Summary
Здесь протокол (MitoCeption) представлен для передачи митохондрии, выделенные из человеческих мезенхимальных стволовых клеток (MSC), к глиобластома стволовых клеток (GSC), с целью изучения их биологических эффектов на GSC метаболизм и функции. Аналогичный протокол может быть выполнен с возможностью передачи митохондрии между другими типами клеток.
Abstract
Митохондрии играют центральную роль для клеточного метаболизма, производства энергии и контроля апоптоза. Неадекватное митохондриальная функция была найдена ответственность за самых разнообразных заболеваний, начиная от неврологических патологий к раку. Интересно отметить, что митохондрии в последнее время было показано, чтобы отобразить способность передаваться между типами клеток, в частности, из мезенхимных стволовых клеток человека (MSC) для раковых клеток в условиях совместного культивирования, с последствиями метаболических и функциональных для клеток-реципиентов митохондрии, дальнейшее повышение тока интерес для биологических свойств этих органелл.
Оценивая последствия перенесенного MSC митохондрий в клетках-мишенях имеет первостепенное значение для понимания биологической исход таких межклеточных взаимодействий. Протокол MitoCeption, описанный здесь позволяет передавать митохондриях, выделенных предварительно из донорских клеток в клетки-мишени, с помощью MSC митохондриии глиобластомы стволовые клетки (GSC) в качестве модельной системы. Этот протокол ранее использовался для передачи митохондрии, выделенные из ПКЦ, чтобы приверженец раковых клеток MDA-MB-231. Этот протокол передачи митохондрии приспособлен здесь GSCs , которые представляют специфическую особенность выращивания в нейросферах в пробирке. Передача выделенных митохондрий может сопровождаться флуоресцентно-активированных клеток (FACS сортировочный) и получения изображений с использованием конфокальной митохондрии витальных красителей. Использование митохондрии донора и клеток-мишеней с различными гаплотипов (SNP) также делает возможным обнаружение передаваемых митохондрий на основе концентрации их округлой митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках-мишенях. После того, как протокол был утвержден с этими критериями, клетки, несущие передаваемые митохондрии могут быть дополнительно проанализированы с целью определения влияния экзогенных митохондрий на биологические свойства, такие как клеточный метаболизм, пластичность, пролиферации и реакции на терапию.
Introduction
Митохондрии являются органеллы, найденные в эукариотических клетках, где они играют центральную роль в поглощении питательных веществ, а также в производстве энергии и метаболита. Эти органеллы содержат круговой митохондриальной ДНК (мтДНК), длиной 16.6 кб, который кодирует белки цепных комплексов электронного транспорта, тРНК и рРНК 1. Функциональность этих органелл имеет решающее значение для клеточного гомеостаза и несколько патологиями, были связаны с митохондриальной дисфункцией 1, 2, 3. Статус митохондрии было, например, связан с воспалением, инфекционных заболеваний и рака, в этом последнем случае , с последствиями для метастазирование и устойчивость к терапии 4, 5, 6, 7.
Митохондрии отобразить замечательную способность получение передаваемых между «донора» и «целевых» клеток. Это приводит к изменениям в энергетическом метаболизме клеток - мишеней, а также в других функциональных модификаций , таких как восстановление ткани и устойчивость к химиотерапевтическим средствам, как недавно показано разных лабораториях 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , отображать эту способность переносить митохондрии в самых разнообразных клеток - мишеней, в том числе кардиомиоцитов, эндотелиальные клетки, легочные гиперплазии эпителиальных клеток, клетки почечных канальцев и раковых клеток, что приводит к модификации функциональных свойств этих клеток 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
обмен Митохондрии теперь появляется как широко используемый механизм, который позволяет несколько различных типов клеток, чтобы общаться друг с другом и изменять свои биологические свойства. Этот обмен митохондрии может происходить через формирование туннельного Нанотрубки (ТНТ), с участием коннексина 43-содержащих щелевые контакты 8 или M-Sec / TNFaip2 и экзоцисты комплекс 19. В качестве альтернативы, передача Митохондрии также было показано, опосредовано arrestin домен-содержащих белок 1-опосредованных микровезикулы (ARMMs) 20. Интересно отметить , что эффективность передачи митохондрии была связана со скоростью экспрессии Rho ГТФ 1 MIRO1 21, что является ключевым фактором для объяснения различий в эффективностей передачи митохондрии между iPSC-MSCs и взрослых БМ-22 MSCs.
Несмотря на это богатство данных, касающихся клетки к клетке обмена митохондрии, относительно мало известно о метаболических и биологического исхода этого переноса митохондрии. Таким образом, она полностью гарантирует создание соответствующих инструментов, чтобы в полной мере оценить биологические эффекты этого переноса. На протяжении многих лет несколько технических подходов к передаче митохондрии от донора к акцепторной клеток, были предложены. Это включает в себя прямое впрыскивание митохондрий в ооцитах 23, 24, 25, слияние клеток генерировать transmitochondrial цибридами 26, 27 и, совсем недавно, передача изолированных митохондрий с использованием фототермическая nanoblades 28.
Мы и другие ранее продемонстрировали способность изолированной mitochondRIA быть усвоены живыми клетками, как это наблюдается как в пробирке и в естественных условиях 29, 30, 31, через механизмы предложил привлечь макропиноцитозом 32. Мы разработали далее метод, называемый MitoCeption, чтобы количественно перенесите изолированными митохондриями (от ПКЦ) в клетки - мишени, в качестве примера с (приверженец) MDA-MB-231 клеток рака молочной железы линии 31. Этот протокол был адаптирован здесь для передачи изолированных митохондрий MSC человека к глиобластомы стволовых клеток (GSCs).
Глиобластома агрессивные злокачественные опухоли головного мозга , которые быстро становятся устойчивыми к лечению, в основном за счет стволовых клеток глиобластомы (ГСС) , присутствующих в опухоли 33. Эти GSCs растут как нейросферах в пробирке и генерировать опухоли в ксенотрансплантатных моделях. Раковые клетки в пределах глиобластомы имеютспособность принимать соединения от клетки к клетке, как показано в последнее время для астроцитарных клеток опухоли головного мозга , которые , через которые митохондрии (а также ядер кальция и клеток) могут мигрировать межсоединений с помощью расширенных микропробирок,, в результате лучевой терапии устойчивых к астроцитомой сетей 34. Глиобластомы может набрать много различных клеток в опухоли микроокружения, в том числе ПКЦ 35, 36. Мы показали, что MSCs может сделать соединения межклеточные с GSCs в сокультивирования и передавать свои митохондрии (данные не показаны), которые, как ожидается, чтобы изменить GSC функциональные свойства. Настоящий протокол описывает, как метод MitoCeption может быть использован для передачи митохондрии, выделенные предварительно из человеческих MSCs, человеческих GSCs с целью определения их функционального биологического результата. Мультипотентны и высоко онкогенные GB4 GSC линия 37 была использована в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 день
1. Маркировка мезенхимальных стволовых клеток (МСК) Митохондрии (Необязательно)
- За два дня до приготовления митохондрии, семена человеческих MSCs в культуральную чашку в 100 мм, в 10 мл αMEM / FBS 10%, с тем, чтобы иметь 4 х 10 5 MSCs в культуре на 1 -й день.
- Полоскание MSCs с PBS (4 мл) и добавляют 4 мл αMEM / FBS 1% (предварительно нагретую до 37 ° С).
- Добавьте необходимое количество митохондриальной витальным красителем и инкубировать клетки в течение 30 мин в 37 ° С инкубатор.
- Удалить раствор красителя митохондрии, полоскание клетки дважды с 4 мл, предварительно нагретом (37 ° С) αMEM / FBS 1% и повторного добавления 4 мл αMEM / FBS 10%. Инкубируйте клетки при 37 ° С.
- Изменение культуральной среды (10 мл αMEM / FBS 10%) через 30 минут, а в другой раз, через 2 часа позже.
1 день
2. Маркировка глиобластома стволовых клеток (GSC) (Необязательно, см раздел Обсуждение)
| Среда для культивирования клеток | Состав |
| GSC базальная среда | DMEM / F-12 с добавлением |
| Инсулин 20 мг / мл | |
| N2 добавка 1x | |
| Глюкоза 3 г / л | |
| L-глутамина 2 мМ | |
| среда распространения GSC | Добавьте к базальной среде: |
| B27 дополнения 1x | |
| ЭФР 10 нг / мл | |
| bFGF 10 нг / мл | |
| Fungine 10 мг / мл | |
| Fungizone 0,25 мг / мл | |
| Гепарин 2 мг / мл | |
| Ципрофлоксацин 2 мкг / мл | |
| Гентамицин 2 мкг / мл | |
| среда распространения MSC | & #945; MEM, дополненной |
| L-глутамина 2 мМ | |
| 10% FBS | |
| bFGF 2 нг / мл |
Таблица 1: Культура Медиа.
- Диссоциируют GSCs (клеточная линия GB4 32 (10 × 10 6 клеток) , выращенных в нейросферах на поли-HEMA колб с покрытием клеточной культуры (см шаги 3.1 3.12).
- Семенной GSCs в 48-луночного планшета на 10 5 клеток / лунку в среде , пролиферации GSC (500 мкл) (таблица 1).
- Центрифуга пластины при 270 х г в течение 5 мин при температуре 20 ° С.
- Добавьте необходимое количество клеток витальным красителем и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С.
- Добавьте 500 мкл GSC базальной среды (таблица 1) на лунку 48-луночного планшета.
- Центрифуга пластины при 270 х г при 20 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
- Повторите шаги с 2,5 до 2,6.
- Добавьте 500 мкл GSC базальной среды и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
- Центрифуга пластины при 270 х г при 20 ° С в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант.
- Добавьте 500 мкл среды пролиферации GSC на лунку 48-луночного планшета и инкубировать в 37 ° С инкубатор.
Примечание: Количество GSCs указано (10 × 10 6 клеток) позволяет проводить различные эксперименты доза-реакция и управления FACS. После того, как условия эксперимента более точно определить это количество может быть уменьшено.
День 2
3. Посев глиобластомы стволовых клеток
- Собирают нейросферы GSC (10 х 10 6 клеток) центрифугированием при 270 х г в течение 5 мин, при 20 ° С в 50 мл пробирку.
- Промыть клетки с 5 мл HBSS и центрифуге при 270 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С.
- Аспирируйте супернатант.
- Аккуратно ресуспендируют осадок GSC в 100 мкл трипсина-EDTA (0,25%) (за 10 х 10
- Инкубируют при 37 ° С в течение 3 мин.
- Добавить 10 мкл CaCl 2 (20 мМ) и 2 мкл ДНКазы I (10 мг / мл).
- Диссоциировать нейросферы осторожно пипеткой вверх и вниз (30-50x) с P200 пипеткой. Избегайте пузырьков. Проверьте под микроскопом, что все GSCs диссоциированы.
- Добавляют 10 мкл ингибитор трипсина (5%) и 10 мл HBSS.
- Центрифуга GSCs при 270 мкг в течение 7 мин при 20 ° С.
- Жидкость над осадком сливают и добавляют 10 мл раствора GSC базальной среды (таблица 1).
- Граф GSCs с счетнокамерное Thoma, а затем центрифугировать клетки при 270 х г в течение 7 мин при температуре 20 ° С.
- Добавьте соответствующий объем среды пролиферации GSC (таблица 1) , чтобы достичь клеточной концентрации 10 6 / мл GSCs.
- Семенной 10 5 GSCs (100 мкл суспензии клеток) на лунку 96-луночного планшета.
- Центрифуга пластины при 270 х г в течение 7 мин при 20 ° С, чтобы получить GSCs в ботомТом скважин.
- Инкубируйте в 96-луночный планшет при 37 ° С до тех пор, раздел 5.
День 2
4. MSC Митохондрии Изоляция
- Доведите температуру микропробирки центрифуге до 4 ° С.
- Приготовьте два 1,5 мл пробирки "А" и "С", содержащий реагенты для экстракции митохондрии (200 мкл реагента А и 400 мкл реагента С, оба из которых содержат ингибиторы протеазы ЭДТА-свободный). Подготовьте 2 другие пробирки, маркированные «MSC» и «Мито». Держите все пробирки на льду. Также подготовьте трубы для митохондрии серийных разведений.
- Промыть MSCs с 10 мл предварительно подогретой (37 ° С) PBS.
- Мытье MSCs с 2 мл трипсина (без ЭДТА) в течение 10 сек и добавляют 1 мл трипсина (без ЭДТА). Инкубируйте клетки в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С.
- Восстановить MSCs добавлением 10 мл αMEM / FBS, 10%, перевод в 50 мл пробирку.
- Центрифуга клетки при 270 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С.
- Удалите супернатант и добавить10 мл αMEM / ФБС 10% к осадку клеток.
- Граф MSCs с счетнокамерное Malassez.
- Центрифуга MSCs (4-5 х 10 5) при 270 х г в течение 5 мин при температуре 20 ° С.
- Удалите супернатант, добавьте 1 м ледяным αMEM / FBS 10% к осадку клеток и передают клетки в "MSC" меченных трубки (полученного на этапе 4.2). Держите трубку на льду.
- Центрифуга трубки, содержащей MSCs при 900 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Удалить все остатки среды из трубки.
- Добавить 200 мкл Митохондрии Isolation реагента А (содержащий ингибиторы протеазы ЭДТА-бесплатно). Vortex на средней скорости в течение 5 сек и оставляют труб на льду в течение ровно 2 мин.
- Добавить 2,5 мкл Митохондрии изоляции Реагент B. Vortex при максимальной скорости в течение 10 секунд, а затем оставить пробирки на лед. Повторите каждые 30 секунд в течение 5 мин.
- Добавить 200 мкл Митохондрии Isolation реагента C (содержащий ингибиторы протеазы ЭДТА-бесплатно). Смешайте путем наклона трубки (роughly 30 раз, не вихрь). Отцентрифугировать пробирку при 700 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
- Передача супернатант (содержащий митохондрии MSC) к "Мито" трубки (полученного на стадии 4.2).
- Центрифуга при 3000 мкг, 15 мин при 4 ° С, чтобы получить митохондриях осадок. Удалите супернатант. Осадок содержит изолированные митохондрии.
- Полоскание митохондриях осадок 200 мкл реактива С. Затем центрифуге при 12000 мкг, 5 мин при 4 ° С, чтобы получить митохондриях осадок.
5. Передача изолированных MSC митохондрии GSCs (MitoCeption)
- Добавить 200 мкл предварительно охлажденный (0 ° C) GSC среды распространения в митохондрии гранул , выделенных из MSCs (4 х 10 5).
- Развести препарат митохондрии (в GSC среде пролиферации) последовательно добавляют 20 мкл митохондриальной суспензии в GSCs.
- Добавьте объем выделенных митохондрий в лунки 96-жELL пластину, содержащую GSCs (со стадии 3.15) в нужной концентрации (от 0,1 до 10 мкг). Добавить митохондрии медленно, близко к нижней части скважины, покрывают всю поверхность, по крайней мере один раз.
- Для контроля утечки витальным красителем ЦКМ митохондрии, добавьте те же количества препарата митохондрии (от 0,1 до 10 мкг) в лунки 96-луночного планшета, содержащего GSC среду пролиферации только (без GSCs) (см часть 6.2 для обнаружения утечки витальным красителем).
- Центрифуга 96-луночный планшет, содержащий GSCs реципиентов митохондрии с митохондриях MSC (этап 5.3), и контрольной пластиной (этап 5.4) при 1500 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
- Место культуры пластины в C клеток инкубаторе 37 ° сразу после центрифугирования.
Примечание: Протокол передачи митохондрии основан на центрифугировании митохондрии подвески на культивируемые клетки на адекватном центрифугирование силы, с числом центрифугировани, которые можно регулировать в зависимости от систэм митохондрий клеток донора / получателей помощи.
3-й день
6. Анализ переноса митохондриях с помощью FACS и конфокальной микроскопии
- Подготовка образцов ГСС для анализа FACS
Примечание: Если MSC митохондрии метили витальным красителем заранее (раздел 1), эффективность можно контролировать с помощью FACS, 24 ч после передачи митохондрии.- Центрифуга 96-луночный планшет с MitoCepted GSCs при 270 х г в течение 5 мин при температуре 20 ° С.
- Удалите супернатант.
- Добавьте 100 мкл трипсина (нет ЭДТА) в каждую лунку. Инкубируют при 37 ° С в течение 3 мин. Пипеткой вверх и вниз, чтобы диссоциировать нейросферы образовавшиеся в период времени 24 ч.
- Добавьте 100 мкл GSC базальной среды.
- Центрифуга пластины при 270 х г в течение 5 мин при температуре 20 ° С и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют GSCs в 300 мкл GSC базальной среды и передача FACS адаптированный труб.
- Выполните Ан FACSalysis.
- Контроль за утечки митохондрии жизненно красителя из изолированного митохондрий (FACS)
Примечание: Цель этого шага заключается в определении FACS сигнала фона, который не будет отражать подлинную передачу MSC митохондрии, но, скорее, лишь утечку жизненно красителя из меченого MSC митохондрий, используемых для MitoCeption (шаг 5.3).- Семенной клетки GSC, как описано в пунктах 3.1 до 3.15.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 1 часа.
- Центрифуга 96-луночный планшет, содержащий митохондрии только (с шагом 5,4 до 5,6) при 1500 х г в течение 5 мин при температуре 20 ° С.
- Аспирируйте культуральной среды от GSC 96-луночного планшета (этап 6.2.2) и заменить его средой инкубировали с митохондриями только (супернатантных со стадии 6.2.3).
- Выдержите 96-луночный планшет, содержащий GSCs при 37 ° С в течение 2 часов.
- Продолжайте, как на этапах 6.1.1 6.1.7 для анализа FACS.
- Приготовление GSC SAMPле для конфокальной микроскопии
Примечание: Если передача MSC митохондрий в GSCs должен быть проанализирован с помощью флуоресцентной визуализации, как и GSCs MSCs должны быть помечены заранее, соответственно митохондрии (шаг 1) и клетки (стадия 2), жизненно важных красителей.- Подготовка GSCs как на этапах 6.1.1 6.1.5.
- Ресуспендируют GSCs в 2 мл среды пролиферации GSC, содержащей 2% FBS и семян в чашках для культивирования 35 мм (со стеклянным дном).
- Выполните визуализацию конфокальной на GSCs с переданным флуоресцентных MSC митохондрии 24 ч позже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Процедурные шаги , излагающие выделение митохондрий из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и их передачи целевых стволовых клеток глиобластомы (ГСС) по MitoCeption показаны на рисунке 1. GSCs раковые стволовые клетки, выращенные в нейросферах сохранить свои свойства стволовых клеток. Для протокола, GSCs высевают в виде отдельных клеток пару часов до передачи митохондрий (этап 3) , чтобы позволить более высокую эффективность передачи митохондрии (см данных FACS Рисунок 3B). После раздела 5 (3 дня), эти клетки вновь наблюдается как формирование нейросферах (рисунок 1).
Визуализация GB4 GSCs, 72 часа после того, как MitoCeption с флуоресцентно меченных MSC митохондрии, показывает , что ЦКМ митохондрии локализованы внутри GB4 GSCs, как показали ортогональные проекции , полученные из конфокальных изображений (Фигура 2В), Переданные MSC митохондрии появляются локализованные на протяжении GSCs, так как это также относится и к эндогенным GSC митохондрий (рис 2А). Конфокальной томография MitoCepted GSCs также была проведена с MSC митохондриях prelabeled с глубоким красным витальным красителем таким образом , чтобы были проанализированы те же GSC образцы как по FACS (смотри рисунок 3A) и визуализации (рис 2С). Передача MSC митохондрий может наблюдаться для большинства GSCs (панель а) и 3D-реконструкция от GSC конфокальных изображений подтвердили внутриклеточный локализацию переданного MSC митохондриях (панели b, c). Prelabeling GSCs (на 1 -й день) с обеих синих клеточных и красных митохондриальных жизненно важных красителей позволило визуализировать локализацию перенесенного MSC митохондрий (окрашена в зеленый цвет) по отношению к эндогенным GSC митохондрий (в красном), после передачи митохондрии MSC (рис 2D) ,
В то время как confoкал визуализации позволяет проверить внутриклеточную локализацию переданного MSC митохондрий следующий MitoCeption, флуоресценция активированных клеток сортировки (FACS) является инструментом выбора для количественной оценки передачи митохондрии, при условии MSC митохондрии prelabeled с витальным красителем. Как показано на фигуре 3А, MitoCeption с увеличением количества флуоресцентных MSC митохондрий приводило к повышению сигналов FACS. Обращает на себя внимание, этот сигнал (в красном) было на несколько порядков выше, чем сигнал, полученный в контрольных условиях (синим цветом, см шаг 6.2). Это еще при условии доказательства того, что сигнал FACS является представителем MSC митохондрий переданного внутри GSCs, а не просто результатом люминесцентной жизненной утечки красителя из меченого MSC митохондрий. Протокол передачи митохондрии , представленные здесь, выполнены на отдельных GSCs клеток, показал дозозависимый ответ (фигура 3В). Эффективность передачи митохондрии MSC также оценивали на Neurospheres. Хотя это также привело к MSC передачи митохондрии к GSCs, эффективность передачи была ниже, как показано в типичном эксперименте (рис 3B).
Передача MSC митохондрий и их содержание внутри GSCs может сопровождаться количественной оценки MSC митохондриальной ДНК (мтДНК) в GSCs. Это требует и MSCs GSCs быть получены от различных доноров, с четко выраженными гаплотипов. Фигура 3С показывает мтДНК последовательности , найденные в D-петле двух доноров с одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) указано в крайнем положении 3 '. Для разработки ПЦР-праймеров, специфически амплифицировать мтДНК либо донор 1 или донор 2, дополнительная мутация была введена в положении N-2 по отношению к 3'-концу праймеров ПЦР. МтДНК донора 1 может быть усилена с помощью набора праймеров: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'и 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (универсальные sequencing праймер 38), в то время как набор праймеров: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(универсальный праймер последовательности из 38) и 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' был использован для амплификации мтДНК донора 2.
Рисунок 1: Последовательность действий при передаче изолированных MSC митохондрий к GSCs по MitoCeption. 7 шагов для MitoCeption МСЦ митохондрий к GSCs и последующих GSC анализов показаны. Числа ступенчатые указаны как в разделе протокола. Если MSC и маркировка GSC не выполняется, так как для функционального анализа, шаги 1 и 2 могут быть опущены, и протокол может следовать из 2-й день на. Фазового контраста изображения представляют GB4 GSCs как нейросферах (день 1), как одноклеточных культуры готовы к передаче MSC митохондрии (день 2) и 24 ч после передачи митохондрии (день 3). Шкала бар =100 мкм. На этапе 4, представитель микрофотография изолированных MSC митохондрий, prelabeled с Mitotracker Красной CMXRos перед выделением из ПКЦ. Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Визуализация GB4 эндогенного митохондрий и MSC митохондрий после переноса в GB4 GSCs по MitoCeption. (А, В, С) GB4 GSCs метили с зеленым витальным красителем. (B, C, D) GB4 GSCs были MitoCepted с 2,5 мкг MSC препарата митохондрии ( в течение 10 5 GSCs). (A) GSCs были помечены Mitotracker Красной CMXRos и культивировали в течение 48 ч (среды распространения GSC без EGF / bFGF).(В) GSC конфокальной сечение и ортогональные проекции, 72 часа после того, как MitoCeption с Mitotracker Красный CMXRos меченного MSC митохондрий (культуральной среды: GSC среды пролиферации / ФБС 2%). (C, D) были MSCs prelabeled с темно - красные митохондрии витальным красителем ( те же условия, что и для анализа FACS) перед передачей MSC митохондрий к GSCs. После передачи MSC митохондрии, GSCs были высеяны в GSC среде, содержащей FBS пролиферации 10%. (C) вид изоповерхности (б, в) с ху плоского сечения (с) в GSC 3D реконструкции из конфокальных изображений (48 ч после MitoCeption). (D) GB4 GSCs были помечены синим клеток витальным красителем и красный краситель митохондрий жизненно важно перед передачей MSC митохондрий prelabeled с темно - красные митохондрии витальным красителем (изображаемых зеленым цветом). просмотров изоповерхности с XZ (б) и ху (с) плоскости сечений GSC 3D реконструкции из конфокальных изображений (72 ч после передачи митохондрии MSC). Все клетки шERE высевали на чашки для культивирования со стеклянным дном и изображения были взяты на живые клетки. Масштабные полоски = 5 мкм, для панели изображения C, за исключением (а), где шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
На рисунке 3: Количественное передачи митохондрий методом флуоресцентной-активированных клеток (FACS сортировки) и обнаружения MSC митохондриальной ДНК (мтДНК) в GSCs. (А, В) GSCs были MitoCepted с MSC митохондриях prelabeled с глубоким красным митохондрии витальным красителем и анализировали с помощью FACS. (А) Репрезентативные FACS результаты , полученные с MitoCepted GSCs (в красном цвете, сверху вниз: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 мкг MSC препарат митохондрии ( в течение 10 5 GSCs)). Синим цветом, для EACч панель, управление FACS-профиль GSCs инкубировали с культуральной среды, кондиционированной с тем же самым количеством MSC митохондрий, используемый для MitoCeption (этап 5.4). Условия управления с немеченых GSCs в черном (сверху). (B) Относительная средняя интенсивность флуоресценции (MFI) , полученного после переноса митохондрии на отдельных GSCs клеток (- •) (среднее из 3 экспериментов, с SEM), на один день GSC нейросферах (- о) и управления митохондрии супернатантов на GSC отдельные клетки (-). (C) ДНК - последовательности в пределах мтДНК D-петли и SNP различия между донорами 1 и 2. ОНП выделены синим цветом на 3' - конце последовательностей. Дизайн праймеров для амплификации специфической ПЦР мтДНК либо донора (праймеры Spe 1 и 2). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Все большее число исследований показывают, что клетки могут обмениваться митохондрии и что эти митохондрии оказывают глубокое воздействие на метаболизм и функции клеток-мишеней. Поэтому крайне важно освоить инструменты, чтобы количественно перенести митохондрии от донора клеток в эти клетки-мишени для того, чтобы точное исследование их биологических эффектов.
Протокол , описанный здесь , был первоначально разработан для передачи митохондрии , выделенные из мезенхимных стволовых клеток человека к прилегающего линии раковых клеток MDA-MB-231 33. Как показано здесь, он может быть адаптирован для раковых стволовых клеток , которые растут по мере того как нейросферах в пробирке. Хотя передача митохондрии действительно имеет место, когда MSC митохондрии добавлены к нейросферах ГСС, было установлено, чтобы быть более эффективным на холостых GSCs клеток, как описано в настоящем протоколе. Этот протокол также может быть экстраполированы на другие не прилипшие клетки, подобно Т-клеткам, с необходимостьюDAPT затравочный концентрации клеток на стадии MitoCeption.
Препарат митохондрии следует проводить на льду для поддержания их целостности. Для получения препаратов митохондрий уменьшает риск загрязнения от других соединений цитозоле, центрифугирование для выделения митохондрий осуществляется при 3000 х г в течение 15 мин. Для того, чтобы контролировать количество митохондрий MSC, используемого для передачи в GSCs, содержание митохондрии белка определяют. Для этой цели, митохондрии белковые экстракты получают с использованием RIPa буфера с добавлением ингибиторов протеазы. Концентрацию белка определяли с помощью анализа бицинхониновой кислоты, в соответствии с инструкциями изготовителя. Бычий сывороточный альбумин был использован в качестве стандарта. В среднем 10 мкг белков были получены из 100000 ПКЦ.
Этикетировочное ЦКМ митохондрии с витальным красителем позволяет количественно эффективность передачи митохондрии, с помощью флуоресцентной-активированных клетоксортировка (FACS), и определение локализации перенесенных митохондрий путем конфокальной микроскопии. В GSCs могут быть помечены с той же митохондрии витальным красителем как MSCs. Эти клетки будут использоваться в качестве положительного контроля для анализа FACS. В качестве альтернативы, GSCs может быть помечено митохондрии витальным красителем, отличной от той из ПКЦ, что позволяет локализацию перенесенных MSC митохондрий по отношению к эндогенной GSC митохондрий. Глубокий красный краситель митохондрии жизненно хорошо подходит для анализа FACS в то время как красные и зеленые красители митохондрии являются предпочтительными для конфокальной микроскопии. Большое значение, MSC воздействие EDTA следует избегать на всех этапах протокола. Таким образом, клетка трипсинизации рекомендуется с помощью трипсина и без ЭДТА; коктейль ингибиторов протеазы, используемых для приготовления митохондрии следует, а, быть лишена ЭДТА. В присутствии ЭДТА, наблюдалась утечка митохондрии витальным красителем из MSC митохондрий. Если митохондрии transfeR к GSCs следует проанализировать с помощью микроскопии, глиобластома реципиент клетки также должны быть маркированы с витальным красителем. Зеленые и синие красители клеток (см Материалы и реагенты Таблица) были предпочтительны , поскольку они дают более однородную мечения клеток, что позволяет 3D - реконструкции из конфокальных изображений.
После того, как протокол был утвержден пользователем с его специфическими клетками, митохондрии маркировки будут опущены для функциональных исследований, чтобы исключить возможные биологические уклоны. Дозовой анализ в широком диапазоне концентраций митохондрии MSC, с серийными разведениями препарата митохондрии, желательно. На самом деле, следует отметить, что биологические эффекты для передаваемых митохондрий может быть достигнуто при низких концентрациях, митохондрии, в нижней части диапазона для обнаружения с помощью FACS или визуализации. Эти функциональные исследования, включая исследования по GSC метаболизма, пролиферации и реакции на лечение, проводятся на следующий день послепередача митохондрии.
Если MSCs и GSCs изолированы от различных доноров (с различными гаплотипов мтДНК), переданные MSC митохондрии можно контролировать путем измерения концентраций MSC мтДНК в целевых GSCs. Различение между MSC и эндогенных GSC мтДНК основан на присутствии ОНП, специфичных для каждого типа клеток, в области гипервариабельной D-петли мтДНК. Поэтому среди различных применений метода MitoCeption, возможность передачи митохондрии укрывательство митохондриальную ДНК с различными гаплотипов не только позволяет обнаруживать перенесенных митохондрий, но и предоставляет инструменты для изучения биологии поддержания мтДНК, в том числе анализ гаплотипов исключения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
INSERM (Национальный институт де ла Санте и де-ла-Recherche MEDICALE), с помощью которого CJ и ML.V. аффилированы, подал заявку на патент на технику MitoCeption (EP14306154.7).
Acknowledgments
Мы благодарим Андреа Parmeggiani (L2C и DIMNP, Монпелье), Бенуа Шарло (IES, Монпелье), а также члены лаборатории за полезные обсуждения, Кристоф Duperray за помощь при проведении анализа FACS, Монпелье объекта РИО томография (МРТ) для предоставления адекватная среда для FACS и конфокальной микроскопии. БНМ была поддержана в аспирантуре от Labex Numev (Конвенция ANR-10-LabX-20). AB была поддержана бакалавриате общения с Варшавским университетом и Европейским Союзом (№ POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV является научный сотрудник из Национального центра научных исследований (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
