Summary
Hier presenteren we protocollen die met succes zijn gebruikt voor dolphin spermacellen collectie, cryopreservatie en heterologe IVF-prestaties met boviene eicellen.
Abstract
Het gebruik van de cryopreserved dolfijn spermacellen vergemakkelijkt de uitwisseling van genetisch materiaal tussen aquatische parken en spermacellen toegankelijk maakt voor laboratoria voor studies om ons begrip van zeezoogdieren reproductie. Heterologe IVF, een vervanging voor homologe IVF, kan dienen als een middel om te testen de sperma vruchtbaarheid potentiële; studie gameet fysiologie en vroege embryo-ontwikkeling; en om te voorkomen dat het gebruik van waardevolle dolfijn eicellen, die moeilijk te verkrijgen. Hier presenteren we de protocollen die zijn geopend met succes cryopreserve dolfijn spermacellen te verzamelen. Het verzamelen van sperma wordt uitgevoerd door handmatige stimulatie bij getrainde dolfijnen. Cryopreservatie wordt bereikt met behulp van een TRIS-ei-dooier gebaseerd extender met glycerol. Daarnaast presenteren wij een protocol die beschrijft heterologe IVF met dolfijn spermacellen en eicellen van runderen en die wordt gecontroleerd of het hybride karakter van het resulterende embryo met behulp van PCR. Heterologe bevruchting roept vragen op over bevruchting en kan worden gebruikt als een instrument gameet fysiologie en vroege embryo-ontwikkeling te gaan studeren. Bovendien, toont het succes van heterologe IVF het potentieel van deze techniek voor het testen van de dolfijn sperma Bemestings-capaciteit, die is de moeite waard nader onderzoek.
Introduction
Geassisteerde voortplanting technologieën zijn slecht ontwikkeld in wilde dieren, met inbegrip van mariene zoogdieren. Het ontbreken van gevoelige methoden voor het beoordelen van sperma waardegevende bestanddelen succes draagt bij aan de trage ontwikkeling van reproductieve technologieën in soorten zoals dolfijnen. Het was niet tot voor kort dat de rudimentaire basisparameters van de Tuimelaar (Tursiops truncatus) gerapporteerde1,2 waren. Variabelen zoals de motiliteit en morfologie, geven hoewel op grote schaal gebruikt, echter beperkte informatie over reproductieve efficiëntie. De beste indicator van de kwaliteit van het sperma is de evaluatie van de waardegevende bestanddelen potentieel.
Onlangs, onze fractie gebruikt een methode ter beoordeling van de dolfijn sperma Bemestings-potentieel door mannelijke pronuclear vorming en/of hybride embryo vorming na heterologe IVF met zona intact boviene eicellen3te bepalen. Het gebruik van dolfijn-runderen heterologe IVF heeft belangrijke voordelen ten opzichte van homologe IVF, zoals het overwint de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van eicellen van de dolfijn en vergemakkelijkt het gebruik van goed getest in vitro boviene oöcyt rijping systemen. Om te voorkomen dat soorten specificiteit, is heterologe bevruchting algemeen uitgevoerd bij gebrek aan ZP. Hoewel het mogelijk voor de evaluatie van het vermogen van de spermacellen Acrosoom-gereageerd om te fuseren met het vitelline membraan maakt, schaadt het de evaluatie van andere kenmerken in verband met bemesting. De beschreven procedure maakt gebruik van zona intact eicellen en vergunningen van de evaluatie van de volgende parameters: sperma zona bindende en bijlage, penetratie, polyspermy, pronuclear formatie en hybride embryo decollete.
Hier, presenteren wij diverse protocollen voor sperma collectie, fundamentele sperma-analyse, spermacellen bevriezing, alsmede de evaluatie van de dolfijn sperma functionaliteit door mannelijke pronuclear en/of hybride embryo vorming na heterologe IVF te bepalen met behulp van zona intact boviene eicellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ethische verklaring: alle experimentele procedures werden herzien en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van het Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren, zoals aangenomen door de vereniging voor de studie van de voortplanting en de Animal Welfare Act voor de verzorging van zeezoogdieren.
1. dolphin sperma collectie en cryopreservatie
- voorbereiding
- maken FERT medium (heparine - en hypotaurine-gratis). Bereiden FERT-TALP medium aangevuld met 25 mM bicarbonaat, 22 mM natrium lactaat, 1 mM natrium pyruvaat, 6 mg/mL vetzuur-vrije BSA en 10 mg/mL heparine (pH 7.4).
Opmerking: Dit medium voor te bereiden op de dag van gebruik en bewaar deze bij 38.5 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2, en in de lucht met een maximale vochtigheidsgraad voor ten minste 2 uur vóór gebruik. - Bereiden TRIS ei dooier gebaseerde buffer. Los 30.28 g/L Tris, 16.75 g/L citroenzuur 12,5 g/L fructose en 0,5 g/L streptomycine in ultrazuiver water (pH 7,3, osmolaliteit = 310 mOsm/kg). Voeg het eigeel 20% (v/v).
- maken FERT medium (heparine - en hypotaurine-gratis). Bereiden FERT-TALP medium aangevuld met 25 mM bicarbonaat, 22 mM natrium lactaat, 1 mM natrium pyruvaat, 6 mg/mL vetzuur-vrije BSA en 10 mg/mL heparine (pH 7.4).
- Trainen een bewezen fokken mannelijke tuimelaar te liggen in de dorsale recumbence in de buurt van de rand van het zwembad voor vrijwillige spermacentrum.
Opmerking: De mannelijke dolfijn moet worden opgeleid over 6 maanden door positieve versterking, zoals eerder beschreven 4. - Verschillende tactiele stimulaties uitvoeren door zachtjes te drukken op de craniale gebied van de genitale groef van de dolfijn te verduidelijken met vrijwillige extrusie van de penis vanaf de genitale groove.
- Direct na het bereiken van een volledige erectie, het uiteinde van de penis in een steriele container te verkrijgen van het ejaculaat.
- Handhaving van het spermastaaltje bij 37 ° C tot de analyse. Herhaal stap 1.3 en 1.4 voor opeenvolgende ejaculaat collecties, met een nieuwe propyleen-glas telkens.
- Onmiddellijk na het verzamelen, bepalen het volume met behulp van een gegradueerde glazen cilinder eerder opgewarmd tot 37 ° C. evalueren de kleur, pH en osmolariteit (met behulp van een micro-osmometer) van het ejaculaat.
- Om te evalueren van de concentratie van spermacellen in het ejaculaat, 10 µL van de sperma-ophanging aan een eppendorf buis met 90 µL van gedistilleerd water toevoegen. Bepaal de concentratie van de zaadcellen met behulp van een zaadcel tellen kamer.
Opmerking: Tijdens de evaluatieperiode, houd de rest van het ejaculaat bij 37 ° C. - De motiliteit parameters evalueren.
- 10 µL van het sperma monster nemen en breng dit in een voorverwarmde sperma kamer.
- Evalueren de beweeglijkheid met behulp van een computer-assisted sperma analysesysteem, eerder gevalideerd voor de Tuimelaar, objectief beoordelen de beweeglijkheid van sperma 2.
Opmerking: Indien nodig, Verdun het spermastaaltje met FERT medium (heparine - en hypotaurine-gratis) voor de adequate visualisatie van de beweeglijkheid van de zaadcellen. Tijdens de evaluatie, het monster bij 37 ° C te handhaven op een verwarmde Microscoop podium.
- 20 µL van spermastaaltje nemen en beoordelen van de levensvatbaarheid en sperma morfologie als eerder beschreven 5.
- Het spermastaaltje overbrengen in een centrifugebuis. Centrifugeer het spermastaaltje bij 250 x g gedurende 5 min. Na het bepalen van de concentratie van de zaadcellen met behulp van een tellen kamer, aanpassen van de concentratie sperma tot 400 x 10 6 spermacellen/mL.
Opmerking: Indien nodig, Verdun de pellet van de geconcentreerde ejaculeert met geïsoleerde rudimentaire plasma van een bovenmatige hoeveelheid het dezelfde ejaculaat door middel van centrifugeren (250 x g, 10 min).- In de loop van 5 min, langzaam verdund het sperma monster 1:1 (v/v) met een TRIS ei dooier gebaseerde buffer met 1,5% glycerol. De buis met de schorsing van het sperma bij 5 ° C gedurende 1 h 30 min.
- Uitvoeren een tweede verdunning van de schorsing van de zaadcellen met een TRIS ei dooier gebaseerde buffer met glycerol om een concentratie van 3% laatste glycerol en een eindconcentratie van 200 x 10 6 sperma/mL te verkrijgen. De sperma schorsen bij 5 ° C gedurende 10 minuten
- De sperma schorsing in 0,25 mL rietjes laden. Heat-Seal de rietjes. Plaats de rietjes in een rack 4.5 cm boven de vloeibare stikstof voor 10 min. de rietjes duik in de vloeibare stikstof en bewaren tot evaluatie.
2. Heterologe In Vitro bevruchting met behulp van Zona Intact boviene eicellen
- voorbereiding
- voorbereiden de kleuring oplossing en het medium van de montage.
- Bereiden Hoechst stockoplossing door ontbinding van 1 mg van Hoechst in 1 mL gedestilleerd water. 30 µL aliquots maken en houd ze in het donker bij-20 ° C tot gebruik. Bereiden kleurstofoplossing door het toevoegen van 25 µL van Hoechst stockoplossing tot 5 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1 g/L PVA. Meng goed en houden in het donker bij 4 ° C tot gebruik.
- Voorbereiden montage medium door het mengen van 6,25 mL PBS met 6,25 mL glycerol en 6,25 µL van de stockoplossing Hoechst. Meng goed en houden in het donker bij 4 ° C tot gebruik.
- Het medium voorbereiden oöcyt collectie en in vitro bevruchting.
- Zoutoplossing bereiden door toevoeging van 0,5 mL gentamycine tot 0,9% NaCl gedistilleerd water.
- Bereiden het medium voorraad rijping door toevoeging van 10 ng/mL epidermale groeifactor (EGF) en 10% foetaal kalfsserum (FCS) tot 10 mL van TCM-199. Beide media bij 38.5 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2, en in de lucht met een maximale vochtigheidsgraad voor ten minste 2 uur vóór gebruik handhaven.
- voorbereiden de kleuring oplossing en het medium van de montage.
- De eierstokken in het slachthuis bevinden in zoutoplossing bij 33-35 ° C verzamelen en transporteren naar het laboratorium binnen 4 uur uit collectie.
- Eenmaal in het laboratorium, spoel de eierstokken driemaal te verwijderen van het puin en bloed met zoutoplossing eerder opgewarmd tot 37 ° C. handhaven de eierstokken zoutoplossing bij 37 ° C gedurende het proces.
- Aspirate 2 tot en met 8 mm follikels met een 18G naald en een spuit van 10 mL. Verzamelen van de aanzuiging folliculaire vloeistof in de buizen van 50 mL.
- Toestaan de folliculaire vloeistof met de eicellen te staan gedurende ongeveer 15 minuten bij 37 ° C, totdat het sediment cellen. Verwijder het supernatant van de buis met een pipet van Pasteur en resuspendeer de pellet in PBS.
- Herstellen van de cumulus-oöcyt complexen (COCs) in 90 mm gerechten onder een stereomicroscoop.
- De COCs wassen drie keer in PBS en eenmaal in rijping middellange.
- Overbrengen morfologisch normale COCs 4-well gerechten, elk putje met 500 mL voor rijping medium, in groepen van 50 COCs per putje.
Opmerking: Hier drie wells – één goed voor heterologe IVF, één besturingselement goed voor homologe IVF en een putje met alleen verviel COCs als een ongeslachtelijke besturingselement – dienden. - De COCs gedurende 24 uur bij 38.5 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2, en in de lucht met maximale luchtvochtigheid Incubeer.
- Bereiden van het medium en het verloop van de dichtheid.
- Om te bereiden bevruchting medium (FERT), vullen FERT-TALP medium met 25 mM bicarbonaat, 22 mM natrium lactaat, 1 mM natrium pyruvaat, 6 mg/mL vetzuur-vrije BSA en 10 mg/mL heparine. Zorg ervoor dat u 38.5 ° C, onder een atmosfeer van 5% CO 2, en in de lucht met een maximale vochtigheidsgraad voor ten minste 2 uur vóór gebruik. Het verloop van de dichtheid bereid
- door toevoeging van 1 mL van de kleurovergang medium dichtheid voor een tube van 15 mL en 3 mL oplossing tot een 15-mL koker te wassen. Ze onderhouden bij 38.5 ° C gedurende ten minste 1 h.
- Was de in vitro verviel eicellen tweemaal in FERT middellange.
- Overbrengen in de eicellen 4-well gerechten, elk putje met 50 COCs in 250 mL FERT. De 4-well gerechten bij 38.5 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2, en in de lucht met een maximale vochtigheidsgraad houden bij de voorbereiding van het sperma voor de bevruchting.
- Ontdooien een bevroren stro met dolfijn spermatozoïden in een waterbad bij 37 ° C gedurende 50 s.
Opmerking: Rundersperma voor homologe IVF moet worden verwerkt parallel, na het standaardprotocol voor homologe boviene IVF. - Nemen 10 µL van het sperma monster en breng dit in een voorverwarmde zaadcellen tellen kamer. Evalueren de beweeglijkheid met behulp van een computer-assisted sperma analysesysteem, eerder gevalideerd voor de soort, objectief beoordelen de beweeglijkheid van de zaadcellen. Gedurende deze tijd, het handhaven van het sperma monster bij 38,5 ° C. Het spermastaaltje toevoegen
- aan de dichtheid kleurovergang buis (stap 2.10.2). Centrifugeer gedurende 10 min op 250 x g.
- Verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet Pasteur. Voeg 3 mL van de oplossing van het wassen aan de buis met de pellet. Resuspendeer de pellet door voorzichtig mengen.
- Centrifuge voor 5 min op 250 x g. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet van Pasteur een sperma volume van 300 µL.
- Toevoegen 5 µL van de ophanging van het sperma om een microcentrifuge met 95 µL van gedistilleerd water. De sperma schorsen op 38,5 ° C. opvulling het tellen van de cel kamer met 10 µL van de 1:20 sperma verdunnings- en maatregel de concentratie. Berekenen van de hoeveelheid FERT medium dat moet worden toegevoegd aan 100 µL van het sperma te verkrijgen van 2 x 10 6 spermacellen/mL.
- De berekende FERT en sperma volume toevoegen voor een tube van 15 mL en meng voorzichtig met behulp van een precisiepipet Pasteur.
- Voeg toe 250 µL van het sperma-FERT schorsing aan elk putje van de 4-well schotel met het FERT medium met de gerijpte eicellen te verkrijgen van een eindconcentratie van 1 x 10 6 spermacellen/mL.
- Co Incubeer de gameten voor 18u bij 38.5 ° C in een atmosfeer van 5% CO 2, en in de lucht met maximale luchtvochtigheid.
- Bereiden op basis van de synthetische oviductal vloeistof aangevuld met 5% FCS voedingsbodem. Bereiden van 25 µL van synthetische oviductal vloeistof cultuur druppels in 35-mm gerechten bedekt met 3 mL minerale olie. Zorg ervoor dat u 38.5 ° C, onder een atmosfeer van 5% CO 2, en in de lucht met een maximale vochtigheidsgraad voor ten minste 2 uur vóór gebruik.
- Op 2,5 h post co incubatie, 20 eicellen uit de schotel verwijderen; de resterende eicellen in de incubator onder dezelfde voorwaarden te handhaven.
- Verwijderen van de losjes gekoppelde spermacellen door krachtig pipetteren de helft van de eicellen via een smalle-boring Pasteur Pipetteer 10 keer.
- Bevestigen van de 20 eicellen in 50 µL van 0,5% Glutaaraldehyde voor 30 min. Wash de eicellen in PBS voor 5 min. Transfer de eicellen tot 50-µL van Hoechst kleurstofoplossing gedurende 15 minuten en wassen van de eicellen in PBS voor 5 min.
- Overbrengen in de eicellen individueel 2 µL druppels van montage medium met een snelheid van 10 eicellen per dia. Zachtjes dek af met een dekglaasje aan en verzegel met nagellak.
- Het aantal spermacellen gekoppeld aan de boviene eicellen met behulp van een Microscoop van de fase contrast uitgerust met epifluorescerende optiek en een 361 nm excitatie filter op 40 x vergroting.
- Na 12u co incubatietijd, 10 vermoedelijke zygoten verwijderen uit de 4-well gerechten; de resterende vermoedelijke zygoten in de incubator onder dezelfde voorwaarden te handhaven.
- Overdracht de 10 vermoedelijke zygoten aan een centrifuge 15 mL tube met 2 mL PBS en vortex gedurende 2 min zachtjes te verwijderen van de cumulus cellen. Wash tweemaal in PBS fix en vlek, zoals hiervoor is beschreven (stap 2.23.2.)
- Na 18, 20, 22 en 24-uurs co incubatietijd, verwijderen van 10 vermoedelijke zygoten uit de 4-well gerechten en vortex, vast te stellen, en vlekken hen zoals hiervoor is beschreven (2.23.2 stap). De rest van de vermoedelijke zygoten in de incubator onder dezelfde voorwaarden handhaven.
- Pronuclear formatie en polyspermy onder een Microscoop fase-contrast/epifluorescerende in beide het homologe en heterologe IVF-groepen evalueren door kleuring met Hoechst.
- Evalueren pronuclear formatie in 10 willekeurig gekozen vermoedelijke hybride zygoten per monster. Bevestigen van de pronuclear formatie onder een confocale laser scanning microscoop op 488-nm argon laser excitatie en detectie van 515 tot 530 nm.
- Afdeling optisch vermoedelijke zygoten sequentieel (2 mm) en het verzamelen van beelden met behulp van een imaging software. Visualiseren met behulp van een 3D analyse softwarepakket.
- Na 24u van co incubatie, wassen 50 vermoedelijke zygoten viermaal PBS en tweemaal kweekmedium.
- Overbrengen in groepen van 25 naar microdruppels van kweekmedium eerder bereid en geëquilibreerd.
- Behouden bij 38.5 ° C in een atmosfeer van 5% O 2 / 5% CO 2 en in de lucht met maximale luchtvochtigheid.
- Na 26 28 nonies van co incubatie, 10 vermoedelijke zygoten verwijderen uit de gerechten en de vortex, de correctie en vlekken van hen, zoals hiervoor is beschreven (stap 2.23.2).
- Na 48u van cultuur, observeren het splijten onder een stereomicroscoop.
- Verwijderen van de zona zitten (ZP) door de overdracht van de embryo's aan een protease-oplossing van 5 mg/mL.
- Individueel wassen elk embryo drie keer in PBS. Module-freeze ze in vloeibare stikstof in 0,2 mL microcentrifuge buizen. Bewaar ze bij-80 ° C tot analyse.
3. PCR
- materialen en reagentia
Opmerking: de reagentia, materialen en apparatuur die wordt gebruikt voor het uitvoeren van het PCR protocol worden beschreven in de tabel van materialen en omvatten een PCR buis rack en een aantal micropipetten (P2, P20 P200, P1000), 1,5 mL microcentrifuge buizen, PCR buizen en caps, een thermische cycler, een UV illuminator, agarose gel en buffer (Tris boraat EDTA (FSME)).- Voorzichtig ontdooien alle reagentia op ijs. Handhaven in ijs gedurende het gehele experiment. Gebruik deoxynucleotides (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP en dGTP), target inleidingen op de referentie gen codeert voor de dolfijn 18 S ribosomal eiwit (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG en F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), polymerase van DNA, 5 X buffer voor de polymerase van DNA, DNA sjabloon steriel water en magnesiumchloride (MgCl 2 op een eindconcentratie van 5.0 mM).
- Agarose gel en sample voorbereiding.
- Voorbereiden dolfijn en runderen sperma DNA-monsters.
- Dooi een bevroren rietje van elke soort in een waterbad bij 37 ° C voor 50 s. Voeg 3 mL oplossing te wassen. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 10 min. Verwijder de bovendrijvende substantie. Voeg 30 µL van STES lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; en 1 mM 0,1% SDS), 2 µL van proteïnase K (20 mg/mL) en 5 µL van dithiothreitol (DTT); eindconcentratie: 150 mM. Zorg ervoor dat u 's nachts 55 ° C. toevoegen 200 µL ultrazuiver water. Centrifugeer bij 250 x g gedurende 5 min. houden het supernatant. Meten van de concentratie van de DNA met een spectrofotometer.
- Uitvoeren van seriële verdunningen van het DNA van dolfijn spermacellen (d.w.z., 0.4, 40 en 4 ng/mL) met ultrazuiver water om te controleren dat de PCR voorwaarden staat zijn opsporen van een kleine hoeveelheid dolphin DNA.
- Uitvoeren van seriële verdunningen van boviene sperma DNA (d.w.z., 4.000, 400, 40 en 4 ng/mL) met ultrazuiver water om te controleren dat de PCR voorwaarden zijn voor het opsporen van een kleine hoeveelheid boviene DNA van.
- Bereiden de dolfijn en runderen embryo's. Ontdooi de embryo's op het ijs. Voeg 8 µL van 100 µg/mL proteïnase K en onderhouden 's nachts bij 55 ° C. Om te stoppen met de reactie, leg de monsters bij 96 ° C gedurende 5 min.
- 2% agarose gel TBE buffer bereiden en Voeg 20 µL van nucleïnezuur vlek met behulp van standaardtechnieken.
- Voorbereiden dolfijn en runderen sperma DNA-monsters.
- PCR voorbereiding.
- Label PCR sproeibuis(-buizen): dolfijn seriële verdunningen (0.4, 40 en 4 ng/mL), runderen seriële verdunningen (4.000, 400, 40 en 4 ng/mL), homologe boviene embryo van de twee cellen, twee cellen vermoedelijke heterologe embryo's en negatieve controle.
- Bereiden een master mengsel in een steriele 1.5-mL microcentrifuge buis tot een eindvolume van 25 µL per reactie.
- Toevoegen 5 µL van 5 X DNA polymerase flexi buffer, 0,5 µL van dNTPs (10 mM) 1.5 µL van MgCl 2 (25 mM), 0,5 µL voor voorwaartse en omgekeerde primer (10 µM), 1.5 µL van DNA sjabloon (sperma) of 8 µL van DNA sjabloon (twee-cel embryo's) , 0,07 µL van polymerase Taq, en steriel gedistilleerd water tot een eindvolume van 25 µL. Meng goed.
- Amplificatie Protocol
- plaatsen van de buizen in de thermische cycler. Selecteer het volgende programma: 94 ° C gedurende 3 minuten; 40 cycli van 94 ° C voor 15 s, 59 ° C gedurende 25 s, 72 ° C gedurende 20 s; en nog 72 ° C gedurende 5 min. het programma Start.
- Slaan de buizen bij 4 ° C. toevoegen 2.5 µL van het laden van de buffer aan elke PCR product bij 4 ° C en belasting 15 µL van het mengsel in de putten van de 2% agarose gel. Gebruik van een DNA-ladder marker voor de schatting van de nauwkeurige grootte van PCR fragmenten.
- Uitvoeren elektroforese voor 15 min om DNA migratie. Banden met behulp van een UV-illuminator gevisualiseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle de resultaten, tabellen en figuren (1 en 2) die hier werden gereproduceerd met toestemming3.
Dolfijn spermacellen hebben hoge beweeglijkheid na bevriezen en ontdooien
De bevroren-ontdooid dolfijn ejaculeert toonde percentages (% ± SD) 84.5 ± 5.3 totaal motile en 69.1 ± 5.1 progressieve motile spermacellen. Deze nummers zijn in termen van de motiliteit, vertegenwoordiger van kwalitatief hoogwaardige cryopreserved spermacellen.
Dolfijn spermacellen zijn geschikt voor indringende zona intact boviene eicellen en de embryo's produceren hybride
Figuur 1A en tabel 1 Toon dolfijn spermacellen gekoppeld aan de boviene ZP na 2,5 h co incubatietijd. Dolfijn spermacellen waren verbonden op een hoger percentage dan runderen spermacellen (figuur 1B en tabel 1). Inderdaad, fluorescentie microscopie blijkt dat dolfijn spermacellen kunnen penetreren zona intact boviene spermacellen (Figuur 1 c), wat leidt tot de vorming van de pronuclear en decolleté (1E figuur en tabel 1). Dit werd bevestigd door confocale microscopie (Figuur 1 d en figuur 1F). Geen polyspermy werd waargenomen in eicellen van de heterologe IVF-groep na 12u co incubatietijd (tabel 1). Pronuclear formatie in het heterologe IVF bereikte het hoogste percentage bij 24 h, een langere tijd dan in de homologe groep, die zich hebben voorgedaan bij 18 h co incubatietijd (tabel 1). Het decolleté tempo 48u na incubatie was lager in de heterologe dan de homologe IVF (tabel 1). Een spontane ongeslachtelijke activering tarief van 8,0% werd waargenomen in runderen gerijpte onbevruchte eicellen op 48 uur (tabel 1).
Ten slotte de PCR-resultaten bevestigd van de aanwezigheid van genetisch materiaal van de dolfijn in de hybride embryo's (Figuur 3) door de aanwezigheid van een dolfijn referentie-gen dat voor de ribosomal 18 S codeert te evalueren eiwit (Figuur 2).
Figuur 1: Dolphin spermacellen gekoppeld aan de runderen zona zitten (ZP). Bijgevoegde dolphin (A) en runderen (B) spermacellen na 2,5 uur van co incubatie met zona intact boviene eicellen. Gameten werden gekleurd met Hoechst en gevisualiseerd onder fase contrast Microscoop (40 X vergroting). Een dolfijn spermacellen in de ruimte van de periviteline van een boviene oöcyt (C en D) en een decondensing dolfijn sperma hoofd in het cytoplasma van de boviene oöcyt (E). Beelden werden gevangen onder een confocal microscoop en corresponderen met de evenaar van de vermoedelijke zygote (Hoechst kleuring; 40 X vergroting). Twee pronuclei (F) waargenomen onder een fasecontrastmicroscoop na 24 h van heterologe IVF, bestaande uit de co incubatie van dolfijn spermacellen met zona intact boviene eicellen (Hoechst kleuring; 40 X vergroting; Schaal bar = 25 µm). Het cijfer was gereproduceerd vanaf referentie3 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger elektroforese (2% agarose gel ethidiumbromide gekleurd) de PCR versterking resultaten voor het 18 S dolfijn gen. Rijstroken 1 tot en met 30 Toon vermoedelijke dolfijn/runderen Hybride embryo's; rijstroken S1 en S2 beschikken over 4 ng/mL en 0.4 ng/mL dolfijn sperma DNA, respectievelijk; en rijstroken C1 tot en met C5 beschikken over twee-cel runderembryo's en H2O (water) (de blanco-controle). De pijl geeft de band van de 190-bp overeenkomt met de versterkte 18 S rDNA. Het cijfer was gereproduceerd vanaf referentie3 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: representatieve beelden van hybride embryo's. Representatief beeld van een twee-cel Hybride embryo (A) op 48 uur incubatie (Hoechst kleuring; 40 X vergroting). Onbevlekt Hybride embryo's op 48 uur incubatie, in verschillende stadia van de divisie, gevisualiseerd onder de stereomicroscoop (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Tabel 1: tarieven van bijlage, polyspermy, pronuclear formatie en decolleté na homologe en heterologe co incubatie met boviene oöcyten en runderen of dolfijn spermacellen, respectievelijk. Variabelen werden geanalyseerd met ANOVA (Kruskal-Wallis en Mann-Whitney-test). De waarden worden uitgedrukt als de gemiddelde ± SEM (bereik) van twaalf replicatieonderzoeken; n = het totale aantal eicellen of vermoedelijke zygoten onderzocht. De tabel werd gereproduceerd van referentie3 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor veel verschillende soorten zoogdieren zijn er verschillende voordelen aan het gebruik van bevroren-ontdooid sperma. Het gaat hierbij om de mogelijkheid om de overdracht van waardevol genetisch materiaal, het potentieel voor wereldwijde distributie, het geringe risico van verontreiniging en het vermogen om te bewaren van mannelijke gameten voor decennia. Het gebruik van cryopreserved sperma is essentieel voor de Tuimelaar, want deze soort is beschermd op grond van bijlage II van CITES, waardoor het transport en de uitwisseling van dieren tussen verschillende aquatische parken wordt beperkt. Dolfijnen vervoer is een activiteit die leidt logistieke problemen en gevaarlijke risico's tot. Afzien van het te vervoeren heeft echter ook gevolgen, zoals het risico van de invoering van bloedverwantschap een gevangenschap populatie van dieren. Een oplossing is de cryopreservatie van sperma. Sommige auteurs hebben dolfijn sperma5,7,8,9, cryopreserved met zeer bemoedigende resultaten. Bovendien was de eerste geboorte van een kalf van de dolfijn bedacht door kunstmatige inseminatie met sperma van de cryopreserved in 2005 gerapporteerde10. Enkele jaren later, werd dit gedaan met behulp van seks-gesorteerd op spermatozoa11.
Dolfijn sperma hebben zijn cryopreserved met behulp van verschillende technieken, van geavanceerde methoden, zoals een programmeerbare vriezer5, om veelgebruikte methoden, zoals droogijs12 of vloeibare stikstof dampen2,9, 13. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van droogijs of vloeibare stikstof dampen is de mogelijkheid om te cryopreserve op dezelfde locatie waar het sperma is gewonnen, zonder het gebruik van zeer gespecialiseerde apparatuur. Sperma bevroren in de rietjes op polystyreen in vloeibare stikstof dampen is een eenvoudige, snelle en goedkope methode13. In de praktijk toen deze methode heeft geweest tweedehands voort dolfijnen, de beweeglijkheid van de zaadcellen 65%. Het is echter belangrijk om te overwegen hoe moeilijk het is een gestandaardiseerde methode vast te stellen: de techniek kan worden beïnvloed door externe factoren, zoals temperatuur, vochtigheid, polystyreen grootte, enz. Dus verdere zijn studies nodig om te optimaliseren en standaardiseren van de procedure ter verbetering van het succes van het gebruik van sperma met de methode van de damp vloeibare stikstof bevroren.
Oog op het optimaliseren van een bevriezing protocol, is het belangrijk een betrouwbare methode voor de functionele beoordeling van de spermacellen te ontwikkelen. IVF is een goede manier van het testen van het sperma potentieel voor bevruchting. Idealiter, dolfijn eicellen moeten worden gebruikt voor IVF, maar de moeilijke en moeizame procedures die nodig zijn voor het verkrijgen van eicellen van vrouwen vertegenwoordigen een belangrijke beperking. Daarom is de mogelijkheid van het gebruik van heterologe IVF opent een nieuw middel voor het testen van de efficiëntie van de bemesting in de dolfijn. Eicellen van andere diersoorten kunnen worden gebruikt voor heterologe dolfijn IVF. Uit de resultaten blijkt dat heterologe IVF tussen runderen oöcyten en dolfijn spermacellen kan worden uitgevoerd. Bevroren en ontdooide dolfijn spermacellen kunnen penetreren de intacte boviene oöcyt zona en genereren een hybride embryo.
De getoonde combinatie van protocollen voor het verzamelen, bevriezen-ontdooien en heterologe IVF met boviene eicellen uit te voeren met succes zijn aangetoond en vormt een eerste stap voor de optimalisering van de cryopreservatie en de evaluatie van Dolfijn sperma. Het is belangrijk op te merken dat er nog steeds veel onbekenden in deze procedures. Echter de mogelijkheid om cryopreserve dolfijn sperma maakt het toegankelijk en in staat stelt om in laboratoria worden gehouden. Dit zal vergemakkelijken wetenschappelijke studies en kan leiden tot een beter begrip van de fysiologie, de samenstelling en de werking van spermacellen.
De evaluatie van de sperma door heterologe IVF de optimalisatie van de bevriezing protocollen kan verlichten, maar het kan ook in de toekomst worden gebruikt om te testen en selecteer mannetjes voor vruchtbaarheid efficiëntie. Een belangrijke overweging is de relatie tussen echte bevruchting getallen en heterologe IVF-waarden. Bovendien, en als gevolg van de nieuwheid van heterologe IVF tussen deze twee fylogenetisch verre soorten, runderen en dolfijn, kunnen nieuwe biologische hypothesen worden gebouwd. Over het geheel genomen is deze protocollen open een nieuwe ruimte voor onderzoek naar de reproductie van de dolfijnen en andere zeezoogdieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
zijn werk werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van economie en concurrentie (AGL2015-70140-R naar D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan en J. F. Pérez-Gutiérrez en Seneca Stichting van Murcia (Grant 20040/kiem/16 naar F. García-Vázquez)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FERT-TALP medium | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 | |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H | |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| Taq polymerase | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | ||
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | ||
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | ||
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | ||
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software | |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | ||
| Microcentrifuge tubes | VWR | ||
| UV iluminator | Bio-Rad | ||
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
