Summary
Här, är ett protokoll (MitoCeption) presenteras för att överföra mitokondrier, isolerade från humana mesenkymala stamceller (MSC), till glioblastom stamceller (GSC), med målet att studera deras biologiska effekter på GSC metabolism och funktioner. Ett liknande protokoll kan anpassas för att överföra mitokondrier mellan andra celltyper.
Abstract
Mitokondrierna spelar en central roll för cellmetabolism, energiproduktion och kontroll av apoptos. Otillräcklig mitokondriefunktion har befunnits ansvarig för mycket olika sjukdomar, som sträcker sig från neurologiska sjukdomar till cancer. Intressant nog har mitokondrier nyligen visats att visa förmåga att överföras mellan celltyper, särskilt från humana mesenkymala stamceller (MSC) till cancerceller i samodling förhållanden, med metabola och funktionella konsekvenser för mitokondrier mottagarceller, att ytterligare stärka den aktuella för de biologiska egenskaperna hos dessa organeller.
Utvärdera effekterna av den överförda MSC mitokondrier i målceller är av största vikt att förstå den biologiska resultatet av sådana cell-cell interaktioner. Den MitoCeption protokoll som beskrivs här tillåter överföring av mitokondrierna isolerade i förväg från givarceller till målcellerna med hjälp av MSC mitokondrieroch glioblastom stamceller (GSC) som ett modellsystem. Detta protokoll har tidigare använts för att överföra mitokondrier, isolerade från MSC: er, för att vidhäftande MDA-MB-231 cancerceller. Detta mitokondrierna överföringsprotokoll anpassas här för GSCs som presenterar den specifika egenhet att växa som neuro in vitro. Överföringen av isolerade mitokondrier kan följas av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och konfokal avbildning med mitokondrier vitala färgämnen. Användningen av mitokondrier donator- och målceller med distinkta haplotyper (SNP) möjliggör också detektering av de överförda mitokondrier, baserat på koncentrationen av deras cirkulära mitokondrie-DNA (mtDNA) i målcellerna. När protokollet har validerats med dessa kriterier, kan cellerna hyser de överförda mitokondrier analyseras ytterligare för att bestämma effekterna av exogena mitokondrier på biologiska egenskaper såsom cellmetabolism, plasticitet, spridning och behandlingssvaret.
Introduction
Mitokondrierna är organeller som finns i eukaryota celler där de spelar en central roll i näringsupptag samt energi och metabolit produktion. Dessa organeller innehåller cirkulär mitokondrie-DNA (mtDNA), 16,6 kb långt, som kodar för proteiner av elektrontransportkedjan komplex, tRNA och rRNA 1. Funktionaliteten hos dessa organeller är avgörande för cell homeostas och flera patologier har förknippats med mitokondrier dysfunktion 1, 2, 3. Mitokondrierna status har till exempel varit kopplade till inflammation, infektionssjukdomar och cancer, i det senare fallet med konsekvenser för metastaser och resistens mot behandling 4, 5, 6, 7.
Mitokondrier visar anmärkningsvärd kapacitet få överföras mellan "givare" och "mål" celler. Detta leder till förändringar i den energiska metabolism av målcellerna såväl som i andra funktionella modifieringar såsom vävnadsreparation och motstånd mot kemoterapeutiska medel, vilket har framgått av olika laboratorier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De humana mesenkymala stamceller (MSC) för att visa denna förmåga att överföra mitokondrier till en bred variation av målceller, inklusive hjärtmuskelceller, endotelceller pulmonära alveolära epitelceller, renala tubulära celler och cancerceller, vilket leder till modifieringar av de funktionella egenskaperna hos dessa celler 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitokondrier utbyte verkar nu som en brett använd mekanism som medger ett antal olika celltyper för att kommunicera med varandra och ändra deras biologiska egenskaper. Denna mitokondrier utbyte kan ske genom tunnel nanorör (TNT) bildning som omfattar connexin 43-innehållande gap junctions 8 eller M-Sec / TNFaip2 och exocyst komplexa 19. Alternativt framställdes mitokondrierna överföringen också visat sig vara medierad av arrestin domän-innehållande protein 1-medierade mikrovesiklar (ARMMs) 20. Intressant nog var effekten av mitokondrierna överföringen i samband med uttrycket hastigheten av Rho GTPas en MIRO1 21, en nyckelfaktor för att förklara skillnaderna i mitokondrier överföringsutbyte mellan iPSC-MSC och vuxna BM-MSC 22.
Trots denna rikedom av uppgifter om cell till cell mitokondrier utbyte, är relativt lite känt om den metaboliska och biologiska resultatet av denna mitokondrier överföring. Därför helt motiverar det inrätta lämpliga verktyg för att helt utvärdera de biologiska effekterna av denna överföring. Under årens lopp har flera tekniska metoder överföra mitokondrier från donator till acceptor celler har föreslagits. Detta inkluderar direkt injektion av mitokondrier i oocyter 23, 24, 25, cellfusion för att generera transmitochondrial Cybrids 26, 27 och, mer nyligen, överföring av isolerade mitokondrier med hjälp av fototermiska nanoblades 28.
Vi och andra tidigare visat förmåga isolerade mitochondria som skall internaliseras av levande celler, såsom observerats både in vitro och in vivo 29, 30, 31, genom mekanismer som föreslås för att involvera macropinocytosis 32. Vi utvecklade vidare en metod, som kallas MitoCeption, kvantitativt överföra isolerade mitokondrier (från MSC: er) till målceller, såsom exemplifieras med (den vidhäftande) MDA-MB-231 bröstcancercell-linjen 31. Detta protokoll anpassades här för överföring av isolerade humana MSC mitokondrier till glioblastom stamceller (GSCs).
Glioblastom är aggressiva maligna tumörer i hjärnan som snabbt blir resistenta mot behandling, främst till följd av glioblastom stamceller (GSC) förekommer i tumören 33. Dessa GSCs växa som neuro in vitro och generera tumörer i xenograft-modeller. Cancerceller inom glioblastom harförmåga att göra cell-till-cell-anslutningar, som visas nyligen astrocytiska hjärntumörceller som interconnect via utökade mikrorör, genom vilken mitokondrier (liksom kalcium och cellkärnor) kan migrera, vilket resulterar i strålbehandling resistenta astrocytom nätverk 34. Glioblastoma kan rekrytera många olika celler i tumören mikro, inklusive MSC 35, 36. Vi visade att MSC kan göra cell-cell kontakter med GSCs i samodling och överföra sina mitokondrier (data visas ej), som förväntas modifiera GSC funktionella egenskaper. Det nuvarande protokollet beskriver hur MitoCeption teknik kan användas för att överföra mitokondrier, isolerade i förväg från humana MSC, mänskliga GSCs i syfte att fastställa deras funktionella biologiska resultat. Den multipotenta och mycket tumorigena GB4 GSC linje 37 användes i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag 1
1. Märkning av mesenkymala stamcellen (MSC) Mitokondrierna (tillval)
- Två dagar före mitokondrierna förberedelse, utsäde mänskliga MSCs i en 100 mm odlingsskål i 10 ml aMEM / FBS 10%, så att de har 4 x 10 5 MSC i odling på dag ett.
- Skölj MSCs med PBS (4 ml) och tillsätt 4 ml aMEM / FBS 1% (förvärmd till 37 ° C).
- Tillsätt erforderlig mängd mitokondrier vitala färgämnet och inkubera cellerna under 30 min i 37 ° C inkubator.
- Ta mitokondrierna färgämneslösningen, skölj cellerna två gånger med 4 ml förvärmd (37 ° C) aMEM / FBS 1% och till tillbaka 4 ml aMEM / FBS 10%. Inkubera cellerna vid 37 ° C.
- Ändra odlingsmedium (10 ml aMEM / FBS 10%) efter 30 minuter och en annan gång, två timmar senare.
Dag 1
2. Märkning av Glioblastoma stamceller (GSC) (tillval, se Diskussion avsnitt)
| Cellodlingsmedium | Sammansättning |
| GSC basalmedium | DMEM / F-12 kompletterat med |
| Insulin 20 mg / ml | |
| N2 komplettera 1x | |
| Glukos 3 g / L | |
| L-glutamin 2 mM | |
| GSC proliferation mediet | Lägg till basmediet: |
| B27 komplettera 1x | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizone 0,25 mg / ml | |
| Heparin 2 mg / ml | |
| Ciprofloxacin 2 | ig / ml | |
| Gentamicin 2 | ig / ml | |
| MSC proliferation mediet | & #945; MEM kompletterat med |
| L-glutamin 2 mM | |
| 10% FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tabell 1: Kultur Media.
- Dissociera GSCs (GB4 cellinje 32 (10 x 10 6 celler) odlas som neuro på poly-HEMA belagda cellodlingsflaskor (se steg 3.1 till 3.12).
- Utsädes GSCs i en 48-brunnars platta vid 10 5 celler / brunn i GSC proliferation medium (500 | j, l) (se tabell 1).
- Centrifugera plattan vid 270 xg under 5 min vid 20 ° C.
- Tillsätt erforderlig mängd cell vitala färgämnet och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
- Tillsätt 500 pl av GSC basalmedium (tabell 1) per brunn i 48-brunnars platta.
- Centrifugera plattan vid 270 xg vid 20 ° C under 5 min. Aspirera supernatanten.
- Upprepa steg från 2,5 till 2,6.
- Tillsätt 500 pl av GSC basalt medium och inkubera vid 37 ° C under 30 min.
- Centrifugera plattan vid 270 xg vid 20 ° C under 5 min. Aspirera supernatanten.
- Tillsätt 500 pl av GSC proliferation medium per brunn i 48-brunnars platta och inkubera i 37 ° C inkubator.
Obs: Mängden GSCs indikerade (10 x 10 6 celler) kan utföra de olika dos-responsexperiment och FACS kontroller. När de experimentella villkoren preciseras detta belopp kan skalas ner.
Dag 2
3. Sådd av Glioblastoma stamceller
- Samla in neurosfärerna GSC (10 x 10 6 celler) genom centrifugering vid 270 x g under 5 min, vid 20 ° C i ett 50 ml rör.
- Tvätta cellerna med 5 ml HBSS, och centrifugera vid 270 xg under 5 min vid 20 ° C.
- Aspirera supernatanten.
- Försiktigt resuspendera pelleten GSC i 100 pl trypsin-EDTA (0,25%) (per 10 x 10
- Inkubera vid 37 ° C under 3 min.
- Tillsätt 10 | il CaCl2 (20 mM) och 2 | il DNas I (10 mg / ml).
- Dissociera neurosfärerna genom att försiktigt pipettera upp och ned (30-50x) med en P200 pipett. Undvika bubblor. Kontrollera i mikroskop att alla GSCs dissocieras.
- Tillsätt 10 | il trypsininhibitor (5%) och 10 ml HBSS.
- Centrifugera GSCs vid 270 xg under 7 min vid 20 ° C.
- Kasta bort supernatanten och tillsätt 10 ml GSC basalmedium (tabell 1).
- Räkna GSCs med en Thoma räknekammare och centrifugera sedan cellerna vid 270 xg under 7 min vid 20 ° C.
- Tillsätt lämplig volym av GSC spridningsmedium (tabell 1) för att nå den cellulära koncentrationen av 10 6 GSCs / ml.
- Seed 10 5 GSCs (100 | j, l av cellsuspensionen) per brunn i en 96-brunnars platta.
- Centrifugera plattorna vid 270 xg under 7 min vid 20 ° C för att få GSCs vid botTom brunnar.
- Inkubera 96-brunnars platta vid 37 ° C tills avsnitt 5.
Dag 2
4. MSC Mitokondrier Isolering
- Justera mikrorör centrifug temperaturen till 4 ° C.
- Förbered två 1,5 ml rör "A" och "C" som innehåller de reagens för mitokondrierna extraktion (200 pl reagens A och 400 pl reagens C, båda innehållande de EDTA-fri proteashämmare). Förbered 2 andra rör, märkta "MSC" och "Mito". Håll alla rören på is. Också förbereda rören för mitokondrier serieutspädningar.
- Tvätt MSCs med 10 ml förvärmd (37 ° C) PBS.
- Tvätta MSCs med 2 ml trypsin (ingen EDTA) under 10 sekunder och tillsätt 1 ml trypsin (ingen EDTA). Inkubera cellerna under 5-10 min vid 37 ° C.
- Återställa MSC genom att tillsätta 10 ml aMEM / FBS 10%, överföring till en 50 ml tub.
- Centrifugera cellerna vid 270 xg under 5 min vid 20 ° C.
- Kasta bort supernatanten och tillsätt10 ml aMEM / FBS 10% till cellpelleten.
- Räkna MSCs med Malassez räknekammare.
- Centrifugera MSCs (4-5 x 10 5) vid 270 xg under 5 min vid 20 ° C.
- Kassera supernatanten, tillsätt 1 m iskall aMEM / FBS 10% till cellpelleten och överföra cellerna till "MSC" -märkt rör (framställd i steg 4,2). Hålla röret på is.
- Centrifugera röret innehållande MSCs vid 900 xg under 5 min, vid 4 ° C.
- Avlägsna all resterande medium från röret.
- Tillsätt 200 pl av Mitokondrier Isolering reagens A (innehållande EDTA-fri proteashämmare). Vortex vid medelhastighet under 5 sekunder och lämna rören på is för exakt två minuter.
- Tillsätt 2,5 pl Mitokondrier Isolering Reagens B. Vortex vid maximal hastighet under 10 sekunder, och sedan lämna rören på is. Upprepa var 30 sekund under 5 minuter.
- Tillsätt 200 pl av Mitokondrier Isolering Reagens C (innehållande EDTA-fri proteashämmare). Blanda genom att luta röret (roughly 30 gånger, inte vortex). Centrifugera röret vid 700 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Överför supernatanten (innehållande MSC mitokondrier) till "Mito" rör (framställd i steg 4,2).
- Centrifugera vid 3000 x g, 15 min vid 4 ° C, för att få mitokondrier pelleten. Kassera supernatanten. Pelleten innehåller de isolerade mitokondrier.
- Skölj mitokondrierna pelleten med 200 | j, l av Reagens C. Därefter centrifugera vid 12000 xg, 5 min vid 4 ° C, för att få mitokondrier pelleten.
5. Överföring av isolerade MSC Mitokondrier till GSCs (MitoCeption)
- Tillsätt 200 pl av för-kyld (0 ° C) GSC proliferation medium till mitokondrierna pellet som isolerats från MSC: er (4 x 10 5).
- Späd beredningen mitokondrier (i GSC spridning medium) att konsekvent tillsätt 20 pl mitokondriella suspension till GSCs.
- Lägga volymen av isolerade mitokondrier i brunnarna i 96-well platta innehållande de GSCs (från steg 3,15), vid den önskade koncentrationen (0,1 till 10 | j, g). Lägga mitokondrierna långsamt, nära botten av brunnen, som täcker hela ytan åtminstone en gång.
- För styrning av MSC mitokondrier vitala färgämnet läckage, lägga till samma mängder av preparatet mitokondrier (0,1 till 10 mikrogram) till brunnar i en 96-brunnar innehåller GSC spridning mediet (inga GSCs) (se del 6.2 för vitala färgämnet upptäckt av läckage).
- Centrifugera 96-brunnsplatta innehållande mitokondrierna mottagande GSCs med MSC mitokondrier (steg 5,3) och styrplattan (steg 5,4) vid 1500 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Placera odlingsplattoma i 37 ° C cellinkubator omedelbart efter centrifugering.
Obs! Mitokondrier överföringsprotokoll bygger på centrifugering av mitokondrier fjädring på de odlade cellerna vid lämplig centrifugeringskraft, med ett antal centrifuge som kan justeras beroende på system av mitokondrier donator / mottagarceller.
dag 3
6. Analys av mitokondrier Transfer med FACS och Confocal Imaging
- Beredning av prover GSC för FACS analys
Obs: Om MSC mitokondrier märktes med en vital färgämne i förväg (avsnitt 1), kan verkningsgraden övervakas genom FACS, 24 timmar efter mitokondrierna överföringen.- Centrifugera 96-brunnar med MitoCepted GSCs vid 270 xg under 5 min vid 20 ° C.
- Kassera supernatanten.
- Tillsätt 100 | il trypsin (ingen EDTA) i varje brunn. Inkubera vid 37 ° C under 3 min. Pipettera upp och ner för att dissociera de neurosfärer som bildas i 24 h tidsperiod.
- Tillsätt 100 pl GSC basal medium.
- Centrifugera plattan vid 270 xg under 5 min vid 20 ° C och kasta bort supernatanten.
- Resuspendera GSCs i 300 pl GSC basalt medium och överföring till FACS anpassade rör.
- Utför FACS enALYS.
- Kontroll för mitokondrier vitala färgämnet läckage från den isolerade mitokondrier (FACS)
Obs: Syftet med detta steg är att bestämma bakgrunds FACS signal som inte skulle återspegla ett verkligt MSC mitokondrier överföring utan snarare enbart läckage av vitala färgämnet från den märkta MSC mitokondrier används för MitoCeption (steg 5,3).- Seed GSC-celler såsom beskrivits i steg 3.1 till 3.15.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 1 timme.
- Centrifugera 96-brunnar som endast innehåller mitokondrier (från steg 5,4-5,6) vid 1500 xg under 5 min vid 20 ° C.
- Aspirera odlingsmedium från GSC 96-brunnar (steg 6.2.2) och ersätta den med mediet inkuberades med mitokondrier endast (supernatant från steg 6.2.3).
- Inkubera 96-brunnars platta som innehåller de GSCs vid 37 ° C under 2 h.
- Gör som i steg 6.1.1 till 6.1.7 för FACS-analys.
- Framställning av GSC SAMPles för konfokal avbildning
Obs: Om överföringen av MSC mitokondrier till GSCs ska analyseras av fluorescens avbildning, både MSC och GSCs måste märkas i förväg, respektive med mitokondrier (steg 1) och cell (steg 2) vitala färgämnen.- Förbered GSCs som i steg 6.1.1 till 6.1.5.
- Resuspendera GSCs i 2 ml GSC proliferation medium innehållande 2% FBS och utsäde i 35 mm odlingsskålar (glas botten).
- Utför konfokal avbildning på GSCs med de överförda fluorescerande MSC mitokondrier 24 timmar senare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De steg i förfarandet som beskriver isolering av mitokondrier från mesenkymala stamceller (MSC) och deras överföring till målinriktade glioblastom stamceller (GSC) av MitoCeption visas i figur 1. GSCs är cancerstamceller odlas som neuro att bevara sina stamcellsegenskaper. För protokollet, är GSCs ympas som enskilda celler ett par timmar innan överföringen av mitokondrier (steg 3) för att tillåta högre effektivitet mitokondrier överföring (se FACS uppgifter figur 3B). Följande avsnitt 5 (dag 3), dessa celler observeras igen utgöra neuro (Figur 1).
Avbildning av GB4 GSCs, 72 h efter MitoCeption med fluorescensmärkt MSC mitokondrier, visar att MSC mitokondrier är lokaliserade inuti GB4 GSCs, vilket framgår av de ortogonala vyer erhållna från konfokala bilder (figur 2B). De överförda MSC mitokondrier verkar lokaliserade alltigenom GSCs, eftersom detta är också fallet för de endogena GSC mitokondrier (Figur 2A). Konfokal avbildning av MitoCepted GSCs utfördes också med MSC mitokondrier förmärkta med en djupröd vitala färgämnet, så att samma GSC proverna analyserades både med FACS (se figur 3A) och avbildning (Figur 2C). Överföring av MSC mitokondrier kunde observeras för de flesta GSCs (panel a) och 3D-rekonstruktion från GSC konfokala bilder bekräftade den intracellulära lokaliseringen av den överförda MSC mitokondrier (paneler b, c). Prelabeling GSCs (dag 1) med både blå cellulära och röda mitokondriella vitala färgämnen tillåtna visualisera lokaliseringen av det överförda MSC mitokondrier (färgad i grönt) i förhållande till den endogena GSC mitokondrier (i rött), efter MSC mitokondrier överföring (Figur 2D) .
medan confocal imaging tillåter kontroll av intracellulära lokaliseringen av den överförda MSC mitokondrier efter MitoCeption, fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är det bästa sättet att kvantifiera mitokondrierna överföringen, förutsatt MSC mitokondrier förmärkta med en vital färgämne. Som visas i figur 3A, MitoCeption med ökande mängder av fluorescerande MSC mitokondrier ledde till ökade FACS signaler. Anmärkningsvärt, denna signal (i rött) var flera tiopotenser högre än den signal som erhålls i kontrollförhållanden (i blått, se steg 6.2). Denna ytterligare visat att FACS-signalen är representativ för MSC mitokondrier överförs i GSCs och inte bara ett resultat av fluorescerande vitala färgämnet läckage från den märkta MSC mitokondrier. Mitokondrierna överföringsprotokoll som presenteras här, utförs på en enda cell GSCs, visade en dosberoende respons (figur 3B). Effektiviteten av MSC mitokondrier överföringen utvärderades också på Neurospheres. Även om detta också lett till MSC mitokondrier överföring till GSCs, effekten av överföringen var lägre, vilket visas i ett representativt experiment (figur 3B).
Överföringen av MSC mitokondrier och deras underhåll inuti GSCs kan följas genom att kvantifiera MSC mitokondrie-DNA (mtDNA) i GSCs. Detta kräver MSC och GSCs kan erhållas från olika givare, med distinkta haplotyper. Figur 3C visar mtDNA-sekvenser hittats inom D-slingan hos två givare med single nucleotide polymorphisms (SNPs) indikerade vid 3'-ändpositionen. För utformningen av PCR-primers, för att specifikt amplifiera mtDNA från antingen donator 1 eller donator 2, tillsattes en ytterligare mutation infördes vid position n-2 i förhållande till 3'-änden av PCR-primrarna. MtDNA från givare 1 kunde amplifieras med uppsättningen av primrar: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 'och 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (universella sequencing primer 38), under det att uppsättningen av primrar: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(universal sekvenseringsprimer från 38) och 5'-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3' användes för att amplifiera mtDNA från givare 2.
Figur 1: Workflow för överföring av isolerade MSC mitokondrier till GSCs av MitoCeption. 7 steg för MitoCeption MSC mitokondrier till GSCs och efterföljande GSC analyserna visas. Stegnumren anges som i protokollet avsnitt. Om MSC och GSC märkningen inte utförs, som för funktionsanalyser, steg 1 och 2 kan utelämnas och protokollet kan följas från dag två på. Faskontrast bilder representerar GB4 GSCs som neuro (dag 1), som encelliga kultur redo för MSC mitokondrier överföring (dag 2) och 24 timmar efter mitokondrierna överföring (dag 3). Skala bar =100 | j, m. I steg 4, representativt mikrofotografi av isolerade MSC mitokondrier, förmärkta med MitoTracker Red CMXRos före isolering från MSC. Skalstreck = 5 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: avbildning av GB4 endogen mitokondrier och MSC mitokondrier efter överföring till GB4 GSCs av MitoCeption. (A, B, C) GB4 GSCs märktes med en grön vitala färgämnet. (B, C, D) GB4 GSCs var MitoCepted med 2,5 mikrogram MSC mitokondrier beredning (för 10 5 GSCs). (A) GSCs märktes med MitoTracker Red CMXRos och odlades under 48 h (GSC proliferation mediet w / o EGF / bFGF).(B) GSC konfokala avsnitt och ortogonala vyer, 72 timmar efter MitoCeption med MitoTracker Red CMXRos-märkt MSC mitokondrier (odlingsmedium: GSC spridning medium / FBS 2%). (C, D) MSC har förmärkta med en djupröda mitokondrier vitala färgämnet (samma villkor som för FACS-analys) innan överföringen av MSC mitokondrier till GSCs. Efter MSC mitokondrier överföringen var GSCs såddes i GSC spridning medium innehållande FBS 10%. (C) isosurface vyer (B, C) med xy-planet sektion (c) i en GSC 3D-rekonstruktion från konfokala bilder (48 h efter MitoCeption). (D) GB4 GSCs märktes med en blå cell vitala färgämnet och en röd mitokondrier vitala färgämnet innan överföringen av MSC mitokondrier förmärkta med en djupröda mitokondrier vitala färgämnet (avbildade i grönt). Isosurface vyer med xz (b) och xy (c) plana sektioner av en GSC 3D-rekonstruktion från konfokala bilder (72 timmar efter MSC mitokondrier överföring). Alla celler were seedade på odlingsskålar med glasbotten och bilder togs på levande celler. Skalstrecken = 5 um, med undantag för bild C panel (a) där Skala bar = 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kvantifiering av mitokondrierna överföring genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och detektion av MSC mitokondrie-DNA (mtDNA) i GSCs. (A, B) GSCs var MitoCepted med MSC mitokondrier förmärkta med en djup röd mitokondrier vitala färgämnet och analyserades med FACS. (A) Representativa FACS resultat som erhållits med MitoCepted GSCs (i rött, från topp till botten: 0,6; 1,2; 2,5; 5; 10 mikrogram MSC mitokondrier beredning (för 10 5 GSCs)). I blått, för EACh panel, styra FACS profilen för GSCs inkuberades med odlingsmediet rade med samma mängd av MSC mitokondrier som användes för MitoCeption (se steg 5.4). Kontrollförhållanden med omärkta GSCs i svart (överst). (B) Relativ genomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) som erhållits efter mitokondrierna överföring på en enda cell GSCs (- •) (genomsnitt 3 experiment, med SEM), på endags GSC neuro (- o) och kontroll mitokondrier supernatanter på GSC enstaka celler (-). (C) DNA-sekvenser inom mtDNA D-slinga och SNP skillnader mellan givare 1 och 2. SNP indikeras i blått vid 3'-änden av sekvenserna. Utformning av primrar för specifik PCR-amplifiering av mtDNA från antingen donator (primrar spe 1 och 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ett ökande antal studier visar att celler kan utbyta mitokondrier och att dessa mitokondrier har djupgående effekter på målet cellens ämnesomsättning och funktioner. Därför är det nödvändigt att behärska de verktyg för att kvantitativt överföra mitokondrier från donatorcellerna på dessa målceller för att möjliggöra en noggrann studie av deras biologiska effekter.
Protokollet som beskrivs här var ursprungligen räknat ut för att överföra mitokondrier isolerade från humana mesenkymala stamceller för att den vidhäftande cancercellinjen MDA-MB-231 33. Som visas här, kan den anpassas för cancerstamceller som växer som neurosfärer in vitro. Även mitokondrierna överföringen sker när MSC mitokondrier läggs till neuro GSC, konstaterades det att vara mer effektivt om encelliga GSCs, som beskrivs i detta protokoll. Detta protokoll kan också extrapoleras till andra icke-adherenta celler, såsom T-celler, med behovet av att enDAPT den ympade cellkoncentrationen för MitoCeption steget.
Mitokondrierna preparatet bör utföras på is för att behålla sin integritet. För att få mitokondrier preparat med minskad kontaminering från andra cytosol föreningar är centrifugering för återvinning av mitokondrier utfördes vid 3000 xg under 15 minuter. Att övervaka mängden MSC mitokondrier som används för överföring till GSCs är innehållet mitokondrierna protein bestämd. För detta ändamål är mitokondrier proteinextrakt bereddes med användning av RIPA-buffert kompletterad med proteashämmare. Proteinkoncentrationen bestämdes med användning av bicinkoninsyra assay, enligt tillverkarens instruktioner. Bovint serumalbumin användes som en standard. I genomsnitt 10 mikrogram av proteiner erhölls från 100.000 MSC.
Märkning MSC mitokondrier med en vitala färgämnet kan kvantifiera effektiviteten i mitokondrierna överföringen av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS), och bestämma lokaliseringen av de överförda mitokondrier genom konfokal avbildning. De GSCs kan märkas med samma mitokondrier vitala färgämnet som MSC. Dessa celler kommer att användas som en positiv kontroll för FACS-analys. Alternativt kan GSCs märkas med en mitokondrier vitala färgämnet som skiljer sig från den hos MSCs, vilket möjliggör lokalisering av de överförda MSC mitokondrier i förhållande till de endogena GSC mitokondrier. Den djupröda mitokondrier vitala färgämnet är väl lämpad för FACS-analys, medan de gröna och röda mitochondria färgämnen är föredragna för konfokal avbildning. Av stor betydelse, bör MSC exponering för EDTA bör undvikas till varje steg i protokollet. Därför cell trypsinering rekommenderas med trypsin och ingen EDTA; den cocktail av proteasinhibitorer som används för mitokondrier preparatet bör, liksom, sakna EDTA. I närvaro av EDTA, var ett läckage av mitokondrierna vitala färgämnet från MSC mitokondrier observerats. Om mitokondrierna överfr för att GSCs skall analyseras genom mikroskopi, bör de mottagande glioblastomceller också märkas med en vitala färgämnet. De gröna och blå cell färgämnen (se Material och reagenser tabell) föredrogs eftersom de ger en mer homogen cellmärkning, vilket gör 3D-rekonstruktion från konfokala bilder.
När protokollet har godkänts av användaren med sina specifika celler, kommer mitokondrier märkning lämnas ut för funktionella studier, för att utesluta eventuella biologiska fördomar. Dos-responsanalyser över ett brett område av MSC mitokondrier koncentrationer, med seriespädningar av mitokondrierna preparatet, är att rekommendera. I själva verket borde det noteras att biologiska effekter för de överförda mitokondrierna kan uppnås vid låga mitokondrier koncentrationer i det lägre intervallet för detektering av FACS eller avbildning. Dessa funktionella studier, inklusive undersökningar av GSC metabolism, proliferation och terapisvaret, utförs dagen eftermitokondrier överföring.
Om MSC: er och GSCs är isolerade från olika givare (med olika mtDNA haplotyper), kan de överförda MSC mitokondrier övervakas genom mätning av koncentrationerna av MSC mtDNA i de riktade GSCs. Diskrimineringen mellan MSC och endogena GSC mtDNAs är baserad på närvaron av SNP, som är specifik för varje celltyp, i mtDNA hypervariabla D-loop region. Därför bland de olika tillämpningar av MitoCeption tekniken, möjligheten att överföra mitokondrier hyser mitokondrie-DNA med olika haplotyper kan inte bara upptäcka de överförda mitokondrier men ger också verktyg för att studera biologi mtDNA underhåll, inklusive analys av haplotyp utslagning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), som CJ och ML.V. är anslutna, har lämnat in en patentansökan på MitoCeption teknik (EP14306154.7).
Acknowledgments
Vi tackar Andrea Parmeggiani (L2C och DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) samt medlemmar av laboratoriet för bra diskussioner, Christophe Duperray för hjälp med FACS-analys, Montpellier RIO imaging anläggning (MRI) för att tillhandahålla lämplig miljö för FACS och konfokalmikroskopi. BNM stöddes av en examen stipendium från LABEX Numev (konvention ANR-10-LABX-20). AB stöddes av en grund stipendium från universitetet i Warszawa och Europeiska unionen (nr POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV är en personal forskare från National Center för vetenskaplig forskning (CNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
