Embryos (A) bei 48 h Inkubation (Hoechst beflecken; 40 X Vergrößerung). Ungefärbten Hybrid-Embryonen im 48 h Inkubation, in den verschiedenen Phasen der Division, unter dem Stereomikroskop (B) visualisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Table 1
Tabelle 1: Preise von Anhaftung, Polyspermy, man Bildung und Spaltung nach homologe und heterologe Co Inkubation mit boviner Oozyten und Rind oder Delphin Samenzelle bzw.. Variablen wurden mit ANOVA (Kruskal-Wallis und Mann-Whitney Test) analysiert. Die Werte sind als Mittelwert ± SEM (Bereich) von zwölf Wiederholungen ausgedrückt; n = Gesamtzahl der Eizellen oder mutmaßlichen Zygoten untersucht. Die Tabelle wurde von Referenz3 mit Erlaubnis reproduziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Für viele verschiedene Säugetierarten gibt es vielfältige Vorteile bei der Verwendung von aufgetauten Spermien. Dazu gehören die Fähigkeit übertragen wertvolles genetisches Material, das Potenzial für den weltweiten Vertrieb, das geringe Risiko der Kontamination und die Fähigkeit, die männlichen Gameten für Jahrzehnte zu bewahren. Die Verwendung von kryokonservierten Spermien gilt der Große Tümmler, da diese Spezies unter Anhang II des Washingtoner ARTENSCHUTZÜBEREINKOMMENS, geschützt ist, was den Transport und Austausch von Tieren zwischen verschiedenen Wasserparks begrenzt. Delphine-Transport ist eine Tätigkeit, die logistischen Probleme und gefährliche Risiken schafft. Beförderung von Tieren zu unterlassen hat jedoch auch folgen, wie das Risiko der Einschleppung Blutsverwandtschaft zu einer Gefangenschaft Bevölkerung von Tieren. Eine Lösung ist die Kryokonservierung von Spermien. Einige Autoren haben kryokonserviert Delphin Sperma5,7,8,9, mit sehr ermutigenden Ergebnissen. Darüber hinaus war die erste Geburt eines Delphin Kalb konzipiert durch künstliche Befruchtung mit kryokonservierten Spermien im Jahr 2005 berichteten10. Einige Jahre später, dies geschah mit Sex sortiert Spermien11.

Delphin Spermien haben kryokonserviert mit verschiedenen Techniken, von anspruchsvollen Methoden, z. B. eine programmierbare Gefrierfach5, um gängige Methoden, wie z. B. Trockeneis12 oder flüssiger Stickstoff2,9Dämpfe, 13. Der wesentliche Vorteil der Verwendung von Trockeneis oder flüssigem Stickstoff dämpfen ist die Möglichkeit, am selben Ort Ovarialgewebe wo das Sperma, ohne den Einsatz von hochspezialisierten Geräten gewonnen wird. Sperma eingefroren in Strohhalme auf Polystyrol in flüssigem Stickstoff dämpfen ist eine einfache, schnelle und kostengünstige Methode,13. In der Praxis wenn diese Methodik auf Delfine, war Samenzellenmotilität 65 %. Es ist jedoch wichtig zu überlegen, wie schwierig es ist, eine standardisierte Methode zu etablieren: die Technik kann durch externe Faktoren wie Temperatur, Feuchtigkeit, Polystyrol Größe usw. beeinflusst werden. Daher sind weitere Untersuchungen nötig, zu optimieren und standardisieren die Prozedur um den Erfolg der mit Sperma eingefroren mit flüssigem Stickstoff-Dampf-Methode zu verbessern.

Um ein Einfrieren Protokoll zu optimieren, ist es wichtig, eine zuverlässige Methode für die funktionale Bewertung von den Spermien zu entwickeln. IVF ist ein gutes Mittel für Befruchtung Spermien testen. Im Idealfall Delphin Eizellen für IVF verwendet werden soll, aber schwierigen und mühsamen Verfahren erforderlich, um Eizellen von Frauen repräsentieren eine wichtige Einschränkung. Daher eröffnet die Möglichkeit der Verwendung von heterologen IVF ein neues Mittel zur Befruchtung Effizienz in der Delphin zu testen. Eizellen aus anderen Spezies können für heterologe Delphin IVF verwendet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass heterologe IVF zwischen boviner Oozyten und Delphin Spermien durchgeführt werden kann. Eingefroren und aufgetaut Delphin Spermatozoa können die Zona intakt bovine Eizelle zu durchdringen und eine Hybrid-Embryonen zu erzeugen.

Die vorgestellten Kombination von Protokollen für das Sammeln von Einfrieren Auftauen und Durchführung heterologen IVF mit boviner Oozyten haben erfolgreich gezeigt und ist einen erster Schritt für die Optimierung der Kryokonservierung und die Auswertung der Delphin-Sperma. Es ist wichtig zu beachten, dass in diesen Verfahren gibt es noch viele unbekannte. Allerdings ist die Fähigkeit, Delphin Sperma Ovarialgewebe macht es zugänglich und ermöglicht es, im Labor aufbewahrt werden. Dies erleichtert die wissenschaftliche Studien und führt zu einem besseren Verständnis der Zusammensetzung, Physiologie und Verhalten von Spermien.

Die Auswertung der Spermien durch heterologe IVF kann die Optimierung der eisigen Protokolle erleichtern, sondern es kann auch in der Zukunft zu testen und wählen Männer für Fruchtbarkeit Effizienz verwendet werden. Ein wichtiger Aspekt ist die Beziehung zwischen realen Befruchtung Zahlen und heterologen IVF-Werte. Darüber hinaus, und aufgrund der Neuartigkeit der heterologen IVF zwischen diesen zwei Arten phylogenetisch entfernten, Rind und Delphin, können neue biologische Hypothesen gebaut werden. Diese Protokolle öffnen insgesamt einen neuen Raum für die Forschung auf die Reproduktion der Delfine und andere Meeressäuger.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

seine Arbeit wurde durch das spanische Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit (AGL2015-70140-R, D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan und J. F. Pérez-Gutiérrez und Seneca Stiftung von Murcia (Grant 20040/GERM/16, F. García-Vázquez) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

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References

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  2. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
  3. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
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Tags

Entwicklungsbiologie Ausgabe 126 Tümmler Spermien aufgetauten Spermien Spermiogramm IVF Befruchtung
Bottlenose Delphin (<em>Tursiops Truncatus</em>) Spermien: Sammlung, Kryokonservierung und heterologen Befruchtung <em>In Vitro</em>
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Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

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