Summary
Aquí, un protocolo (MitoCeption) se presenta para transferir las mitocondrias, aislado a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC), a las células madre glioblastoma (GSC), con el objetivo de estudiar sus efectos biológicos sobre el metabolismo y funciones GSC. Un protocolo similar se puede adaptar para transferir mitocondrias entre otros tipos de células.
Abstract
Las mitocondrias juegan un papel central para el metabolismo celular, la producción de energía y el control de la apoptosis. la función mitocondrial inadecuada ha sido encontrado responsable de muy diversas enfermedades, que van desde patologías neurológicas al cáncer. Curiosamente, las mitocondrias recientemente se ha demostrado para mostrar la capacidad de ser transferido entre los tipos de células, en particular a partir de células madre mesenquimatosas humanas (MSC) a las células cancerosas en condiciones de cocultivo, con metabólicos y funcionales consecuencias para las células mitocondrias receptores, mejorando aún más el interés actual para las propiedades biológicas de estos orgánulos.
La evaluación de los efectos de la mitocondria MSC transferido en las células diana es de primordial importancia para entender el resultado biológico de tales interacciones célula-célula. El protocolo MitoCeption descrito aquí permite la transferencia de las mitocondrias aisladas de antemano a partir de las células del donante a las células diana, usando MSC mitocondriasy células madre de glioblastoma (GSC) como un sistema modelo. Este protocolo se ha utilizado anteriormente para transferir las mitocondrias, aislado de MSCs, a adherente células cancerosas MDA-MB-231. Este protocolo de transferencia de las mitocondrias está adaptado aquí para GSCS que presentan la particularidad específica de crecer como neuroesferas in vitro. La transferencia de las mitocondrias aisladas puede ir seguida de células activadas por fluorescencia (FACS) y la imagen confocal utilizando mitocondrias colorantes vitales. El uso de células donantes y de destino mitocondrias con haplotipos distintos (SNP) también permite la detección de la mitocondria transferidos sobre la base de la concentración de su ADN mitocondrial circular (ADNmt) en las células diana. Una vez que el protocolo ha sido validado con estos criterios, las células que albergan la mitocondria transferidos se pueden analizar adicionalmente para determinar los efectos de las mitocondrias exógenos en las propiedades biológicas, tales como el metabolismo celular, la plasticidad, la proliferación y respuesta al tratamiento.
Introduction
Las mitocondrias son orgánulos que se encuentran en las células eucariotas en los que juegan un papel central en la absorción de nutrientes, así como en la producción de energía y metabolitos. Estos orgánulos contienen ADN mitocondrial circular (mtDNA), 16,6 kb de largo, que codifica las proteínas de los complejos de la cadena de transporte de electrones, tRNAs y rRNAs 1. La funcionalidad de estos orgánulos es crítica para la homeostasis celular y varias patologías se han asociado con disfunción mitocondrias 1, 2, 3. El estado de las mitocondrias, por ejemplo, ha sido relacionado con la inflamación, las enfermedades infecciosas y el cáncer, en este último caso con consecuencias para la metástasis y la resistencia a la terapia de 4, 5, 6, 7.
Las mitocondrias muestran la notable capacidad de las siendo transferido entre las células "diana" "donante" y. Esto conduce a cambios en el metabolismo energético de las células diana, así como en otras modificaciones funcionales, tales como la reparación de tejidos y la resistencia a los agentes quimioterapéuticos, como demostrado recientemente por diferentes laboratorios 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Las células madre mesenquimales humanas (MSCs) muestran esta capacidad de transferencia de las mitocondrias a una amplia variedad de células diana, incluyendo cardiomiocitos, células endoteliales, células epiteliales alveolares pulmonares, células tubulares renales y las células cancerosas, lo que lleva a las modificaciones de las propiedades funcionales de estas células 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Las mitocondrias de cambio aparece ahora como un mecanismo ampliamente utilizado que permite que un número de diferentes tipos de células para comunicarse unos con otros y modificar sus propiedades biológicas. Este intercambio mitocondria puede ocurrir a través de la formación de los nanotubos de efecto túnel (TNT), con la participación de conexina 43 que contienen uniones gap 8 o M-Sec / TNFaip2 y la exocyst complejas 19. Alternativamente, la transferencia de las mitocondrias también ha demostrado ser mediada por arrestina microvesículas proteína que contiene el dominio 1 (mediadas por ARMMs) 20. Curiosamente, la eficacia de la transferencia de las mitocondrias estaba vinculada a la tasa de expresión de la Rho GTPasa 1 miro1 21, un factor clave para explicar las diferencias en las eficacias de transferencia entre las mitocondrias iPSC-MSC y adultos BM-MSC 22.
A pesar de esta gran cantidad de datos relativos a las mitocondrias de cambio de célula a célula, se sabe relativamente poco sobre el metabolismo y la evolución biológica de esta transferencia de las mitocondrias. Por lo tanto, completamente de acuerdo con la configuración de las herramientas apropiadas para evaluar plenamente los efectos biológicos de esta transferencia. A través de los años, varios enfoques técnicos para la transferencia de las mitocondrias de donante a las células aceptoras se han propuesto. Esto incluye la inyección directa de las mitocondrias en oocitos de 23, 24, 25, la fusión celular para generar cíbridos transmitochondrial 26, 27 y, más recientemente, la transferencia de mitocondrias aisladas utilizando fototérmica nanoblades 28.
Nosotros y otros previamente demostrada la capacidad de mitochond aisladoria para ser internalizado por las células vivas, como se observa tanto in vitro como in vivo 29, 30, 31, a través de los mecanismos propuestos para involucrar a macropinocitosis 32. Hemos desarrollado además un método, llamado MitoCeption, para transferir cuantitativamente mitocondrias aisladas (de MSCs) a las células diana, como se ejemplifica con el (adherente) MDA-MB-231 línea celular de cáncer de mama 31. Este protocolo fue adaptado aquí para la transferencia de las mitocondrias aisladas MSC humanos a las células madre de glioblastoma (GSCS).
Glioblastoma son tumores malignos agresivos del cerebro que rápidamente se vuelven resistentes al tratamiento, debido principalmente a las células madre glioblastoma (GSC) presentes dentro del tumor 33. Estos GSCs crecen como neuroesferas en vitro y generan tumores en modelos de xenoinjerto. Las células cancerosas dentro de glioblastoma tienen lacapacidad para hacer conexiones de célula a célula, como se muestra recientemente para células tumorales cerebrales astrocíticos que se interconectan a través de microtubos extendidos, a través del cual las mitocondrias (así como núcleos de calcio y de células) pueden migrar, lo que resulta en las redes de astrocitoma de radioterapia resistente 34. Glioblastoma puede reclutar muchas células diferentes dentro del microambiente del tumor, incluyendo MSCs 35, 36. Nos mostró que las MSC puede realizar conexiones entre células con GSCS en co-cultivo y transferir sus mitocondrias (datos no mostrados), que se espera para modificar las propiedades funcionales de la SGC. El presente protocolo describe cómo la técnica MitoCeption se puede utilizar para transferir las mitocondrias, de antemano aislada de MSC humanas, a GSCs humanos con el propósito de determinar su resultado biológico funcional. El multipotentes y altamente tumorigénico línea Gb4 GSC 37 se utilizó en este estudio.
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Protocol
Día 1
1. El etiquetado de la célula madre mesenquimales (MSC) Las mitocondrias (Opcional)
- Dos días antes de la preparación mitocondrias, semilla de MSC humanas en una placa de cultivo de 100 mm, en 10 ml aMEM / FBS 10%, a fin de tener 4 x 10 5 MSCs en cultivo en el Día 1.
- Enjuagar las MSC con PBS (4 ml) y añadir 4 ml aMEM / FBS al 1% (precalentado a 37 ° C).
- Añadir la cantidad requerida de las mitocondrias colorante vital e incubar las células durante 30 min en la incubadora a 37ºC.
- Retire la solución de colorante mitocondrias, enjuagar las células dos veces con 4 ml precalentada (37 ° C) aMEM / FBS al 1% y volver a agregar 4 ml aMEM / FBS al 10%. Se incuban las células a 37 ° C.
- Cambiar el medio de cultivo (10 ml aMEM / FBS 10%) después de 30 min y, otra vez, 2 horas más tarde.
Día 1
2. El etiquetado de las células de glioblastoma madre (GSC) (Opcional, ver la sección Discusión)
| Medio de cultivo celular | Composición |
| medio basal GSC | DMEM / F-12 suplementado con |
| La insulina 20 mg / ml | |
| 1x suplemento N2 | |
| La glucosa 3 g / L | |
| L-glutamina 2 mM | |
| medio de proliferación SGC | Añadir al medio basal: |
| 1x suplemento B27 | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizone 0,25 mg / ml | |
| Heparina 2 mg / ml | |
| La ciprofloxacina 2 mg / ml | |
| Gentamicina 2 mg / ml | |
| medio de proliferación MSC | & #945; MEM suplementado con |
| L-glutamina 2 mM | |
| 10% de FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tabla 1: Medios de cultivo.
- Disociar GSCS (línea celular Gb4 32 (10 x 10 6 células) crecido como neuroesferas en poli-HEMA frascos de cultivo celular recubierto (consulte los pasos 3.1 a 3.12).
- GSCS de semillas en una placa de 48 pocillos a 10 5 células / pocillo en medio de proliferación GSC (500 l) (ver Tabla 1).
- Centrifugar la placa a 270 xg durante 5 minutos a 20 ° C.
- Añadir la cantidad requerida de colorante vital de células y se incuba durante 30 min a 37 ° C.
- Añadir 500 l de medio basal GSC (Tabla 1) por pocillo de la placa de 48 pocillos.
- Centrifugar la placa a 270 xg, a 20 ° C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Repita los pasos 2.5 a 2.6.
- Añadir 500 l de medio basal GSC y se incuba a 37 ° C durante 30 min.
- Centrifugar la placa a 270 xg, a 20 ° C durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Añadir 500 l de medio de proliferación GSC por pocillo de la placa de 48 pocillos y se incuban en la incubadora a 37ºC.
Nota: La cantidad de GSCS indicado (10 x 10 6 células) permite la realización de los diferentes experimentos de dosis-respuesta y los controles de FACS. Una vez que las condiciones experimentales se definen con mayor precisión esta cantidad puede ser mucho menos marcada.
Dia 2
3. La siembra de las células madre de glioblastoma
- Recoger las neuroesferas GSC (10 x 10 6 células) por centrifugación a 270 xg durante 5 min, a 20 ° C en un tubo de 50 ml.
- Lavar las células con 5 ml de HBSS, y se centrifuga a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Aspirar el sobrenadante.
- resuspender suavemente el sedimento de GSC en 100 l de tripsina-EDTA (0,25%) (por 10 x 10
- Incubar a 37 ° C durante 3 min.
- Añadir 10 l CaCl DNasa 2 (20 mM) y 2 l I (10 mg / ml).
- Disociar las neuroesferas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo (30-50x) con una pipeta P200. Evitar las burbujas. Compruebe bajo el microscopio que todos GSCS se disocian.
- Añadir 10 l inhibidor de tripsina (5%) y 10 ml de HBSS.
- Centrifugar a 270 xg GSCS durante 7 minutos a 20 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y añadir 10 ml de medio basal GSC (Tabla 1).
- Contar GSCS con una cámara de recuento Thoma y centrifugar las células a 270 xg durante 7 minutos a 20 ° C.
- Añadir el volumen adecuado de medio de proliferación GSC (Tabla 1) para llegar a la concentración celular de 10 6 GSCS / ml.
- De semillas 10 5 GSCs (100 l de la suspensión de células) por pocillo de una placa de 96 pocillos.
- Centrifugar las placas a 270 x g durante 7 minutos a 20 ° C para obtener GSCS en el bottom de pozos.
- Incubar la placa de 96 pocillos a 37 ° C hasta que la sección 5.
Dia 2
4. Aislamiento de MSC mitocondrias
- Ajuste la temperatura del microtubo de centrifugación a 4 ° C.
- Preparar dos tubos de 1,5 ml "A" y "C", que contiene los reactivos para la extracción de las mitocondrias (200 l de reactivo A y 400 l de reactivo C, que contiene tanto los inhibidores de la proteasa libre de EDTA). Preparar otros 2 tubos, etiquetados "MSC" y "Mito". Mantenga todos los tubos en hielo. También hay que preparar los tubos para las diluciones seriadas de las mitocondrias.
- Wash MSCs con 10 ml precalentada (37 ° C) PBS.
- Wash MSCs con 2 ml de tripsina (sin EDTA) durante 10 segundos y añadir 1 ml de tripsina (sin EDTA). Se incuban las células durante 5-10 minutos a 37 ° C.
- Recuperar las MSC mediante la adición de 10 ml aMEM / FBS al 10%, la transferencia a un tubo de 50 ml.
- centrifugar las células a 270 xg durante 5 minutos a 20 ° C.
- Eliminar el sobrenadante y añadir10 ml aMEM / FBS 10% al sedimento celular.
- Contar las MSCs con una cámara de recuento Malassez.
- Centrifugar MSCs (4-5 x 10 5) a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Descartar el sobrenadante, añadir 1 m enfriado en hielo aMEM / FBS 10% al sedimento celular y la transferencia de las células al tubo marcado con "MSC" (preparado en el paso 4.2). Mantenga el tubo en hielo.
- Centrifugar el tubo que contiene las MSCs en 900 xg durante 5 min, a 4 ° C.
- Eliminar todo el medio residual del tubo.
- Añadir 200 l de mitocondrias Aislamiento Reactivo A (que contiene los inhibidores de la proteasa libre de EDTA). Vortex a velocidad media durante 5 seg y dejar los tubos en hielo durante exactamente 2 min.
- Añadir 2,5 l de mitocondrias Aislamiento Reactivo B. Vortex a velocidad máxima durante 10 segundos, y luego se van tubos en hielo. Repetir cada 30 s durante 5 min.
- Añadir 200 l de mitocondrias Aislamiento Reactivo C (que contiene los inhibidores de proteasa libre de EDTA). Mezclar por la inclinación del tubo (roughly 30 veces, no vórtice). Centrifugar el tubo a 700 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante (que contiene la mitocondria MSC) al tubo "Mito" (preparado en el paso 4.2).
- Centrifugar a 3000 xg, 15 min a 4 ° C, para obtener el pellet mitocondrias. Descartar el sobrenadante. El sedimento contiene las mitocondrias aisladas.
- Enjuague el pellet mitocondrias con 200 l de reactivo C. A continuación, se centrifuga a 12.000 xg, 5 min a 4 ° C, para obtener el pellet mitocondrias.
5. Transferencia de mitocondrias aisladas MSC a GSCS (MitoCeption)
- Añadir 200 l de la (0 ° C) medio pre-enfriado GSC proliferación al sedimento de mitocondrias aisladas de MSCs (4 x 10 5).
- Se diluye la preparación de las mitocondrias (en medio de proliferación SGC) para añadir consistentemente 20 l de suspensión mitocondrial de los GSCS.
- Añadir el volumen de mitocondrias aisladas en los pocillos de la 96-wplaca ell que contiene los GSCs (de la etapa 3.15), a la concentración deseada (de 0,1 a 10 mg). Añadir la mitocondria lentamente, cerca de la parte inferior del pozo, que cubre toda la superficie al menos una vez.
- Para el control de MSC mitocondrias fuga de colorante vital, añadir la misma cantidad de la preparación mitocondrias (0,1 a 10 mg) a los pocillos de una placa de 96 pocillos que contenía GSC medio de proliferación solamente (sin GSCS) (véase la parte 6.2 para la detección de fugas de colorante vital).
- Centrifugar la placa de 96 pocillos que contiene las mitocondrias GSCs receptores con la mitocondria MSC (etapa 5.3) y la placa de control (paso 5.4) a 1.500 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Colocar las placas de cultivo en el 37 ° C incubadora de células inmediatamente después de la centrifugación.
Nota: El protocolo de transferencia de las mitocondrias se basa en la centrifugación de la suspensión mitocondrias en las células cultivadas en la fuerza de centrifugación adecuada, con una serie de centrifugaciones que se puede ajustar en función de la System células de donante / receptor mitocondrias.
Día 3
6. Análisis de la transferencia de mitocondrias por FACS y Confocal Imaging
- Preparación de muestras para análisis FACS GSC
Nota: Si las mitocondrias MSC se marcaron con un colorante vital de antemano (Sección 1), la eficiencia puede ser monitoreado por FACS, 24 horas después de la transferencia de las mitocondrias.- Centrifugar la placa de 96 pocillos con los GSCs MitoCepted a 270 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Descartar el sobrenadante.
- Añadir 100 l de tripsina (sin EDTA) en cada pocillo. Incubar a 37 ° C durante 3 min. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para disociar las neuroesferas formadas en el periodo de tiempo de 24 horas.
- Añadir 100 l de medio basal SGC.
- Centrifugar la placa a 270 xg durante 5 min a 20 ° C y descartar el sobrenadante.
- Resuspender GSCS en 300 l GSC medio basal y la transferencia de FACS adaptado tubos.
- Realice la una FACSANÁLISIS.
- El control de fugas mitocondrias colorante vital de las mitocondrias aisladas (FACS)
Nota: El propósito de este paso es determinar la señal de FACS de fondo que no reflejaría una verdadera transferencia MSC mitocondrias sino, más bien, la mera fuga de colorante vital de la mitocondria MSC marcado utilizado para MitoCeption (paso 5.3).- Sembrar las células GSC como se describe en los pasos 3.1 a 3.15.
- Se incuban las células a 37 ° C durante 1 hr.
- Centrifugar la placa de 96 pocillos que contiene mitocondrias solamente (de la etapa 5.4 a 5.6) a 1500 xg durante 5 min a 20 ° C.
- Aspirar el medio de cultivo de la placa de 96 pocillos GSC (paso 6.2.2) y sustituirlo por el medio incubado con mitocondrias solamente (sobrenadante del paso 6.2.3).
- Incubar la placa de 96 pocillos que contiene los GSCs a 37 ° C durante 2 hr.
- Proceder como en los pasos 6.1.1 a 6.1.7 para el análisis FACS.
- Preparación de GSC samples de imagen confocal
Nota: Si la transferencia de MSC mitocondrias para GSCS va a ser analizada por imágenes de fluorescencia, ambos MSC y GSCS necesitan ser etiquetados con anterioridad, respectivamente, con las mitocondrias (paso 1) y celular (paso 2) colorantes vitales.- Preparar GSCS como en los pasos 6.1.1 a 6.1.5.
- Volver a suspender en 2 ml GSCS GSC medio de proliferación que contenía FBS al 2% y las semillas en placas de cultivo de 35 mm (fondo de cristal).
- Realizar imagen confocal en las GSCS con las mitocondrias fluorescentes MSC transferidos 24 horas más tarde.
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Representative Results
Los pasos de procedimiento que describen el aislamiento de las mitocondrias de las células madre mesenquimales (MSC) y su transferencia a las células madre glioblastoma dirigidos (GSC) por MitoCeption se muestran en la Figura 1. GSCS son las células madre cancerosas cultivadas como neuroesferas para preservar sus propiedades de células madre. Para el protocolo, GSCS se siembran como células individuales de un par de horas antes de la transferencia de las mitocondrias (paso 3) para permitir una mayor eficiencia de transferencia de las mitocondrias (ver datos de FACS Figura 3B). A raíz de la Sección 5 (día 3), se observan estas células una vez más como la formación de neuroesferas (Figura 1).
Obtención de imágenes de los GSCs GB4, 72 hr después de MitoCeption con mitocondrias MSC-marcado con fluorescencia, muestra que las mitocondrias MSC se localizan dentro de las GSCs GB4, como se demuestra por las vistas ortogonales obtenidos a partir de imágenes confocal (Figura 2B). Las mitocondrias MSC transferidos aparecen localizados a lo largo de los GSCS, ya que este es también el caso de las mitocondrias GSC endógenos (Figura 2A). Imagen confocal de la MitoCepted GSCS También se realizó con el MSC mitocondrias premarcan con un colorante vital rojo profundo para que se analizaron las mismas muestras GSC tanto por FACS (véase la Figura 3A) y de imagen (Figura 2C). La transferencia de las mitocondrias de MSC se observó para la mayoría de GSCs (panel a) y la reconstrucción 3D a partir de imágenes confocales GSC confirmó la localización intracelular de las mitocondrias MSC transferido (paneles b, c). Prelabeling GSCs (en días 1) con ambas azul colorantes vitales mitocondriales celulares y rojos permiten la visualización de la localización de la mitocondria MSC transferido (de color verde) con relación a la mitocondria GSC endógeno (en rojo), después de la transferencia de las mitocondrias MSC (Figura 2D) .
mientras confoimágenes cal permite verificar la localización intracelular de las mitocondrias MSC transferido siguiente MitoCeption, células activadas por fluorescencia (FACS) es la herramienta de elección para cuantificar la transferencia de las mitocondrias, a condición de mitocondrias MSC se premarcan con un colorante vital. Como se muestra en la Figura 3A, MitoCeption con cantidades crecientes de mitocondrias fluorescentes MSC provocado un aumento de las señales de FACS. Digno de mención, esta señal (en rojo) era varios órdenes de magnitud más alta que la señal obtenida en las condiciones de control (en azul, véase el paso 6.2). Esta evidencia condición adicional de que la señal de FACS es representativa de MSC mitocondrias transferido dentro GSCS y no meramente el resultado de la fuga de colorante vital fluorescente de la mitocondria etiqueta MSC. El protocolo de transferencia de mitocondrias que aquí se presenta, realizado en GSCs de células individuales, mostraron una respuesta dependiente de la dosis (Figura 3B). La eficiencia de la transferencia de las mitocondrias MSC también se evaluó en neurospheres. Aunque esto también dio lugar a la transferencia de MSC mitocondrias a las GSCs, la eficacia de la transferencia fue menor, como se muestra en un experimento representativo (Figura 3B).
La transferencia de MSC mitocondrias y su mantenimiento dentro de las GSCs puede ser seguido por la cuantificación de ADN mitocondrial MSC (ADNmt) en los GSCs. Esto requiere que las MSC y GSCS que se obtienen a partir de diferentes donantes, con haplotipos distintos. La Figura 3C muestra secuencias de ADNmt se encuentran dentro de la D-loop de dos donantes con polimorfismos de nucleótido único (SNPs) indicada en la posición del extremo 3 '. Para el diseño de cebadores de PCR, para amplificar específicamente el ADNmt de cualquiera de los donantes 1 o donante 2, se introdujo una mutación adicional en la posición n-2 en relación con el extremo 3 'de los cebadores de PCR. El ADN mitocondrial del donante 1 podría ser amplificado con el conjunto de cebadores: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'y 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (s universalesequencing imprimación 38), mientras que el conjunto de cebadores: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(cebador de secuenciación universal a partir de 38) y 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' se utilizó para amplificar el ADN mitocondrial del donante 2.
Figura 1: Flujo de trabajo para la transferencia de las mitocondrias aisladas de MSC a GSCS por MitoCeption. Se muestran los 7 pasos para el MitoCeption de MSC mitocondrias para GSCS y los análisis posteriores de la SGC. Los números de los pasos se indican como en la sección de protocolo. Si no se realiza MSC y etiquetado GSC, como para los análisis funcionales, los pasos 1 y 2 se puede omitir y el protocolo puede ser seguido de día 2 en. imágenes de contraste de fase representan GSCS Gb4 como neuroesferas (día 1), como la cultura unicelulares listo para la transferencia MSC mitocondrias (día 2) y 24 horas después de la transferencia de las mitocondrias (día 3). Barra de escala =100 micras. En el paso 4, microfotografía representativa de las mitocondrias MSC aisladas, premarcan con MitoTracker Red CMXRos antes del aislamiento de MSCs. Barra de escala = 5 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Obtención de imágenes de Gb4 mitocondrias endógeno y mitocondrias de MSC después de la transferencia a las GSCS Gb4 por MitoCeption. (A, B, C) Gb4 GSCS fueron marcadas con un colorante vital verde. (B, C, D) Gb4 GSCS fueron MitoCepted con 2,5 g de preparación mitocondrias MSC (por 10 5 GSCS). (A) GSCS se marcaron con MitoTracker Red CMXRos y se cultivaron durante 48 horas (medio de proliferación GSC w / o EGF / bFGF).(B) GSC sección confocal y vistas ortogonales, 72 horas después de MitoCeption con mitocondrias etiqueta MSC-CMXRos MitoTracker Red (medio de cultivo: medio de proliferación GSC / FBS al 2%). (C, D) MSC se premarcan con un profundo color rojo mitocondrias colorante vital (mismas condiciones que para el análisis FACS) antes de la transferencia de MSC mitocondrias para GSCS. Después de la transferencia MSC mitocondrias, GSCS se sembraron en medio de proliferación GSC que contiene FBS al 10%. (C) vistas Isosurface (B, C) con la sección plano xy (c), de una reconstrucción 3D a partir de imágenes GSC confocal (48 horas después de MitoCeption). (D) Gb4 GSCS fueron marcadas con un colorante vital azul celular y unas mitocondrias rojas colorante vital antes de la transferencia de MSC mitocondrias premarcan con un colorante vital profundas mitocondrias rojas (con imagen formada en verde). vistas Isosurface con xz (b) y XY (c) Secciones planas de una reconstrucción 3D a partir de imágenes GSC confocal (72 horas después de la transferencia de las mitocondrias MSC). Todas las células wERE sembraron en placas de cultivo con fondo de cristal y las imágenes fueron tomadas en las células vivas. Las barras de escala = 5 micras, con excepción de panel de imágenes C (a) cuando Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La cuantificación de la transferencia de las mitocondrias por células activadas por fluorescencia (FACS) y la detección de ADN mitocondrial MSC (ADNmt) en los GSCs. (A, B) se GSCs MitoCepted con MSC mitocondrias premarcan con un mitocondrias rojo colorante vital profunda y se analizaron por FACS. (A) FACS representativos resultados obtenidos con MitoCepted GSCS (en rojo, de arriba a abajo: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 mg preparación de las mitocondrias MSC (por 10 5 GSCS)). En azul, para el EACpanel de h, el control de perfil FACS de GSCs incubó con el medio de cultivo acondicionado con la misma cantidad de MSC mitocondrias tal como se utiliza para MitoCeption (véase el paso 5.4). las condiciones de control con GSCS no marcados en negro (parte superior). (B) la intensidad media de fluorescencia relativa (MFI) obtenida después de la transferencia de las mitocondrias en GSCS de células individuales (- •) (promedio de 3 experimentos, con SEM), en un día neuroesferas GSC (- O) y con las mitocondrias de control sobrenadantes de GSC células individuales (-). Secuencias de ADN (C) dentro de la D-loop ADNmt y diferencias de SNP entre los donantes 1 y 2. SNPs se indican en azul en el extremo 3 'de las secuencias. Diseño de cebadores para la amplificación específica por PCR de ADN mitocondrial de cualquiera de los donantes (cebadores Spe 1 y 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un creciente número de estudios muestran que las células pueden intercambiar las mitocondrias y que estas mitocondrias tener profundos efectos en el metabolismo y las funciones de la célula diana. Por lo tanto, es esencial para dominar las herramientas para transferir cuantitativamente la mitocondria de las células del donante a estas células diana para permitir un estudio preciso de sus efectos biológicos.
El protocolo descrito aquí fue originalmente funcionó para transferir las mitocondrias aisladas de células madre mesenquimatosas humanas a la línea celular de cáncer adherente MDA-MB-231 33. Como se muestra aquí, puede ser adaptado para que las células madre de cáncer que crecen como neuroesferas en vitro. Aunque la transferencia de las mitocondrias se produce cuando las mitocondrias MSC se añaden a las neuroesferas GSC, se encontró ser más eficientes en GSCs de células individuales, como se describe en el presente protocolo. Este protocolo también podría extrapolarse a otras células no adherentes, como las células T, con la necesidad de unaDAPT la concentración de células sembrado para el paso MitoCeption.
La preparación mitocondrias se debe realizar en hielo para mantener su integridad. Para obtener preparaciones mitocondrias con la contaminación reducida de otros compuestos de citosol, centrifugación para la recuperación de las mitocondrias se realiza a 3.000 xg durante 15 min. Para controlar la cantidad de mitocondrias MSC utilizado para la transferencia a las GSCs, se determina el contenido de proteína mitocondrias. Para este propósito, los extractos de proteínas mitocondrias se preparan utilizando tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa. La concentración de proteína se determinó usando el ensayo del ácido bicinconínico, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. albúmina de suero bovina se utilizó como un estándar. En promedio 10 g de proteínas se obtuvieron de 100.000 MSCs.
Etiquetado MSC mitocondrias con un colorante vital permite la cuantificación de la eficiencia de la transferencia de las mitocondrias, por fluorescencia de células activadas(FACS), y determinar la localización de las mitocondrias transferidos por formación de imágenes confocal. Los GSCS pueden marcarse con la misma mitocondria colorante vital como el MSC. Estas células se utilizaron como control positivo para el análisis FACS. Alternativamente, GSCs se pueden marcar con un colorante vital mitocondrias diferente de la de los MSCs, permitiendo la localización de las mitocondrias MSC transferidos relativos a la mitocondria GSC endógenos. La mitocondria rojo colorante vital profunda es muy adecuado para el análisis de FACS, mientras que los colorantes mitocondrias verde y rojo son los preferidos para formación de imágenes confocal. De gran importancia, la exposición al EDTA MSC debe evitarse en todos los pasos del protocolo. Por lo tanto, la tripsinización de células se recomienda con tripsina y EDTA no; el cóctel de inhibidores de proteasa utilizados para la preparación mitocondrias debería, así, estar desprovisto de EDTA. En presencia de EDTA, se observó una fuga de la mitocondria colorante vital de MSC mitocondrias. Si la transfe mitocondriasr para GSCS va a ser analizada por microscopía, las células de glioblastoma destinatario también deben ser etiquetados con un colorante vital. Se prefieren los colorantes de células verdes y azules (véase Materiales y Reactivos Tabla), ya que dan un marcaje celular más homogénea, lo que permite la reconstrucción 3D a partir de imágenes confocal.
Una vez que el protocolo ha sido validado por el usuario con sus células específicas, etiquetado mitocondrias se quedará fuera de los estudios funcionales, para evitar posibles sesgos biológicos. análisis de dosis-respuesta en un amplio intervalo de concentraciones de mitocondrias MSC, con diluciones en serie de la preparación de las mitocondrias, es aconsejable. De hecho, hay que señalar que los efectos biológicos de la mitocondria transferidos podrían alcanzarse para bajas concentraciones mitocondrias, en el rango inferior para la detección por FACS o formación de imágenes. Estos estudios funcionales, incluidas las investigaciones sobre el metabolismo de GSC, la proliferación y la respuesta al tratamiento, se llevó a cabo el día siguiente a lala transferencia de las mitocondrias.
Si MSCs y GSCs se aíslan de diferentes donantes (con diferentes haplotipos de ADNmt), la mitocondria MSC transferidos se pueden monitorizar mediante la medición de las concentraciones de MSC ADNmt en las GSCs dirigidos. La discriminación entre el MSC y endógeno GSC ADNmts se basa en la presencia de SNPs, específica para cada tipo de célula, en la región D-bucle hipervariable ADNmt. Por lo tanto, entre las diversas aplicaciones de la técnica MitoCeption, la posibilidad de transferir las mitocondrias que alberga ADN mitocondrial con diferentes haplotipos no sólo permite la detección de la mitocondria transferidos sino que también proporciona las herramientas para estudiar la biología de mantenimiento ADNmt, incluyendo el análisis de exclusión de haplotipos.
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Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), con el que CJ y ML.V. están afiliados, ha presentado una solicitud de patente de la técnica MitoCeption (EP14306154.7).
Acknowledgments
Agradecemos a Andrea Parmeggiani (L2C y DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier), así como los miembros del laboratorio útil para los debates, Christophe Duperray para ayudar con el análisis FACS, la instalación de imágenes RIO Montpellier (MRI) para proporcionar el medio ambiente adecuado para FACS y microscopía confocal. BNM fue apoyado por una beca de postgrado de la LABEX Numev (convención ANR-10-LabX-20). AB fue apoyado por una beca de estudiante de la Universidad de Varsovia y la Unión Europea (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV es un miembro del personal científico del Centro Nacional de Investigación Científica (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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