Summary
الجينات الحذف المسوخ ولدت من خلال إعادة التركيب مثلي هي المعيار الذهبي للدراسات وظيفة الجينات. يوصف أوسكار (خطوة واحدة بناء أغروباكتريوم-ريكومبيناتيون-ريسبونز-بلاسميدس) طريقة لتوليد السريع من يبني الحذف. الجراثيم بوساطة التحول الفطري يلي. وأخيرا، يتم عرض طريقة تأكيد ير القائم على الحذف الجينات في المحولات الفطرية.
Abstract
الحذف الدقيق للجينات (ق) من الفائدة، في حين ترك بقية الجينوم دون تغيير، ويوفر المنتج المثالي لتحديد أن وظيفة الجينات معينة في الكائن الحي. في هذا البروتوكول وصفت طريقة أوسكار من البناء البلازميد الحذف الدقيق والسريع. ويعتمد أوسكار على نظام الاستنساخ الذي يتم فيه رد فعل ريكومبيناس واحد يحتوي على تنقية ير تضخيم 5 'و 3' الأجنحة من الجين من الفائدة واثنين من البلازميدات، با-هيغ أوسكار (ناقلات علامة) و بوسكار (الجمعية قوه موجهة). يتم تأكيد ناقلات الحذف تجميعها بشكل صحيح من قبل رسم الخرائط الهضم تقييد تليها التسلسل. ثم يتم استخدام الجراثيم المبيضات للتوسط إدخال بناء الحذف في الجراثيم الفطرية (المشار إليها باسم أتمت). أخيرا، يوصف مقايسة ير لتحديد ما إذا كان بناء الحذف متكاملة من قبل إعادة التركيب مثلي أو غير متماثل، مما يدل على حذف الجينات أوالتكامل خارج الرحم، على التوالي. وقد استخدم هذا النهج بنجاح لحذف العديد من الجينات في فيرتيسيليوم دالياي وفي فوزاريوم فيرتيسيليوادس بين الأنواع الأخرى.
Introduction
التشريح الجيني هو منهجية قوية لتحديد الأهمية الوظيفية للفرد أو مجموعات من الجينات. النهج القياسي لفهم دور جينات محددة هو إنتاج مسوخ الجينات واحدة دون تغيير في أي جين آخر. وأقوى وأقل احتمالا مربكة النهج الكامل والدقيق حذف الجين من إطار القراءة مفتوحة الفائدة (غوي أورف) دون ضرر لأي وظيفة الجينات الأخرى.
لأن نهج ربط القياسية لحذف جيل البلازميد تتطلب خطوات متعددة، وكان العقلاني ل أوسكار 1 لإنتاج أسرع في النهج المختبر . الشكل 1 يصور عملية التجميع في نهج أوسكار. الطريقة الموصوفة هنا لديها ميزة الجمع بين البناء السريع للنواقل الحذف الجينات الفردية في رد فعل متعدد الأجزاء واحد في تركيبة مع اللاحقة أغروباكتريوم توميفاسينس بوساطة ترانسفورماتيون (أتمت). أوسكار سريع جدا ويقارن جيدا مع استراتيجيات أخرى مثل استخدام الجمعية جيبسون في الخميرة 2 . وقد استخدمت طريقة أوسكار بنجاح مع العديد من أنواع أسكوميكوتا من الفطريات. وتشمل هذه الأنواع: فوزريوم فيرتيسيليوادس (غير منشورة)، فيرتيسيليوم دالياي 3 ، سيتوسفيريا تورسيكا 4 ، ميتارهيزيوم روبرتسي 5 ، فوزاريوم أوكسيسبورم f. س. 6 ، بيستالوفيوسيس ميكروسبورا 7 ، كوليتوتريتشوم هيجينزيانوم 8 ، و دوثيستروما سيبوسبورم 9 و ساروكلاديوم زي (غير منشورة) .
ويوفر هذا البروتوكول خطوة بخطوة تعليمات للطريقة بما في ذلك تصميم التمهيدي، الجناح ير التضخيم، رد فعل أوسكار بب، حذف بناء هيكل تأكيد، ترانزفورماتأيون من أغروباكتريوم مع بناء تليها أتمت نقل استنادا بناء الحذف في الخلايا الفطرية، وأخيرا التفريق المسوخ الحذف الفطرية من تلك التي يبني الحذف إكتوبيكالي المتكاملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تصميم التمهيدي ل ير التضخيم من الأجنحة الجينية
- تحميل لملف معالجة كلمة المنطقة الجينومية من الجينات في المصالح (غوي) بما في ذلك إطار القراءة المفتوحة (أورف) وعلى الأقل 2 كيلو بايت يرافق الجين على كل جانب من فونجيدب أو غيرها من موارد البيانات الجينومية.
- تسليط الضوء على أورف المقصود للحذف والتسمية بدء وإيقاف كودونات.
- تحديد وتسليط الضوء على أورفس المجاورة داخل تسلسل تحميلها.
- استخدام 2 كيلو بايت 5 'نهاية غوي أورف وأداة تصميم التمهيدي (انظر قائمة المواد) لتصميم ير التمهيدي زوج O1 و O2 لتوليد الحد الأدنى من حجم المنتج من 1 كيلو بايت. احرص على عدم التأثير على أورفس المجاورة.
- لصق 2 كيلو بايت 5 'الجناح في نافذة "دخول تسلسل". انقر على مربع "عرض المعلمات المخصصة". أدخل معلمات التصميم المخصصة التالية: تمهيدي تم 58 (مين)، 60 (أوبت) و 62 (ماكس)؛ بريمر غ 40 (مين)، 50 (أوبت) أند 60 (ماكس)؛ بريمر سيز 22 (مين)، 24 (أوبت) أند 26(كحد أقصى)؛ أمبليكون سيز 1250 (مين)، 1500 (أوبت) أند 2000 (ماكس).
- اختر النتيجة التي تضع التمهيدي العكسي (O2) الأقرب إلى أورف. التقاط لقطة شاشة من المقايسات ونسخ ولصق تسلسل التمهيدي في وثيقة معالجة النصوص.
- كرر هذه العملية لمدة 3 'الجناح لتوليد الاشعال O3 و O4، وهذه المرة اختيار النتيجة وضع التمهيدي إلى الأمام (O3) الأقرب إلى أورف الهدف.
- قم بإضافة مواقع إرفاق مناسبة إلى 5 "أطراف من الاشعال من 1 إلى 4 (انظر الجدول 1 ).
- أيضا تصميم والنظام أورف الاشعال محددة لاستخدامها لتأكيد الحذف في القسم 4 أدناه. وينبغي أن تكون المعلمات كما هي في الخطوة 1.4.1 باستثناء استخدام أمبليكون حجم 500 (دقيقة)، 750 (اختيار) و 1000 (الحد الأقصى) ضبط لطول أورف إذا لزم الأمر. وأخيرا، لتأكيد ريكومبينانتس مثلي، وتوليد 5 'خارج و 3' الاشعال خارج وجدت خارج الأجنحة داخل الكروموسوم. وسيتم استخدام هذه "خارج" الاشعال معهغر (210) و هيغف (850)، على التوالي ( الشكل 2 ).
- ترتيب الاشعال.
2. إنتاج أوسكار كونستروكتس
- باستخدام طيبة مرحبا تاق ، تنفيذ اثنين من ردود الفعل، واحد لكل من 5 'و 3' الأجنحة، وذلك باستخدام الاشعال (100 ميكرومتر) O1 و O2 في رد فعل واحد والبادئات O3 و O4 في الثانية. خليط التفاعل يحتوي على ما يلي: 29.5 ميكرولتر الماء المقطر العقيمة (سدو)، 5 ميكرولتر 10X لا ير عازلة، 8 ميكرولتر 2.5 ملي دنتب مزيج، 5 ميكرولتر 25 ملي مغكل 2 ، 1 قالب ميكرولتر (50 نانوغرام / ميكرولتر)، 0.5 ميكرولتر مرحبا- الإخلاص الطق ، 0.5 ميكرولتر التمهيدي O1 و 0.5 ميكرولتر التمهيدي O2 لمدة 5 'الجناح (أو 0.5 ميكرولتر التمهيدي O3 و 0.5 ميكرولتر التمهيدي O4 لمدة 3' الجناح) استخدام ظروف التفاعل هي كما يلي: 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم الخطوات النهائية من 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم عقد لأجل غير مسمى عند 10 درجة مئوية.
- تشغيل 0.8٪أغاروس 1X تاي (40 ملم تريس خلات درجة الحموضة 8.3، 1 ملي إدتا) هلام الكهربائي لحوالي 125 ف في جهاز مينيجل القياسية لتحديد حجم المنتج والتركيز النسبي. آخر وصمة عار هلام مع غير إيثديوم وصمة عار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تصور على إضاءة الأشعة فوق البنفسجية.
- إذا كان 5 'و 3' المنتجات الجناح هي في تركيز حتى تقريبا، والجمع بينهما واستخدام مجموعة العمود تقارب (أو بيج هطول الأمطار 90 ميكرولتر المنتجات ير مجتمعة، 240 ميكرولتر تي العازلة درجة الحموضة 7.5، 160 ميكرولتر من 30٪ البولي ايثيلين جلايكول PEG8000 30 ملي مغكل 2 ) إلى شارك في تنقية المنتجات ير وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إذا لم تكن من التركيز على قدم المساواة الجمع بين كل من منتج تركيز منخفض مع كمية مساوية تقدر من الناتج من رد فعل أعلى العائد.
- استخدام مقياس الطيف لقياس تركيز الحمض النووي المنقى.
- تنفيذ رد فعل بب عن طريق خلط ما يلي: 1 ميكرولتر من 60 نانوغرام / ميكرولتر بوسكار، 2 ميكرولتر من 60 نانوغرام /ميكرولتر با-هيغ-أوسكار، 1 ميكرولتر من 60 نانوغرام / ميكرولتر جنبا إلى جنب الأجنحة، 1 ميكرولتر من كلوناز. احتضان لمدة 16 ساعة عند 25 درجة مئوية. إنهاء رد فعل بإضافة 0.5 ميكرولتر بروتين K واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- تحويل الكفاءة العالية E. خلايا القولونية . تم استخدام كل من الخلايا المختصة المتاحة تجاريا والخلايا المختصة DH5α كاكل 2 محلية الصنع بنجاح كما المستلمين كما هو موضح من قبل تعليمات الشركة الصانعة. لوحة على الصوديوم منخفضة (0.5 غرام / لتر كلوريد الصوديوم) لب تحتوي على 100 ميكروغرام / مل سبكتينوميسين (المواصفات).
- تحديد البناء الصحيح عن طريق أداء مينيبريبس الحمض النووي 10 من المستعمرات ولدت أعلاه. أداء الهضم المزدوج مع هين دي و كين I على النحو التالي: ماصة 5 ميكرولتر الحمض النووي، 2 U من كل انزيم، 2 ميكرولتر العازلة 10X المناسبة مع سدو إلى إجمالي حجم 20 ميكرولتر. هذا يطلق إدراج (4.5 كيلوبايت تقريبا مع 1.5 كيلو بايت الجينات الأجنحة) من المتجه (كا 7 كيلو بايت) ويقطع أي مواقع فيالأجنحة التي يمكن أن تعطي أحجام الفرقة يمكن التنبؤ بها.
- تسلسل 11 اختيار الحيوانات المستنسخة تبين نمط النطاقات المناسبة.
3. أغروباكتريوم المبيضات التحول بوساطة (أتمت) من الفطريات
- تحويل أغروباكتريوم المهدئات سلالة AGL1 مع أوسكار حذف بناء 12 .
- تحويل الفطر مع AGL1 تحتوي على غوي أوسكار الحذف البلازميد. للقيام بذلك تنفيذ الخطوات التالية:
- إعداد تعليق بوغ الفطرية مع الماء المعقم في 2 × 10 6 الجراثيم / مل. تحديد الجراثيم على عدادة الكريات أو عداد الخلية الآلي. مكان 500 ميكرولتر من هذا في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل. هذا الإعداد هو لمدة 4 لوحات التحول.
- استخدام حلقة معقمة زرقاء معقمة لإضافة غوب مرئية بسهولة (يجب أن تغطي حوالي 20٪ من قطر حلقة) من البلازميد الحذف التي تحتوي على AGL1 من 2-3 أيام العمر لب-سبيك 100 المتوسطة (انظر Mأتيريالس قائمة لتكوين) تحتوي على لوحات وتخلط في تعليق بوغ. دوامة حتى الخلايا البكتيرية هي مشتتة جيدا ( حوالي 5 دقيقة سرعة متوسطة).
- ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الكونيديا الزراعية على مركز مرشح غشاء السليلوز وضعت على كل من أربعة أطباق سم 6 بتري تحتوي على شارك في زراعة المتوسطة 12 .
- نشر تعليق مع الخرز الزجاجي العقيمة (حوالي 4) لتغطية سطح كامل من مرشح الغشاء. بدلا من ذلك نشر التعليق باستخدام أداة انتشار التقليدية. السماح للتصفية غشاء لتجف في غطاء محرك السيارة لمدة 10 دقيقة تقريبا، والتفاف مع فيلم البارافين. كرر الخطوات 3.2.2 و 3.2.3 لإعداد تحولات متعددة.
- احتضان لوحة لمدة 2 أيام في درجة حرارة الغرفة، مقلوب.
- نقل مرشح غشاء على 6 سم المتوسطة اختيار الرشاشيات 12 لوحات تحتوي على هيغروميسين B (هيغ) 150 ميكروغرام / مل، 200 ملي سيفوتاكسيم و 100 ميكروغرام / ملموكسالاكتام. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-7 أيام قبل عزل المستعمرات مقاومة للرطوبة.
- مع المسواك العقيمة، ونقل ترانزفورمانتس المفترضة على 6 سم البطاطا سكر العنب أغار (بدا) لوحات تحتوي على 150 ميكروغرام / مل هيغ، 100 ميكروغرام / مل كانامايسين.
4. حذف مسخ تحديد بواسطة ير
- استخراج الحمض النووي ل ير من ترانزفورمانتس التي كتبها التحلل الحراري 13 .
- مرة واحدة المحولات تشكل مستعمرات على المساعد الشخصي الرقمي من الخطوة 3.2.7، واستخدام مسواك معقم لنقل كمية صغيرة (2 مم × 2 مم) من الخلايا الفطرية أو الخميرة من المستعمرة إلى 100 ميكرولتر من محلول تحلل (50 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4، 1 ملي إدتا، 5٪ الجلسرين) في أنبوب ميكروسنتريفوج.
- احتضان الخليط في 85-90 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. تخزين استخراج الخام التي تحتوي على الحمض النووي الجيني في -20 درجة مئوية حتى استخدام في الخطوة 4.2.
- تنفيذ 4 تفاعلات ير لكل المحول، واحد لكل دإتكت ريكومبيناتيون مثلي من 5 'و 3' الأجنحة، على التوالي، واحدة للعلامة اختيار (هيغروميسين فوسفهوترانزفيراس في هذه الحالة) وواحد ل غوي أورف.
ملاحظة: نحن عادة استخدام رخيصة منخفضة الدقة تاق لهذه التفاعلات. شروط رد الفعل كما هو موضح في الخطوة 2.1 أعلاه وتحتوي على سدو 20 ميكرولتر، 10X العازلة العازلة 2.5 ميكرولتر، دنتبس (10 ملم) 0.5 ميكرولتر، محلية الصنع طق 14 ، 0.5 ميكرولتر، التمهيدي A (100 ميكرومتر) 0.5 ميكرولتر، التمهيدي B (100 ميكرومتر ) 0.5 ميكرولتر، قالب 0.5 ميكرولتر. انخفاض تركيز التمهيدي الأسهم (10 ميكرومتر) يمكن استخدامها بشكل جيد على قدم المساواة. - تشغيل هلام الاغاروز (على سبيل المثال 0.8٪) من المنتجات ير. سوف المسوخ الحذف تنتج الفرقة هيغ ولكن ليس منتج أورف. سوف المتكاملين خارج الرحم تظهر كلا العصابات. نوع البرية سوف تنتج فقط الفرقة أورف.
- تخزين دائم المسوخ الحذف (وتحويل خارج الرحم أو اثنين للضوابط) لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: 15٪ الجلسرين يستخدم ل sمزقت سلالات لدينا على المدى الطويل في -80 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طريقة أوسكار، في رد فعل واحد، يولد البلازميد التي تحتوي على أجنحة الجين الهدف ليتم حذفها المحيطة كاسيت علامة اختيار. إنتاج بنيات الحذف باستخدام أوسكار هو فعال جدا. ومع ذلك، يمكن للنظام أن ينتج منشآت جزئية تحتوي على بعض الشظايا الثلاثة وليس جميعها (الجناحان الجينيان وعلامة التحديد). عموما، فإن غالبية E. كولاي ترانزفورمانتس تحتوي على بناء أوسكار الصحيح. على سبيل المثال، الشكل 2 يصور بناء الحذف أوسكار للجين فيرتيسيليوم دالياي VDAG_06812. في هذه الحالة الأجنحة من VDAG_06812 تفتقر هين دي أو كني المواقع، وبالتالي ينبغي إدراج سراح البلازميد من 4،247 بي بي. ويبين الشكل 3 هين DII- كين I تقييد انزيم تأكيد الهضم المزدوج للبنية البلازميد الصحيح باستثناء الممرات 5 و 11 تمثل كونستروك الشاذةالخبر. ويبين الشكل 4 تأكيد النهائي من اثنين من الحذف الجينات مختلفة من قبل لطخة الجنوبية. ويبين الشكل 5 نهج ير النهائي كبديل لطخة جنوب.
الشكل 1: أوسكار رد فعل بناء الحذف. وتشمل عملية بناء الحذف أوسكار التضخيم ير منفصلة من الجينات 5 'و 3'، تليها رد فعل بب كلوناز مع المنتجات جنبا إلى جنب تنقية المنقى و البلازميدات الثنائية واختيار علامة. B1r، B2r، B3، B4، P1r، P2r، P3، P4، R1، R2، L3 و L4 تمثل مواقع إعادة التركيب لامدا. أعد الطباعة بإذن من المرجع 1 .
الشكل 2: بناء الحذف أوسكار ل < إم> فيرتيسيليوم دالياي جين VDAG_06812. وتظهر مواقف التقييد انزيم التقييد ومواقع التمهيدي الصلب للتحقق من الصحيح بنية بناء الحذف. أعد الطباعة بإذن من المرجع 1 .
الشكل 3: تقييد الهضم تأكيد هيكل بناء الحذف من VDAG_06812 مع كين I وهين ديي. تم هضم البلازميدات وتحليلها بالهلام الكهربائي على هلام الاغاروز 0.8٪. البناء الصحيح يولد اثنين من العصابات، من حوالي 6.9 كيلو بايت و 4.2 كيلو بايت، تمثل العمود الفقري ناقلات ثنائي وعلامة هيغر تنصهر إلى الأجنحة الجينات المستهدفة، على التوالي. أعد الطباعة بإذن من المرجع 1 .
الشكل 4: التهجين لطخة الجنوبية مؤكدا حذف VDAG_02161 و VDAG_09930 في V. دالياي باستخدام بنيات الحذف أوسكار. تم هضم الحمض النووي الجيني مع بكل I. ثم تم بحثها في وقت واحد مع VDAG_02161 و VDAG_09930 أورف تحقيقات. نطاقات التهجين هي 2،757 نقطة أساس و 1،426 نقطة أساس للأليلات البرية نوع VDAG_02161 و VDAG_09930، على التوالي. العينات هي كما يلي: حارة 1: نوع البرية سلالة VdLs.17. حارة 2: الحذف متحولة سلالة 02161.1؛ حارة 3: الحذف متحولة سلالة 02161.3؛ حارة 4: السلالة المحولة خارج الرحم إلخ 02161.2؛ حارة 5: حذف متحولة سلالة 09930.3؛ حارة 6: الحذف متحولة سلالة 09930.10؛ حارة 7: السلالة المحولة خارج الرحم إلخ 09930.4. أعد الطباعة بإذن من المرجع 1 .
gether.within الصفحات = "1"> 
الشكل 5: تأكيد متحولة الحذف عن طريق ير. تحليل الحذف و خارج الرحم فوزريوم فيرتيسيليوادس ترانزفورمانتس للجين FVEG_13253. الممرات 1 أعلى وأسفل، علامة؛ الممرات 2-6 أعلى هلام ترانسفورمانت ير 5 'خارج التضخيم جزء؛ الممرات 7-11 أعلى هلام أورف التضخيم. الممرات 2-6 أسفل هلام هيغ التضخيم الجيني. الممرات 7-11 أسفل هلام 3 'خارج التضخيم جزء. عينات هي سلالات الحذف 11/31 (الممرات 2 و 7)، 11/32 (الممرات 3 و 8)، 11/33 (الممرات 4 و 9)، والمحولات خارج الرحم 11/34 (الممرات 5 و 10)، و 11 / 35 (الممرات 6 و 11).
| كتاب تمهيدي | استعمال | تسلسل |
| بريمر O1- (attB2r) | التضخيم من 5'الجناح،التمهيدي إلى الأمام | 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA |
| بريمر O2- (attB1r) | التضخيم من 5'الجناح، التمهيدي العكسي | 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT |
| بريمر O3- (attB4) | التضخيم من 3'الجناح، التمهيدي إلى الأمام | 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT |
| بريمر O4- (attB3) | التضخيم من 3'الجناح، التمهيدي العكسي | 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT |
الجدول 1: التمهيدي أوسكار محددة 5 'ملحقات المضافة إلى تسلسل التمهيدي الجينات محددة.
| كتاب تمهيدي | استعمال | تسلسل |
| OSC-F | 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT | |
| OSC-R | أوسكار عكس التمهيدي التسلسل، متواليات حبلا لمكافحة الشعور 5 'الجناح | 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT |
| هيغر (210) | عكس التمهيدي التسلسل، متواليات حبلا لمكافحة الشعور 5 'الجناح | 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA |
| هيغف (850) | تسلسل التمهيدي إلى الأمام، تسلسل الشعور حبلا من 3 'الجناح | 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG |
| جديد هيغ علامة إلى الأمام | لتضخيم الجين المقاومة هيغروميسين كعنصر تحكم (جنبا إلى جنب مع جديد هيغ علامة عكس التمهيدي أدناه) | 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA |
| جديد هيغ علامة عكس | لتضخيم الجين المقاومة هيغروميسين كعنصر تحكم (جنبا إلى جنب مع جديد التمهيدي علامة التمهيدي إلى الأمام أعلاه) | 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG |
الجدول 2: الاشعال لتحليل بنى حذف أوسكار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم بناء خطوة واحدة بناء الجراثيم -Recombination جاهزة البلازميدات (أوسكار) بنجاح مع عدد متزايد من الفطريات أسكوميكوتا. وينبغي أيضا أن تكون الطريقة قابلة للتطبيق بسهولة على باسيديوميكوتا والأنواع من فيلا الفطرية الأخرى (مع المروجين المناسب يقود الجينات علامة للاختيار)، على افتراض التحول بوساطة أغروباكتريوم وإعادة التركيب مثلي ممكنة. وقد تم إنشاء ناقلات علامة إضافية لتنويع الخيارات من مركب مضاد للفطريات وكذلك السماح لإنتاج المسوخ مزدوجة وأعلى النظام. وتشمل هذه المقاومة ل G418، نورسوثريسين، ومؤخرا مبيدات الأعشاب غلوفوسينات الأمونيوم و كلوريمورون إيثيل 4 .
وقد وضعت هذه الطريقة للاستخدام مع فرتيسيليوم دالياي التي الصور الواردة هنا مشتقة في المقام الأول 1 . وقد استخدمت مؤخرا أوسكار على نطاق واسع للحذف من الجينات في الفطر ميكوتوكسيجينيك فوساريوم فيرتيسيليوادس. تم إجراء أكثر من 60 بناء الحذف وحذف المسوخ لأكثر من 30 الجينات التي تم إنشاؤها (غير منشورة).
في التكرار الحالي تتطلب العملية حوالي 4-6 أسابيع لديك مجموعة من المسوخ الحذف المؤكد في متناول اليد. وفيما يلي قائمة مختصرة بالخطوات الرئيسية التي وضعتها أوسكار والوقت التقريبي اللازم لإنجازها: 1) تصميم وشراء الاشعال أوسكار استنادا إلى بيانات الجينوم (5 أيام)، 2) تضخيم الجناح والاستنساخ، (2 أيام)، 3) (4 أيام)، 5) إنتاج المحولات من قبل أتمت في فوزاريوم فيرتيسيليوادس وتنمو (2 أسابيع، لاحظ أن هذا يعتمد على معدل النمو من قبل مينيبريب والتسلسل (1 أسبوع)، 4) إدخال البلازميد في أغروباكتريوم ل أتمت من الفطريات قيد الدراسة)، والتحلل الحراري و ير تحديد الأنماط الجينية المحولة (2 أيام)، 6) واحد سبورينغ، تأكيد النمط الجيني والتخزين (1-2 أسابيع).
أس = "jove_content"> لم يتم محاولة تكييف أوسكار إلى إنتاجية عالية حقيقية إلى معرفتنا ولكن يجب أن تكون عملية. ردود الفعل قوية بما فيه الكفاية للسماح للتطبيق الناجح في شكل متعدد جيدا. ومن المؤكد أن استخدام الروبوتات سيعزز هذا النهج. الأسلوب أوسكار لديه الوقت توفير ميزة تتطلب رد فعل إعادة التركيب واحد يحتوي على أجنحة تضخيم واثنين من البلازميدات بوسكار و با-هيغ أوسكار. تتطلب نهج مماثلة جيل من استنساخ دخول التي يجب تأكيدها ثم استخدامها في رد فعل الثاني لتوليد بناء الفائدة. البلازميدات بوسكار و با-هيغ أوسكار المذكورة متوفرة عن طريق أدجين أو مركز الأوراق الوراثية الفطرية 15 . يمكن أن تكون البلازميدات أوسكار علامة أخرى مثل با-بار-أوسكار و با-سور-أوسكار متاحة من المؤلفين 5 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون طلاب المرحلة الجامعية والثانوية التالية لعملهم لتوليد المسوخ أوسكار في فوساريوم فيرتيسيليويوديس : أنجليكا ميلر، اطهر نصير، شيوى لين، كاتلين وودبوري، تشيلسي باترسون، كاثلين روبرتسون، كريستينا برادلي، أشتون روجرز، أليكسيس ماكنزي، ماني هرنانديز ، أشلي كريبساك، جيف ديلونغ، كريستيان كينغ، جي جيونغ، ماريا بلدينج، كريستي بور، دانيال أوميرا، لورين (فيكتوريا) كوك، جيك غودمان، سامبريتي دي، أوج أوكوي، أليسا بيكستيد، غاريت هيبس، نيك غولدستين، كارولين توم ، كريس بينسون، لويس ستوكس، هانا إيتل، جين هولز، جاسم محمد، جيمس لوجينز، كيلي راسل، غريشنا جونز، كريستين شيفر، مريم حمادي، آفا ويلسون، كاترينا بازيمور، توني هاربر، كارلين ماكغي، محمد مومين، ريما مومين ، ثي نغوك لي وأنجل فام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5α One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria, etc. | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamycin | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
References
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
- Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8 (2), 172 (1990).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).
