Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Øresvinet delfiner (Tursiops truncatus) sædcellerne: indsamling, kryopræservering og heterolog In Vitro fertilisering

Published: August 21, 2017 doi: 10.3791/55237
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 4, 5, 1, 1, 2
1Department of Animal Reproduction, Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), 2Department of Animal Medicine and Surgery, School of Veterinary Medicine, Universidad Complutense de Madrid, 3Department of Physiology, Faculty of Veterinary Science, University of Murcia, Campus Mare Nostrum, 4Mundomar, Benidorm, 5Veterinary Services, L'Oceanográfic, Ciudad de las Artes y las Ciencias, Junta de Murs i Vals, s/n, 46013

Summary

Vi præsenterer her, protokoller, der er brugt med succes til dolphin sædcellerne samling, kryopræservering og heterolog IVF ydeevne ved hjælp af kvæg oocyter.

Abstract

Brug af kryopræserverede dolphin sædcellerne letter udveksling af genetiske materiale mellem akvatiske parker og gør sædcellerne adgang til laboratorier for undersøgelser til at fremme vores forståelse af havpattedyr reproduktion. Heterolog IVF, en erstatning for homologe IVF, kunne give et middel til at teste sædceller frugtbarhed potentiale; at studere gamet fysiologi og tidlig embryo udvikling; og for at undgå brugen af værdifulde dolphin oocytter, som er vanskelig at opnå. Vi præsenterer her, protokoller, der med succes har brugt til at indsamle og cryopreserve dolphin sædcellerne. Opsamling af sæd er udført af manuel stimulation på trænede delfiner. Kryopræservering er udført ved hjælp af en TRIS æggeblomme baseret extender med glycerol. Derudover præsenterer vi en protokol, der beskriver heterolog IVF bruger dolphin sædcellerne og kvæg oocyter og som kontrollerer den hybride karakter af den resulterende embryo ved hjælp af PCR. Heterolog befrugtning rejser spørgsmål om befrugtning og kan bruges som et redskab til at studere gamet fysiologi og tidlig embryo udvikling. Derudover viser heterolog IVF succes potentiale af denne teknik til at teste dolphin sperm befrugtende kapacitet, som er værd at yderligere undersøgelse.

Introduction

Assisteret reproduktionsteknologi er dårligt udviklet hos vilde dyr, herunder havpattedyr. Manglen på følsomme metoder til at vurdere sperm gødskning succes bidrager til den langsomme udvikling af reproduktive teknologier i arter som dolphin. Det var ikke indtil for nylig, at de skelsættende grundparametrene for øresvin (Tursiops truncatus) var rapporteret1,2. Men variabler såsom motilitet og morfologi, selv om udbredt, giver begrænsede oplysninger om reproduktiv effektivitet. Den bedste indikator for sædkvalitet er evalueringen af gødskning potentiale.

For nylig, vores gruppe bruges en metode til at vurdere dolphin sperm befrugtende potentiale ved at vurdere mandlige pronuclear dannelse og/eller hybrid embryo dannelsen efter heterolog IVF bruge zona intakt bovin oocyter3. Brugen af delfin-kvæg heterolog IVF har vigtige fordele over homologe IVF, som det overvinder vanskeligheden ved at opnå dolphin oocyter og letter brugen af velafprøvede in vitro- kvæg oocyt modning systemer. For at undgå arter specificitet, udføres heterolog befrugtning normalt i mangel af ZP. Selv om det giver mulighed for evalueringen af de acrosome-reagerede sædcellerne evne til at smelte med vitelline membranen, svækker det evaluering af andre funktioner med relation til befrugtning. Den beskrevne procedure bruger zona intakt oocyter og tillader evaluering af følgende parametre: sperm zona bindende og vedhæftet fil, penetration, polyspermy, pronuclear dannelse og hybride embryoner kavalergang.

Her, præsenterer vi flere protokoller for sperm samling, grundlæggende sædanalyse, sædcellerne frysning samt evaluering af dolphin sperm funktionalitet ved at vurdere mandlige pronuclear og/eller hybrid embryo dannelsen efter heterolog IVF bruge zona intakt kvæg oocyter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

etik erklæring: alle de eksperimentelle procedurer blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Alle eksperimenterne blev udført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brugen af forsøgsdyr, som blev vedtaget af Society for undersøgelse af reproduktion, og at den animalsk velfærd opføre for pleje af havpattedyr.

1. dolphin Sperm samling og kryopræservering

  1. forberedelse
    1. gøre FERT medium (heparin - og hypotaurine-fri). Forberede FERT-TALP medium suppleret med 25 mM bikarbonat, 22 mM sodium lactat, 1 mM natrium pyruvat, 6 mg/mL fedtsyre-fri BSA og 10 mg/mL heparin (pH 7,4).
      Bemærk: Forberede dette medium på dagen for brug og holde det på 38,5 ° C under en atmosfære med 5% CO 2, og i luften med maksimal fugt i mindst 2 timer før brugen.
    2. Forberede TRIS æg æggeblomme-baseret buffer. At opløse 30.28 g/L Tris, 16.75 g/L citronsyre, 12,5 g/L fructose og 0,5 g/L streptomycin i ultrarent vand (pH 7.3, osmolalitet = 310 mOsm/kg). Tilføj 20% æggeblomme (v/v).
  2. Tog en gennemprøvet avl mandlige øresvin at ligge i dorsal recumbence nær kanten af poolen for frivillig tyrestationer.
    Bemærk: Den mandlige delfin bør være uddannet over 6 måneder af positiv forstærkning, som tidligere beskrevet 4.
  3. Udføre forskellige taktil stimulering ved forsigtigt at trykke på området kranie i delfinen genital groove at fremkalde frivillige ekstrudering af penis fra den genitale groove.
  4. Efter at opnå en komplet erektion, direkte penis spidsen i en steril beholder til at opnå ejakulere.
  5. Vedligehold sædprøve ved 37 ° C indtil analysen. Gentag trin 1.3 og 1.4 for successive ejakulere samlinger, ved hjælp af en ny propylen glas hver gang.
  6. Umiddelbart efter opsamlingen, bestemme lydstyrken ved hjælp af en gradueret glas cylinder tidligere varmede til 37 ° C. Evaluer farve, pH og osmolaritet (ved hjælp af en mikro-osmometer) af sædvæsken.
  7. Til at evaluere koncentrationen af sædceller i sædvæsken, tilføje 10 µL af sperm suspension til en eppendorf tube indeholder 90 µL destilleret vand. Sperm koncentrationen ved hjælp af en sædcelle tælle afdeling.
    Bemærk: Under vurderingen, holde resten af sædvæsken på 37 ° C.
  8. Vurdere parametrene motilitet.
    1. Tage 10 µL af sædprøve og placere det i en pre varmede sperm afdeling.
    2. Evaluere motilitet ved hjælp af en computer-assisteret sperm analysesystem, tidligere valideret for Øresvinet, at objektivt vurdere sperm motilitet 2.
      Bemærk: Hvis det er nødvendigt, fortyndes sædprøve med FERT medium (heparin - og hypotaurine-fri) for passende visualisering af sperm motilitet. Under vurderingen, opretholde prøve ved 37 ° C på en opvarmet mikroskop scenen.
  9. 20 µL af sædprøve og evaluere levedygtighed og sperm morfologi som tidligere beskrevet 5.
  10. Overføre sædprøve til et centrifugeglas. Der centrifugeres ved 250 x g i 5 min sædprøve. Efter afgøre, at koncentrationen af sædceller ved hjælp af en optælling kammer, justere koncentrationen af sædceller til 400 x 10 6 sædceller/mL.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, fortyndes pellet fra de koncentrerede ejakulerer med isolerede skelsættende plasma fra en overskydende mængde af den samme ejakulere ved centrifugering (250 x g, 10 min).
    1. i løbet af 5 min langsomt fortyndede sæd prøve 1:1 (v/v) med en TRIS æg æggeblomme-baseret buffer indeholdende 1,5% glycerol. Placer røret indeholder sæd suspension ved 5 ° C i 1 h 30 min.
    2. Udføre en anden fortynding af sperm suspension med en TRIS æg æggeblomme-baseret buffer indeholdende glycerol for at få en 3% endelige glycerol koncentration og en endelig koncentration på 200 x 10 6 sædceller/mL. Opretholde sperm suspensionen ved 5 ° C i 10 min.
  11. Ladning sperm suspension i 0,25 mL sugerør. Heat-Seal af strå. Sugerør i et rack 4,5 cm over flydende kvælstof i 10 min. styrte strå i den flydende kvælstof og gemme indtil evalueringen.

2. Heterolog In Vitro befrugtning ved hjælp af Zona intakt bovin oocyter

  1. forberedelse
    1. Forbered farvning løsning og montering medium.
      1. Forberede Hoechst stamopløsning ved at opløse 1 mg af Hoechst i 1 mL destilleret vand. Gøre 30 µL delprøver og holde dem i mørke ved-20 ° C indtil brug. Forbered Farvningsopløsningen ved at tilføje 25 µL af Hoechst stamopløsning til 5 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS) suppleret med 1 g/L PVA. Bland godt og holde i mørke ved 4 ° C indtil brug.
      2. Forbered montering medium ved at blande 6,25 mL PBS med 6,25 mL glycerol og 6,25 µL af Hoechst stamopløsning. Bland godt og holde i mørke ved 4 ° C indtil brug.
    2. Forberede mediet for oocyt samling og in vitro- befrugtning.
      1. Forberede saltopløsning ved at tilføje 0,5 mL phosphatbufferet til 0,9% NaCl destilleret vand.
      2. Forberede lager modning medium ved at føje 10 ng/mL epidermal vækstfaktor (EGF) og 10% føtalt kalveserum (FCS) til 10 mL TCM-199. Vedligeholde begge medier på 38,5 ° C under en atmosfære med 5% CO 2, og i luften med maksimal fugt i mindst 2 timer før brugen.
  2. Indsamle æggestokkene på slagteriet i saltvand løsning på 33-35 ° C og transportere dem til laboratoriet inden for 4 h fra samling.
  3. En gang i laboratoriet, vaske æggestokkene tre gange til at fjerne snavs og blod ved hjælp af saltopløsning tidligere varmede til 37 ° C. opretholde æggestokkene i saltopløsning ved 37 ° C i løbet af processen.
  4. Aspirat 2 til 8 mm follikler med en 18G kanyle og en 10-mL sprøjte. Indsamle de indsugning follikulært væske i 50 mL rør.
  5. Tillad den follikulære væske indeholdende oocyter henstår i ca 15 min ved 37 ° C, indtil cellerne sediment. Fjern supernatanten af røret med Pasteur pipette og genopslæmmes pellet i PBS.
  6. Genoprette cumulus-oocyt komplekser (p-piller) i 90 mm retter under et stereomikroskop.
  7. Vaske p-piller tre gange i PBS og en gang i modning medium.
  8. Overføre morfologisk normale p-piller til 4-godt retter, hver godt indeholder 500 mL af modning medium, i grupper af 50 p-piller pr. brønd.
    Bemærk: Her tre brønde – et godt for heterolog IVF, ét kontrolelement godt for homologe IVF og ene godt indeholder kun modnet p-piller som en parthenogenetic kontrol – anvendtes.
  9. Ruger p-piller i 24 timer ved 38,5 ° C under en atmosfære med 5% CO 2 og i luften med Maksimalfugtighed.
  10. Forberede mediet og tæthed farveforløb.
    1. At forberede befrugtning medium (FERT), supplere FERT-TALP medium med 25 mM bikarbonat, 22 mM sodium lactat, 1 mM natrium pyruvat, 6 mg/mL fedtsyre-fri BSA og 10 mg/mL heparin. Vedligehold på 38,5 ° C under en atmosfære med 5% CO 2, og i luften med maksimal fugt i mindst 2 timer før brugen.
    2. Forberede tæthed farveforløb ved tilsætning af 1 mL af tæthed gradient medium til en 15 mL tube og 3 mL af vask løsning til en 15 mL tube. Vedligeholde dem på 38,5 ° C i mindst 1 h.
  11. Vask af in vitro- modnet oocyter to gange i FERT medium.
  12. Overførsel af oocytter til 4-godt retter, hver godt indeholder 50 p-piller i 250 mL af FERT. Opretholde de 4-godt retter på 38,5 ° C under en atmosfære med 5% CO 2, og i luften med Maksimalfugtighed mens forberedelserne sæd til befrugtning.
  13. Tø en frossen halm indeholder dolphin sædceller i et vandbad ved 37 ° C til 50 s.
    Bemærk: Tyresæd for homologe IVF skal behandles parallelt, efter den standardprotokol for homologt bovint IVF.
  14. Tage 10 µL af sperm prøve og placere den i en pre varmede sperm tæller kammer. Evaluere motilitet ved hjælp af en computer-assisteret sperm analysesystem, tidligere valideret for arterne, at objektivt vurdere sperm motilitet. I løbet af denne tid, opretholde sædprøve på 38,5 ° C.
  15. Tilføje en sædprøve til tæthed gradient rør (trin 2.10.2). Der centrifugeres i 10 min. ved 250 x g.
  16. Fjern forsigtigt supernatanten ved hjælp af Pasteurs pipette. Tilføj 3 mL af opløsningen, vask at tuben indeholder pelleten. Genopslæmmes pellet ved forsigtigt blanding.
  17. Centrifugeres i 5 min. ved 250 x g. Fjern supernatanten med Pasteur pipette til en sperm volumen af 300 µL.
  18. Tilføje 5 µL af sperm suspension til en microcentrifuge, der indeholder 95 µL destilleret vand. Opretholde sperm suspensionen på 38,5 ° C. Fyld celle tælle kammer med 10 µL af 1:20 sperm fortynding og måle koncentrationen. Beregningen af FERT medium, der skal føjes til 100 µL af sædceller at få 2 x 10 6 sædceller/mL.
  19. Tilføje den beregnede FERT og sperm volumen til en 15 mL tube og forsigtigt blandes ved hjælp af Pasteurs pipette.
  20. Tilføje 250 µL af sæd-FERT suspension til hver brønd af 4-godt parabol indeholdende FERT medium med de modne oocyter at opnå en endelig koncentration på 1 x 10 6 sædceller/mL.
  21. Co Inkuber mælke til 18 h på 38,5 ° C under en atmosfære med 5% CO 2, og i luften med Maksimalfugtighed.
  22. Forbered næringssubstratet baseret på syntetisk oviductal væsken suppleret med 5% FCS. Forberede 25 µL af syntetiske oviductal væske kultur dråber i 35-mm retter dækket med 3 mL af mineralsk olie. Vedligehold på 38,5 ° C under en atmosfære med 5% CO 2, og i luften med maksimal fugt i mindst 2 timer før brugen.
  23. På 2,5 h post Co inkubation, fjerne 20 oocytter fra fadet, opretholde de resterende oocyter i inkubator på samme betingelser.
    1. Fjerne de løst tilknyttede sædcellerne ved energisk pipettering halvdelen af oocytter gennem en smal-bore Pasteur pipette 10 gange.
    2. Fastsætte de 20 oocyter i 50 µL af 0,5% glutaraldehyd i 30 min. Skyl oocyter i PBS i 5 min. Overfør oocytter til 50 µL af Hoechst farvning løsning for 15 min og vask oocyter i PBS i 5 min.
    3. Overføre oocyter individuelt til 2 µL dråber med montering medium med en hastighed på 10 oocyter pr. slide. Forsigtigt dække med en coverslip og forsegle med neglelak.
    4. Tælle antallet af sædceller knyttet til kvæg oocyter ved hjælp af et fasekontrast mikroskop udstyret med epifluorescerende optik og en 361 nm excitation filter på 40 x forstørrelse.
  24. Efter 12 h Co inkubation, fjerne 10 formodede zygotes fra 4-godt retter, opretholde de resterende formodede zygotes i rugemaskine på samme betingelser.
    1. Overførsel af 10 formodede zygotes til en 15 mL centrifugeres rør indeholdende 2 mL PBS og vortex forsigtigt for 2 min til at fjerne cumulus celler. Vask to gange i PBS, fix og pletter, som tidligere beskrevet (skridt 2.23.2.)
  25. Efter 18, 20, 22 og 24 h Co inkubation, fjerne 10 formodede zygotes fra 4-godt retter og vortex, ordne og bejdse dem som tidligere beskrevet (trin 2.23.2). Vedligeholde resten af formodede zygotes i rugemaskine på samme betingelser.
    1. Evaluere pronuclear dannelse og polyspermy under en epifluorescerende/fase-kontrast mikroskop i begge de homologe og heterolog IVF grupper ved farvning med Hoechst.
    2. Evaluere pronuclear dannelse i 10 tilfældigt valgte formodede hybrid zygotes pr. prøve. Bekræft pronuclear dannelse under en Konfokal laser scanning mikroskop på 488-nm argon laser excitation og 515 til 530 nm påvisning.
    3. Optisk sektion formodede zygotes sekventielt (2 mm) og indsamle billeder ved hjælp af en software til billedbehandling. Visualisere ved hjælp af en 3D analyse softwarepakke.
    4. Efter 24 h Co inkubation, vask 50 formodede zygotes fire gange i PBS og to gange i dyrkningsmediet.
  26. Overføre dem i grupper på 25 til microdroplets af næringssubstratet tidligere forberedt og ekvilibreres.
  27. Vedligehold på 38,5 ° C under en atmosfære med 5% O 2 / 5% CO 2 og i luften med Maksimalfugtighed.
  28. Efter 26 og 28 h Co inkubation, fjerne 10 formodede zygotes fra retter og vortex, fix, og bejdse dem, som tidligere beskrevet (trin 2.23.2).
  29. Efter 48 h af kultur, observere kavalergang under et stereomikroskop.
  30. Fjerne zona pellucida (ZP) ved overførsel af embryoner til en 5 mg/mL protease løsning.
  31. Vask individuelt hver embryo tre gange i PBS. Snap-fryse dem i flydende kvælstof i 0,2 mL microcentrifuge rør. Opbevar dem ved-80 ° C indtil analyse.

3. PCR

  1. materialer og reagenser
    Bemærk: reagenser, materialer og udstyr, der anvendes til at udføre PCR-protokol er nærmere beskrevet i tabel materialer og omfatter en PCR rør rack og et sæt af Mikropipetter (P2, P20, P200, P1000), 1,5 mL microcentrifuge rør, PCR rør og hætter, en termisk cycler, en UV illuminator, agarosegel og buffer (Tris Borat EDTA (TBE)).
    1. Tø forsigtigt alle reagenser på is. Fastholde dem i isen hele eksperimentet. Brug deoxynucleotides (dNTP'er; dATP, dCTP, dTTP og dGTP), målrette primere på reference genet koder for dolphin 18 S ribosomale protein (DQ404537.1); R1: TTGGACACACCCACGGTGCGG og F2: CAGAAGGACGTGAAGGATGGA), DNA polymerase, 5 X buffer til template DNA polymerase, DNA, sterilt vand og magnesiumchlorid (MgCl 2 i en endelig koncentration på 5,0 mM).
    2. Agarosen gel og prøve forberedelse.
      1. Forbered dolphin og kvæg sæd DNA prøver.
        1. Tø en frossen halm af hver art i et vandbad ved 37 ° C til 50 s. tilsættes 3 mL vask løsning. Der centrifugeres ved 250 x g i 10 min. Fjern supernatanten. Tilføj 30 µL af STES lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8; 20 mM NaCl; og 1 mM 0,1% SDS), 2 µL af proteinase K (20 mg/mL) og 5 µL af dithiothreitol (DTT); endelig koncentration: 150 mM. Vedligeholde natten på 55 ° C. tilføje 200 µL ultrarent vand. Der centrifugeres ved 250 x g i 5 min. holde supernatanten. Måle DNA koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer.
      2. Udføre serielle fortyndinger af DNA fra dolphin sædcellerne (dvs., 40, 4 og 0,4 ng/mL) med ultrarent vand til at kontrollere, at PCR er i stand til at påvisning af en lille mængde af dolphin DNA.
      3. Udføre serielle fortyndinger af kvæg sæd DNA (dvs. 4.000, 400, 40 og 4 ng/mL) med ultrarent vand til at kontrollere, at PCR er i stand til at afsløre en lille mængde af kvæg DNA.
      4. Forbereder dolphin og kvæg embryonerne. Tø embryoner på is. Tilføje 8 µL af 100 µg/mL proteinase K og vedligeholde natten over ved 55 ° C. For at stoppe reaktionen, placere prøverne på 96 ° C i 5 min.
      5. Forbereder 2% Agarosen gel TBE buffer og tilføje 20 µL af nukleinsyre pletten ved hjælp af standardteknikker.
    3. PCR forberedelse.
      1. Etiket PCR røret: dolphin serielle fortyndinger (40, 4 og 0,4 ng/mL), kvæg serielle fortyndinger (4.000, 400, 40 og 4 ng/mL), homologt bovint to-celle embryon, to-celle formodede heterolog embryoner og negativ kontrol.
      2. Udarbejde en master blanding i sterile 1,5 mL microcentrifuge rør til en endelige mængden af 25 µL pr. reaktion.
        1. Tilføje 5 µL af 5 X DNA polymerase flexi buffer, 0,5 µL af dNTP'er (10 mM) 1,5 µL af MgCl 2 (25 mM), 0,5 µL af forward og reverse primer (10 µM), 1,5 µL DNA skabelon (sperm) eller 8 µL DNA skabelon (to-celle embryoner) , 0,07 µL af Taq-polymerase, og sterilt destilleret vand op til en 25 µL endelige rumfang. Bland godt.
  2. Forstærkning protokol
    1. lægge rør i den termiske cycler. Vælg følgende program: 94 ° C i 3 min. 40 cyklusser af 94 ° C til 15 s, 59 ° C i 25 s, 72 ° C i 20 s; og mindst 72 ° C i 5 min. starter programmet.
    2. Gemme rør på 4 ° C. tilføje 2.5 µL for at indlæse buffer til hver PCR produkt på 4 ° C og belastning 15 µL af blandingen i wells af 2%-agarosegel. Brug en DNA ladder markør til at anslå den nøjagtige størrelse af PCR fragmenter.
    3. Udføre elektroforese for 15 min at tillade DNA migration. Visualiseret bands bruger en UV illuminator.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Alle resultater, tabeller og figurer (1 og 2) præsenteres her blev gengivet med tilladelse3.

Dolphin sædcellerne har høj motilitet efter nedfrysning og optøning

De optøede dolphin ejakulerer viste procentdele (% ± SD) af 84.5 ± 5.3 total motile og 69,1 ± 5,1 progressive motile sædceller. I motilitet vilkår er disse tal repræsentative for høj kvalitet befrugtede sædcellerne.

Dolphin sædcellerne er i stand til gennemtrængende zona intakt bovin oocyter og producerer hybride embryoner

Figur 1A og tabel 1 viser dolphin sædcellerne knyttet til kvæg ZP efter 2,5 h Co inkubation. Dolphin sædcellerne var knyttet til en højere procentdel end kvæg sædcellerne (figur 1B og tabel 1). Fluorescens mikroskopi viser faktisk, at dolphin sædcellerne er i stand til at trænge igennem zona intakt bovin sædcellerne (figur 1 c), fører til pronuclear dannelse og spaltning (figur 1E og tabel 1). Dette blev bekræftet af Konfokal mikroskopi (fig. 1 d og figur 1F). Ingen polyspermy blev observeret i oocytter fra gruppen heterolog IVF efter 12 h Co inkubation (tabel 1). Pronuclear dannelse i heterolog IVF nåede den højeste procentdel på 24 h, længere tid end i gruppen homologe, som indtraf på 18 h Co inkubation (tabel 1). Den spaltning på 48 timer efter inkubation var lavere i den heterolog end den homologe IVF (tabel 1). En spontan parthenogenetic aktivering på 8,0% blev observeret i kvæg modnet ubefrugtede oocyter på 48 h (tabel 1).

Endelig, PCR-resultater bekræftet tilstedeværelsen af dolphin genetisk materiale i hybride embryoner (figur 3) ved at vurdere tilstedeværelsen af en delfin reference gen, der koder for de ribosomale 18 S protein (figur 2).

Figure 1
Figur 1: Dolphin sædcellerne knyttet til kvæg zona pellucida (ZP). Vedlagte delfin (A) og kvæg (B) sædcellerne efter 2,5 h Co inkubation med zona intakt bovin oocyter. Mælke var plettet med Hoechst og visualiseret under fasekontrast mikroskop (40 X forstørrelse). En delfin sædcellerne i periviteline rum i et kvæg oocyt (C og D) og en decondensing delfin sperm hoved i kvæg oocyt cytoplasma (E). Billeder blev taget til fange under en Konfokal mikroskop og svarer til den ækvatoriale fly af den formodede zygote (Hoechst farvning, 40 X forstørrelse). To pronuclei (F) observeret under en fase kontrast mikroskop efter 24 h af heterolog IVF bestående af co Inkubationen af dolphin sædcellerne med zona intakt bovin oocyter (Hoechst farvning, 40 X forstørrelse; Skalalinjen = 25 µm). Tallet var gengivet fra reference3 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative elektroforese (2% Agarosen gel ethidiumbromid farves) viser PCR forstærkning resultater for 18 S dolphin genet. Baner 1 til 30 Vis formodede delfin/kvæg hybride embryoner; baner S1 og S2 har 4 ng/mL og 0,4 ng/mL dolphin sæd DNA, henholdsvis; og baner C1 til C5 indslag to-celle koembryoner og H2O (vand) (blindkontroller). Pilen angiver 190-bp bandet svarende til de forstærkede 18 S rDNA. Tallet var gengivet fra reference3 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant billeder af hybride embryoner. Repræsentativt billede af et to-celle hybrid embryo (A) på 48 h inkubation (Hoechst farvning, 40 X forstørrelse). Unstained hybrid embryoner på 48 h inkubation, på forskellige stadier af division, visualiseret under stereomikroskopet (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: satserne for vedhæftet fil, polyspermy, pronuclear dannelse og kavalergang efter homologe og heterolog Co inkubering med bovin oocyter og kvæg eller delfin sædcellerne, henholdsvis. Variabler blev analyseret med ANOVA (Kruskal-Wallis og Mann-Whitney test). Værdierne er udtrykt i den gennemsnit ± SEM (interval) af tolv replikater; n = antallet af oocytter eller formodede zygotes undersøgt. Tabellen var gengivet fra reference3 med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For mange forskellige pattedyr arter er der forskellige fordele ved at bruge optøede sperm. Disse omfatter evnen til at overføre værdifuldt genetisk materiale, potentialet for verdensomspændende distribution, lav risiko for kontaminering, og evnen til at bevare mandlige gameter i årtier. Brug af kryopræserverede sæd er afgørende for Øresvinet, fordi denne art er beskyttet i henhold til tillæg II i CITES, som begrænser transport og udveksling af dyr mellem forskellige akvatiske parker. Delfiner transport er en aktivitet, der skaber logistiske problemer og farlige risici. Men afstår fra transport af dem også har konsekvenser, såsom risikoen for indslæbning af indavl til en fangenskab population af dyr. En løsning er kryopræservering af sædceller. Nogle forfattere har befrugtede dolphin sperm5,7,8,9, med meget opmuntrende resultater. Desuden var den første fødsel af en delfin kalv undfanget ved kunstig befrugtning ved hjælp af kryopræserverede sperm i 2005 rapporterede10. Nogle år senere, dette blev gjort ved hjælp af sex-sorteret sædcellerne11.

Dolphin sæd har været befrugtede ved hjælp af forskellige teknikker fra sofistikerede metoder, såsom en programmerbar fryser5, til fælles metoder, såsom tøris12 eller flydende kvælstof dampe2,9, 13. Den største fordel ved hjælp af tøris eller flydende nitrogen dampe er muligheden for at cryopreserve det samme sted, hvor sæden er udvundet, uden brug af højt specialiseret udstyr. Sæd frossen i sugerør på polystyren i flydende nitrogen dampe er en enkel, hurtig og billig metode13. I praksis, da denne metode er blevet brugt på delfiner, var sperm motilitet 65%. Det er imidlertid vigtigt at overveje, hvor vanskeligt det er at etablere en standardiseret metode: teknikken kan være påvirket af eksterne faktorer, såsom temperatur, luftfugtighed, polystyren størrelse, osv. Derfor, yderligere undersøgelser er nødvendige for at optimere og standardisere proceduren for at forbedre succesen med at bruge sæd frossen med flydende kvælstof vapor metode.

For at optimere en indefrysning protokol, er det vigtigt at udvikle en pålidelig metode til funktionel vurdering af sædcellerne. IVF er et godt middel til at teste sæden potentiale for befrugtning. Ideelt, dolphin oocyter bør anvendes til IVF, men de vanskelige og besværlige procedurer nødvendig for at opnå oocytter fra kvinder repræsenterer en vigtig betingelse. Derfor åbner mulighed for at anvende heterolog IVF et nyt middel til at teste befrugtning effektivitet i delfinen. Oocytter fra andre arter kan bruges til heterolog dolphin IVF. Resultaterne viser, at heterolog IVF mellem kvæg oocyter og dolphin sædcellerne kan udføres. Frosne eller optøede dolphin sædcellerne kan trænge igennem zona intakt bovin oocyt og generere en hybrid embryo.

Præsenteres kombinationen af protokoller til indsamling, fryse-optøning, og udfører heterolog IVF med bovin oocyter har påvist med succes og er et indledende skridt til optimering af kryopræservering og evalueringen af Dolphin sperm. Det er vigtigt at bemærke, at der er stadig mange ubekendte i disse procedurer. Men evnen til at cryopreserve delfin sæd gør det tilgængeligt og gør det muligt at blive holdt i laboratorier. Dette vil lette videnskabelige undersøgelser og kan føre til en bedre forståelse af fysiologi, sammensætning og funktionsmåde af sædceller.

Evaluering af sædceller ved heterolog IVF kan lette optimering af frysning-protokoller, men det kan også anvendes i fremtiden til at teste og vælg hanner for frugtbarhed effektivitet. En vigtig overvejelse er forholdet mellem virkelige befrugtning tal og heterolog IVF værdier. Desuden, og på grund af nyhedsværdien af heterolog IVF mellem disse to Fylogenetisk Fjern arter, kvæg og dolphin, kan nye biologiske hypoteser bygges. Helt, disse protokoller åbne et nyt rum for forskning på reproduktionen af delfinen og andre havpattedyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

hans arbejde blev finansieret af det spanske ministerium for økonomi og konkurrenceevne (AGL2015-70140-R til D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan og J. F. Pérez-Gutiérrez og Seneca fundament af Murcia (Grant 20040/Kim/16 til F. García-Vázquez)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
  2. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
  3. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
  4. Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
  5. Robeck, T. R., O'brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
  6. Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
  7. Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
  8. Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
  9. Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
  10. Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
  11. Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
  12. Schroeder, J. P. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. Leatherwood, S., Reeves, R. R. , Academic Press. San Diego. 447-460 (1990).
  13. Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 126 Øresvinet sædcellerne optøede sperm sædanalyse IVF befrugtning
Øresvinet delfiner (<em>Tursiops truncatus</em>) sædcellerne: indsamling, kryopræservering og heterolog <em>In Vitro</em> fertilisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sánchez-Calabuig, M. J.,… More

Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter