Summary
Her er en protokoll (MitoCeption) present å overføre mitokondriene, isolert fra humane stamceller (MSC), til glioblastom stamceller (GSC), med mål om å studere deres biologiske effekter på GSC metabolisme og funksjoner. En lignende protokoll kan tilpasses til å overføre mitokondriene mellom andre celletyper.
Abstract
Mitokondrier spiller en sentral rolle for celle metabolisme, energiproduksjon og kontroll av apoptose. Utilstrekkelig mitokondriefunksjon har blitt funnet ansvarlig for meget forskjellige sykdommer, som strekker seg fra neurologiske sykdomstilstander til kreft. Interessant, mitokondrier har nylig blitt vist å vise evne til å bli overført mellom celletyper, særlig fra humane stamceller (MSC) til kreftceller i coculture forhold, med metabolske og funksjonelle konsekvenser for mitokondriene mottakercellene, noe som ytterligere forbedrer den aktuelle for de biologiske egenskapene til disse organeller.
Evaluere effekten av det overførte MSC mitokondriene i målcellene er av primær betydning for å forstå den biologiske resultatet av slike celle-celle interaksjoner. Den MitoCeption Protokollen er beskrevet her muliggjør overføringen av mitokondriene isolert på forhånd fra donorcellene til målcellene, ved hjelp av MSC mitokondrierog glioblastom stamceller (GSC) som et modellsystem. Denne protokollen har tidligere vært brukt til å overføre mitokondriene, isolert fra MSC, til adherente MDA-MB-231 kreftceller. Dette mitokondrier overføringsprotokoll er tilpasset her for GSCs som presenterer den spesifikke spesielle ved vokser som neurosfærer in vitro. Overføringen av de isolerte mitokondrier kan etterfølges av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og konfokal avbildning ved hjelp mitokondrier vitale fargestoffer. Bruken av mitokondrier donor og målceller med forskjellige haplotyper (SNPs) muliggjør også påvisning av de overførte mitokondriene basert på konsentrasjonen av deres sirkulære mitokondrie DNA (mtDNA) i målcellene. Når protokollen har blitt validert med disse kriteriene, kan de celler som de overførte mitokondriene bli ytterligere analysert for å bestemme virkningene av eksogene mitokondrier på biologiske egenskaper slik som cellemetabolisme, plastisitet, proliferasjon og respons på behandling.
Introduction
Mitokondrier er organeller som finnes i eukaryote celler der de spiller en sentral rolle i næringsopptak, samt i energi og metabolitt produksjon. Disse organeller inneholde sirkulært mitokondrie DNA (mtDNA), 16,6 kb langt, som koder for proteiner av elektrontransportkjeden komplekser, tRNA og rRNAs 1. Funksjonaliteten av disse organeller er kritisk for celle homeostase og flere patologier som er forbundet med mitokondrier dysfunksjon 1, 2, 3. Mitokondriene status er for eksempel blitt koblet til betennelse, infeksjonssykdommer og kreft, i dette sistnevnte tilfellet med konsekvenser for metastasering og motstand mot terapi 4, 5, 6, 7.
Mitokondrier vise bemerkelsesverdig kapasitet bli overført mellom "donor" og "mål" celler. Dette fører til endringer i den energetiske metabolismen av målcellene, så vel som i andre funksjonelle modifikasjoner som vevsreparasjon og motstand mot kjemoterapeutiske midler, som nylig vist ved forskjellige laboratorier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De humane stamceller (MSC) for å vise denne evne til å overføre mitokondriene til et bredt utvalg av målceller, inkludert kardiomyocytter, endotelceller, pulmonare alveolare epitelceller, renale tubulære celler og kreftceller, som fører til modifikasjoner av de funksjonelle egenskapene til disse cellene 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitokondrier utveksling fremstår nå som en mye brukt mekanisme som gjør at en rekke forskjellige celletyper for å kommunisere med hverandre og modifisere deres biologiske egenskaper. Dette mitokondrier utveksling kan skje gjennom tunneling nanorør (TNT) formasjon, som involverer connexin 43-holdige gap veikryss 8 eller M-Sec / TNFaip2 og exocyst komplekse 19. Alternativt mitokondriene overføringen ble også vist å være formidlet av arrestin domene-inneholdende protein 1-medierte mikrovesikler (ARMMs) 20. Interessant nok var effekten av mitokondriene overføring knyttet til uttrykket hastigheten av Rho GTPase en MIRO1 21, en nøkkelfaktor for å forklare forskjellene i mitokondriene overførings efficacies mellom iPSC-MSC og voksen BM-MSC 22.
Til tross for denne enorme mengder data om celle-til-celle-mitochondria utveksling, er forholdsvis lite kjent om den metabolske og biologisk resultat av dette mitokondrier overføringen. Derfor det fullt garanterer å sette opp de riktige verktøyene for å vurdere biologiske effekter av denne overføringen fullt. Gjennom årene har flere tekniske tilnærminger overføre mitokondrier fra donor til akseptor-celler har vært foreslått. Dette omfatter direkte injeksjon av mitokondrier i oocytter 23, 24, 25, cellefusjon for å generere transmitochondrial cybrids 26, 27 og, mer nylig, overføring av isolerte mitokondrier som bruker fototermiske nanoblades 28.
Vi og andre tidligere vist kapasiteten av isolert mitochondria å bli internalisert av levende celler, som observert både in vitro og in vivo 29, 30, 31, gjennom mekanismer foreslått å involvere macropinocytosis 32. Vi utviklet ytterligere en fremgangsmåte, kalt MitoCeption, til kvantitativt å overføre isolerte mitokondrier (fra MSC) til målceller, som eksemplifisert med (adherente) MDA-MB-231 brystkreftcellelinje 31. Denne protokollen ble tilpasset her for overføring av isolerte humane MSC mitokondriene til glioblastoma stamceller (GSCs).
Glioblastom er aggressive maligne svulster i hjernen som raskt blir resistente mot behandling, hovedsakelig på grunn av glioblastom stamceller (GSC) til stede i svulsten 33. Disse GSCs vokse som neurosfærer in vitro og generere tumorer i xenograft-modeller. Kreftceller innenfor glioblastom harkapasitet til å gjøre celle-til-celle-forbindelser, slik som vist nylig for astrocytic hjernetumorceller som sammenkoblings via utvidet mikrorør, gjennom hvilke mitokondrier (så vel som kalsium- og cellekjerner) kan migrere, noe som resulterer i radioterapi fast astrocytom nettverk 34. Glioblastom kan rekruttere mange forskjellige celler i tumoren mikromiljøet, inkludert MSC 35, 36. Vi viste at MSC kan gjøre celle-celle forbindelser med GSCs i coculture og overføre sine mitokondrier (data ikke vist), noe som forventes å endre GSC funksjonelle egenskaper. Den nåværende protokollen beskriver hvordan MitoCeption teknikken kan brukes til å overføre mitokondriene, isolert på forhånd fra menneskelige MSC, menneskelige GSCs med det formål å bestemme deres funksjonelle biologiske utfallet. Den multipotent og svært tumorgene GB4 GSC linje 37 ble anvendt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. Merking av Mesenchymale Stem Cell (MSC) Mitokondrier (valgfritt)
- To dager før den mitokondriene fremstillingen, frø humane MSC i en 100 mm kulturskål, i 10 ml aMEM / FBS 10%, slik som å ha 4 x 10 5 MSC i kultur på dag en.
- Skyll MSC med PBS (4 ml) og tilsett 4 ml aMEM / FBS 1% (forvarmet til 37 ° C).
- Legge til den nødvendige mengde av mitokondrier vitale fargestoff og inkubere cellene i 30 min i 37 ° C inkubator.
- Fjern mitokondriene fargeoppløsning, skylles cellene to ganger med 4 ml forvarmet (37 ° C) aMEM / FBS 1% og legge tilbake 4 ml aMEM / FBS 10%. Inkuber cellene ved 37 ° C.
- Endre dyrkningsmedium (10 ml aMEM / FBS 10%) etter 30 min, og en annen gang, 2 timer senere.
Dag 1
2. Merking av Glioblastoma stamceller (GSC) (ekstrautstyr, se omtale avsnitt)
| Cellekulturmediet | sammensetning |
| GSC basal medium | DMEM / F-12 supplert med |
| Insulin 20 mg / ml | |
| N2 supplement 1x | |
| Glukose 3 g / l | |
| L-glutamin 2 mM | |
| GSC spredning medium | Legg til basal medium: |
| B27 supplement 1x | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizone 0,25 mg / ml | |
| Heparin 2 mg / ml | |
| Ciprofloxacin 2 ug / ml | |
| Gentamicin 2 ug / ml | |
| MSC spredning medium | & #945, MEM supplert med |
| L-glutamin 2 mM | |
| 10% FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tabell 1: Culture Media.
- Distansere GSCs (GB4 cellelinje 32 (10 x 10 6 celler) dyrket som Neurosfærene på poly-HEMA belagte cellekulturflasker (se trinn 3.1 til 3.12).
- Frø GSCs i en 48-brønns plate 10 5 celler / brønn i GSC proliferasjon medium (500 pl) (se tabell 1).
- Sentrifuger plate ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Legge til den nødvendige mengden av celle vitale fargestoff og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C.
- Legg 500 mL av GSC basalmedium (Tabell 1) per brønn av 48-brønns plate.
- Sentrifuger plate ved 270 xg ved 20 ° C i 5 minutter. Aspirer supernatanten.
- Gjenta trinn 02.05 til 02.06.
- Legg 500 mL av GSC basal medium og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter.
- Sentrifuger plate ved 270 xg ved 20 ° C i 5 minutter. Aspirer supernatanten.
- Legg 500 mL av GSC spredning medium per brønn av 48-brønns plate og inkuberes i 37 ° C inkubator.
Merk: Mengden GSCs indikert (10 x 10 6 celler) kan utføre de ulike dose-respons-eksperimenter og FACS kontroller. Når forsøksbetingelsene er mer presist definert dette beløpet kan skaleres ned.
dag 2
3. Seeding av glioblastom stamceller
- Samle GSC neurosfærene (10 x 10 6 celler) ved sentrifugering ved 270 xg i 5 minutter, ved 20 ° C i et 50 ml rør.
- Vask cellene med 5 ml HBSS, og sentrifuger ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Aspirer supernatanten.
- Resuspen-deres forsiktig GSC pelleten i 100 pl trypsin-EDTA (0,25%) (per 10 x 10
- Inkuber ved 37 ° C i 3 minutter.
- Tilsett 10 pl CaCl2 (20 mM) og 2 ul DNase I (10 mg / ml).
- Distansere neurosfærene ved forsiktig pipettering opp og ned (30-50x) med en P200 pipette. Unngå bobler. Sjekk under mikroskopet at alle GSCs er dissosiert.
- Tilsett 10 ul trypsin inhibitor (5%) og 10 ml HBSS.
- Sentrifuger GSCs ved 270 x g i 7 min ved 20 ° C.
- Kast supernatanten og tilsett 10 ml GSC basal medium (tabell 1).
- Telle GSCs med et Thoma tellekammer, og deretter sentrifugere cellene ved 270 x g i 7 minutter ved 20 ° C.
- Tilsett passende mengde GSC proliferasjon medium (tabell 1) for å nå den cellulære konsentrasjon på 10 6 GSCs / ml.
- Seed 10 5 GSCs (100 ul av cellesuspensjonen) per brønn i en 96-brønns plate.
- Sentrifuger platene ved 270 x g i 7 min ved 20 ° C for å få GSCs ved bottom brønner.
- Inkuber 96-brønners plate ved 37 ° C inntil § 5.
dag 2
4. MSC Mitokondrier Isolation
- Juster mikrorør sentrifuge temperatur på 4 ° C.
- Fremstille to 1,5 ml rør "A" og "C" inneholdende reagenser for mitokondrier ekstraksjon (200 ul reagens A og 400 pl reagens C, begge inneholdende EDTA-fri proteasehemmere). Forbered 2 andre rør, merket "MSC" og "Mito". Hold alle rørene på is. Også forberede rør for mitokondrienes serielle fortynninger.
- Vask MSC med 10 ml forvarmet (37 ° C) PBS.
- Vask MSC med 2 ml trypsin (ingen EDTA) i 10 sekunder og tilsett 1 ml trypsin (ingen EDTA). Inkuber cellene i 5-10 minutter ved 37 ° C.
- Gjenopprette de MSC ved tilsetning av 10 ml aMEM / FBS 10%, overføres til et 50 ml rør.
- Sentrifuger cellene ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Kast supernatanten og legge10 ml aMEM / FBS 10% til cellepelleten.
- Telle MSC med Malassez tellekammer.
- Sentrifuge MSC (4-5 x 10 5) ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Kast supernatanten, tilsett 1 m iskald aMEM / FBS 10% til cellepelleten og overføre cellene til "MSC" -merket rør (fremstilt i trinn 4.2). Hold røret på is.
- Sentrifuger røret som inneholder MSCS ved 900 xg i 5 min, ved 4 ° C.
- Fjern alle rester av medium fra røret.
- Tilsett 200 ul av Mitokondrier Isolation Reagens A (inneholdende EDTA-fri proteasehemmere). Vortex på middels hastighet i 5 sek og la rørene på is for nøyaktig 2 min.
- Legg 2,5 mL av Mitokondrier Isolation Reagens B. Vortex ved maksimal hastighet i 10 sekunder, og deretter la rørene på is. Gjenta hver 30 sek i 5 min.
- Tilsett 200 ul av Mitokondrier Isolation Reagent C (inneholdende EDTA-fri proteasehemmere). Bland ved å vippe røret (roughly 30 ganger, ikke vortex). Sentrifuger røret ved 700 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten (inneholdende mitokondrier MSC) til "Mito" rør (fremstilt i trinn 4.2).
- Sentrifuger ved 3000 x g, 15 min ved 4 ° C, for å få mitokondriene pellet. Kast supernatanten. Pelleten inneholder de isolerte mitokondrier.
- Skyll mitokondrier pellet med 200 pl av den Reagens C. Deretter, sentrifuger ved 12 000 x g, 5 min ved 4 ° C, for å få mitokondriene pellet.
5. Overføring av Isolated MSC Mitokondrier å GSCs (MitoCeption)
- Tilsett 200 ul av den pre-avkjølt (0 ° C) GSC medium proliferasjon til mitokondriene pellet isolert fra MSC (4 x 10 5).
- Spe mitokondriene forberedelse (i GSC spredning medium) å konsekvent legge til 20 mL av mitokondrielle suspensjon til GSCs.
- Legg volumet av isolerte mitokondrier inn i brønnene av 96-well plate inneholdende de GSCs (fra trinn 3.15), ved den ønskede konsentrasjon (0,1 til 10 ug). Tilsett langsomt mitokondrier, nær bunnen av brønnen, som dekker hele overflaten minst én gang.
- For styring av MSC mitokondriene vital fargestoff lekkasje, legge de samme mengder av mitokondriene forberedelse (0,1 til 10 mikrogram) til brønner i en 96-brønns plate som inneholder GSC spredning medium bare (ingen GSCs) (se del 6.2 for viktig fargestoff lekkasje deteksjon).
- Sentrifuger 96-brønners plate inneholdende mitokondrier mottaker GSCs med MSC mitokondrier (trinn 5.3) og styreplaten (trinn 5.4) ved 1500 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Plasser kulturplater i 37 ° C inkubator celle umiddelbart etter sentrifugering.
Merk: I mitokondriene overføringsprotokollen er avhengig av sentrifugering av suspensjonen mitokondrier på de dyrkede celler ved sentrifugering tilstrekkelig styrke, med en rekke sentrifugeringer som kan justeres avhengig av system av mitokondrier giver / mottakercellene.
dag 3
6. Analyse av Mitokondrier Transfer ved FACS og Confocal Imaging
- Utarbeidelse av GSC prøver for FACS analyse
Merk: Hvis MSC mitokondrier ble merket med en vital fargestoff på forhånd (punkt 1), kan effektiviteten overvåkes ved hjelp av FACS, 24 timer etter den mitokondriene overføringen.- Sentrifuger 96-brønns plate med MitoCepted GSCs ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C.
- Kast supernatanten.
- Tilsett 100 ul trypsin (uten EDTA) i hver brønn. Inkuber ved 37 ° C i 3 minutter. Pipettes opp og ned for å dissosiere neurosfærene dannet i den 24 timers periode.
- Tilsett 100 ul av GSC basalmedium.
- Sentrifuger plate ved 270 xg i 5 minutter ved 20 ° C og kast supernatanten.
- Resuspender GSCs i 300 mL GSC basal medium og overføre til FACS tilpasset rør.
- Utfør FACS enalysis.
- Styring for mitokondrier vitale fargestoff lekkasje fra det isolerte mitokondrier (FACS)
Merk: Formålet med dette trinn er å bestemme bakgrunns FACS-signal som ikke ville reflektere en ekte MSC mitokondriene overføring, men snarere den rene lekkasje av vital fargestoff fra det merkede MSC mitokondriene anvendes for MitoCeption (trinn 5.3).- Seed GSC-celler som beskrevet i trinn 3.1 til 3.15.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i 1 time.
- Sentrifuger 96-brønners plate inneholdende mitokondrier bare (fra trinn 5.4 til 5.6) ved 1500 xg i 5 min ved 20 ° C.
- Aspirer kulturmediet fra GSC 96-brønns plate (trinn 6.2.2) og erstatte den med medium inkubert med mitokondrier bare (supernatant fra trinn 6.2.3).
- Inkuber 96-brønners plate inneholdende de GSCs ved 37 ° C i 2 timer.
- Fortsett som i trinn 6.1.1 til 6.1.7 for FACS analyse.
- Utarbeidelse av GSC SAMPles for confocal bildebehandling
Merk: Hvis overføring av MSC mitokondriene til GSCs er å bli analysert av fluorescens bildebehandling, både MSC og GSCs må merkes på forhånd, henholdsvis med mitokondrier (trinn 1) og celle (trinn 2) vitale fargestoffer.- Forbered GSCs som i trinn 6.1.1 til 6.1.5.
- Resuspender GSCs i 2 ml GSC spredning medium som inneholder 2% FBS og frø i 35 mm kultur retter (glass nederst).
- Utfør confocal bildebehandling på GSCs med de overførte fluorescerende MSC mitokondrier 24 timer senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De prosedyretrinn som beskriver isolering av mitokondrier fra mesenchymale stamceller (MSC) og deres overføring til de målrettede glioblastoma stamceller (GSC) ved MitoCeption er vist i figur 1. GSCs er kreftstamceller dyrket som Neurosfærene å bevare sine stamcelleegenskaper. For protokollen, GSCs sådd som enkeltceller et par timer før overføring av mitochondria (trinn 3) for å tillate høyere mitokondrier overføringseffektivitet (se FACS data figur 3B). Etter § 5 (dag 3), er disse cellene observert igjen som danner neurosfærer (figur 1).
Imaging av GB4 GSCs, 72 timer etter MitoCeption med fluorescens-merket MSC mitokondriene, viser at MSC mitokondriene er lokalisert inne i GB4 GSCs, som demonstrert av de ortogonale riss hentet fra confocal bilder (figur 2B). De overførte MSC mitokondriene vises lokalisert i hele GSCs, da dette også er tilfelle for de endogene GSC mitokondriene (Figur 2A). Confocal avbildning av MitoCepted GSCs ble også utført med MSC mitokondrier prelabeled med en dyp rød viktig fargestoff, slik at de samme GSC prøvene ble analysert både ved FACS (se figur 3A) og imaging (Figur 2C). Overføringen av MSC mitokondriene kan observeres for de fleste GSCs (panel a) og 3D-rekonstruksjon fra GSC konfokale bilder bekreftet den intracellulære lokalisering av det overførte MSC mitokondriene (paneler b, c). Prelabeling GSCs (på dag 1) med både blå cellulære og røde mitokondrie vitale fargestoffer tillatt å visualisere lokalisering av den overførte MSC mitokondriene (farget i grønt) i forhold til den endogene GSC mitokondriene (i rødt), etter MSC mitokondriene overføring (figur 2D) .
mens confocal bildebehandling lar sjekke intracellulær lokalisering av den overførte MSC mitokondriene følgende MitoCeption, fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) blir førstevalget for å kvantifisere mitokondriene overføring, forut MSC mitokondrier ble prelabeled med en vital fargestoff. Som vist i figur 3A, MitoCeption med økende mengder av fluorescerende MSC mitokondrier førte til økte FACS-signaler. Verdt å merke seg, idet dette signal (rødt) var flere størrelsesordener høyere enn signalet som ble oppnådd i kontrollbetingelsene (i blått, se trinn 6.2). Dette ytterligere gitt bevis for at den FACS signal er representativt for MSC mitokondrier overføres inne GSCs og ikke bare et resultat av den fluorescerende fargestoff vital lekkasje fra den merkede MSC mitokondriene. Mitokondriene overføringsprotokoll presentert her, utført på enkeltcelle GSCs, viste en doseavhengig respons (figur 3B). Effektiviteten av MSC-mitochondria overføringen ble også evaluert på Neurospheres. Selv om dette også ført til MSC mitokondriene overføring til GSCs, effektiviteten av overføringen var lavere, som vist i et representativt eksperiment (figur 3B).
Overføringen av MSC mitokondrier og deres vedlikehold inne i GSCs kan følges ved å kvantifisere MSC mitokondrie DNA (mtDNA) i de GSCs. Dette krever MSC og GSCs å være hentet fra ulike givere, med forskjellige haplotyper. Figur 3C viser mtDNA-sekvenser innenfor det D-løkke av to givere med enkeltnukleotidpolymorfi (SNP'er) angitt ved 3'-enden stilling. For utforming av PCR-primere, for å spesifikt forsterke mtDNA fra enten en donor donor eller 2, ble en ytterligere mutasjon innført ved posisjon n-2 i forhold til 3'-enden av PCR-primere. Den mtDNA fra donor en kan bli forsterket med et sett av primere: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'og 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (universal sequencing primer 38), mens den sett av primere: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(universalsekvenseringsprimeren fra 38) og 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' ble anvendt til å amplifisere mtDNA fra donor 2.
Figur 1: Arbeidsflyt for overføring av isolerte MSC mitokondriene til GSCs av MitoCeption. De 7 trinn for MitoCeption av MSC mitokondrier til GSCs og de påfølgende GSC analysene er vist. Trinn tallene er angitt som i protokollen delen. Hvis MSC og GSC merking ikke er utført, som for funksjonsanalyser, trinn 1 og 2 kan utelates og protokollen kan følges fra dag 2 på. Fasekontrast bildene representerer GB4 GSCs som neurosfærer (dag 1), som encellede kultur klar for MSC mitokondrier overføring (dag 2) og 24 timer etter overføringen mitokondrier (dag 3). Scale bar =100 um. I trinn 4, representative mikrofotografi av isolerte MSC mitokondriene, prelabeled med MitoTracker Red CMXRos før isolasjon fra MSC. Scale bar = 5 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Imaging av GB4 endogen mitokondrier og MSC mitokondrier etter overføring til GB4 GSCs av MitoCeption. (A, B, C) GB4 GSCs ble merket med en grønn vital fargestoff. (B, C, D) GB4 GSCs ble MitoCepted med 2,5 mikrogram MSC mitokondrier forberedelse (for 10 5 GSCs). (A) GSCs ble merket med MitoTracker Red CMXRos og dyrket i 48 timer (GSC spredning medium w / o EGF / bFGF).(B) GSC confocal seksjon og ortogonale utsikt, 72 timer etter MitoCeption med MitoTracker Red CMXRos-merket MSC mitokondrier (dyrkningsmedium: GSC spredning medium / FBS 2%). (C, D) MSC ble prelabeled med en dyp rød mitokondrier vital fargestoff (samme vilkår som for FACS analyse) før overføring av MSC mitokondriene til GSCs. Etter MSC mitokondriene overføring, ble GSCs sådd i GSC spredning medium som inneholdt FBS 10%. (C) Isosurface utsikt (b, c) med xy-planet seksjon (c) av en GSC 3D rekonstruksjon fra confocal bilder (48 timer etter MitoCeption). (D) GB4 GSCs ble merket med en blå celle vital fargestoff og en rød mitokondrier vital fargestoff før overføring av MSC mitokondrier prelabeled med en dyp rød mitokondrier vital fargestoff (fotografert i grønt). Isosurface synspunkter med xz (b) og xy (c) flyet deler av en GSC 3D rekonstruksjon fra confocal bilder (72 timer etter at MSC mitokondriene overføring). Alle celler were seeded på kultur retter med glassbunn og bildene ble tatt på levende celler. Skala barer = 5 mikrometer, med unntak av bilde C panel (a) hvor Scale bar = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Kvantifisering av mitokondriene overføring av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) og påvisning av MSC mitokondrie DNA (mtDNA) i de GSCs. (A, B) GSCs ble MitoCepted med MSC mitokondrier prelabeled med en dyp rød mitokondrier vital fargestoff og analysert ved FACS. (A) Representative FACS resultater oppnådd med MitoCepted GSCs (rødt, fra topp til bunn: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 ug MSC mitokondrier preparat (for 10 5 GSCs)). I blå, for each panel, tak FACS-profil av GSCs inkubert med kulturmediet betinget med den samme mengde av MSC mitokondrier som anvendes for MitoCeption (se trinn 5.4). Kontroll forhold med umerkede GSCs i svart (oppe). (B) Relativ gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) oppnådd etter mitokondriene transfer på encellete GSCs (- •) (gjennomsnitt på 3 forsøk, med SEM), på én dag GSC Neurosfærene (- o) og med kontroll mitokondrier supernatanter på GSC enkeltceller (-). (C) DNA-sekvenser innenfor mtDNA D-løkke og SNP forskjeller mellom giverne 1 og 2. SNP er angitt i blått ved 3'-enden av sekvensene. Utformingen av primere for spesifikk PCR-amplifisering av mtDNA fra hver donor (primere spe 1 og 2). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et økende antall studier viser at cellene kan utveksle mitokondrier og at disse mitokondriene har dyptgripende virkninger på målcellen metabolisme og funksjoner. Derfor er det vesentlig å beherske verktøy til kvantitativt å overføre mitokondrier fra donorcellene på disse målcellene for å muliggjøre en nøyaktig undersøkelse av deres biologiske virkninger.
Protokollen er beskrevet her var opprinnelig utarbeidet for å overføre mitochondria isolert fra humane stamceller til tilhenger kreftcellelinje MDA-MB-231 33. Som vist her, kan det tilpasses for kreft stamceller som vokser som neurosfærer in vitro. Selv om mitokondrier overføring forekommer når MSC mitokondrier er lagt til GSC neurosfærene, ble det funnet å være mer effektiv på enkeltcelle GSCs, slik det er beskrevet i den foreliggende protokoll. Denne protokollen kan også bli ekstrapolert til andre ikke-adherente celler, som T-celler, med behovet for endapt seeded cellekonsentrasjon for MitoCeption trinnet.
Mitokondriene forberedelse bør utføres på is for å opprettholde sin integritet. For å oppnå mitokondrier preparater med redusert forurensning fra andre cytosol forbindelser, er sentrifugering for utvinning av mitokondriene utført ved 3000 xg i 15 min. For å overvåke mengden av MSC mitokondriene brukes til overføring til GSCs er mitokondriene proteininnhold bestemt. For dette formål er mitokondrier proteinekstrakter fremstilt under anvendelse av RIPA-buffer supplementert med proteasehemmere. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av bicinchoninic syre analysen, i henhold til produsentens instruksjoner. Bovint serumalbumin ble anvendt som en standard. I gjennomsnitt 10 ug proteiner ble oppnådd fra 100000 MSC.
Merking MSC mitokondrier med en vital fargestoff tillater å kvantifisere effektiviteten av mitochondria overføring, ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS), og bestemme lokaliseringen av de overførte mitokondriene ved confocal bildebehandling. De GSCs kan merkes med samme mitokondriene vital fargestoff som MSC. Disse cellene vil bli brukt som en positiv kontroll for FACS-analyse. Alternativt kan GSCs merkes med en mitokondrier vital fargestoff forskjellig fra den til MSC, slik at lokaliseringen av de overførte MSC mitokondriene i forhold til de endogene GSC mitokondriene. Den dyprøde mitokondrier vitale fargestoff er godt egnet for FACS-analyse, mens de grønne og røde fargestoffer mitokondrier er foretrukket for konfokal avbildning. Av stor betydning, bør MSC eksponering for EDTA unngås på alle trinn i protokollen. Derfor er celle trypsinering anbefales med trypsin og uten EDTA; cocktail av proteaseinhibitorer anvendt for mitokondrier fremstillingen skal, i tillegg, være blottet for EDTA. I nærvær av EDTA, ble det observert en lekkasje av mitokondrier vitale fargestoff fra MSC mitokondrier. Hvis mitokondriene transfer til GSCs er som skal analyseres ved mikroskopi, bør mottakerens glioblastomer cellene også bli merket med en vital fargestoff. De grønne og blå cellefargestoffer (se Materialer og reagenser tabell) ble foretrukket som de gir en mer homogen celle merking, slik at 3D-rekonstruksjon fra confocal bilder.
Når protokollen er godkjent av brukeren med sine spesifikke celler, vil mitokondrier merking bli tatt ut for funksjonelle studier, for å utelukke mulige biologiske skjevheter. Dose-responsanalyser over et bredt område av MSC mitokondrier konsentrasjoner, med serielle fortynninger av mitokondriene fremstillingen, er tilrådelig. Faktisk bør det bemerkes at biologiske virkninger for de overførte mitokondriene kan oppnås for lave konsentrasjoner mitokondrier, i det nedre området for deteksjon ved hjelp av FACS eller avbildning. Disse funksjonelle studier, inkludert undersøkelser på GSC stoffskifte, spredning og respons på behandling, utføres dagen ettermitokondrier overføring.
Hvis MSC og GSCs er isolert fra forskjellige givere (med forskjellige mtDNA haplotyper), kan de overførte MSC mitokondriene bli overvåket ved å måle konsentrasjonen av MSC mtDNA i de målrettede GSCs. Diskrimineringen mellom MSC og endogene GSC mtDNAs er basert på tilstedeværelsen av SNP, bestemt for hver celletype, i den hypervariable mtDNA D-løkke-regionen. Derfor er blant de forskjellige anvendelser av MitoCeption teknikk, er muligheten for å overføre mitokondrier huse mitokondrie DNA med forskjellige haplotyper ikke bare tillater påvisning av de overførte mitokondriene, men gir også verktøy for å studere biologi av mtDNA vedlikehold, herunder analyse av haplotype utelukkelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE), som CJ og ML.V. er tilknyttet, har innlevert en patentsøknad på MitoCeption teknikk (EP14306154.7).
Acknowledgments
Vi takker Andrea Parmeggiani (L2C og DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) samt medlemmer av laboratoriet for nyttige diskusjoner, Christophe Duperray for hjelp med FACS analysen, Montpellier RIO bildeanlegg (MRI) for å gi tilstrekkelig miljø for FACS og konfokalmikroskopi. BNM ble støttet av en utdannet fellesskap fra LABEX startet Numev (convention ANR-10-LabX-20). AB ble støttet av en lavere fellesskap fra Universitetet i Warszawa og europeiske union (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV er en stab forsker fra Nasjonalt senter for vitenskapelig forskning (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
