Summary
Burada, bir protokol (MitoCeption) GSC metabolizması ve fonksiyonları üzerine biyolojik etkilerini inceleyerek amacı ile glioblastoma kök hücreler (GSC) için, insan mezenkimal kök hücrelerin (MSC) izole mitokondri, transfer sunulmaktadır. Benzer bir protokol için diğer hücre tipleri arasında mitokondri aktarmak için adapte edilebilir.
Abstract
Mitokondri hücre metabolizması, enerji üretimi ve apoptozis kontrolü için merkezi bir rol oynar. Yetersiz mitokondriyal fonksiyonu nörolojik patolojilerden kansere kadar çok çeşitli hastalıklardan sorumlu olduğu bulunmuştur. İlginç bir şekilde, mitokondri en son kapasitesini göstermek için gösterilmiştir, soz konusu ilgi artırılması, mitokondri alıcı hücrelerin metabolik ve işlevsel sonuçları ile Coculture koşullarında kanser hücrelerine insan mezenkimal kök hücreler (MSC) ile ilgili özellikle, hücre tipleri arasında aktarılacak bu organellerin biyolojik özellikleri.
hedef hücrelerde transfer MSC mitokondri etkilerinin değerlendirilmesi, hücre-hücre etkileşimleri biyolojik sonucu anlamak için temel önem taşır. Burada açıklanan MitoCeption protokolü MSC mitokondri kullanılarak hedef hücrelere donör hücrelerinden daha önce izole edilmiş mitokondri aktarılmasını sağlarbir model sistem olarak glioblastoma kök hücreleri (GSC). Bu protokol daha önce MDA-MB-231, kanser hücrelerini yapışık için, MSC ile ilgili mitokondri, izole aktarmak için kullanılmaktadır. Bu mitokondri aktarım protokolü in vitro neurospheres olarak büyüyen özel tikelliği sunmak GSC 'lerin burada uyarlanmıştır. İzole mitokondri transferi mitokondri vital boya kullanılarak floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) konfokal görüntüleme ile izlenebilir. tat haplotypes (SNP) ile mitokondri donör ve hedef hücrelerin kullanımı, aynı zamanda, hedef hücrelerde Dairesel mitokondriyal DNA (mtDNA) konsantrasyonuna göre transfer mitokondri saptanmasını sağlar. Protokol Bu kriterlerdeki doğrulandıktan sonra, transfer mitokondri barındıran hücreler, bundan başka, hücre metabolizması, plastisite, proliferasyon ve tedaviye yanıt olarak biyolojik özellikler üzerinde dışsal mitokondri etkilerini belirlemek için analiz edilebilir.
Introduction
Mitokondri da besin alımı hem de enerji ve metabolit üretimi önemli bir rol oynar ökariyotik hücrelerde bulunan organellerdir. Bu organellerin dairesel mitokondrial DNA elektron taşıma zinciri kompleksleri, tRNAs ve rRNA 1 proteinlerini kodlayan 16.6 kb uzunluğunda (mtDNA), içerirler. Bu organellerin işlevselliği hücre homeostazı ve çeşitli patolojiler mitokondri disfonksiyonu 1, 2, 3 ile ilişkilendirilmiştir için önemlidir. Mitokondri durum mesela Therapy 4, 5, 6, 7, metastaz ve direnç sonuçları, bu ikinci durumda, enflamasyon, enfeksiyon hastalıkları ve kanser ile bağlantılı olmuştur.
Mitokondri olağanüstü kapasitesi görüntüler "Donör" ve "hedef" hücreler arasında transfer alıyorum. Son zamanlarda, 15 farklı laboratuarlar 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ile gösterildiği gibi bu, örneğin doku onarımı ve kemoterapötik ajanlara karşı direnç gibi diğer işlevsel değişiklikler yanı sıra hedef hücrelerin enerji metabolizmasında değişikliklere yol açar 16. Insan mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) bu hücrelerin fonksiyonel özellikleri modifikasyonlara yol kardiyomiyositler, endotel hücreleri, pulmoner alveolar epitel hücreleri, renal tübüler hücreler ve kanser hücreleri dahil olmak üzere hedef hücrelerin bir çok çeşitli mitokondri transfer Bu yetiyi sergileyen 8> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitokondri değişimi artık farklı hücre tipleri bir dizi birbirleriyle iletişim ve biyolojik özelliklerini değiştirmek için izin veren bir yaygın olarak kullanılan bir mekanizma olarak görünür. Bu mitokondri değişimi 19 karmaşık konneksin 43 içeren gap junction 8 veya M-Sec / TNFaip2 ve exocyst içeren, tünel nanotüpler (TNT) oluşumu yoluyla oluşabilir. Seçenek olarak ise, mitokondri transferi de etki alanı içeren protein 1 dolayımlı microvesicles (ARMMs) 20 arrestin aracılık ettiği gösterilmiştir. İlginçtir ki, mitokondri transferi etkinliği Rho GTPaz 1 ifadesi oranı MIRO1 21, iPSC- arasında mitokondri transferi etkinliklerinin farklılıkları açıklamak için bir anahtar faktör bağlantılı olduğunuMKH ve yetişkin BM-MKH 22.
Hücre-hücre mitokondri alışverişine ilişkin verilerin bu zenginliği rağmen, nispeten daha az bu mitokondri transferi metabolik ve biyolojik sonuçları hakkında bilinmektedir. Bu nedenle, tam tam bu transferin biyolojik etkilerini değerlendirmek için uygun araçlar kurma garanti. Yıllar boyunca, çeşitli teknik yaklaşımları alıcı hücrelere donörden mitokondri aktarmak için önerilmiştir. Bu 27 transmitochondrial sibrid 26 oluşturmak için oosit 23, 24, 25, hücre füzyonunun olarak mitokondri doğrudan enjeksiyon içerir ve daha yakın zamanda, fototermal kullanarak izole mitokondri transferi 28 nanoblades.
Biz ve diğerleri, daha önce izole edilmiş mitochond kapasitesini göstermiştirin vitro ve in vivo olarak görüldüğü gibi, RIA, canlı hücreler tarafından edilmesi Mekanizmalarla 29, 30, 31, 32, makropinositoz içerdiği öne. Biz daha nicel olarak (yapışık) ile örneklendiği gibi, hedef hücrelere, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücre çizgisi 31 (MSC ile ilgili) izole mitokondri aktarmak için, MitoCeption adlı bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokol glioblastoma kök hücreleri izole insan MSC mitokondri transferi (GSC 'lerin) burada uyarlanmıştır.
Glioblastoma hızla ağırlıklı olarak tümör 33 içinde mevcut glioblastoma kök hücrelerinin (GSC) için, tedaviye dirençli hale beynin agresif kötü huylu tümörlerdir. Bu GSC 'lerin in vitro neurospheres olarak büyümeye ve ksenogreft modellerinde tümörleri oluşturur. glioblastoma içinde Kanser hücreleri varRadyoterapi dayanıklı astrositoma ağları 34 ortaya çıkartılmıştır mikrotüplerde aracılığıyla birbirine olan mitokondri (aynı zamanda kalsiyum ve hücre çekirdekleri) üzerinden geçiş için astrositik beyin tümörü hücreleri için, son olarak kapasite, hücreden hücreye bağlantı yapmak için. Glioblastoma MKH 35, 36 de dahil olmak üzere, tümör mikro içinde birçok farklı hücre işe. Biz MKH kokültürü GSC 'lerin hücre-hücre bağlantıları yapmak ve GSC fonksiyonel özelliklerini değiştirmek için beklenen onların mitokondri (veriler gösterilmemiştir), aktarabilirsiniz gösterdi. Mevcut protokol MitoCeption tekniği işlevsel biyolojik sonuçlarını belirlemek amacıyla insan GSC 'lerin için, insan MSC gelen mitokondri, izole önceden aktarmak için nasıl kullanılabileceği anlatılmaktadır. Multipotent ve son derece tümörijenik GB4 GSC hattı 37 bu çalışmada kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.gün
Mezenkimal kök hücre 1. Etiketleme (MSC) Mitokondri (İsteğe bağlı)
- Gün 1 kültür 4 x 10 5 mezenkimal sahip olacak şekilde iki gün mitokondri hazırlanmasından önce, 10 mi αMEM / FBS% 10, 100 mm kültür çanağı insan mezenkimal tohum.
- PBS (4 mi) ile MKH'lerin durulayın ve 4 ml αMEM / FBS,% 1 ilave (37 ° C'ye kadar önceden ısıtılmış).
- 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca hücreler mitokondri vital boyanın gerekli miktarda ilave edin ve inkübe edilir.
- , Mitokondri boya çözüm kaldırmak prewarmed 4 ml (37 ° C) αMEM / FBS% 1 ile hücreler iki kez yıkayın ve geri 4 ml αMEM / FBS% 10 ekleyin. 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- 2 saat sonra, başka bir zaman 30 dakika sonra kültür ortamı (10 ml αMEM / FBS% 10) olarak değiştirin ve.
1.gün
Glioblastoma Kök Hücre (GSC) 2. Etiketleme (İsteğe bağlı, Tartışma Bölüm bakınız)
| Hücre kültür ortamı, | kompozisyon |
| GSC bazal ortam | DMEM / F-12 ile takviye |
| İnsülin, 20 mg / ml | |
| N2 ek 1x | |
| Glukoz, 3 g / L | |
| L-glutamin, 2 mM | |
| GSC çoğalması ortamı | bazal ortama ekleyin: |
| B27 takviyesi 1x | |
| EGF 10 ng / ml | |
| bFGF 10 ng / ml | |
| Fungine 10 mg / ml | |
| Fungizone 0.25 mg / ml | |
| Heparin 2 mg / ml | |
| Siprofloksasin 2 ug / ml | |
| Gentamisin 2 ug / ml | |
| MSC çoğalması ortamı | & #945; ile takviye edilmiş MEM |
| L-glutamin, 2 mM | |
| % 10 FBS | |
| bFGF 2 ng / ml |
Tablo 1: Kültür Medya.
- Poli-HEMA kaplı hücre kültürü şişeleri üzerinde neurospheres olarak yetiştirilen GSC 'lerin (GB4 hücre hattı 32 (10 x 10 6 hücre) (adımlarını 3.12 ile 3.1) ayırmak.
- 10 5 hücre 48 oyuklu bir plaka içerisinde tohum GSC'lerin / oyuk GSC proliferasyon ortamı (500 ul) (Tablo 1 e bakınız).
- 20 ° C'de 5 dakika boyunca 270 x g'de plaka santrifüjleyin.
- Hücre vital boyanın gerekli miktarda ilave edin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- 48 çukurlu levha başına GSC bazal ortamı 500 ul (Tablo 1) ekleyin.
- 5 dakika boyunca 20 ° C'de 270 x g'de plaka santrifüjleyin. süpernatant aspire.
- Tekrarlayın 2.6 2.5 adımları tekrarlayın.
- GSC bazal ortamı 500 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 5 dakika boyunca 20 ° C'de 270 x g'de plaka santrifüjleyin. süpernatant aspire.
- 48 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu GSC proliferasyon ortamında 500 ul ilave edin ve 37 ° C inkübatör.
Not: GSC 'lerin miktarı belirtilen (10 x 10 6 hücre) farklı doz-yanıt deneyleri ve FACS kontrollerini gerçekleştiren sağlar. deneysel koşullar daha kesin tanımlandıktan sonra bu miktar küçültülmüş olabilir.
2. gün
Glioblastoma Kök Hücre 3. Tohum
- 50 ml'lik bir tüp içinde 20 ° C 'de, 5 dakika boyunca 270 x g'de santrifüj ile GSC Neurospheres (10 x 10 6 hücre) toplayın.
- 20 ° C'de 5 dakika boyunca 270 x g'de 5 HBSS ml santrifüj ile hücreler yıkanır.
- süpernatant aspire.
- Yavaşça 100 ul tripsin-EDTA (% 0.25) (GSC pelletini, 10 x 10 başı
- 3 dakika için 37 ° C'de inkübe edilir.
- 10 ul CaCl2 (20 mM) ve 2 ul DNase I (10 mg / ml) eklenir.
- nazikçe P200 pipet ile aşağı yukarı pipetleme (30-50x) tarafından neurospheres ayırmak. kabarcıkları kaçının. Tüm GSC 'lerin ayrışmış olan mikroskop altında kontrol edin.
- 10 ul tripsin inhibitörü (% 5) ve 10 mi HBSS ekleyin.
- 20 ° C 'de, 7 dakika boyunca 270 x g'de santrifüjleyin GSC'lerin.
- Süpernatant atılır ve 10 mi GSC bazal ortamı (Tablo 1) ekleyin.
- Bir Thoma sayım odası ile GSC'lerin sayın ve daha sonra 20 ° C'de 7 dakika boyunca 270 xg'de hücreleri santrifüj.
- 10 6 GSC'lerin / ml hücre konsantrasyonuna ulaşmak için GSC proliferasyon ortamında (Tablo 1), uygun hacim.
- Tohum 10 5 GSC'lerin 96 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğu (hücre süspansiyonu 100 ul).
- bot de GSC'lerin almak için 20 ° C'de 7 dakika boyunca 270 x g'de santrifüj plakalarıKuyuların tom.
- Bölüm 5 olana kadar 37 ° C'de 96 oyuklu plaka inkübe edin.
2. gün
4. MSC Mitokondri İzolasyon
- 4 ° C'ye mikrotüp santrifüj sıcaklığını ayarlamak.
- İki 1.5 ml tüpler "A" ve (her ikisi de EDTA'sız proteaz önleyicileri ihtiva eden 200 ul reaktif A ve 400 ul reaktif C) mitokondrilerin çıkarılması için reaktifler içeren "C" hazırlayın. 2 diğer tüpler, "MSC" ve "Mito" etiketli hazırlayın. buz üzerinde tüm tüpleri tutun. Ayrıca mitokondri seri seyreltme için tüpler hazırlamak.
- önceden ısıtılmış 10 ml (37 ° C), PBS ile yıkayın MSC'ler.
- 2 ml 10 saniye tripsin (hayır EDTA) ve 1 ml tripsin (hayır EDTA) ekleyin ile yıkayın MKH. 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle inkübe hücreleri.
- 10 mi αMEM / FBS% 10, 50 ml'lik bir tüp transfer ekleyerek MKH'lerin kurtarmak.
- 20 ° C'de 5 dakika boyunca 270 x g'de santrifüje hücreleri.
- Süpernatantı atın ve eklemekHücre topağı 10 ml αMEM / FBS,% 10.
- Bir Malassez sayım odası ile MKH'lerin sayın.
- Santrifüj MSC'ler (4-5 x 10 5), 20 ° C'de 5 dakika boyunca 270 x g'de.
- Süpernatantı atın hücre pelet 1 m buz gibi soğuk αMEM / FBS% 10 eklemek ve "MSC" -etiketli tüp (adım 4.2 hazırlanan) hücreleri aktarmak. buz üzerinde tüp tutun.
- Santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 900 x g'de MKH'lerin içeren tüp.
- tüp kalan tüm orta çıkarın.
- Mitokondri İzolasyon Reaktif A (EDTA'sız proteaz inhibitörleri ihtiva eden) 200 ul ekle. 5 saniye boyunca orta hızda karıştırın ve tam olarak 2 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın.
- 10 saniye boyunca maksimum hızda Mitokondri İzolasyon Reaktif B. Vortex 2.5 ul ekleyin ve sonra buz üzerinde tüpler bırakın. 5 dakika boyunca her 30 saniyede tekrarlayın.
- Mitokondri İzolasyon Reaktif C (EDTA'sız proteaz inhibitörleri ihtiva eden) 200 ul ekle. ro (tüp eğerek karıştırınughly 30 kez) değil girdap yapmak. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 700 x g'de tüp santrifüjleyin.
- "Mito" tüp (adım 4.2 hazırlanan) supernatant (MSC mitokondri içeren) aktarın.
- 3.000 x g'de, 4 ° C'de 15 dakika, santrifüjleyin mitokondri pelet alır. süpernatant atın. Pelet izole mitokondri içerir.
- mitokondri pelet elde etmek için, 12,000 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika ile ayıraçların C'de 200 ul, santrifüj ile mitokondri pelet durulayın.
GSC 'lerin için İzole MSC Mitokondri 5. Transferi (MitoCeption)
- MSC (4 x 10 5) izole mitokondri pelet önceden soğutulmuş (0 ° C) GSC proliferasyon ortamında 200 ul ekle.
- sürekli GSC 'lerin mitokondriyal süspansiyon 20 ul eklemek için (GSC çoğalması ortamında) mitokondri hazırlık sulandırmak.
- 96-w kuyulara izole mitokondri hacmi ekleistenen konsantrasyona (0,1-10 ug) (aşama 3.15) GSC'lerin içeren ell plaka. en az bir kez tüm yüzeyini kaplayan, yakın kuyunun dibine, yavaş yavaş mitokondri ekleyin.
- MSC mitokondri vital boya sızmasını kontrol etmek için, GSC proliferasyon ortam yalnızca (GSC'lerin) (vital boya sızdırma saptama için bölümü 6.2) ihtiva eden 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına mitokondri hazırlanması (0.1 ug ila 10), aynı şekilde artırmıştır.
- Santrifüj 4 ° C'de 15 dakika boyunca 1500 x g'de MSC mitokondri (aşama 5.3) ve kontrol plakası (aşama 5.4) ile mitokondri alıcı GSC'lerin ihtiva eden 96 oyuklu plaka.
- Hemen Santrifüj işleminden sonra, 37 ° C hücre kuluçka makinesi içinde kültür plakaları yerleştirin.
Not: mitokondri aktarım protokolü Sist bağlı olarak ayarlanabilir santrifüj bir dizi ile yeterli santrifüj kuvvetinde kültürlenmiş hücrelerde mitokondri süspansiyonu santrifüj dayanırmitokondri donör / alıcı hücrelerin em.
gün 3
FACS ve Konfokal Görüntüleme tarafından Mitokondri Transferinin 6. Analizi
- FACS analizi için GSC örneklerinin hazırlanması
Not: MSC mitokondri önce önemli bir boya (Kısım 1) ile işaretlendi ise, etkinlik 24 saat mitokondri transferinden sonra, FACS ile izlenebilir.- Santrifüj 20 ° C'de 5 dakika boyunca 270 xg'de MitoCepted GSC 'lerin 96 oyuklu plaka.
- süpernatant atın.
- Her oyuktaki 100 ul tripsin (Resim EDTA) ekleyin. 3 dakika için 37 ° C'de inkübe edilir. Pipet yukarı ve aşağı 24 saat süre içinde oluşan neurospheres ayırmak.
- GSC bazal ortamın 100 ul ekle.
- 20 ° C'de 5 dakika boyunca 270 x g'de santrifüj plaka ve supernatant atın.
- Süspanse GSC 'lerin 300 ul GSC FACS bazal orta ve transfer tüpleri uyarlanmış.
- FACS yükseltme gerçekleştirmealysis.
- İzole mitokondri gelen mitokondri hayati boya sızıntı kontrolü (FACS)
Not: Bu adımın amacı yerine, gerçek bir MSC mitokondri transferi yansıtacak ama olmaz arka plan FACS sinyali, MitoCeption (adım 5.3) için kullanılan etiketli MSC mitokondri hayati boya sadece sızıntısını tespit etmektir.- 3,15 adımlar 3.1 açıklandığı gibi GSC hücreleri Tohum.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe hücreleri.
- Santrifüj 20 ° C'de 5 dakika boyunca 1500 x g'de (adım 5.4 5.6) Sadece mitokondri ihtiva eden 96 oyuklu plaka.
- GSC 96 oyuklu plaka (aşama 6.2.2) kültür ortamının aspire ve mitokondri, sadece (adım 6.2.3 süpernatant) ile inkübe ortam ile değiştirin.
- 2 saat boyunca 37 ° C'de GSC'lerin ihtiva eden 96 oyuklu plaka inkübe edin.
- FACS analizi için 6.1.7 adımlar 6.1.1 gibi devam edin.
- GSC samp hazırlanmasıKonfokal görüntüleme için les
Not: GSC 'lerin MSC mitokondri transferi floresan görüntüleme ile analiz edilecek olursa, MKH ve GSC' lerin hem mitokondri (adım 1) ve hücrenin (adım 2) hayati boyalarla sırasıyla, önceden etiketlenmiş olması gerekir.- adımlara 6.1.5 için 6.1.1 gibi GSC'lerin hazırlayın.
- Süspanse GSC'lerin 35 mm kültür çanakları (cam alt) içinde% 2 FBS ve tohum ihtiva eden 2 mi GSC proliferasyon ortamında.
- 24 saat sonra transfer floresan MSC mitokondri ile GSC 'lerin üzerinde konfokal görüntüleme gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mezenkimal kök hücreler (MSC) ve MitoCeption hedeflediği glioblastoma kök hücreler (GSC) kendi transfer mitokondri izole özetleyen prosedür adım, Şekil 1 'de gösterilmiştir. GSC 'lerin kendi kök hücre özelliklerini korumak için neurospheres olarak yetiştirilen kanser kök hücrelerdir. Protokolü için, GSC 'lerin daha yüksek mitokondri transfer verimliliği sağlamak için mitokondri (adım 3) transferi öncesinde tek hücre olarak birkaç saat ekilir (FACS veri Şekil 3B). Bölüm 5 (3 gün) sonra, bu hücreler, Neurospheres (Şekil 1) oluşturan tekrar görülmektedir.
GB4 GSC 'lerin Imaging, floresan etiketli MSC mitokondri ile MitoCeption sonra 72 saat, konfokal görüntülerden elde edilen ortogonal açıdan gösterildiği gibi MSC mitokondri, GB4 GSC' lerin içinde lokalize olduğunu gösterir (Şekil 2B). Bu da endojen GSC mitokondri (Şekil 2A) olduğu gibi aktarılan MSC mitokondri, GSC 'lerin boyunca lokalize görünür. MitoCepted GSC 'lerin Konfokal görüntüleme de MSC, aynı GSC Numuneler, FACS ile analiz edildi, her iki şekilde koyu kırmızı bir vital boya ile etiketlenir mitokondri (Şekil 3A) ve görüntüleme (Şekil 2C) ile gerçekleştirildi. MSC mitokondri devri, en GSC 'lerin için gözlenebilir (Panel A) ve GSC konfokal görüntüleri 3D rekonstrüksiyonu transfer MSC mitokondri hücre içi yerini teyit etti (panel B, C). Transfer MSC mitokondri lokalizasyonu görselleştirmek izin mavi hücresel ve kırmızı mitokondriyal hayati boyalar hem (1 gün) GSC'lerin Prelabeling MSC mitokondri devri sonrasında, (kırmızı) endojen GSC mitokondri akrabası (yeşil renkli) (Şekil 2B) .
confo daCAL görüntüleme mitokondri transferi ölçmek için tercih edilen bir araçtır MitoCeption, floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS), aşağıdaki transfer MSC mitokondri hücre içi lokalizasyonu olan kontrol sağlar MSC mitokondri önemli bir boya ile etiketlenir edildi sağladı. Artan FACS sinyallerine neden flüoresan MSC mitokondri artan miktarları ile Şekil 3A, MitoCeption gösterildiği gibi. Dikkate değer, bu sinyal (kırmızı) (mavi, adım 6.2), kontrol şartlarında elde edilen sinyalin daha yüksek birkaç kat oldu. FACS sinyali GSC 'lerin içinde transfer MSC mitokondri temsilcisi ve etiketli MSC mitokondri floresan hayati boya sızıntısı değil, sadece sonucu olduğunu, bu daha da sağlanan kanıtlar. Tek hücre GSC 'lerin gerçekleştirilir Burada sunulan mitokondri aktarım protokolü, doza bağlı bir yanıt (Şekil 3B) göstermiştir. MSC mitokondri transferi verimliliği de neur üzerinde değerlendirilmiştirospheres. Bu, aynı zamanda GSC 'lerin MSC mitokondri transferine yol olmasına rağmen bir temsili (Şekil 3B)' de gösterildiği gibi, transfer etkinliği düşüktür.
MSC mitokondri ve GSC 'lerin içinde kendi bakımı transfer GSC' lerin MSC mitokondriyal DNA (mtDNA) miktarının takip edilebilir. Bu MSC'ler ve GSC'lerin tat haplotip, farklı vericilerden elde gerektirir. Şekil 3C mtDNA tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) ile iki donör D-döngü içinde bulunan dizileri 3 'ucu pozisyonunda belirtilen gösterir. özellikle konumunda ya donör 1 veya donör 2, ek mutasyon tanıtıldı PCR primerlerinin 3 'ucuna, N-2 göreli mtDNA amplifiye etmek için PCR primerleri dizayn için. verici 1 mtDNA primerler kümesi ile amplifiye edilebilir: 5'-TAACAGTACATAGCACATACAA-3 've 5'-GAGGATGGTGGTCAAGGGA-3' (genel s, primer 38) equencing ise primer grubu: 5'-TTAACTCCACCATTAGCACC-3 '(genel sıralama 38 ila primer) ve-AGTATTTATGGTACCGTCCG-3 5' 'verici 2 mtDNA amplifiye etmek için kullanılmıştır.
Şekil 1: MitoCeption tarafından GSC 'lerin izole MSC mitokondri transferi için iş akışı. GSC 'lerin ve sonraki GSC analizler MSC mitokondri MitoCeption için 7 adım gösterilmiştir. Adım numaraları protokolü bölümünde olduğu gibi belirtilir. MSC ve GSC markalama gerçekleştirilmezse, fonksiyonel analiz için olduğu gibi, adım 1 ve 2 ihmal edilebilir ve protokol günde 2 takip edilebilir. Faz kontrastlı görüntüler mitokondri transferi (3 gün) sonra MSC mitokondri transferi (2 gün) ve 24 saat hazır tek hücreli kültür olarak neurospheres olarak GB4 GSC'lerin (gün 1) temsil eder. Ölçek çubuğu =100 um. 4. Adımda, MSC izolasyon önce MitoTracker Kırmızı CMXRos ile etiketlenir izole MSC mitokondri, temsili fotomikrografıdır. Ölçek çubuğu = 5 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: MitoCeption tarafından GB4 GSC 'lerin transfer edildikten sonra GB4 endojen mitokondrinin Görüntüleme ve MSC Mitokondri. (A, B, C) GB4 GSC'lerin yeşil vital boya ile etiketlenmiştir. (B, C, D) GB4 GSC'lerin (10 5 GSC 'lerin için) 2.5 ug MSC mitokondri hazırlanması MitoCepted edildi. (A) GSC'lerin MitoTracker Kırmızı CMXRos ile etiketlenmiş ve (/ EGF / bFGF O W GSC proliferasyon ortamında) 48 saat süre ile kültüre edildi.(B) GSC konfokal bölümü ve ortogonal açıdan, MitoTracker Kırmızı CMXRos etiketli MSC mitokondri ile MitoCeption sonra 72 saat (kültür ortamı: GSC proliferasyon ortamında / FBS,% 2). (C, D) MSC'ler GSC 'lerin MSC mitokondri aktarılmadan önce koyu kırmızı bir mitokondri vital boya (FACS analizi ile aynı koşullar) ile etiketlenir edildi. MSC mitokondri Aktarma işleminden sonra, GSC'lerin FBS% 10 ihtiva eden GSC proliferasyon ortamında ekilmiştir. (C) Isosurface görünümleri (b, c) konfokal resimlerden bir GSC 3D rekonstrüksiyon xy düzlemi bölümünde (c) (MitoCeption sonra 48 saat) ile birlikte. (D) GB4 GSC 'lerin mavi hücre hayati boya ve hayati boya derin bir kırmızı mitokondri hayati boya ile etiketlenir MSC mitokondri aktarılmadan önce (yeşil görüntülü) kırmızı mitokondri ile işaretlendi. xz (b) ve xy (c) Isosurface görünümleri konfokal görüntüleri (72 saat MSC mitokondri transferinden sonra) bir GSC 3 boyutlu rekonstrüksiyon düzlem bölümleri. Tüm hücreler Bere cam alt kültür yemekleri ekildi ve görüntüleri canlı hücreler alınmıştır. Görüntü Cı panel hariç Ölçek çubukları = 5 um, (a) burada Ölçek çubuğu = 10 um. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: GSC 'lerin MSC mitokondriyal DNA mitokondri floresans ile aktive edilen hücre tarafından transferi sıralama (FACS) ve tespit (mtDNA) miktarının belirlenmesi. (A, B) GSC'lerin koyu kırmızı bir mitokondri vital boya ile etiketlenir ve FACS ile analiz MSC mitokondri ile MitoCepted edildi. (A), Örnek FACS sonuçlar MitoCepted GSC 'lerin elde (üstten alta doğru, kırmızı: 1.2, 2.5, 5, 0.6, 10 ug MSC mitokondri preparasyonu (10 5 GSC' lerin için)). mavi, EAC içinH paneli MitoCeption (adım 5.4) için kullanıldığı gibi GSC 'lerin FACS profil MSC mitokondri aynı miktarda kıvamlandırılmış kültür ortamı ile kuluçkalanmıştır kontrol eder. siyah (üstte) de etiketsiz GSC 'lerin Kontrol koşulları. (- O) bir günlük GSC neurospheres üzerinde (SEM 3 deneyin ortalamasıdır) ve GSC kontrol mitokondri süpernatanları ile - (•) (B) 'nin ortalama florasan yoğunluğu (MFI), tek bir hücre GSC' lerin ilgili mitokondri transferinden sonra elde edilen tek hücreler (-). MtDNA D-döngü içinde (C), DNA dizileri ve donör 1 ve 2 SNP arasındaki SNP farklar dizilerin 3 'ucunda mavi gösterilir. verici birinden mtDNA spesifik PCR amplifikasyonu için primerlerin (primerler 1 SPE ve 2). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
çalışmaların sayısı giderek artıyor hücreleri mitokondri alışverişi olduğunu ve bu mitokondri hedef hücre metabolizması ve fonksiyonları üzerinde derin etkilere sahip olduğunu göstermektedir. Nedenle, miktar olarak biyolojik etkilerini doğru bir çalışma sağlamak için, bu hedef hücreler verici hücrelerinden mitokondri aktarmak için araçları ana esastır.
Burada açıklanan protokol başlangıçta yapışık kanser hücre hattı MDA-MB-231 33 insan mezenkimal kök hücrelerin izole mitokondri aktarmak için çalıştı oldu. Burada gösterildiği gibi, in vitro olarak neurospheres olarak büyümeye kanser kök hücreleri için uyarlanabilir. mitokondri transferi MSC mitokondri GSC neurospheres eklenir ortaya rağmen, bu protokolde tarif edildiği gibi, bu, tek bir hücre GSC 'lerin daha fazla etkili olduğu bulunmuştur. Bu protokol, aynı zamanda, bir ihtiyacı ile, T hücreleri gibi diğer yapışmayan hücreler ekstrapole edilebilirMitoCeption adımı için aşılanmış hücre konsantrasyonunu DAPT.
mitokondri Terkip, bütünlüğünü korumak için buz üzerinde yapılmalıdır. Diğer Sitosol bileşiklerden daha az kirlenme mitokondri preparatlar elde edilmesi için, mitokondri geri kazanımı için santrifüjleme, 15 dakika boyunca 3000 x g'de gerçekleştirilir. GSC 'lerin transfer için kullanılan MSC mitokondri miktarını izlemek için, mitokondri protein içeriği belirlenir. Bu amaçla, mitokondri protein özleri proteaz inhibitörleri ile takviye edilmiş RIPA tamponu kullanılarak hazırlanır. Protein konsantrasyonu, üretici firmanın talimatlarına uygun olarak, bisinkoninik asit deneyi kullanılarak belirlendi. Sığır serum albümini standart olarak kullanılmıştır. Ortalama protein 10 ug 100,000 MSC elde edilmiştir.
önemli bir boya ile etiketleme MSC mitokondri floresans ile aktive edilmiş hücre tarafından, mitokondri transferi verimini miktarının sağlar(FACS) sıralama ve konfokal görüntüleme ile aktarılan mitokondri lokalizasyonu belirlenmesi. GSC'lerin MSC aynı mitokondri vital boya ile etiketlenebilir. Bu hücreler, FACS analizi için bir pozitif kontrol olarak kullanılır. Alternatif olarak, GSC 'lerin endojen GSC mitokondri göre transfer MSC mitokondri lokalizasyonu sağlayan MKH farklı bir mitokondri hayati boya ile etiketli olabilir. yeşil ve kırmızı mitokondri boyalar konfokal görüntüleme için tercih edilen ise koyu kırmızı mitokondri vital boya FACS analizi için de uygundur. büyük önem, EDTA MSC maruz protokolünün tüm adımları kaçınılmalıdır. Bu nedenle, hücre trypsinization tripsin ve hiçbir EDTA ile tavsiye edilir; mitokondri hazırlanmasında kullanılan proteaz önleyicileri kokteyli yanı sıra, EDTA içermeyen olmalıdır. EDTA varlığında MSC mitokondri, mitokondri vital boya bir sızıntı gözlenmiştir. mitokondri transfe EğerGSC 'lerin R mikroskobu ile analiz edilecek olan, bir alıcı, glioblastoma hücreleri aynı zamanda önemli bir boya ile işaretlenmiş olmalıdır. Onlar daha homojen bir hücre etiketleme vermek gibi yeşil ve mavi hücre boyaları (Materyaller ve Reaktifler Tablo bakınız) konfokal görüntülerden 3 boyutlu rekonstrüksiyon sağlayan tercih edilmiştir.
protokol yaptığı özel hücrelerle kullanıcı tarafından doğrulandıktan sonra, mitokondri etiketleme olası biyolojik önyargıları önlemek için, fonksiyonel çalışmalar için dışarı bırakılacaktır. Doz-yanıt mitokondri hazırlama seri seyreltileri ile, tavsiye edilir MSC mitokondri konsantrasyonları geniş bir aralık üzerinde analiz eder. Aslında, transfer mitokondri için biyolojik etkileri, FACS ya da görüntüleme tespiti için en düşük aralıkta düşük mitokondri konsantrasyonları için elde edilebilir olduğu not edilmelidir. GSC metabolizması, çoğalması ve tedaviye yanıtta soruşturma da dahil olmak üzere, bu fonksiyonel çalışmalar, ertesi gün yapılırmitokondri transferi.
MSC'ler ve GSC'lerin (çeşitli mtDNA haplotiplerin) ile, farklı vericilerden izole edilir ise, transfer MSC mitokondri hedef GSC 'lerin MSC mtDNA konsantrasyonlarının ölçülmesi ile izlenebilir. MSC ve endojen GSC mtDNAs arasındaki ayrım mtDNA hiperdeğişken D-halka bölgesindeki her hücre türü için belirli SNP varlığında dayanmaktadır. Bu nedenle, MitoCeption tekniğinin çeşitli uygulamalar arasında, farklı haplotipleri ile mitokondriyal DNA barındıran mitokondri aktarılması olasılığı sadece transfer mitokondri algılanmasını sağlar, aynı zamanda haplotip dışlama analizi de dahil olmak üzere, mtDNA bakım biyolojisi okumak için araçlar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
İNSERM (Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale), hangi ile CJ ve ML.V. bağlı bulundukları, MitoCeption tekniği (EP14306154.7) bir patent başvurusunda bulunmuştur.
Acknowledgments
Biz yararlı tartışmalar için laboratuvar üyeleri yanı sıra Andrea Parmeggiani (L2C ve DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) teşekkür ederim, Christophe Duperray sağlamak için FACS analizi, Montpellier RIO görüntüleme tesisi (MRG) ile yardım için FACS ve konfokal mikroskopi için yeterli ortam. BNM LABEX Numev (kongre ANR-10-LabX-20) mezunu burs ile desteklenmiştir. AB Varşova ve Avrupa Birliği Üniversitesi'nden lisans bursu tarafından desteklenmiştir (n POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV bilimsel araştırmalar için Ulusal Merkezi (CNRS) bir personel bilim adamıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 | |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 11520536 | |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50x) | Fisher Scientific | 11500446 | |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 | |
| poly Heme | Sigma | P3932 | |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F | |
| DMEM/F-12 without glutamine | Fisher Scientific | 11540566 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Insuline | Sigma | I 1882 | |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| CaCl2 | MERCK | 2382 | |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 | |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 | |
| Trypsine 0.25% / EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 | |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F | |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 | |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 | |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 | |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 | |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 | |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 | |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 | |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 | |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C | |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
