Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55237

Summary

Burada, Yunus sperm toplama, dondurma ve sığır yumurta kullanarak kapaklı tüp bebek performansı için başarılı bir şekilde kullanılmıştır protokolleri mevcut.

Abstract

Cryopreserved yunus sperm kullanımı su parkları arasında genetik malzeme alışverişini kolaylaştırır ve sperm hücreleri laboratuarlar anlayışımız Deniz memelileri üreme daha ileri çalışmalar için hale getirmektedir. Kapaklı tüp bebek, yerine homolog tüp bebek, sperm doğurganlık potansiyel test etmek için bir araç sağlayabilir; çalışma gamet fizyolojisi ve erken embriyo gelişimi için; ve elde etmek zordur değerli yunus yumurta kullanmaktan kaçının. Burada, başarılı bir şekilde toplamak ve yunus sperm elde cryopreserve için kullanılmış olan protokolleri mevcut. Sperm toplama eğitimli yunuslar üzerinde el ile stimülasyon tarafından gerçekleştirilir. Dondurma TRIS yumurta sarısı dayalı extender gliserol ile kullanılarak yapılır. Buna ek olarak, biz bir protokolü kapaklı tüp bebek yunus sperm hücreleri ve sığır yumurta kullanarak açıklar ve PCR kullanarak elde edilen embriyo hibrid doğası doğrular mevcut. Kapaklı döllenme fertilizasyon tarih soruları yanıtlayan ve çalışma gamet fizyolojisi ve erken embriyo gelişimi için bir araç olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, kapaklı tüp bebek başarı daha fazla muayene olan kapasitesi, gübreleme yunus sperm test etmek için bu teknik potansiyelini gösterir.

Introduction

Yardımlı üreme teknikleri kötü vahşi hayvanlar, Deniz memelileri de dahil olmak üzere geliştirilir. Hassas yöntemler sperm Gübreden başarı değerlendirmek için eksikliği yunus gibi türlerin üreme teknolojileri yavaş gelişmesine katkıda bulunur. Yakın zamana kadar şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) temel seminal parametreler bildirilen1,2vardı değildi. Ancak, hareketliliği ve Morfoloji, gibi değişkenler her ne kadar yaygın olarak kullanılan, üreme verimliliği hakkında sınırlı bilgi verir. En iyi sperm kalitesini Gübreden potansiyeli değerlendirme göstergesidir.

Son zamanlarda, bizim grup erkek pronuclear oluşumu ve/veya melez embriyo oluşumu zona olduğu gibi sığır yumurta3kullanarak kapaklı tüp bebek sonra değerlendirme tarafından potansiyel gübreleme yunus sperm değerlendirmek için kullanılan bir yöntem. Yunus-sığır kapaklı tüp bebek gibi yunus yumurta elde etme zorluk üstesinden homolog IVF, önemli avantajları vardır ve iyi sınanmış vitro sığır oosit olgunlaşma sistemlerinin kullanımı kolaylaştırır. Türler Özgüllük önlemek amacıyla, kapaklı fertilizasyon genellikle ZP olmaması durumunda gerçekleştirilir. Her ne kadar vitelline membran ile sigorta yeteneği acrosome tepki sperm değerlendirilmesi için sağlar, gübreleme için ilgili diğer özelliklerin değerlendirilmesi bozar. Açıklanan yordamı zona sağlam yumurta kullanır ve izni aşağıdaki parametrelerin değerlendirilmesi: sperm zona bağlama ve eki, penetrasyon, polyspermy, pronuclear oluşumu ve Melez embriyo bölünme.

Burada, çeşitli protokoller sperm toplama, temel sperm analizi, sperm dondurma yanı sıra yunus sperm işlevselliği değerlendirilmesi için kapaklı tüp bebek sonra erkek pronuclear ve/veya melez embriyo oluşumu değerlendirmek tarafından zona olduğu gibi kullanarak mevcut sığır yumurtalar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

etik beyanı: deneysel yordamları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INİA) kullanım Komitesi tarafından onaylanmış. Üreme çalışma için ve Deniz memelileri bakımı için hayvan refah Yasası için toplum tarafından kabul edilen Kılavuzu uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları, Bütün deneyler yapıldı.

1. Yunus Sperm toplama ve dondurma

  1. hazırlık
    1. FERT yapmak orta (heparin-hypotaurine-özgür ve). 25 mM bikarbonat, sodyum laktat 22 mM, 1 mM sodyum pyruvate, 6-mg/mL yağ asidi içermeyen BSA ve 10 mg/mL heparin (pH 7,4) ile FERT-TALP orta hazırlayın.
      Not: Bu orta kullanım gününde hazırlamak ve % 5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de devam.
    2. Hazırlamak TRIS yumurta sarısı tabanlı arabellek. 30.28 g/L Tris, 16.75 g/L sitrik asit, 12,5 g/L fruktoz ve 0.5 g/L streptomisin ultrasaf su dağıtılması (pH 7.3, osmolalite = 310 mOsm/kg). % 20 yumurta sarısı (v/v) ekleyin.
  2. Havuzun kenarına gönüllü sperm koleksiyonu için yakınındaki dorsal recumbence yalan söylemek bir kanıtlanmış damızlık erkek şişe burunlu yunus tren.
    Not: Erkek yunus 6 ay mutlak güçlendirme tarafından eğitilmesi daha önce 4 açıklandığı gibi.
  3. Penis genital groove üzerinden gönüllü ekstrüzyon temin için hafifçe yunus genital oluk kafatası alan üzerine basarak çeşitli dokunsal elektrodlar gerçekleştirmek.
  4. Tam bir ereksiyon elde sonra penis ucu steril bir kap içine boşalmak edinmek için doğrudan.
  5. Sperm örneği 37 ° C'e kadar analiz korumak. 1.3 1.4 her seferinde yeni bir propilen cam kullanarak birbirini izleyen boşalmak koleksiyonları için aygıtlarından.
  6. Hemen toplandıktan sonra daha önce 37 ° C. değerlendir rengi, pH ve (bir mikro-osmometer kullanarak) Osmolarite boşalmak ısındı mezun cam silindir kullanarak birimi belirlemek.
  7. Ejakülatta sperm konsantrasyonu değerlendirmek için
  8. 90 µL distile su içeren bir eppendorf tüp sperm süspansiyon 10 µL ekleyin. Bir sperm odası sayma kullanarak sperm konsantrasyonu belirlemek.
    Not: değerlendirme sırasında boşalmak kalanı 37, tutmak ° C.
  9. Motilite parametreleri değerlendirmek.
    1. 10 µL sperm örneği alıp Önceden ısıtılmış sperm odasında yerleştirin.
    2. Motilite sperm hareketliliği 2 objektif değerlendirmek için daha önce şişe burunlu yunus için doğrulanmış bir bilgisayar destekli sperm analizi sistemi kullanarak değerlendirmek.
      Not: gerekirse, sperm örneği ile FERT orta (heparin ve hypotaurine-içermeyen) sperm motilitesi yeterli görselleştirme için oranında seyreltin. Değerlendirme sırasında örnek 37 ° C'de ısıtılmış mikroskop sahneye korumak.
  10. 20 µL sperm örneği alıp canlılığı ve sperm morfolojisi yukarıda açıklanan 5 olarak değerlendirmek.
  11. Sperm örnek bir santrifüj tüpü aktarın. Sperm örneği 5 min için 250 x g'santrifüj kapasitesi. Sonra bir sayım odası kullanarak sperm konsantrasyonu belirlemek, 400 x 10 6 sperm hücreleri/ml sperm konsantrasyonu ayarlayın.
    Not: gerekirse, yoğun cinsel ilißki üzerinden Pelet aynı boşalmak aşırı bir biriminden izole seminal plazma ile Santrifüjü tarafından (250 x g, 10 dk) oranında seyreltin.
    1. 5 dk boyunca, yavaş yavaş seyreltik sperm 1:1 (v/v) % 1.5 gliserol içeren bir TRIS yumurta sarısı tabanlı bir arabellek ile örnek. 1 h 30 dk. 5 ° C'de sperm süspansiyon içeren tüp yer
    2. Gerçekleştir sperm süspansiyon bir TRIS ile ikinci bir seyreltme yumurta sarısı tabanlı arabellek içeren gliserol %3 son gliserol konsantrasyon ve 200 x 10 6 sperm/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için. 10 dakika süreyle 5 ° C'de sperm süspansiyon korumak
  12. Sperm süspansiyon 0.25 mL payet yük. Payet ve. Bir rafa 4,5 cm yukarıda 10 dakika süreyle sıvı azot payet payet sıvı azot Dalma ve mağaza kadar değerlendirme yer.

2. Kapaklı In Vitro fertilizasyon kullanarak Zona olduğu gibi sığır yumurta

  1. hazırlık
    1. boyama hazırla çözüm ve montaj orta.
      1. Hazırlamak Höchst hisse senedi çözüm Höchst 1 mg 1 mL distile su içinde eriterek tarafından. 30 µL aliquots yapmak ve onları kadar kullanmak-20 ° C'de karanlıkta bırakın. Boyama çözüm fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 g/L ile PVA takıma 5 ml 25 µL Höchst hisse senedi çözüm ekleyerek hazırlayın. Mix iyi ve 4 ° c kadar kullanmak anlatmamanı.
      2. PBS 6.25 mL 6.25 mL gliserol ve 6.25 µL Höchst hisse senedi çözüm ile karıştırma tarafından montaj orta
      3. hazırla. Mix iyi ve 4 ° c kadar kullanmak anlatmamanı.
    2. Orta yumurta toplama ve vitro fertilizasyon için hazırlamak.
      1. Tuzlu çözüm viomisin 0.5 mL % 0,9 NaCl distile su ekleyerek hazırlayın.
      2. Hisse senedi olgunlaşma orta TCM-199 için 10 mL 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) ve % 10 fetal buzağı serum (FCS) ekleyerek hazırlayın. Her iki medya % 5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de korumak.
  2. 33-35 ° c tuzlu çözüm mezbahada, yumurtalık toplamak ve onları 4 h içinde laboratuvar koleksiyonundan taşıma.
  3. Bir kez laboratuvarda, yumurtalık üç kez yıkayın enkaz kaldırmak ve daha önce 37 için sıcak tuzlu çözüm kullanarak kan ° C. korumak için yumurtalıkların 37 ° C'de tuzlu çözüm sürecinde.
  4. Aspire edin 2-8 mm köklerinin 18G ile iğne ve 10 mL şırınga. 50 mL tüpler emişli foliküler sıvı toplamak.
  5. Yaklaşık 15 dakika 37 ° C'de hücreler tortu kadar durmak için yumurta içeren foliküler sıvı izin. Pasteur pipet ile tüp süpernatant kaldırmak ve Pelet PBS içinde yeniden askıya alma.
  6. Bir stereomicroscope altında 90 mm yemeklerinde kümülüs oosit kompleksleri (COCs) kurtarmak.
  7. COCs üç kez PBS ve bir kez olgunlaşma orta yıkayın.
  8. Morfolojik normal COCs 4-iyi yemekleri, her şey iyi başına 50 COCs gruplar halinde olgunlaşma orta 500 mL içeren transfer.
    Not: Burada, üç kuyuları – kapaklı tüp bebek, homolog IVF için iyi bir kontrol ve bir de yalnızca içeren bir iyi olgunlaşmış COCs parthenogenetic kontrol olarak – kullanılmıştır.
  9. COCs % 5 CO 2 ve maksimum nem ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de 24 h için kuluçkaya.
  10. Orta ve yoğunluk gradient hazırlayın.
      Gübreleme orta (FERT) hazırlamak, 25 mM bikarbonat, sodyum laktat 22 mM, 1 mM sodyum pyruvate, 6 mg/mL yağ asidi içermeyen BSA ve 10 mg/mL heparin ile FERT-TALP orta tamamlamak için
    1. . %5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de korumak.
    2. Yoğunluğu degrade orta 15 mL tüp ve çözüm için bir 15 mL tüp yıkama 3 mL 1 mL ekleyerek yoğunluğu degrade hazır olun. Onları korumak için en az 1 h. 38,5 ° C'de
  11. Yıkama vitro olgunlaşmış FERT ortamda iki kez yumurta.
  12. Yumurta 4-iyi yemekleri, her FERT 250 ml 50 COCs de içeren transfer. 4-iyi yemekler %5 CO 2 ve maksimum nem ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de gübreleme için sperm hazırlarken korumak.
  13. Donmuş bir saman 50 37 ° C'de bir su banyosunda yunus sperm hücreleri içeren çözülme s.
    Not: Sığır meni homolog IVF için paralel, homolog sığır IVF için standart protokol sonrası işlenmelidir.
  14. Al 10 µL sperm örnek ve Önceden ısıtılmış bir sperm odası sayma yerleştirin. Motilite sperm motilitesi objektif değerlendirmek için daha önce türler için doğrulanmış bir bilgisayar destekli sperm analizi sistemi kullanarak değerlendirmek. Bu süre zarfında sperm örneği 38,5'korumak ° C.
  15. Sperm örnek yoğunluk gradient tüp (Adım 2.10.2) ekleyin. 250 x g., 10 dk santrifüj
  16. Dikkatli bir şekilde Pasteur pipet kullanarak süpernatant çıkarın. Pelet içeren tüp 3 mL yıkama çözeltisi ekleyin. Pelet yavaşça karıştırarak yeniden askıya alma.
  17. Santrifüj 250 x g., 5 min için kaldırmak için 300 µL sperm hacmi Pasteur pipet ile süpernatant.
  18. Ekleyin 5 µL sperm süspansiyon için 95 µL distile su içeren bir microcentrifuge. 38,5, sperm süspansiyon korumak ° C. Hücre sayımı dolgu Odası 1:20 10 µL ile sperm seyreltme ve ölçü konsantrasyonu. 2 x 10 6 sperm hücreleri/mL elde etmek için sperm 100 µL eklenmelidir FERT orta tutarını hesaplar.
  19. Hesaplanan FERT ve sperm cilt 15 mL tüp ekleyin ve karışımı yavaşça Pasteur pipet kullanarak.
  20. Ekleyin 250 µL sperm-FERT süspansiyon her şey 1 x 10 6 sperm hücreleri/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için olgunlaşmış yumurta ile FERT orta içeren 4-iyi yemeğin için.
  21. Co gamet 38,5 ° c, % 5 CO 2 ve maksimum nem ile havada bir atmosfer altında 18 h için kuluçkaya.
  22. Sentetik oviductal sıvı %5 FCS ile desteklenen temel kültür orta hazırlayın. 35-mm yemeklerinde 3 mL mineral yağ ile kaplı sentetik oviductal sıvı kültür damlacıkları 25 µL hazırlayın. %5 CO 2 ve en yüksek nem için kullanmadan önce en az 2 h ile havada bir atmosfer altında 38,5 ° C'de korumak.
  23. , 2,5 h sonrası yardımcı kuluçka, 20 yumurta yemek Kaldır; kuluçka aynı koşullar altında kalan yumurta korumak.
    1. Tarafından şiddetle dar geçişli Pasteur pipet ile yumurtalar yarısı 10 kez pipetting gevşek olarak bağlı sperm hücreleri kaldırmak.
    2. 50 µL % 0.5 oxazolidin 30 dk PBS 5 dakika süreyle yumurta Transfer yıkama için 20 yumurta yumurta 50-µL 15dk için Höchst boyama çözümü için tamir ve PBS 5 dakika süreyle yumurta yıkama
    3. Yumurta tek tek slayt başına 10 yumurta oranında montaj orta 2 µL damlacıkları aktarın. Yavaşça kapağı ile bir coverslip ve tırnak cilası ile mühür.
    4. Epifluorescent optik ve 40 x büyütme, 361 nm uyarma filtre ile donatılmış bir faz kontrast mikroskop kullanarak sığır yumurta bağlı sperm hücreleri saymak.
  24. 12 h, co kuluçka sonra 10 meşru zigotları gelen 4-iyi yemekler Kaldır; kuluçka aynı koşullar altında kalan meşru zigotları korumak.
    1. Transfer 10 meşru zigotları 15 mL santrifüj için PBS ve hafifçe 2 min için girdap kümülüs hücreleri kaldırmak için içeren 2 mL tüp. Yıkama iki kez PBS, düzeltme ve leke, daha önce açıklandığı gibi (Adım 2.23.2.)
  25. 18, 20, 22 ve 24 h, co kuluçka, 10 kaldırdıktan sonra 4-iyi yemekler ve girdap, meşru zigotları, düzeltmek ve onları daha önce açıklandığı gibi (Adım 2.23.2) leke. Aynı koşullar altında kuluçka meşru zigotları geri kalanı korumak.
    1. Pronuclear oluşumu ve polyspermy homolog ve kapaklı tüp bebek gruplar halinde bir faz-kontrast/epifluorescent mikroskop altında Höchst ile boyama tarafından değerlendirmek.
    2. Pronuclear örnek başına 10 rasgele seçilmiş meşru hibrid zigotları oluşumunda değerlendirin. 488-nm argon lazer uyarma, mikroskop ve 515-530 nm algılama tarama confocal lazer altında pronuclear oluşumu onaylayın.
    3. Optik meşru zigotları sırayla bölüm (2 mm) ve toplamak bir görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri. 3D analiz yazılım paketi kullanarak görselleştirmek.
    4. , Co kuluçka 24 saat sonra PBS ve kültür orta iki kez 50 meşru zigotları dört kez yıkayın.
  26. 25 gruplar halinde onları kültür daha önce hazırlanan ve equilibrated orta microdroplets için transfer.
  27. Bakım altında bir atmosfer %5 O 2 / %5 38.5 ° C'de CO 2 ve havada maksimum nem ile.
  28. Sonra 26 ve 28 h, co kuluçka, 10 meşru zigotları kaldırmak yemekleri ve girdap, düzeltme ve onları, daha önce açıklandığı gibi (Adım 2.23.2) leke.
  29. Kültür 48 saat sonra bir stereomicroscope altında bölünme gözlemlemek.
  30. 5 mg/mL proteaz çözüm embriyo transfer ederek zona pelusida (ZP) kaldırın.
  31. Tek tek her embriyo PBS içinde üç kez yıkayın. Ek onları 0.2 mL microcentrifuge tüpler içinde sıvı azot kıpırdama. Onları analiz kadar-80 ° C'de depolayın.

3. PCR

  1. malzemeler ve Kimyasalları
    Not: reaktifler, malzemeleri ve aletleri PCR Protokolü gerçekleştirmek için kullanılan malzemeler tablo ayrıntılı ve PCR tüp raf ve MİKROPİPETLER (P2, P20, P200, P1000), bir takım 1,5 mL microcentrifuge tüpler, PCR tüpleri ve kapaklar, termal cycler, UV ışığı, özel jel ve arabellek (Tris Bor EDTA (TBE)).
    1. Yavaşça tüm reaktifler buz çözme. Onları buz deneme boyunca korumak. Deoxynucleotides kullanın (dNTPs; dATP, dCTP, dTTP ve dGTP), hedef referans gen yunus 18 S ribozomal protein (DQ404537.1); için kodlama üzerinde astar R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG ve F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA polimeraz, 5 X arabellek DNA polimeraz, DNA şablon, steril su ve magnezyum klorür (MgCl 2 ' de 5.0 mM son bir konsantrasyon).
    2. Özel jel ve örnek hazırlama.
      1. Hazırla yunus ve sığır sperm DNA örnekleri.
        1. Tezcan 37 ° C'de bir su banyosu içinde her tür donmuş bir saman 50 s., çözüm yıkama 3 mL ekleyin. 10 dakika süreyle santrifüj 250 x g de süpernatant kaldırın. STES lizis arabelleği (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; ve 1 mM % 0,1 SDS), 30 µL eklemek, İndinavir K 2 µL (20 mg/mL) ve dithiothreitol (DTT); 5 µL son konsantrasyonu: 150 mM. Gecede 55 ° C. Ekle 200 µL ultrasaf su korumak. 5 dakika süreyle santrifüj 250 x g de süpernatant tutun. Bir Spektrofotometre kullanarak DNA toplama ölçmek.
      2. Seri dilutions DNA PCR koşulların yeteneğine sahip olduğunu kontrol etmek için ultrasaf su ile yunus sperm hücreleri (Yani, 40, 4 ve 0,4 ng/mL) gerçekleştirmek Yunus DNA az miktarda tespit.
      3. Sığır Sperm DNA (Yani, 4000, 400, 40 ve 4 ng/mL) PCR koşulların sığır DNA'ın küçük bir miktar algılama yeteneğine sahip olduğunu kontrol etmek için ultrasaf su ile seri dilutions gerçekleştirmek.
      4. Yunus ve sığır embriyoları hazırlayın. Embriyo buz çözme. 100 µg/mL İndinavir K 8 µL eklemek ve gecede 55 ° C'de bakımını yapmak Reaksiyon durdurmak için örnekleri 5 dakika süreyle 96 ° C'de yer
      5. % 2 özel jel TBE tampon hazırlamak ve nükleik asit leke standart yöntemlerle 20 µL ekleyin.
    3. PCR hazırlık.
      1. Etiket PCR tüpler: yunus seri dilutions (40, 4 ve 0.4 ng/mL), sığır seri dilutions (4.000, 400, 40 ve 4 ng/mL), homolog sığır iki hücreli embriyo, iki hücreli meşru Contegra embriyo ve negatif kontrol.
      2. Steril 1.5 mL microcentrifuge tüp tepki başına 25 µL son hacmi için ana bir karışım hazırlayın.
        1. Ekleyin 5 µL 5 X DNA polimeraz flexi arabelleği, dNTPs (10 mM) 1.5 0.5 µL µL MgCl 2 (25 mM), ileriye ve geriye doğru astar (10 µM), 1,5 µL DNA şablonunun (sperm) veya DNA şablonunun (iki hücreli embriyo) 8 µL 0.5 µL , 0,07 µL Taq polimeraz ve steril distile su 25 µL son hacim kadar. Mix iyi.
  2. Amplifikasyon Protokolü
    1. tüpler içinde termal cycler yerleştirin. Aşağıdaki programı seçin: 94 ° C 3 dakika; 40 devredir 15 94 ° c s, 59 ° C 25 s, 20 72 ° C s; ve 72 ° C 5 dakika süreyle programı başlatmak.
    2. 4 ° C. Ekle 2.5 µL % 2 özel jel kuyu arabellek her karışımı 4 ° C ve yük 15 µL PCR ürünü için yükleme, tüpler saklayın. Bir DNA merdiven marker PCR parçaları doğru boyutu tahmin için kullanın.
    3. Gerçekleştir Elektroforez DNA geçiş izin vermek 15 dakika. Görselleştirildiği UV ışığı kullanarak bantları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tüm sonuçlar, tablo ve şekiller burada sunulan (1 ve 2) izni3ile çoğaltılamaz.

Yunus sperm dondurma ve çözme sonra yüksek hareketlilik var

Dondurulmuş çözdürülen yunus cinsel ilißki oranlarda (% ± SD), 84,5 ± 5.3 Toplam hareketli ve 69.1 ± 5.1 Progresif hareketli sperm hücreleri gösterdi. Motilite açısından, bu yüksek kaliteli cryopreserved sperm temsilcisi sayılardır.

Yunus Sperm üreten melez embriyo ve delici zona olduğu gibi sığır yumurta verebilir

Şekil 1A ve Tablo 1 yunus eş kuluçka 2,5 h sonra sığır ZP bağlı sperm hücreleri gösterir. Yunus sperm sığır sperm hücreleri (şekil 1B ve Tablo 1) daha yüksek bir yüzde, bağlanmıştır. Nitekim, Floresans mikroskobu yunus sperm pronuclear oluşumu ve bölünme (1E şekil ve Tablo 1) önde gelen zona olduğu gibi sığır sperm (şekil 1 c), nüfuz mümkün olduğunu gösterir. Bu confocal mikroskobu (şekil 1 d ve şekil 1F) tarafından doğrulandı. Hiçbir polyspermy co kuluçka (Tablo 1) 12 h sonra yumurtalar kapaklı tüp bebek grubundan gözlendi. Kapaklı tüp bebek pronuclear oluşumunda en yüksek yüzdesini, 24 h, daha uzun bir zaman ortak kuluçka (Tablo 1) 18 h oluştu homolog grubunda ulaştı. 48 h kuluçka sonra bölünme oranı homolog IVF (Tablo 1) kapaklı içinde düşük oldu. 8.0 oranında kendiliğinden parthenogenetic harekete geçirmek, 48 h (Tablo 1) sığır olgunlaştı döllenmemiş yumurta gözlendi.

Son olarak, PCR sonuçları ribozomal 18 S için kodlar bir yunus başvuru genin varlığı değerlendirerek yunus genetik materyal melez embriyo (şekil 3) içinde varlığını doğruladı protein (Şekil 2).

Figure 1
Şekil 1: yunus sperm bağlı sığır zona pelusida (ZP). Ekli yunus(a)ve sığır (B) spermlerin, zona olduğu gibi sığır yumurta ile ortak kuluçka 2,5 h sonra. Gamet Höchst ile lekeli ve faz kontrast mikroskop (40 X büyütme) altında görüntülenir. Bir yunus sperm bir sığır oosit (C ve D) ve (E) sığır oosit sitoplazmada decondensing bir yunus sperm kafa periviteline uzayda. Görüntüleri confocal mikroskop altında ele geçirildi ve meşru zigot (Höchst boyama; 40 X büyütme) Ekvator düzlemi karşılık gelir. İki pronuclei (F) kapaklı IVF yunus sperm ile zona olduğu gibi sığır yumurta (Höchst boyama; 40 X büyütme; ortak kuluçka oluşan 24 saat sonra faz kontrast mikroskop altında gözlenen Ölçek çubuğu 25 µm =). Rakam başvuru3 izni ile yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: temsilcisi Elektroforez (lekeli % 2 özel jel etidyum bromür) 18 S yunus gen için PCR güçlendirme bulundu. Meşru yunus/sığır melez embriyo göstermek şerit 1 30; Şerit S1 ve S2 4 ng/mL ve 0.4 ng/mL yunus sperm DNA, sırasıyla özelliği; ve şeritli C1 C5 özelliği iki hücreli sığır embriyo ve H2O (su) (boş denetimi). Güçlendirilmiş 18 S karşılık gelen 190-bp grup ok gösterir rDNA. Rakam başvuru3 izni ile yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: melez embriyo temsilcisi görüntüler. Temsili resim 48 h, kuluçka (Höchst boyama; 40 X büyütme) adlı iki hücreli melez embriyo(a). Günahı melez embriyo, 48 h, kuluçka, farklı aşamalarında bölümü, (B) stereomicroscope altında görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Table 1
Tablo 1: eki, polyspermy, pronuclear oluşumu ve bölünme homolog ve kapaklı co kuluçka sığır yumurta ve sperm, sığır veya Yunus ile sırasıyla takip oranları. Değişkenleri ANOVA (Kruskal-Wallis ve Mann-Whitney testi) ile analiz edildi. Değerleri on iki çoğaltır ortalama ± SEM (Aralık) ifade edilir; n = yumurta veya meşru zigotları incelendiğinde toplam sayısı. Tablo başvuru3 izni ile yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birçok farklı memeli türü için dondurulmuş çözdürülen sperm kullanılarak çeşitli yararları vardır. Bu değerli genetik materyal, dünya çapında dağıtımı için potansiyel, düşük kirlenme riski ve erkek gamet yıllardır korumak yeteneği aktarma yeteneği içerir. Bu tür ek II, taşıma ve hayvanların farklı su parkları arasında değişimi sınırlayan DEĞİNİR altında korunduğu için cryopreserved sperm kullanımı şişe burunlu yunus için esastır. Yunuslar taşıma, lojistik sorunlar ve tehlikeli riskler oluşturur bir etkinliktir. Ancak, onları taşıma kaçınarak da akrabalık hayvanlar esir bir nüfusa tanıtmaktan riski gibi sonuçları vardır. Sperm dondurma bir çözümdür. Bazı yazarlar yunus sperm5,7,8,9, ile çok cryopreserved sonuçları cesaret verici. Ayrıca, 2005 yılında suni tohumlama tarafından cryopreserved sperm kullanılarak tasarlanmış bir yunus buzağı ilk doğum bildirilen10oldu. Birkaç yıl sonra bu yapıldı seks sıralanmış sperm11kullanarak.

Kuru buz12 ya da sıvı azot2,9buharı gibi yunus sperm ortak yöntemleri, programlanabilir dondurucu5gibi sofistike yöntemlerden farklı teknikler kullanarak cryopreserved, 13. Kuru buz veya sıvı azot buharlar kullanmanın ana avantajı nerede sperm, alanında son derece uzman ekipman kullanımı olmadan ayıklanır aynı yerde cryopreserve imkanı vardır. Payet polistiren sıvı azot buharlar üzerinde donmuş sperm, hızlı, basit ve ucuz yöntem13yaşında. Uygulamada, bu metodoloji yunuslar üzerinde kullanıldığında sperm motilitesi % 65 oldu. Ancak, standart bir yöntem kurmak için ne kadar zor olduğunu dikkate almak önemlidir: teknik sıcaklık, nem, polistren boyutu, vb gibi dış etkenlerden etkilenebilir. Bu nedenle, daha fazla çalışmaları en iyi duruma getirme ve sıvı azot buharı yöntemi ile dondurulmuş sperm kullanılarak başarısını artırmak için yordamı standartlaştırmak gereklidir.

Buz gibi bir iletişim kuralı en iyi duruma getirmek için sperm işlev değerlendirmesi için güvenilir bir yöntem geliştirmek önemlidir. IVF gübreleme için potansiyel sperm testi, iyi bir yoludur. İdeal olarak, Yunus yumurta IVF için kullanılması gerektiğini, ancak yumurta kadın almak için gerekli zor ve zahmetli yordamlar önemli bir kısıtlama temsil. Bu nedenle, kapaklı tüp bebek kullanma imkanı fertilizasyon verimlilik içinde yunus test etmek için yeni bir araç açılır. Yumurta diğer türlerden Contegra yunus IVF için kullanılabilir. Sonuçlar sığır yumurta ve yunus sperm hücreleri arasındaki kapaklı IVF gerçekleştirilebilir gösterir. Dondurulmuş ve çözülmüş yunus sperm hücreleri zona olduğu gibi sığır oosit nüfuz ve Melez embriyo oluşturmak.

Toplama için protokol sundu kombinasyonu, donma-çözülme ve sığır yumurta ile kapaklı tüp bebek gerçekleştirme başarıyla göstermiştir ve dondurma iyileştirme ve değerlendirilmesi için bir ilk adımı temsil etmektedir Yunus sperm. Orada hala birçok bilinmeyen bu yordamlarda unutmayın önemlidir. Ancak, yetenek yunus meni cryopreserve için erişilebilir yapar ve laboratuvarlarda tutulması sağlar. Bu bilimsel çalışmaları kolaylaştıracak ve daha iyi fizyolojisi, kompozisyon ve sperm hücreleri davranışını anlamak için yol açabilir.

Sperm kapaklı tüp bebek tarafından değerlendirilmesi dondurucu protokolleri optimizasyonu kolay olabilir, ama bu da gelecekte test ve erkek üreme verimliliği için seçmek için kullanılabilir. Gerçek fertilizasyon sayılar ve kapaklı tüp bebek değerleri arasındaki ilişki bir önemli noktadır. Buna ek olarak ve bu iki filogenetik uzak türler, sığır ve yunus, arasındaki kapaklı tüp bebek yenilik nedeniyle yeni biyolojik hipotezler inşa edilebilir. Özet olarak, bu iletişim kuralları, Yunus ve diğer deniz memelileri araştırma üreme için yeni bir alan açın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

onun iş ekonomi ve rekabet (AGL2015-70140-R ö. Rizos için), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan ve J. F. Pérez-Gutiérrez ve Seneca Murcia Vakfı (Grant 20040/mikrop/16 F. García-Vázquez için) İspanyolca Bakanlığı tarafından finanse edildi

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
  2. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
  3. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
  4. Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
  5. Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
  6. Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
  7. Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
  8. Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
  9. Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
  10. Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
  11. Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
  12. Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
  13. Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 126 şişe burunlu yunus sperm sperm dondurulmuş çözdürülen semen analizi IVF gübreleme
Şişe burunlu yunus (<em>Tursiops truncatus</em>) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı <em>In Vitro</em> fertilizasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sánchez-Calabuig, M. J.,More

Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter