Summary
Hier, wordt een protocol (MitoCeption) voorgelegd aan mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) over te dragen, glioblastoma stamcellen (GSC), met als doel het bestuderen van hun biologische effecten op het metabolisme en de functies SGR. Een soortgelijk protocol kan worden aangepast aan mitochondriën dragen tussen andere celtypen.
Abstract
Mitochondriën spelen een centrale rol voor de celstofwisseling, de productie van energie en de controle van apoptose. Onvoldoende mitochondriale functie is verantwoordelijk voor de zeer uiteenlopende ziekten gevonden, variërend van neurologische aandoeningen aan kanker. Interessant mitochondria is onlangs aangetoond dat het vermogen weer worden overgedragen tussen celtypen, zoals uit menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) om kankercellen in coculture omstandigheden met metabole en functionele consequenties voor de mitochondriën ontvangende cellen, verdere verbetering van de huidige belangstelling de biologische eigenschappen van deze organellen.
De effecten van de MSC overgedragen mitochondriën in de doelcellen van primair belang voor de biologische resultaat van deze cel-cel interacties begrijpen. De MitoCeption protocol beschreven voor de overdracht van de mitochondria vooraf geïsoleerd uit de donorcellen aan de doelcellen met behulp MSC mitochondriaen glioblastoma stamcellen (SGR) als modelsysteem. Dit protocol is eerder gebruikt om mitochondriën geïsoleerd overbrengen van MSCs tot MDA-MB-231 kankercellen beoefenaar. Deze mitochondria transfer protocol wordt hier aangepast voor GSCs dat de specifieke bijzonderheid van groeien als neurosferen in vitro te presenteren. De overdracht van de geïsoleerde mitochondria kan worden gevolgd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en confocale beeldvorming met behulp mitochondria vitale kleurstoffen. Het gebruik van mitochondria donor en doelcellen met verschillende haplotypen (SNPs) maakt ook detectie van het overgedragen mitochondriën gebaseerd op de concentratie van de cirkelvormige mitochondriaal DNA (mtDNA) in de doelcellen. Nadat het protocol is gevalideerd met deze criteria, kunnen de cellen die de overgedragen mitochondria verder geanalyseerd om het effect van de exogene mitochondriën biologische eigenschappen zoals celmetabolisme, plasticiteit, proliferatie en respons op behandeling vast te stellen.
Introduction
Mitochondriën zijn organellen in eukaryote cellen waar ze een centrale rol spelen bij voedselopname en energie en metabolietproductie. Deze organellen bevatten circulair mitochondriaal DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, dat eiwitten van het elektron transport keten complexen, tRNA en rRNA 1 codeert. De functionaliteit van deze organellen is essentieel voor celhomeostase en verscheidene ziekten zijn geassocieerd met dysfunctie mitochondria 1, 2, 3. De status mitochondria is bijvoorbeeld in verband gebracht met ontsteking, chronische infecties en kanker, in het laatste geval met gevolgen voor metastase en therapieresistentie 4, 5, 6, 7.
Mitochondriën tonen de opmerkelijke capaciteit van krijgen overgedragen tussen "donor" en "target" cellen. Dit leidt tot veranderingen in de energetische metabolisme van de doelcellen en in andere functionele modificaties zoals weefselherstel en resistentie tegen chemotherapeutische middelen, zoals onlangs aangetoond door verschillende laboratoria 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) tonen het vermogen om mitochondriën te dragen aan een grote verscheidenheid aan doelcellen, zoals cardiomyocyten, endotheelcellen, pulmonaire alveolaire epitheelcellen, renale tubulaire cellen en kankercellen, leidend tot modificaties van de functionele eigenschappen van deze cellen 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitochondriën uitwisseling wordt nu als een veel gebruikt mechanisme dat een aantal verschillende celtypen te communiceren met elkaar en hun biologische eigenschappen wijzigen. Deze mitochondria uitwisseling kan plaatsvinden door middel van tunneling nanobuisjes (TNT) formatie, waarbij connexine 43-bevattende gap junctions 8 of M-Sec / TNFaip2 en de exocyst complex 19. Als alternatief werd de mitochondriën overdracht ook getoond te worden gemedieerd door arrestin-domein bevattend eiwit 1 gemedieerde microvesicles (ARMMs) 20. Interessant is dat de effectiviteit van de mitochondria overschrijving verbonden met de expressiesnelheid van de Rho GTPase 1 MIRO1 21, een belangrijke factor voor het verklaren van de verschillen in mitochondria overdracht efficacies tussen iPSC-MSCs en volwassen BM-MSC 22.
Desondanks schat aan gegevens betreffende cel-cel mitochondriën uitwisseling relatief weinig bekend over het metabolisme en biologische uitkomst van deze mitochondria overdracht. Daarom rechtvaardigt het opzetten van de juiste tools om de biologische effecten van deze overdracht volledig te kunnen beoordelen. Door de jaren heen een aantal technische benaderingen overbrengen mitochondria van donor naar acceptor cellen zijn voorgesteld. Dit omvat directe injectie van mitochondriën in oöcyten 23, 24, 25, celfusie te 26 genereren transmitochondrial cybriden, 27 en, meer recentelijk, de overdracht van geïsoleerde mitochondria gebruik fotothermische nanoblades 28.
Wij en anderen eerder aangetoond het vermogen van geïsoleerde mitochondria worden geïnternaliseerd door levende cellen, zoals waargenomen zowel in vitro als in vivo 29, 30, 31, via mechanismen voorgesteld macropinocytose 32 betrekken. Verder hebben we een methode ontwikkeld, genaamd MitoCeption om kwantitatief geïsoleerde mitochondria (van MSCs) aan doelcellen, zoals bijvoorbeeld de (lid) MDA-MB-231 borstkanker cellijn 31. Dit protocol werd aangepast hier voor de overdracht van geïsoleerde menselijke MSC mitochondriën glioblastoma stamcellen (GSC).
Glioblastoom zijn agressieve kwaadaardige tumoren van de hersenen die snel resistent zijn tegen behandeling te worden, vooral als gevolg van glioblastoma stamcellen (GSC) die aanwezig zijn in de tumor 33. Deze GSCs groeien als neurosferen in vitro en het genereren van tumoren in xenograft modellen. Kankercellen binnen glioblastoma hebben devermogen om cel-cel verbindingen te maken, zoals recent aangetoond voor astrocyten hersentumor cellen die interconnect via uitgebreid microbuizen, waardoor mitochondriën (als calcium en celkernen) kan migreren, wat resulteert in radiotherapie-resistente astrocytoom netwerken 34. Glioblastoma een groot aantal verschillende cellen rekruteren in de tumor micro-omgeving, zoals MSC's 35, 36. We toonden aan dat MSCs cel-cel verbindingen met GSC in coculture kunnen maken en hun mitochondria (gegevens niet getoond), die naar verwachting SGR functionele eigenschappen te wijzigen overdragen. Dit protocol beschrijft hoe de MitoCeption techniek kan worden gebruikt om mitochondriën geïsoleerd voren brengen van menselijke MSCs, menselijke GSCs met de bepaling van de functionele biologische uitkomst. De multipotente en zeer tumorigene GB4 GSC lijn 37 werd gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. Etikettering van de mesenchymale stamcel (MSC) Mitochondriën (optioneel)
- Twee dagen voor de bereiding mitochondria, zaad menselijke MSCs in een 100 mm kweekschaal, in 10 ml aMEM / 10% FBS, om 4 x 10 5 MSC's in cultuur op dag 1.
- MSCs spoelen met PBS (4 ml) en voeg 4 ml aMEM / FBS 1% (voorverwarmd tot 37 ° C).
- Voeg de vereiste hoeveelheid mitochondria vitale kleurstof en incubeer cellen gedurende 30 min in 37 ° C incubator.
- Verwijder de mitochondria kleurstofoplossing, tweemaal spoelen cellen met 4 ml voorverwarmd (37 ° C) aMEM / FBS 1% en voeg opnieuw 4 ml aMEM / 10% FBS. Incubeer cellen bij 37 ° C.
- Verander het kweekmedium (10 ml aMEM / FBS 10%) na 30 min en een andere keer, 2 uur later.
Dag 1
2. Etikettering van de Glioblastoma Stem Cells (GSC) (optioneel, zie Overleg sectie)
| Celkweekmedium | Samenstelling |
| GSC basismedium | DMEM / F-12 gesupplementeerd met |
| Insuline 20 mg / ml | |
| N2 supplement 1x | |
| Glucose 3 g / l | |
| L-glutamine 2 mM | |
| GSC proliferatie medium | Toe te voegen aan de basale medium: |
| B27 supplement 1x | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizone 0,25 mg / ml | |
| Heparine 2 mg / ml | |
| Ciprofloxacine 2 ug / ml | |
| Gentamicine 2 ug / ml | |
| MSC proliferatie medium | & #945, MEM gesupplementeerd met |
| L-glutamine 2 mM | |
| 10% FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tabel 1: Culture Media.
- Distantiëren GSCs (GB4 cellijn 32 (10 x 10 6 cellen) gekweekt als neurosferen op poly-HEMA gecoate celkweek kolven (zie stap 3,1-3,12).
- GSC zaad in een 48-well plaat bij 10 5 cellen / putje in GSC proliferatie medium (500 pl) (zie tabel 1).
- Centrifugeer de plaat bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
- Voeg de vereiste hoeveelheid cellen vitale kleurstof en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 500 pl GSC basaal medium (tabel 1) per putje van de 48-well plaat.
- Centrifugeer de plaat bij 270 x g bij 20 ° C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant.
- Herhaal stap 2,5-2,6.
- Voeg 500 pl GSC basismedium en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de plaat bij 270 x g bij 20 ° C gedurende 5 minuten. Zuig het supernatant.
- Voeg 500 pl GSC proliferatie medium per putje van de 48-well plaat en incubeer in de 37 ° C incubator.
Opmerking: De hoeveelheid GSC aangegeven (10 x 10 6 cellen) kan uitvoeren van verschillende dosis-respons experimenten en FACS controles. Zodra de experimentele omstandigheden nauwkeuriger gedefinieerd dit bedrag kan worden afgebouwd.
Dag 2
3. Seeding van glioblastoma Stem Cells
- Verzamel de GSC neurosferen (10 x 10 6 cellen) door centrifugatie bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C in een 50 ml buis.
- Was de cellen met 5 ml HBSS en centrifugeer bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
- Zuig het supernatant.
- Voorzichtig resuspendeer de SGR pellet in 100 ui trypsine-EDTA (0,25%) (per 10 x 10
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min.
- Voeg 10 gl CaCl2 (20 mM) en 2 gl DNase I (10 mg / ml).
- Distantiëren de neurospheres door zachtjes en neer te pipetteren (30-50x) met een P200 pipet. Vermijd bubbels. Controleer onder de microscoop dat alle GSC's worden gescheiden.
- Voeg 10 ul trypsine inhibitor (5%) en 10 ml HBSS.
- Centrifugeer GSCs bij 270 xg gedurende 7 minuten bij 20 ° C.
- Verwijder het supernatant en voeg 10 ml GSC basaal medium (tabel 1).
- GSC rekenen met een Thoma telkamer en centrifugeer de cellen bij 270 xg gedurende 7 minuten bij 20 ° C.
- Voeg de juiste hoeveelheid GSC proliferatie medium (tabel 1) bij de cellulaire concentratie van 10 6 GSC / ml bereikt.
- Zaad 10 5 GSC (100 pl van de celsuspensie) per putje van een 96-wells plaat.
- Centrifugeer de platen bij 270 xg gedurende 7 minuten bij 20 ° C te GSCs krijgen op het bottom putten.
- Incubeer de 96-well plaat bij 37 ° C wanneer deel 5.
Dag 2
4. MSC Mitochondriën Isolation
- Stel de microbuis centrifuge temperatuur tot 4 ° C.
- Bereid twee 1,5 ml buisjes "A" en "C" met de reagentia voor de mitochondriën extractie (200 ul reagens A en 400 pi reagens C, zowel met de EDTA-vrije protease remmers). Bereid 2 andere tubes, het label "MSC" en "Mito". Houd alle buizen op ijs. Ook bereiden buizen voor de mitochondriën seriële verdunningen.
- MSCs wassen met 10 ml voorverwarmd (37 ° C) PBS.
- MSCs wassen met 2 ml trypsine (geen EDTA) gedurende 10 sec en voeg 1 ml trypsine (zonder EDTA). Incubeer cellen gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C.
- Herstellen van de MSC's door het toevoegen van 10 ml aMEM / FBS 10%, over te dragen aan een 50 ml buis.
- Centrifugeer cellen bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
- Verwijder het supernatant en voeg10 ml aMEM / 10% FBS aan de cel pellet.
- Tel de MSC's met een Malassez telkamer.
- Centrifuge MSCs (4-5 x 10 5) bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
- Verwijder het supernatant, voeg 10% 1 m ijskoude aMEM / FBS aan de celpellet en overbrengen van de cellen naar de "MSC" gemerkte buis (bereid bij stap 4.2). Houd de buis op ijs.
- Centrifugeer de buis met het MSC's bij 900 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder alle resten van het medium van de buis.
- Voeg 200 ul van Mitochondriën Isolation Reagent A (met de EDTA-vrije protease remmers). Vortex bij gemiddelde snelheid gedurende 5 seconden en laat buizen op ijs gedurende precies 2 minuten.
- Voeg 2,5 ul van Mitochondriën Isolation Reagens B. Vortex op maximale snelheid gedurende 10 seconden, en dan laat buizen op ijs. Herhaal elke 30 seconden gedurende 5 min.
- Voeg 200 ul van Mitochondriën Isolation Reagens C (met de EDTA-vrije protease remmers). Meng door het kantelen van de buis (roughly 30 keer, niet vortex). Centrifugeer de buis bij 700 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Breng de supernatant (dat het MSC mitochondria) op "Mito" tube (bereid bij stap 4.2).
- Centrifugeer bij 3000 xg, 15 minuten bij 4 ° C, de mitochondria pellet krijgen. Verwijder het supernatant. De pellet bevat het geïsoleerde mitochondria.
- Spoel de mitochondria pellet met 200 ul van de reagens C. Vervolgens centrifuge bij 12.000 xg, 5 min bij 4 ° C, de mitochondria pellet krijgen.
5. Overdracht van geïsoleerde MSC Mitochondriën om GSCs (MitoCeption)
- Voeg 200 ul van de vooraf gekoelde (0 ° C) GSC proliferatie medium naar de mitochondriën pellet geïsoleerd uit MSCs (4 x 10 5).
- Verdun de mitochondria preparaat (in GSC proliferatie gemiddeld) consistent 20 ui mitochondriale suspensie toevoegen GSCs.
- Voeg het volume van geïsoleerde mitochondria in de putjes van de 96-well plaat met de GSC (uit stap 3,15), in de gewenste concentratie (0,1 tot 10 ug). Voeg de mitochondria langzaam, dicht bij de bodem van de put, die het gehele oppervlak ten minste eenmaal.
- Bestrijding MSC mitochondria vitale kleurstof lekkage dezelfde hoeveelheden van de mitochondria preparaat (0,1 tot 10 ug) toevoegen aan putjes van een 96-well plaat met GSC proliferatie medium alleen (geen GSC) (zie deel 6,2 voor vitale kleurstof lekdetectie).
- Centrifugeer de 96-well plaat met de mitochondria ontvanger GSCs de mitochondria MSC (stap 5.3) en de stuurplaat (stap 5,4) bij 1500 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Plaats de kweekplaten in de 37 ° C celincubator onmiddellijk na centrifugeren.
Opmerking: De mitochondria overdrachtsprotocol voert het centrifugeren van de mitochondriën vering van de gekweekte cellen op de passende centrifugatie kracht, met een aantal centrifugeren kunnen worden aangepast afhankelijk van de system mitochondria donor / ontvanger-cellen.
Dag 3
6. Analyse van de mitochondria Transfer door FACS en confocale Imaging
- Bereiding van GSC monsters voor FACS-analyse
Opmerking: Als MSC mitochondria werden gelabeld met een vitale kleurstof vooraf (paragraaf 1), kan de efficiëntie worden gevolgd door FACS, 24 uur na de mitochondriën overdracht.- Centrifugeer de 96-well plaat met de MitoCepted GSCs bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
- Verwijder het supernatant.
- Voeg 100 ul trypsine (geen EDTA) in elk putje. Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 min. Pipet op en neer naar de neurosferen gevormd in de 24 uurs periode distantiëren.
- Voeg 100 ul van GSC basale medium.
- Centrifugeer de plaat bij 270 xg gedurende 5 minuten bij 20 ° C en werp de supernatant.
- Resuspendeer GSC's in 300 ul GSC basaal medium en transfer naar FACS aangepaste buizen.
- Voer de FACS eenalysis.
- Controle voor mitochondria vitale kleurstof lekkage uit de geïsoleerde mitochondriën (FACS)
Noot: Het doel van deze stap is de achtergrond FACS signaal dat zou duiden op een echte MSC overdracht mitochondria maar eerder het enkele lekken van vitale kleurstof van de gelabelde MSC mitochondriën voor MitoCeption (stap 5,3) te bepalen.- Zaad SGR cellen zoals beschreven in stap 3,1-3,15.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Centrifugeer de 96-well plaat met mitochondria slechts (van stap 5,4-5,6) bij 1500 g gedurende 5 min bij 20 ° C.
- Zuig het kweekmedium van de GSC 96-well plaat (stap 6.2.2) en vervang deze door het medium geïncubeerd met mitochondriën alleen (supernatant van stap 6.2.3).
- Incubeer de 96-well plaat met de GSC bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Ga als in de stappen 6.1.1 tot en met 6.1.7 voor FACS-analyse.
- Voorbereiding van de GSC samples voor confocale beeldvorming
Opmerking: Indien de overdracht van MSC mitochondriën om GSCs moet worden geanalyseerd met behulp van fluorescentie beeldvorming, zowel MSC en GSCs moet vooraf respectievelijk worden geëtiketteerd, met mitochondriën (stap 1) en mobiele (stap 2) vitale kleurstoffen.- Bereid GSCs zoals in de stappen 6.1.1 tot en met 6.1.5.
- Resuspendeer GSCs in 2 ml GSC proliferatie medium dat 2% FBS en zaad in 35 mm cultuur gerechten (glazen bodem).
- Voeren confocale beeldvorming op GSCs met de overgedragen fluorescerende mitochondria MSC 24 uur later.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De procedurestappen waarin de isolering van mitochondriën uit mesenchymale stamcellen (MSC) en de overdracht van het beoogde glioblastoma stamcellen (GSC) van MitoCeption zijn weergegeven in figuur 1. GSCs zijn kanker stamcellen gekweekt als neurospheres om hun stamcellen eigenschappen te behouden. Voor het protocol, worden GSCs gezaaid als enkele cellen van een paar uur voor de overdracht van de mitochondria (stap 3) tot een hogere mitochondria overdracht efficiency toe (zie FACS data figuur 3B). Volgende afdeling 5 (dag 3), zijn deze cellen meer waargenomen als deel neurosferen (figuur 1).
Beeldvorming van de GB4 GSC, 72 uur na MitoCeption met fluorescent gelabelde MSC mitochondria, blijkt dat de MSC mitochondriën gelokaliseerd binnen de GB4 GSCs, zoals blijkt uit de orthogonale verkregen confocale beelden (figuur 2B). De overgedragen MSC mitochondriën gelokaliseerd verschijnen gehele GSCs, zoals dit ook het geval is voor de endogene GSC mitochondria (Figuur 2A). Confocale beeldvorming van de MitoCepted GSC werd ook uitgevoerd met MSC mitochondria prelabeled met een donkerrode vitale kleurstof zodat dezelfde SGR monsters werden beiden geanalyseerd door FACS (zie figuur 3A) en beeldvorming (figuur 2C). De overdracht van MSC mitochondria worden waargenomen voor de meeste GSC (panel a) en 3D-reconstructie uit GSC confocale beelden bevestigd de intracellulaire lokalisatie van de MSC overgedragen mitochondria (kaders b, c). Voormerkend GSC (op dag 1) met zowel blauwe cellulaire en rode mitochondriale vitale kleurstoffen mogen visualiseren localisatie overgedragen MSC mitochondria (gekleurd in groen) ten opzichte van de endogene SGR mitochondria (rood), na de MSC mitochondria overdracht (figuur 2D) .
terwijl confocal imaging maakt het controleren van de intracellulaire lokalisatie van de overgedragen MSC mitochondria na MitoCeption, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is het middel bij uitstek om de mitochondria overdracht te kwantificeren, mits MSC mitochondriën werden prelabeled met een vitale kleurstof. Zoals getoond in figuur 3A, MitoCeption met toenemende hoeveelheden fluorescerende MSC mitochondria geleid tot meer FACS signalen. Opmerkelijk dit signaal (rood) was verscheidene orden van grootte hoger is dan het signaal verkregen in de controle omstandigheden (in blauw, zie stap 6,2). Deze verdere bewijs geleverd dat de FACS signaal representatief MSC mitochondria overgedragen binnen GSCs en niet slechts het resultaat van de fluorescerende vitale kleurstof lekkage uit het gelabelde MSC mitochondria. De mitochondria overdrachtsprotocol hier gepresenteerde uitgevoerd op enkele cel GSCs, vertoonde een dosisafhankelijke respons (Figuur 3B). De efficiëntie van de mitochondria MSC overdracht werd ook geëvalueerd op neurospheres. Hoewel hieruit bovendien MSC overdracht naar de mitochondriën GSCs, de werkzaamheid van de overdracht was lager, zoals blijkt uit een representatief experiment (Figuur 3B).
De overdracht van MSC mitochondria en het onderhoud in het GSC kan worden gevolgd door het kwantificeren MSC mitochondriaal DNA (mtDNA) in de GSC. Dit vereist MSCs en GSCs te verkrijgen van verschillende donoren, met verschillende haplotypes. Figuur 3C toont mtDNA sequenties gevonden in de D-lus van twee donoren single nucleotide polymorphisms (SNPs) aangegeven aan de 3 'eindpositie. Voor het ontwerp van PCR-primers, specifiek amplificeren mtDNA van zowel donor 1 of 2 donor een extra mutatie werd geïntroduceerd op positie n-2 ten opzichte van het 3 'uiteinde van de PCR primers. De mtDNA van donor 1 kan worden versterkt met de set van primers: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'en 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (universal sequencing primer 38), terwijl het stel primers: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(universele sequencing primer van 38) en 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' werd gebruikt voor het amplificeren van mtDNA donor 2.
Figuur 1: Workflow voor de overdracht van geïsoleerde MSC mitochondria te GSCs door MitoCeption. De 7 stappen voor het MitoCeption MSC mitochondriën GSCs en de daaropvolgende SGR analyses worden getoond. De stap nummers worden aangegeven in de sectie protocol. Als MSC en GSC etikettering niet wordt uitgevoerd, als voor functionele analyses, stap 1 en 2 kunnen worden weggelaten en het protocol kan worden gevolgd vanaf de eerste dag 2 op. Fasecontrastbeelden vertegenwoordigen GB4 GSCs als neurosferen (dag 1), als eencellige kweek klaar voor de MSC overdracht mitochondriën (dag 2) en 24 uur na de overdracht mitochondria (dag 3). Schaal bar =100 urn. In stap 4, vertegenwoordiger microfoto van geïsoleerde MSC mitochondria, prelabeled met Mitotracker Red CMXRos voor isolatie van MSC's. Schaal bar = 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: beeldvorming van GB4 endogene mitochondria en MSC mitochondria na overschrijving naar de GB4 GSCs door MitoCeption. (A, B, C) GB4 GSCs werden met de groene vitale kleurstof. (B, C, D) GB4 GSCs MitoCepted werden met 2,5 ug MSC mitochondria preparaat (10 5 GSC). (A) GSCs werden gemerkt met Mitotracker Red CMXRos en gedurende 48 uur (GSC proliferatie medium w / o EGF / bFGF).(B) GSC confocale sectie en orthogonale uitzicht, 72 uur na MitoCeption met Mitotracker Red CMXRos-gelabelde MSC mitochondria (kweekmedium: GSC proliferatie medium / FBS 2%). (C, D) MSCs werden prelabeled met een donkerrode mitochondria vitale kleurstof (dezelfde omstandigheden als voor FACS analyse) vóór de overdracht van MSC mitochondriën GSCs. Na de MSC overdracht mitochondriën werden uitgezaaid in GSC GSC proliferatie medium met FBS 10%. (C) isosurface uitzicht (b, c) met xy vlakke doorsnede (c) van een GSC 3D-reconstructie van confocale beelden (48 uur na MitoCeption). (D) GB4 GSCs werden gemerkt met een blauwe cel vitale kleurstof en een rode mitochondria vitale kleurstof voor de overdracht van MSC mitochondria prelabeled met een diep rode mitochondria vitale kleurstof (afgebeeld in groen). bekeken isosurface met xz (b) en xy (c) vlakke doorsneden van een 3D reconstructie uit GSC confocale beelden (72 uur na de MSC mitochondria transfer). Alle cellen were gezaaid op kweekschalen met glazen bodem en afbeeldingen werden genomen op levende cellen. Schaal bars = 5 micrometer, behalve voor het C-paneel (a) waar de schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van de mitochondria overdracht van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en detectie van MSC mitochondriaal DNA (mtDNA) in GSCs. (A, B) werden GSCs MitoCepted MSC mitochondria prelabeled met een donkerrode mitochondria vitale kleurstof en geanalyseerd door FACS. (A) Representatieve FACS resultaten verkregen met MitoCepted GSC (rood, van boven naar beneden: 0,6, 1,2, 2,5, 5, 10 ug MSC mitochondria preparaat (10 5 GSC)). In blauw, voor each paneel, controle FACS profiel van GSC geïncubeerd met de geconditioneerde kweekmedium met dezelfde hoeveelheid MSC mitochondriën als voor MitoCeption (zie stap 5,4). Controle voorwaarden ongelabelde GSC's in zwart (boven). (B) Relatieve gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) verkregen na de mitochondriën transfer bij eencellige GSC (- •) (gemiddelde van 3 experimenten met SEM) op eendaagse GSC neurosferen (- o) en met controle mitochondria supernatanten op GSC enkele cellen (-). (C) DNA sequenties in het mtDNA D-lus en SNP verschillen tussen donoren 1 en 2 SNPs zijn aangegeven in blauw bij het 3 'uiteinde van de sequenties. Ontwerp van primers voor specifieke PCR amplificatie van mtDNA van zowel donor (spe primers 1 en 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Steeds studies tonen aan dat cellen mitochondriën kunnen uitwisselen en dat deze mitochondriën ingrijpende effecten op de doelcel metabolisme en functie. Daarom is het essentieel om de juiste spullen voor mitochondria kwantitatief uit de donorcellen deze doelcellen goed bestuderen van de biologische effecten mogelijk te maken.
De hier beschreven protocol was oorspronkelijk uitgewerkt mitochondriën geïsoleerd uit menselijke mesenchymale stamcellen dragen aan de hechtende kanker cellijn MDA-MB-231 33. Zoals hier getoond, kan worden aangepast voor kanker stamcellen die neurosferen groeien als in vitro. Hoewel de mitochondriën overgang optreedt wanneer MSC mitochondriën worden toegevoegd aan het SGR neurosferen bleek efficiënter op enkele cel GSCs zijn, zoals in het onderhavige protocol. Dit protocol kan ook worden geëxtrapoleerd naar andere niet-hechtende cellen, zoals T-cellen, met de noodzaak om eendapt de gezaaide cel concentratie voor de MitoCeption stap.
De mitochondria preparaat moet worden uitgevoerd op ijs om hun integriteit. Mitochondriën preparaten met verminderde besmetting door andere verbindingen cytosol te verkrijgen, wordt centrifugeren voor het herstel van mitochondriën uitgevoerd bij 3000 xg gedurende 15 min. Om de hoeveelheid MSC mitochondriën worden gebruikt voor de overdracht aan de GSCs controleren, is de mitochondriën eiwitgehalte bepaald. Daartoe worden mitochondriën eiwitextracten bereid met RIPA-buffer, aangevuld met proteaseremmers. De eiwitconcentratie werd bepaald met behulp van de bicinchoninezuur assay, volgens de instructies van de fabrikant. Bovine serum albumine werd als standaard gebruikt. Gemiddeld 10 ug eiwitten werden verkregen uit 100.000 MSCs.
Labeling MSC mitochondria met een vitale kleurstof maakt het kwantificeren van de efficiëntie van de overdracht mitochondria, door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), en het bepalen van de lokalisatie van de overgedragen mitochondria door confocale beeldvorming. De GSC kan worden gemerkt met dezelfde mitochondriën vitale kleurstof als de MSC's. Deze cellen worden gebruikt als een positieve controle voor de FACS-analyse. Als alternatief kan GSCs worden gemerkt met een vitale kleurstof mitochondriën dan die van de MSC's, waarbij de lokalisatie van de MSC overgedragen mitochondriën opzichte van de endogene SGR mitochondria. De dieprode mitochondria vitale kleurstof is geschikt voor FACS-analyse, terwijl de groene en rode kleurstoffen mitochondriën hebben de voorkeur voor confocale beeldvorming. Van groot belang, moet MSC blootstelling aan EDTA worden vermeden bij alle stappen van het protocol. Daarom wordt aanbevolen trypsine cel met trypsine en zonder EDTA; de cocktail van proteaseremmers voor de mitochondriën preparaat zijn, maar ook, ervan elk EDTA. In aanwezigheid van EDTA, een lekkage van de mitochondria vitale kleurstof van MSC mitochondria waargenomen. Als de mitochondriën transfer GSCs wordt geanalyseerd door microscopie, moet de ontvanger glioblastoma cellen worden gemerkt met een vitale kleurstof. De groene en blauwe cel kleurstoffen (zie materialen en reagentia tabel) werden de voorkeur, want ze geven een meer homogene cel etikettering, waardoor 3D-reconstructie van confocale beelden.
Nadat het protocol is gevalideerd door de gebruiker met zijn specifieke cellen, zal mitochondria etikettering worden gelaten voor functionele studies, om mogelijke biologische vooroordelen weg staan. Dosis-respons analyse over een breed bereik van concentraties MSC mitochondria met seriële verdunningen van de mitochondria preparaat, wenselijk. In feite moet worden opgemerkt dat de biologische effecten van de overgedragen mitochondriën kan worden bereikt mitochondria lage concentraties in het lagere bereik voor detectie of beeldvorming door FACS. Deze functionele studies, met inbegrip van onderzoeken naar GSC metabolisme, proliferatie en de respons op de behandeling, worden uitgevoerd de dag na demitochondria overdracht.
Als MSCs en GSCs zijn geïsoleerd van verschillende donoren (met verschillende mtDNA haplotypes), kan de MSC overgedragen mitochondria worden gevolgd door het meten van de concentraties van MSC mtDNA in de beoogde GSCs. Het onderscheid tussen de MSC en endogene GSC mtDNAs is gebaseerd op de aanwezigheid van SNPs, specifiek voor elk celtype, in het mtDNA hypervariabele D-lusgebied. Derhalve tussen de verschillende toepassingen van de MitoCeption techniek kan worden overgebracht mitochondria herbergen mitochondrial DNA met verschillende haplotypen maakt niet alleen de detectie van de overgedragen mitochondria maar ook de middelen om de biologie van mtDNA onderhoudsonderzoek, waaronder de analyse van het haplotype uitsluiting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), waarmee CJ en ML.V. zijn aangesloten, heeft een octrooiaanvraag ingediend op de MitoCeption techniek (EP14306154.7).
Acknowledgments
Wij danken Andrea Parmeggiani (L2C en DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), evenals leden van het laboratorium voor nuttige discussies, Christophe Duperray voor hulp bij de FACS-analyse, het Montpellier RIO imaging faciliteit (MRI) voor het leveren van de adequate omgeving voor FACS en confocale microscopie. BNM werd ondersteund door een afgestudeerde beurs van de Labex Numev (conventie ANR-10-LabX-20). AB werd ondersteund door een undergraduate beurs van de Universiteit van Warschau en de Europese Unie (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV is een staf wetenschapper van het Nationaal Centrum voor Wetenschappelijk Onderzoek (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
