Summary
Här presenterar vi protokoll som framgångsrikt har använts för dolphin spermier insamling, frysförvaring och heterologa IVF prestanda med nötkreatur oocyter.
Abstract
Användning av frysförvarade dolphin spermier underlättar utbyte av genetiskt material mellan vattenparker och gör spermier tillgänglig för laboratorier för studier för att ytterligare vår förståelse av marina däggdjur reproduktion. Heterologa IVF, en ersättning för homologa IVF, kan vara ett medel att testa spermier fertilitet potentiella; att studera gamet fysiologi och tidig embryo utveckling. och för att undvika användning av värdefull dolphin oocyter, som är svårt att få. Här presenterar vi protokoll som framgångsrikt har använts för att samla och frysa dolphin spermier. Insamling av sperma utförs genom manuell stimulering på utbildade delfiner. Frysförvaring sker med hjälp av en TRIS äggula-baserat extender med glycerol. Dessutom presenterar vi ett protokoll som beskriver heterologa IVF med dolphin spermier och bovin oocyter och som verifierar hybridkaraktär resulterande embryot med PCR. Heterologa befruktning väcker frågor om gödsling och kan användas som ett verktyg för att studera gamet fysiologi och tidiga embryoutvecklingen. Dessutom visar heterologa IVF framgång potentialen för denna teknik för att testa dolphin spermier gödsling kapacitet, vilket är värt ytterligare granskning.
Introduction
Assisterad befruktning är dåligt utvecklade i vilda djur, inklusive marina däggdjur. Avsaknaden av känsliga metoder för att bedöma spermier gödsla framgång bidrar till den långsamma utvecklingen av reproduktiva tekniker i arter som delfiner. Det var inte förrän nyligen att nyskapande grundparametrarna för flasknosdelfinen (Tursiops truncatus) var rapporterade1,2. Men ger variabler såsom motilitet och morfologi, även om ofta används, begränsad information om reproduktiv effektivitet. Den bästa indikatorn på spermiernas kvalitet är utvärderingen av gödning potential.
Nyligen har använde vår grupp en metod för att bedöma dolphin spermier gödsling potential genom att bedöma manliga pronukleär bildning och/eller hybrid embryo bildas efter heterologa IVF med zona intakt nötkreatur oocyter3. Användning av dolphin-nötkreatur heterologa IVF har viktiga fördelar över homologa IVF, som övervinner den svårigheten att få dolphin oocyter och underlättar användningen av väl beprövad i vitro nötkreatur oocyt mognad system. För att undvika arter specificitet, utförs generellt heterologa befruktning i avsaknad av ZP. Även om det låter för utvärdering av de akrosomen-reagerade spermier förmåga att smälta samman med det vitelline membranet, försämrar det utvärderingen av andra funktioner relaterade till befruktning. Proceduren använder zona intakt oocyter och medger utvärdering av följande parametrar: spermier zona bindande och fastsättning, penetration, polyspermy, pronukleär bildning och hybrid embryo klyvning.
Här presenterar vi flera protokoll för spermier samling, grundläggande spermier analys, spermier frysning samt utvärdering av dolphin spermier funktionaliteten genom att bedöma manliga pronukleär eller hybrid embryo bildas efter heterologa IVF med zona intakt bovin oocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etik uttalande: alla experimentella procedurer har granskats och godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén av Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Alla experiment utfördes i enlighet med guiden för skötsel och användning av försöksdjur, som antogs av samhället för studie av reproduktionen och att djurskyddslagen för vård av marina däggdjur.
1. dolphin spermier insamling och frysförvaring
- beredning
- göra FERT medium (heparin - och hypotaurine-free). Förbereda FERT-TALP medium kompletteras med 25 mM bikarbonat, 22 mM natrium laktat, 1 mM natrium pyruvat, 6 mg/mL fettsyra-fri BSA och 10 mg/mL heparin (pH 7,4).
Obs: Förbereda detta medium på dagen för användning och förvara den i 38,5 ° C, under en atmosfär av 5% CO 2, och i luften med maximal luftfuktighet för minst 2 h innan användning. - Förbereda TRIS ägg äggula-baserad buffert. Upplösa 30.28 redov Tris, 16.75 HB citronsyra, 12,5 g/L fruktos och 0,5 g/L streptomycin i ultrarent vatten (pH 7,3, osmolalitet = 310 mOsm/kg). Lägg till 20% äggula (v/v).
- göra FERT medium (heparin - och hypotaurine-free). Förbereda FERT-TALP medium kompletteras med 25 mM bikarbonat, 22 mM natrium laktat, 1 mM natrium pyruvat, 6 mg/mL fettsyra-fri BSA och 10 mg/mL heparin (pH 7,4).
- Tåg en beprövad avel manliga flasknosdelfin att ligga i dorsala recumbence nära kanten av poolen för frivilliga seminstation.
Obs: Manliga delfinen bör utbildas över 6 månader av positiv förstärkning, som tidigare beskrivits 4. - Utför olika taktil stimuli genom att försiktigt trycka på genitala spåret av dolphin cranial området att framkalla frivilliga extrudering av penis från genitala spåret.
- Efter att uppnå en fullständig erektion, direkt penis spetsen i en steril behållare att erhålla ejakulat.
- Behålla sperma provet vid 37 ° C tills analysen. Upprepa steg 1.3 och 1.4 för successiva ejakulat samlingar, med en ny propen glas varje gång.
- Omedelbart efter samlingen, bestämma volymen med en graderad glas cylinder tidigare värmas till 37 ° C. utvärdera färg, pH och osmolaritet (med en mikro-osmometer) av ejakulat.
- Att utvärdera koncentrationen av spermier i ejakulatet, Lägg till 10 µL av den sperma suspensionen till ett eppendorf rör innehållande 90 µL destillerat vatten. Att bestämma spermiekoncentration med hjälp av en spermier räkna kammare.
Obs: Under utvärderingen, hålla resten av ejakulat vid 37 ° C. - Utvärdera parametrarna motilitet.
- Ta 10 µL av sperma provet och placera den i en pre värmde spermier kammare.
- Utvärdera det motilitet som använder en datorstödd spermier analyssystem, tidigare validerad för flasknosdelfinen, att objektivt bedöma den spermier motilitet 2.
Obs: Vid behov, späd sperma provet med FERT medium (heparin - och hypotaurine-fri) för adekvat visualisering av spermierörlighet. Under utvärderingen, upprätthålla provet vid 37 ° C på en uppvärmd Mikroskop scenen.
- Ta 20 µL av sperma prov och utvärdera lönsamhet och spermier morfologi som tidigare beskrivits 5.
- Överföra sperma provet till ett centrifugrör. Centrifugera sperma provet vid 250 x g i 5 min. Efter att bestämma spermiekoncentration med hjälp av en räknande, justera spermiekoncentration till 400 x 10 6 spermier/mL.
Obs: Vid behov, späd det koncentrerade extraktet från de koncentrerade får utlösning med isolerade seminalplasma från en överskottet av samma ejakulat genom centrifugering (250 x g, 10 min).- Under loppet av 5 min, långsamt utspädd sperma prov 1:1 (v/v) med TRIS ägg äggula-baserad buffert innehållande 1,5% glycerol. Placera röret med spermier suspension vid 5 ° C för 1 h 30 min.
- Utför en andra utspädning av spermier fjädringen med en TRIS ägg äggula-baserad buffert som innehåller glycerol för att få en 3% slutliga glycerol koncentration och en slutlig koncentration på 200 x 10 6 spermier/mL. Upprätthålla spermier suspensionen vid 5 ° C i 10 min.
- Ladda spermier suspensionen i 0,25 mL strån. Värmeförseglings stråna. Stråna i en rack 4,5 cm ovanför flytande kväve för 10 min. störta sugrören i det flytande kvävgasen och lagra tills utvärdering.
2. Heterologa In Vitro befruktning med hjälp av Zona intakt nötkreatur oocyter
- beredning
- Förbered färgningen lösning och monteringsmedium.
- Förbereda Hoechst stamlösning av upplösning 1 mg av Hoechst i 1 mL destillerat vatten. Göra 30 µL portioner och hålla dem i mörker vid-20 ° C fram till användning. Förbereda färglösningen genom att lägga till 25 µL av Hoechst stamlösning 5 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) kompletteras med 1 g/L PVA. Blanda väl och hålla i mörker vid 4 ° C fram till användning.
- Förbered monteringsmedium genom att blanda 6,25 mL PBS med 6,25 mL glycerol och 6,25 µL av Hoechst stamlösning. Blanda väl och hålla i mörker vid 4 ° C fram till användning.
- Förbereda medium för äggcell insamling och in vitro- fertilisering.
- Förbereda saltlösning genom att tillsätta 0,5 mL gentamycin till 0,9% NaCl destillerat vatten.
- Förbereda lager mognad mediet genom att lägga 10 ng/mL epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 10% fetalt kalvserum (FCS) till 10 mL TCM-199. Upprätthålla båda medier vid 38,5 ° C, under en atmosfär av 5% CO 2, och i luften med maximal luftfuktighet för minst 2 h innan användning.
- Förbered färgningen lösning och monteringsmedium.
- Samla äggstockarna på slakteriet i saltlösning vid 33-35 ° C och transportera dem till laboratoriet inom 4 h från samling.
- En gång i laboratoriet, tvätta äggstockarna tre gånger att ta bort skräp och blod med koksaltlösning tidigare värmas till 37 ° C. behålla äggstockarna i saltlösning vid 37 ° C under processen.
- Aspirera 2 till 8 mm folliklar med en 18G nål och en 10 mL-spruta. Samla de aspirerade follikulära vätskan i 50 mL rör.
- Tillåt den follikulära vätska som innehåller oocyterna stå i cirka 15 min vid 37 ° C, tills det celler sedimenten. Ta bort supernatanten av röret med en Pasteur-pipett och resuspendera pelleten i PBS.
- Återställa de cumulus-äggcell komplex (COC) i 90 mm rätter under ett stereomikroskop.
- Tvätta COC tre gånger i PBS och en gång i mognad medium.
- Överföra morfologiskt normala COC till 4-väl rätter, varje brunn innehållande 500 mL mognad medium, i grupper om 50 COC per brunn.
Obs: Här, tre brunnar – en brunn för heterologa IVF, en kontroll för homologa IVF och en brunn innehållande endast mognat COC som partenogenetiska kontroll – användes. - Inkubera i COC för 24 h vid 38,5 ° C, under en atmosfär av 5% CO 2 och i luften med maximal luftfuktighet.
- Förbereda mediet och täthetlutningen.
- Att förbereda befruktning medium (FERT), komplettera FERT-TALP medium med 25 mM bikarbonat, 22 mM natrium laktat, 1 mM natrium pyruvat, 6 mg/mL fettsyra-fri BSA och 10 mg/mL heparin. Underhåll vid 38,5 ° C, under en atmosfär av 5% CO 2, och i luften med maximal luftfuktighet för minst 2 h innan användning.
- Förbereda täthetlutningen genom att tillsätta 1 mL täthet lutning medium till en 15-mL tub och 3 mL tvättlösningen till en 15-mL tub. Bibehålla dem vid 38,5 ° C i minst 1 h.
- Tvätta den i vitro mognat oocyter två gånger i FERT medium.
- Överför oocyterna till 4-väl rätter, varje brunn innehållande 50 COC i 250 mL FERT. Underhåll av 4-bra rätter på 38,5 ° C, under en atmosfär av 5% CO 2, och i luften med maximal luftfuktighet medan du förbereder spermier för befruktning.
- Tina frysta halm som innehåller dolphin spermier i ett vattenbad vid 37 ° C för 50 s.
Obs: Tjursperma för homologa IVF måste behandlas parallellt, efter standardprotokollet för homologt bovint IVF. - Ta 10 µL av sperma prov och placera den i en pre värmde spermier räkna kammare. Utvärdera den motilitet som använder en datorstödd spermier analyssystem, tidigare validerad för arten, att objektivt bedöma spermierörlighet. Under denna tid upprätthålla sperma provet vid 38,5 ° C.
- Lägga till sperma provet täthet lutning röret (steg 2.10.2). Centrifugera i 10 min på 250 x g.
- Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en Pasteur-pipett. Tillsätt 3 mL tvättlösningen till röret som innehåller pelleten. Resuspendera pelleten genom att försiktigt blanda.
- Centrifugera under 5 minuter på 250 x g. avlägsna supernatanten med en Pasteur-pipett till en spermier volym på 300 µL.
- Tillsätt 5 µL av spermier suspensionen till en mikrocentrifug innehållande 95 µL destillerat vatten. Upprätthålla spermier fjädringen på 38,5 ° C. Fyll cell räkna kammare med 10 µL av 1:20 spermier utspädning och mäta koncentrationen. Beräkna mängden FERT medium som måste läggas till 100 µL av spermierna att erhålla 2 x 10 6 spermier/mL.
- Lägga till beräknade FERT och sperma volymen i en 15 mL tub och blanda försiktigt med hjälp av en Pasteur-pipett.
- Lägga till 250 µL av den sperma-FERT suspensionen till varje brunn 4-väl skålen som innehåller det FERT mediet med mognat oocyterna att erhålla en slutlig koncentration på 1 x 10 6 spermier/mL.
- Co Inkubera könsceller för 18 h på 38,5 ° C, under en atmosfär av 5% CO 2, och i luften med maximal luftfuktighet.
- Förbereda odlingssubstratet baserat på syntetiska oviductal vätskan kompletteras med 5% FCS. Förbereda 25 µL av syntetiska oviductal vätska kultur droppar i 35-mm rätter täckt med 3 mL av mineralolja. Underhåll vid 38,5 ° C, under en atmosfär av 5% CO 2, och i luften med maximal luftfuktighet för minst 2 h innan användning.
- På 2.5 h post samtidig inkubering, ta bort 20 oocyter från skålen; upprätthålla de återstående oocyterna i inkubatorn på samma villkor.
- Ta bort de löst bifogade spermier genom kraftfullt pipettering hälften av oocyterna genom en smal-bore Pasteur-pipett 10 gånger.
- Fixa de 20 oocyterna i 50 µL 0,5% glutaraldehyd för 30 min. Tvätta oocyterna i PBS för 5 min. överföra oocyterna till 50-µL av Hoechst färglösningen för 15 min och tvätta oocyterna i PBS för 5 min.
- Överför oocyterna individuellt till 2 µL droppar av monteringsmedium med en hastighet av 10 ägg per bild. Försiktigt Täck med ett täckglas och försegla med nagellack.
- Räkna antalet spermier bifogas nötkreatur oocyterna använder ett faskontrastmikroskop utrustad med epifluorescerande optik och en 361 nm excitationsfilter på 40 x förstoring.
- Efter 12 h samtidig inkubering, ta bort 10 presumtiva zygoter från 4-väl rätterna; upprätthålla de återstående presumtiva zygoter i inkubatorn på samma villkor.
- Överföring 10 presumtiva zygoter att en 15 mL Centrifugera röret innehållande 2 mL PBS och vortexa försiktigt i 2 min bort cumulus cellerna. Tvätta två gånger i PBS, fix och fläck, som tidigare beskrivits (steg 2.23.2.)
- Efter 18, 20, 22 och 24 h samtidig inkubering, ta bort 10 presumtiva zygoter från 4-väl rätter och vortex, fixa, och färga dem som tidigare beskrivits (steg 2.23.2). Behålla resten av presumtiva zygoter i inkubatorn under samma betingelser.
- Utvärdera pronukleär bildning och polyspermy i fas-kontrast/epifluorescerande Mikroskop i båda homologa och heterologa IVF grupper genom färgning med Hoechst.
- Utvärdera pronukleär bildning i 10 slumpmässigt valda presumtiva hybrid zygoter per prov. Bekräfta pronukleär bildning under en confocal laserscanning mikroskopet på 488-nm argon laser excitation och 515 till 530 nm detektion.
- Optiskt avsnitt presumtiva zygoter sekventiellt (2 mm) och samla in bilder med hjälp av ett bildprogram. Visualisera ett 3D analys programvara paket.
- Efter 24 h samtidig inkubering, tvätta 50 presumtiva zygoter fyra gånger i PBS och två gånger i odlingsmedium.
- Överföra dem i grupper om 25 till microdroplets av odlingsmedium tidigare beredd och jämviktas.
- Underhåll på 38,5 ° C under en atmosfär av 5% O 2 / 5% CO 2 och i luften med maximal luftfuktighet.
- Efter 26 och 28 h samtidig inkubering, ta bort 10 presumtiva zygoter från rätter och vortex, fix och färga dem, som tidigare beskrivits (steg 2.23.2).
- Efter 48 h av kultur, iaktta klyvning under ett stereomikroskop.
- Ta bort zona pellucida (ZP) genom att överföra embryon till en 5 mg/mL lösning, proteas.
- Tvätta individuellt varje embryo tre gånger i PBS. Snapin-frysa dem i flytande kväve i 0,2 mL mikrocentrifugrör. Lagra dem vid-80 ° C tills analys.
3. PCR
- material och reagens
Obs: de reagenser, material och utrustning som används för att utföra PCR-protokollet beskrivs i tabell av material och inkluderar ett PCR-röret rack och en uppsättning Mikropipetter (P2, P20, P200, P1000), 1,5 mL mikrocentrifugrör, PCR-rör och lock, en termocykel, en UV-lampan, agarosgel och buffert (Tris Borat EDTA (TBE)).- Tina försiktigt alla reagens på is. Behålla dem i is i hela experimentet. Använda deoxinukleotider (dNTP; dATP, dCTP, dTTP och dGTP), rikta grundfärger på referens-gen som kodar för dolphin 18 S ribosomala proteinet (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG och F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA-polymeras, 5 X buffert för DNA-polymeras, DNA-mall, sterilt vatten och magnesiumklorid (MgCl 2 med en slutlig koncentration på 5,0 mM).
- Agaros gel och prov förberedelse.
- Förbered dolphin och nötkreatur spermier DNA prover.
- Tina frysta halm av varje art i ett vattenbad vid 37 ° C för 50 s. Tillsätt 3 mL tvättlösningen. Centrifugera vid 250 x g i 10 min. ta bort supernatanten. Tillsätt 30 µL STES lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; och 1 mM 0,1% SDS), 2 µL av proteinas K (20 mg/mL) och 5 µL Ditiotreitol (DTT); slutlig koncentration: 150 mM. Bibehålla över natten vid 55 ° C. Tillsätt 200 µL av ultrarent vatten. Centrifugera vid 250 x g för 5 min. Håll supernatanten. Mätning av DNA koncentrationen med en spektrofotometer.
- Utföra seriespädningar av DNA från dolphin spermier (dvs. 40, 4 och 0,4 ng/mL) med ultrarent vatten för att kontrollera att villkor som PCR klarar av att upptäcka en liten mängd dolphin DNA.
- Utföra seriespädningar av nötkreatur spermier DNA (dvs, 4 000, 400, 40 och 4 ng/mL) med ultrarent vatten att kontrollera att villkor som PCR kan upptäcka en liten mängd bovint DNA.
- Förbereda dolphin och bovint embryon. Tina embryona på is. Tillsätt 8 µL av 100 µg/mL proteinas K och underhålla över natten vid 55 ° C. För att stoppa reaktionen, placera proverna vid 96 ° C för 5 min.
- Förbereda 2% agaros gel TBE buffert och tillsätt 20 µL av nukleinsyra fläcken med standardtekniker.
- Förbered dolphin och nötkreatur spermier DNA prover.
- PCR-beredning.
- Etikett PCR rör: dolphin seriespädningar (40, 4 och 0,4 ng/mL), nötkreatur seriespädningar (4.000, 400, 40 och 4 ng/mL), homologt bovint två celler embryo, två celler presumtiva heterologa embryon och negativ kontroll.
- Förbereder en master blandning i en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör till en slutlig volym av 25 µL per reaktion.
- Tillsätt 5 µL av 5 X DNA polymeras flexi buffert, 0,5 µL av dNTP (10 mM) 1,5 µL av MgCl 2 (25 mM), 0,5 µL av framåt och bakåt primer (10 µM), 1,5 µL av DNA mall (spermier) eller 8 µL av DNA mall (två celler embryon) , 0,07 µL av Taq polymeras, och sterilt destillerat vatten upp till en slutlig volym 25 µL. Blanda väl.
- Förstärkning protokoll
- Placera rören i termocykel. Välj följande program: 94 ° C för 3 min; 40 cykler av 94 ° C för 15 s, 59 ° C för 25 s, 72 ° C under 20 s; och 72 ° C i 5 min. startar programmet.
- Lagra rören vid 4 ° C. Lägg 2,5 µL lastning buffert till varje PCR-produkten vid 4 ° C och load 15 µL av blandningen i brunnar av 2% agarosgel. Använda en DNA stege markör för exakt storlek uppskattning av PCR-fragmenten.
- Utför elektrofores för 15 min till tillåta DNA migration. Visualiseras band med hjälp av en UV-illuminator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alla resultat, tabeller och figurer (1 och 2) presenteras här återges med tillstånd3.
Dolphin spermier har hög motilitet efter frysning och upptining
De frysta-tinade dolphin får utlösning visade procentsatser (% ± SD) av 84,5 ± 5.3 totala rörliga och 69,1 ± 5.1 progressivt motila spermier. Motilitet sett är dessa siffror representativa för högkvalitativa frysförvarade spermier.
Dolphin spermier klarar av genomträngande zona intakt nötkreatur oocyter och producerande hybrid embryon
Figur 1A och tabell 1 visar dolphin spermier bifogas den bovin ZP efter 2,5 h samtidig inkubering. Dolphin spermier fästes på en högre andel än nötkreatur spermier (figur 1B och tabell 1). Faktiskt, fluorescensmikroskopi visar att dolphin spermier ska kunna penetrera zona intakt nötkreatur spermier (figur 1 c), vilket leder till pronukleär bildning och klyvning (figur 1E och tabell 1). Detta bekräftades av konfokalmikroskopi (figur 1 d och figur 1F). Ingen polyspermy observerades i oocyter från gruppen heterologa IVF efter 12 h samtidig inkubering (tabell 1). Pronukleär bildning i den heterologa IVF nådde den högsta procentsatsen på 24 h, en längre tid än i gruppen homologa, som inträffade vid 18 h samtidig inkubering (tabell 1). Klyvning på 48 h efter inkubation var lägre i den heterologa än den homologa IVF (tabell 1). En spontan partenogenetiska aktiveringen skattesats på 8,0% observerades hos nötkreatur mognat obefruktade äggceller på 48 h (tabell 1).
Slutligen, PCR-resultaten bekräftat förekomsten av dolphin genetiskt material i hybrid embryon (figur 3) genom att utvärdera förekomsten av en dolphin referens gen som kodar för den ribosomal 18 S protein (figur 2).
Figur 1: Dolphin spermier bifogas med nötkreatur zona pellucida (ZP). Bifogade dolphin (A) och nötkreatur (B) spermier efter 2,5 h samtidig inkubering med zona intakt nötkreatur oocyter. Könsceller var fläckade av Hoechst och visualiseras under faskontrastmikroskop (40 X förstoring). En dolphin spermier i periviteline rymden av ett nötkreatur äggcellen (C och D) och en decondensing dolphin spermier huvudet i nötkreatur äggcellen cytoplasman (E). Bilder fångades under en confocal Mikroskop och motsvarar det ekvatoriella-hyvlar av presumtiva zygoten (Hoechst färgning; 40 X förstoring). Två pronuclei (F) observerades i fas kontrast Mikroskop efter 24 h heterologa IVF bestående av samtidig inkubering av dolphin spermier med zona intakt nötkreatur oocyter (Hoechst färgning; 40 X förstoring; Skalstapeln = 25 µm). Siffran var återges från referens3 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa elektrofores (2% agaros gel etidiumbromid målat) visar resultaten PCR-amplifiering för 18 S dolphin genen. Lanes 1 till 30 Visa presumtiva dolphin/nötkreatur hybrid embryon. Lanes S1 och S2 har 4 ng/mL och 0,4 ng/mL dolphin spermier DNA, respektive; och lanes C1 till C5 har två celler nötkreaturembryon och H2O (vatten) (tom kontrollen). Pilen anger 190-bp bandet motsvarar den förstärkta 18 S rDNA. Siffran var återges från referens3 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa bilder av hybrid embryon. Representativ bild av en två-cell hybrid embryo (A) på 48 h för inkubation (Hoechst färgning; 40 X förstoring). Ofärgade hybrid embryon på 48 h för inkubation, i olika skeden av division, visualiseras under stereomikroskopet (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: andelen kvarstad, polyspermy, pronukleär bildning och klyvning efter homologa och heterologa samtidig inkubering med nötkreatur oocyter nötkreatur eller dolphin spermier, respektive. Variabler analyserades med ANOVA (Kruskal-Wallis och Mann-Whitney test). Värdena uttrycks som den medelvärde ± SEM (intervall) för tolv replikat; n = det totala antalet oocyter eller presumtiva zygoter undersökt. Tabellen var återges från referens3 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För många olika däggdjursarter finns det olika fördelar med att använda frysta-tinade spermier. Dessa inkluderar möjligheten att överföra värdefullt genetiskt material, potential för global distribution, den låga risken för kontaminering och förmågan att bevara manliga könsceller i årtionden. Användning av frysförvarade spermier är viktigt för flasknosdelfinen, eftersom denna art är skyddad under Appendix II i CITES, vilket begränsar transport och utbyte av djur mellan olika vattenparker. Delfiner är en aktivitet som skapar logistiska problem och farliga risker. Men har att avstå från att transportera dem också konsekvenser, såsom risken att införa blodsband till en fångenskap population av djur. En lösning är Frysförvaring av spermier. Några författare har fryst tillstånd dolphin spermier5,7,8,9, med mycket uppmuntrande resultat. 2005 var dessutom den första födelsen av en dolphin kalv avlad av artificiell insemination med hjälp av frysförvarade spermier rapporterade10. Några år senare, detta gjordes med hjälp av sex-sorterade spermier11.
Dolphin spermier har varit fryst tillstånd med olika tekniker, från sofistikerade metoder, såsom en programmerbar frys5, gemensamma metoder, såsom torris12 eller flytande kväve ångor2,9, 13. Den största fördelen med att använda torris eller flytande kväve ångor är möjligheten att frysa på samma plats där spermierna utvinns, utan användning av högspecialiserad utrustning. Spermier som frysta i strån på polystyren i flytande kväve ångor är en enkel, snabb och billig metod13. I praktiken, när denna metod har använts på delfiner, var spermiernas rörlighet 65%. Det är dock viktigt att tänka på hur svårt det är att upprätta en standardiserad metod: tekniken kan påverkas av yttre faktorer, såsom temperatur, fuktighet, polystyren storlek, etc. Ytterligare är studier därför nödvändigt att optimera och standardisera förfaranden för att förbättra framgång med hjälp av spermier frysas med flytande kväve vapor metoden.
För att optimera en frysning protokoll, är det viktigt att utveckla en tillförlitlig metod för funktionell bedömning av spermier. IVF är ett bra sätt att testa spermierna potential för befruktning. Idealiskt, dolphin oocyter bör användas för IVF, men de svåra och mödosamma förfaranden som krävs för att erhålla oocyter från hondjur representerar en viktig begränsning. Därför öppnar möjligheten att använda heterologa IVF ett nytt sätt att testa befruktning effektivitet i delfinen. Oocyter från andra arter kan användas för heterologa dolphin IVF. Resultaten visar att heterologa IVF mellan nötkreatur oocyter och dolphin spermier kan utföras. Frysta och upptinade dolphin spermier kan tränga igenom de zona intakt nötkreatur äggcellen och generera en hybrid embryo.
Presenterade kombinationen av protokoll för insamling, frysa-upptining och utföra heterologa IVF med nötkreatur oocyter har påvisats framgångsrikt och utgör ett första steg för optimering av frysförvaring och utvärderingen av Dolphin spermier. Det är viktigt att notera att det fortfarande finns många okända faktorer i dessa förfaranden. Dock möjlighet att frysa dolphin sperma gör den tillgänglig och gör att den kan hållas i laboratorier. Detta kommer att underlätta vetenskapliga studier och kan leda till en bättre förståelse för den fysiologi, sammansättning och funktion av spermier.
Utvärdering av spermier genom heterologa IVF kan lindra optimering av protokollen frysning, men det kan också användas i framtiden att testa och välj hanar för fertilitet effektivitet. En viktig faktor är förhållandet mellan verkliga befruktning tal och heterologa IVF värden. Dessutom, och på grund av nyheten av heterologa IVF mellan dessa två fylogenetiskt avlägsen arter, nötkreatur och Delfin, kan nya biologiska hypoteser byggas. Sammantaget öppna dessa protokoll ett nytt utrymme för forskning på reproduktion av delfinen och andra marina däggdjur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
hans arbete finansierades av det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (AGL2015-70140-R till D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan och J. F. Pérez-Gutiérrez och Seneca Foundation i Murcia (Grant 20040/GRODDAR/16 till F. García-Vázquez)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FERT-TALP medium | Merck | ||
| TCM-199 | Sigma | M-4530 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 | |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 | |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 | |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 | |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H | |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H | |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A | |
| MB agarose | Biotools | 20.012 | |
| Taq polymerase | Promega | ||
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A | |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | ||
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | ||
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | ||
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | ||
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | ||
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | ||
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | ||
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software | |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | ||
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | ||
| Microcentrifuge tubes | VWR | ||
| UV iluminator | Bio-Rad | ||
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
