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Biology

고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리

doi: 10.3791/55251 Published: March 8, 2017

Introduction

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미토콘드리아 생물 에너지 학 및 호흡기 용량은 투과성이 세포 또는 섬유에서뿐만 아니라 고립 된 미토콘드리아에뿐만 아니라 공부하실 수 있습니다. 본 연구에서는 고해상도 호흡율 측정을위한 차등 원심 분리를 이용하여 그대로 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

호흡율 위해 미토콘드리아 손상을 분리하기 위해, 조직을 균일화하고 미토콘드리아는 종래의 차등 원심 분리 방법에 의해 분리된다. 차동 원심 분리 방법은 순차적 회 원심에 처음 Pallade에 의해 도입 된 조직 균질 및 동료 거의 70 년 전 1의 (증가 속도의 직렬)을 기반으로합니다. 조직은 처음 가위를 사용하여 다진과 헐렁한 유봉과 유리 균질에서 기계적으로 균질화한다. 그 후 균질 저속 깨지지 조직을 포함하는 생성 된 펠릿 세포 원심 분리파편과 핵은 폐기된다. 그 후, 상등액을 고속으로 여러 번 원심 분리하여 농축 된 미토콘드리아 분획을 수집한다. 차등 원심 분리 방법의 장점은 미토콘드리아가있는 분리하기 : ⅰ) 상기 방법은 빠르며 미토콘드리아 (호흡 실험 최대한 빠른 같이 수행되어야한다) 1-1.5 시간 내에 분리 할 수있다; ⅱ)이 저렴하다; 및 ⅲ) 그것은 매우 효율적입니다 및 차등 원심 분리하여 얻은 미토콘드리아는 호흡율 분석을위한 충분한 순수하다. 차동 원심 분리 방법의 단점은 미토콘드리아는 분리하기가 ⅰ) 미토콘드리아가 손상 및 균질화 동안 비 결합 얻을 수 있습니다; ⅱ) 다른 세포 구성 요소와 미토콘드리아 (의 오염은 더 세정 추가 원심 분리 단계와 미토콘드리아 펠렛)에 의해 해결 될 수있다; ⅲ) 차동 회 원심 단계 동안 예를 들어, 다른 개체군 미토콘드리아를, 선택의 가능성, MIT낮은 밀도와 ochondria 7을 제외 할 수 있습니다; 및 ⅳ) 미토콘드리아 세포 주변 누락 단지 이론적 최대 호흡을 측정 할 수있다. 호흡율 분석법 미토콘드리아를 분리하는 또 다른 방법은 밀도 구배 원심이있다. 에 따라 다른 세포 성분으로부터 분리 될 미토콘드리아 원인이 기술에서, 조직 추출물 자당 또는 (원심 분리 튜브의 하단보다 높은 밀도)를 퍼콜 구배 용액 위에 적층되고, 소정의 속도로 원심 분리하여 그 밀도. 이 방법은 종종 시냅 토좀 (synaptosome)에서 매우 낮은 오염 미토콘드리아 뇌를 분리하기 위해 사용된다. 그러나, 밀도 구배 원심 분리에 의해 단리 래트의 간 미토콘드리아는 매우 다른 세포 소기관 (3)로 오염된다. 이러한 방법의 한계 중 하나는 원심 분리 튜브 내의 수크로오스 구배 본 너무 파열 수도 있다는나 미토콘드리아 (삼투압 충격).

조직의 유형에 따라, 차동 원심 분리하여 손상 미토콘드리아의 분리를 위해 고려해야 할 몇 가지 중요한 요소가있다. 첫 번째 필요성은 부드러운 방식으로 조직을 균질화하는 것입니다. 이러한 신장, 뇌, 간 등의 부드러운 조직을 균질화 동안 적용 부드러운 기계적 힘을 필요로한다. 이것은 훨씬 더 강한 기계적인 힘을 필요로 심장과 골격 근육 열심히 조직과 대조. 다진 조직은 일반적으로 이전에 조직을 부드럽게 균질화에 단백질 분해 효소로 처리됩니다. 균질화 및 원심 분리 동안 사용 된 모든 버퍼는 차가운 얼음하고 세포질 4, 5와 호환 이온과 삼투 강도 생리 관련 pH가 있어야합니다.

절연 미토콘드리아 생체 에너지 연구의 장점 중 하나는 세포 원형질막 permeabi가있을 필요가 없다는 것이다미토콘드리아 외막 무결성을 손상 수있는 등 디기 토닌 또는 사포닌 4, 6 등의 세제와 함께하게 안정적. 단리 된 미토콘드리아의 또 다른 장점은 산소 소비 미토콘드리아 기능의 분석을 방해 할 수있는 다른 세포 내 인자의 부재이다. 단리 된 미토콘드리아를 사용하는 단점은 원심 분리 단계 동안 특정 미토콘드리아 인구의 가능한 선택 균질화시 미토콘드리아 손상 고립 미토콘드리아 7, 8의 양호한 수율을 얻기 위해서 생물학적 시료의 높은 양에 대한 요구이다.

분리 과정을 거친 후, 미토콘드리아 복합체의 호흡 속도 I-, 및 IV II- 의존성 (주 2, 3, 4)는 고해상도 호흡율을 사용하여 결정된다. 복잡한 I-구동 호흡, 글루타메이트에 대한및 말산은 아데노신이 인산염 (ADP) 다음에 추가됩니다. 복잡한 II 중심의 호흡을 위해, 숙시 네이트는 ADP 다음에 추가됩니다. 복잡한 IV 구동 호흡, 아스 코르 베이트 및 tetramethylphenylendiamine (TMPD) 미국 ADP 9, 10, 11, 12을 첨가한다. 상태 2 형 기질의 존재 하에서 산소 소비를 지칭한다. 상태 3은 기판 및 ADP의 존재하에 산소 소비를 지칭한다. 주 4 ADP 고갈 후 산소 소비를 의미한다. 호흡 조절 비율 (RCR)은 산소 소모 ATP 생산의 결합의 지표이고, 상태 3, 상태 4 (13), (15) 사이의 비율로서 계산된다.

요약하면, 우리는 차동 원심 분리에 의해 기능적 손상 골격근 미토콘드리아를 분리하고 이러한 고립 mitochon를 사용하는 프로토콜을 기술높은 해상도 호흡율과 같은 기능과 생체 에너지 연구 dria.

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Protocol

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사두근 근육 조직 검사는 미토콘드리아가 차등 원심 분리에 의해 분리되는에서 마취 돼지에서 가져온 것입니다. 돼지는 또 다른 실험 이후에 사용됩니다. 이 연구는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라와 광저우 베른, 스위스의 동물 관리위원회의 승인을 수행한다.

1. 골격근의 균질화와 미토콘드리아 격리

  1. 소비세 마취 돼지 5-10g의 대퇴사 두근 근육 표본. 본 분석에서는 돼지의 골격 근육을 사용합니다. 이 프로토콜은 다른 종으로부터 미토콘드리아 분리하는데 사용될 수있다 (예를 들면, 래트, 마우스, 사람 등.).
    참고 :이 단계는 수술에 대한 전문 지식과 의료 전문가에 의해 수행된다.
    1. 근육 내 케타민 (20 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (2 밀리그램 / kg)으로 진정 돼지 마취 인트라로 유도되기 이전정맥 미다 졸람 (0.5 ㎎ / ㎏, 플러스 아트로핀 0.02 ㎎ / ㎏). 수술 중 연속 정맥 주사 프로포폴의 주입 (시간 당 4 ~ 8 ㎎ / ㎏)과 펜타닐 (시간 당 30 μg의 / kg)으로 마취를 유지한다.
  2. 즉시 빙냉 미토콘드리아 분리 완충액 20 ㎖ (표 1)을 함유하는 비이커에 조직 샘플을 담가.
    참고 : 버퍼가 균질화 동안 사용 및 회 원심은 차가운 얼음하고 세포질과 호환 이온과 삼투 강도 생리 관련 pH가 있어야합니다.
  3. 분석 칭량 균형 비이커에서 조직 샘플을 단다. 차단 완충액 20 ㎖를 함유하는 비이커 균형 용기.
  4. 얼음 양동이에 비커를 놓습니다.
    참고 : 얼음 양동이 온도에서 균질화 과정의 다음 단계를 모두 수행하고 얼음 양동이에있는 모든 버퍼를 유지합니다.
  5. 비커에서 골격 근육을 말하다 미세 sciss를 사용하여 3-4 분 동안 1-2mm 작은 조각으로 (얼음 계속)ORS.
  6. 얼음 차가운 분리 버퍼 (20 ㎖ 각 세척 단계)로 두 번 비커에 다진 조직을 씻어.
  7. 5 mg의 프로테아제 / g 조직을 포함하는 조직 무게 (g) 당 분리 버퍼 볼륨 (10)의 조직을 중단.
  8. 자석 교반기 빙욕에서 비커를 놓고 10 분 동안 교반한다.
  9. 0.2 % (중량 / 부피) 탈지 된 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충 된 조직 무게 (g) 당 분리 버퍼 볼륨으로 추가 10 비커 현탁액을 희석.
  10. 0.2 % BSA로 보충 된 분리 버퍼의 모든 경사 분리하고 0.2 % BSA (20 ㎖ 각각 세정 공정)으로 보충 된 차가운 얼음 분리 완충액으로 두번 비커 조직을 헹군다.
  11. 탈지 BSA와 0.2 %로 보충 조직 무게 (g) 당 분리 버퍼 10 부피에 재현 탁 조직.
  12. 느슨한 - 피팅 유봉 (10 획)와 (얼음에 보관) 반자동 유리 균질와 조직을 균질화.
    참고 : Homogeniz동일한 방식으로 항상 조직 (스트로크의 동일한 횟수, 예를 들면, 10 스트로크) 전자. 스트로크의 높은 숫자는 손상 미토콘드리아를 풀다 수 있습니다. 바람직하게는, 자동화 된 균질기를 이용하여 조직을 균질화. 수동으로 (그리고 주관적으로) 유리 균질의 균질 조직 샘플은 고립 된 미토콘드리아의 서로 다른 특성을 생성 할 수있다.
  13. 원심 분리기 10,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 균질 조직.
    주 : 모든 원심 분리 단계는 고정 된 각도 로터와 원심 분리기에서 수행된다.
  14. 혈청 학적 피펫을 사용하여 상청액을 폐기하고 BSA-보충 빙냉 분리 매질 펠릿 (10 ㎖ / g 조직)에 재현 탁.
  15. 원심 분리기 350 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 정지.
  16. 혈청 학적 피펫을 이용하여 상층 액을 예약 및 펠릿 (세포 파편)을 폐기합니다.
  17. (17 스레드 / cm 2) 세포 debr을 제거하는 거즈 두 레이어를 통해 (얼음에 보관) 비커에 뜨는 필터이다.
  18. 원심 분리기 7,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 필터링 된 서스펜션.
  19. 뜨는을 취소하고 7,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 0.2 % (중량 / 부피) BSA와 원심 분리기 정지 보충 분리 버퍼 (5 ㎖ / g 조직)의 원유 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁.
  20. 뜨는을 취소하고 세척 버퍼 (표 1)에서 원유 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 7,000 × g으로 10 분 동안 4 ° C에서 다시 정지.
  21. g 뜨는을 취소하고 세척 버퍼의 원유 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁하고 X 7,000에서 10 분 동안 4 ° C에서 다시 정지를 원심 분리기.
  22. 뜨는을 취소하고 세척 완충액 1.0 mL에 조 미토콘드리아 펠렛을 재현 탁.
  23. 미토콘드리아 현탁액의 단백질 농도를 결정하고 얼음에 집중 미토콘드리아 현탁액을 유지합니다.
    주 : 단백질 농도는 표준 방법을 사용하여 측정 할 수있다.
  24. 직전분석을 위해 호흡율, 0.4 ㎎ / ㎖ 미토콘드리아 단백질의 최종 농도 호흡 버퍼 내의 미토콘드리아 현탁액을 재현 탁.

2. 고해상도 호흡율

  1. 고해상도 oxygraph 챔버로 호흡 완충액 (표 1) (16)의 피펫 2.1 mL의 연속 안정된 산소 플럭스 신호까지 1 시간 동안 37 ° C에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대를 사용하여 상기 버퍼 교반 폴라로 그래프 산소 센서를 얻을 수있다.
    주 : 각 oxygraph 챔버 내의 폴라로그래피 산소 전극, 산소 농도를 측정하고, 각 챔버 내에 산소 소비량 (유량)을 구한다. 산소 농도 및 산소 소모 속도 (광속)은 데이터 획득 및 분석 소프트웨어를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시된다. 또, 정확하고 신뢰할 수있는 결과를 보장하기 위해서, 쓸모 산소 배경 보정되어야제조업체의 지시에 따라 수행 하였다.
    주 : 호흡 버퍼 정확히 2.1 ㎖를 마개를 닫은 후 2.0 ㎖의 최종 챔버 체적 교정 용 챔버로 추가된다.
  2. 제조자의 프로토콜에 따라 17 폴라 산소 센서의 공기 보정을 수행한다.
    주 : 공기 교정 중에, 기체 상으로 존재하는, 미디어 산소 농도가 15 ~ 20 분 정도의 평형 것이다. 온도, 기압, 미디어와 산소 농도에 따라 용해도 것이 계산 될 수있다.
  3. 공기 교정 후, oxygraph 실에서 호흡 매체를 기음과 oxygraph의 챔버에 단계 1.24에서 고립 된 미토콘드리아 현탁액 (0.4 ㎎ / ㎖ 미토콘드리아 단백질)의 2.1 mL를 넣어.
    참고 : 호흡 버퍼의 볼륨이 설정 악기와 제조 업체에 따라 달라집니다. 고해상도 호흡율 들어 호흡 BU의 2.1 mL의ffer은 스토퍼를 닫은 후 2.0 ㎖의 최종 챔버 체적 교정 용 챔버로 추가된다.
  4. 스토퍼를 삽입하여 oxygraph 실을 닫습니다.
  5. 안정적인 산소 유량 신호가 도달 할 때까지 지속적으로 3 ~ 5 분 동안베이스 라인에서 37 ° C에서 챔버 (700 RPM)에 존재하는 자기 교반 막대 및 기록 세포 호흡을 사용하여 미토콘드리아 정지를 저어.
    주 : 산소 농도 및 산소 플럭스 신호는 데이터 수집 및 분석 용 소프트웨어 (17)를 사용하는 컴퓨터에 온라인으로 실시간으로 표시된다.
  6. 그 후, 다음과 같은 표준 프로토콜을 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 미토콘드리아 호흡 기질 및 억제제를 주입.

3. 복잡한 I-따라 호흡

  1. 단계 2.1-2.5에 기재된 절차에 따라 단리 된 미토콘드리아 현탁액 (0.4 ㎎ / ㎖)을 함유하는 oxygraph 챔버 준비안정된 신호를 기다리십시오.
  2. (0.4 ㎎ / ㎖) 챔버 스토퍼 티탄 주입구 고립 미토콘드리아 현탁액을 함유 oxygraph 챔버에 0.8 M 말산 12.5 μL (5 mM의 최종 농도) 및 2 M 글루타메이트 10 μL (10 mM의 최종 농도)을 주입 안정된 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지 3-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
    주 : 다음 단계에서의 모든 주사가 ​​주사기를 사용하여 스토퍼 티탄 주입 포트를 통해 수행된다.
  3. 다음 감소하고 (3-5 분) 안정화 챔버 스토퍼 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버 내로 0.05 M ADP (0.25 mM)을 10 μL를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 미토콘드리아 호흡을 기록한다.
    참고 : ADP의 첨가 후 호흡의 고원 ADP 농도가 높고 포화을 나타냅니다. 호흡 중에 사용 미토콘드리아의 양에 따라 ADP 농도 적정해야안정된 상태 3 산소 소비 (최대 호흡)합니다. 미토콘드리아 현탁액 ADP를 첨가 (주 3 호흡)을 증가 산소 소비량의 증가와 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다. ADP에 소비 된 후, 산소 유량 신호 (상태 4 호흡)을 감소한다.

4. 복합 II 의존 호흡

  1. 단계 2.1-2.5에서 설명하고 안정적인 신호를 기다리 절차에 따라 격리 된 미토콘드리아 현탁액 (0.4 ㎎ / ㎖)가 포함 된 oxygraph 챔버를 준비합니다.
  2. 주사기를 사용하여 챔버 스토퍼 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버에 0.2 밀리미터 로테 논 (0.2 μM) '주의'2 μL를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지 3-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
    주 : 로테 위험한 독약과 인체에 큰 영향을 미칠 수있다.
  3. oxygraph의 채널에 1 M 숙시 네이트 (10 mM)을 20 μL를 주입황색 안정된 산소 플럭스 신호까지 3-5 분 동안 기록 미토콘드리아 호흡이 달성된다.
  4. 다음 감소하고 (3-5 분) 안정화 안정화 챔버 스토퍼 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버 내로 0.05 M ADP (0.25 mM)을 10 μL를 주입하고, 산소 유량의 신호가 증가 할 때까지 세포 호흡을 기록한다.
    주 : 미토콘드리아 현탁액 ADP의 첨가 (주 3 호흡)을 증가 산소 소비량의 증가와 산소 플럭스 신호를 유도 할 것이다. ADP에 소비 된 후, 산소 유량 신호 (상태 4 호흡)을 감소한다.

5. 복잡한 IV-따라 호흡

  1. 단계 프로토콜 2.5-2.1 안정된 신호를 기다리에 기재된 절차에 따라, 격리 된 미토콘드리아 현탁액을 함유하는 oxygraph 챔버 (0.4 ㎎ / ㎖)를 제조 하였다.
  2. 그런 다음 0.8 mM의 아스 코르 빈산의 2.5 μL (1 mm)를 주입. 그 직후 0.2 2.5 μL를 주입TMPD M (0.25 mM)을 산소 플럭스 신호가 증가 될 때까지 oxygraph 챔버 기록 세포 호흡에 0.05 M ADP (0.25 mM)을 10 μL 및 (3-5 분) 안정화시킨다.
  3. 마지막 oxygraph 챔버로 1 M 소듐 아자 이드 (5 mM)을 '주의'10 μL를 투입하고, 산소 유량의 신호가 감소 할 때까지 세포 호흡 기록 및 안정화시킨다.
    주 : 아 지드 화 나트륨 위험한 독약과 인체에 큰 영향을 미칠 수있다.

6. 시토크롬 C 테스트

  1. 단계 프로토콜 2.5-2.1 안정된 신호를 기다리에 기재된 절차에 따라, 격리 된 미토콘드리아 현탁액을 함유하는 oxygraph 챔버 (0.4 ㎎ / ㎖)를 제조 하였다.
  2. (0.4 ㎎ / ㎖) 챔버 스토퍼 티탄 주입구 절연 미토콘드리아 현탁액을 함유 oxygraph 챔버에 0.8 M 말산 12.5 μL (5 mM의 최종 농도) 및 2 M 글루타메이트 10 μL (10 mM의 최종 농도)을 주입안정된 산소 플럭스 신호가 달성 될 때까지 3-5 분 동안 세포 호흡을 기록한다.
  3. 다음 감소하고 (3-5 분) 안정화 산소 플럭스 신호가 증가 될 때까지 상기 챔버 스토퍼 기록 미토콘드리아 호흡 티탄 주입구를 통해 oxygraph 챔버로 0.5 M ADP (2.5 mM)을 10 μL를 주입한다.
  4. 마지막으로, 챔버로 oxygraph 4 mM의 시토크롬 C (10 μM)의 5 μL를 주입하고 안정한 산소 플럭스 신호가 얻어 질 때까지 5 분 동안 세포 호흡을 기록한다.

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Representative Results

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복잡한 I-따라 호흡

격리 미토콘드리아 복합체 I 의존적 호흡 레이트 (주 2, 3, 4)는 고해상도 호흡율 (도 1, 대표도)를 사용하여 결정된다. 미토콘드리아 복합체 I 기판 글루타메이트 말산은 ADP를 첨가하여 추가된다. 상태 2는 단독으로, 기판의 존재 하에서 산소 소비를 지칭한다. 상태 (3)은 기판 및 ADP의 존재하에 산소 소비를 지칭한다. 주 4 ADP 고갈 후 산소 소비를 의미한다. RCR은 ATP 생산에 대한 산소 소비량의 결합의 지표이며,도 1에 도시 된 바와 같이, ADP, 미토콘드리아 호흡 속도가 증가 즉시 (주 3 호흡)의 첨가시, 상태 3 및 상태 4의 비율로서 계산되며, 다음 수준의 매우 s의 (주 4 호흡)을 감소상태 (2)의 것과 imilar이 높은 RCR을 표시하고 미토콘드리아 무결성 잘 분리 과정 중에 보존된다. 도 2는 부적절한 실패한 미토콘드리아 분리를 나타내는 하이 상태 4 호흡률과 로우 상태 3 호흡률과 RCR 측정의 대표도이다. 주 4에서 높은 호흡 속도는 미토콘드리아 양자 leakiness (15)의 지표입니다.

그림 1
그림 1 : 성공적인 미토콘드리아 분리 : 미토콘드리아 무결성이 잘 분리 절차를 수행하는 동안 보존됩니다. 글루타메이트와 같은 기판 말산 (복소 I 의존적 호흡)을 이용하여 고해상도의 호흡율 트레이싱. 파란색 선은 산소 농도를 나타냅니다. 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 옥시고립 된 미토콘드리아가 사용할 수있는 산소를 사용하는 같은 세대의 농도는 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비 pmol의 / (SX mg의 미토콘드리아 단백질)로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 실패 미토콘드리아 분리 : 미토콘드리아의 무결성을 잘 부적절한 미토콘드리아 분리를 나타내는 분리 절차를 수행하는 동안 유지되지 않습니다. 글루타메이트와 같은 기판 말산 (복소 I 의존적 호흡)을 이용하여 고해상도의 호흡율 트레이싱. 파란색 선은 산소 농도를 나타냅니다. 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 절연 미토콘드리아가 availab 사용할수록 산소 농도는 시간이지나면서 감소제작 : 산소. 산소 소비 pmol의 / (SX mg의 미토콘드리아 단백질)로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

복잡한 II 의존 호흡

격리 미토콘드리아 복합체 II 의존 호흡 레이트 (주 2, 3, 4)는 고해상도 호흡율 (도 3의 대표도)를 사용하여 결정된다. 이 분석의 경우, 미토콘드리아 복합체 I은 로테의 첨가에 의해 억제되고, 그 후, 숙신산 (복합체 II 기판) ADP 뒤에 첨가된다. 그림 3은 ADP의 첨가시, 미토콘드리아 호흡 증가 즉시, 다음 잘 결합 된 미토콘드리아를 나타내는 상태 2의 그것과 매우 유사 수준에와 있음을 감소 함을 보여줍니다미토콘드리아 무결성 잘 분리 과정 중에 보존된다. 이 전형적인 실험 계산 RCR 값 가능한 문헌 10, 11, 23)에 도시 된 값에 가까운 합의 인 4.23이다. 도 4는 부적절한 분리를 나타내는 하이 상태 4 호흡률과 로우 상태 3 호흡률과 RCR 측정의 대표도이다.

그림 3
그림 3 : 성공적인 미토콘드리아 분리 : 미토콘드리아 무결성이 잘 분리 절차를 수행하는 동안 보존됩니다. 기판 (복합체 II 의존 호흡)와 같은 숙시 네이트를 사용하여 고해상도 호흡율에서 트레이싱. 파란색 선은 산소 농도를 나타냅니다. 의 붉은 선이 산소의 흐름을 나타냅니다 (경사산소 농도). 절연 미토콘드리아 가능한 산소를 사용하여, 상기 산소 농도가 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비 pmol의 / (SX mg의 미토콘드리아 단백질)로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 실패 미토콘드리아 분리 : 미토콘드리아의 무결성을 잘 부적절한 분리를 나타내는 분리 절차를 수행하는 동안 유지되지 않습니다. 기판 (복합체 II 의존 호흡)와 같은 숙시 네이트를 사용하여 고해상도 호흡율에서 트레이싱. 파란색 선은 산소 농도를 나타냅니다. 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 산소 농도는 격리 mitoc으로 시간이지나면서 감소hondria 사용 가능한 산소를 사용합니다. 산소 소비 pmol의 / (SX mg의 미토콘드리아 단백질)로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

복잡한 IV-따라 호흡

격리 미토콘드리아 복잡한 IV 의존 호흡 속도 고해상도 호흡율 (도 5, 대표도)를 사용하여 측정 (3 주 2). 이 분석을 위해 아스코르브 / TMPD 및 ADP 복잡한 IV를 억제하는 아 지드 화 나트륨,이어서 추가된다.

이전과 아 지드 화 나트륨을 첨가 한 후, 산소 소모의 차이는 실제 호흡 복잡한 IV로 해석된다. 그림 5는 지표 성과의 대표이다미토콘드리아 무결성 잘 분리 과정 중에 보존되었음을 나타내는 높은 복잡한 IV 의존 상태 3 호흡률의 장담. 대조적으로,도 6에 부적절한 분리를 나타내는 로우 상태 (3)의 측정의 대표도이다.

그림 5
그림 5 : 성공적인 미토콘드리아 분리 : 미토콘드리아 무결성이 잘 분리 절차를 수행하는 동안 보존됩니다. 기판 (IV 복잡한 의존 호흡)로 아스 코르 베이트 / TMPD를 이용하여 고해상도의 호흡율 트레이싱. 복합 IV 호흡 (주 3) 이전에 아 지드 화 나트륨을 첨가 한 후, 산소 소모를 감산하여 해석된다. 파란색 선은 산소 농도를 나타냅니다. 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 산소 농도는 격리 mitocho으로 시간이지나면서 감소사용 가능한 산소를 사용 ndria. 산소 소비 pmol의 / (SX mg의 미토콘드리아 단백질)로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
그림 6 : 실패 미토콘드리아 분리 : 미토콘드리아의 무결성을 잘 부적절한 분리를 나타내는 분리 절차를 수행하는 동안 유지되지 않습니다. 기판 (IV 복잡한 의존 호흡)로 아스 코르 베이트 / TMPD를 이용하여 고해상도의 호흡율 트레이싱. 복합 IV 호흡 (주 3) 이전에 아 지드 화 나트륨을 첨가 한 후, 산소 소모를 감산하여 해석된다. 파란색 선은 산소 농도를 나타냅니다. 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 산소 conce고립 된 미토콘드리아가 가능한 산소를 사용할 때 ntration은 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비 pmol의 / (SX mg의 미토콘드리아 단백질)로 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미토콘드리아 외막 무결성 평가 시토크롬 C를 사용하여

미토콘드리아 제제의 품질을 평가하기 위해, 시토크롬 C 시험 글루타메이트 말산, ADP와 사이토 크롬 C의 이후의 첨가 후 미토콘드리아 호흡 측정에 의해 미토콘드리아 외막 무결성을 결정하기 위해 수행된다 (ADP는 복잡한 II 의존 상태 3 호흡 자극 시토크롬 C의 존재). 도 7에 도시 된 바와 같이, 시토크롬 C는 복소 I 의존 상태 3을 다시 향상 않는다 격리 된 미토콘드리아의 spiration,이 미토콘드리아 외막에서 시토크롬 C의 손실을 없었다 및 미토콘드리아 무결성이 보존되고있는 것을 나타내는.

그림 6
그림 7 : 시토크롬 C는 절연 미토콘드리아의 호흡을 향상시키지 않는다 : 미토콘드리아 무결성 잘 분리 과정 중에 보존된다. 기판 글루타메이트 / 말산 (복소 I 의존적 호흡)을 이용하여 고해상도의 호흡율 트레이싱. 파란색 선은 산소 농도를 나타냅니다. 적색 라인은 산소 유량 (산소 농도 기울기)를 나타낸다. 절연 미토콘드리아 가능한 산소를 사용하여, 상기 산소 농도가 시간이 지남에 따라 감소한다. 산소 소비 pmol의 / (SX mg의 미토콘드리아 단백질)로 표현된다.m / 파일 / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미토콘드리아 분리 버퍼
화학 집중
KCl을 100 밀리미터
황산 10 mM의
모르 폴리 설 폰산 (MOPS) 50 mM의
ethylenedinitrilotetraacetic 산 (EGTA) 1.0 밀리미터
ATP 1.1 밀리미터
pH 7.4의
미토콘드리아 세척 버퍼
화학 집중
KCl을 100 밀리미터
MOPS 50 mM의
EGTA 0.5 밀리미터
pH 7.4의
미토콘드리아 호흡 버퍼 (16)
화학 집중
자당 110 밀리미터
EGTA 0.5 밀리미터
의 MgCl 2 3.0 밀리미터
KCl을 80 mM의
K-락토 60 mM의
KH 2 PO 4 10 mM의
타우린 20 mM의
헤 페스 20 mM의
BSA 1.0 g / L
pH가 7.1

표 1 : 버퍼 조성물.

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Discussion

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본 연구에서 우리는 고품질의 손상 및 고해상도 호흡율 기능성 연구에 사용할 수있는 차등 원심 분리에 의해 단단히 결합 골격근 미토콘드리아를 분리하는 프로토콜을 기술한다.

손상과 밀접하게 결합 미토콘드리아를 분리하기 위해, 본 프로토콜 내에서 고려되어야 할 몇 가지 한계점이있다. 골격 조직을 채취 후, 즉시 빙냉 미토콘드리아 차단 완충액에 침지한다. 모든 원심 분리 단계는 4 ° C에서 수행해야하며, 미토콘드리아 현탁액을 분리하는 동안 얼음에 항상 보관해야합니다. 분리 절차는 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 균질는 청소 세제없이 원심 분리기 튜브에 원심 분리되어야한다. 프로 시저의 끝에서, 미토콘드리아 현탁액 농축 유지되어야하고 호흡율 직전에 희석 될 수있다. 호흡율 데이터는 초 당 pmol의 PE로 표현되기 때문에미토콘드리아 단백질 밀리그램의 R은 정확하게 분리 후의 미토콘드리아 단백질 농도를 측정하는 좋은 방법을 사용하는 것이 중요하다.

일부 미토콘드리아 분리 방법에있어서, 상기 미토콘드리아가 비 결합 또는 고해상도 호흡율을 사용하여 적절하게 산소를 소비하지 않는 것이 일어날 수있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 조직은 항상 헐렁한 유봉 (단계 1.12)가있는 균질화기를 사용하여 동일한 방법 (스트로크의 동일한 수)로 균질화한다. 여기서, 우리는 항상 10 스트로크 자동 호 모지 나이저를 사용하여 골격근 조직을 균질화시킨다. 스트로크의 높은 숫자는 손상 미토콘드리아를 풀다 수 있습니다. 수동으로 (그리고 주관적으로) 유리 균질의 균질 조직 샘플은 고립 된 미토콘드리아의 서로 다른 특성을 생성 할 수있다. 미토콘드리아의 동결도 결합되지 미토콘드리아가 발생할 수 있습니다 하나는 회 원심이 아닌이 테 아래 4 ° C에서 수행하고 있는지 확인한다mperature. 버퍼 용액의 pH가 올바르지 않거나 원심 튜브가 깨끗하지 않은 경우 미토콘드리아 무결성뿐만 아니라 손상 될 수있다. 하나는 원심 분리 튜브 세제없이 제대로 세척 있는지 확인해야합니다.

분리 동안 고려 될 첫번째 중요한 요소 중 하나는 완만하게 조직을 균일화하는 것이다. 하드 조직이 훨씬 더 강한 기계적인 힘을 필요로하는 반면 부드러운 조직, 균질화 동안 적용 부드러운 기계적 힘을 필요로한다. 균질화 및 회 원심 동안 사용 된 버퍼는 차가운 얼음하고 세포질과 호환 이온과 삼투 강도 생리 관련 pH가 있어야합니다. 골격근 등의 경조직 들어, 기계적 균질화 한 후, 트립신과 같은 프로테아제는 또한 조직 (4, 5)를 해리하는 추가 될 수있다.

(D)에 기초 절연 미토콘드리아의 한계 중 일부ifferential 원심 분리 ⅰ) 균질화 및 격리 절차 19시 가능성이 손상된 미토콘드리아, ⅱ) 미토콘드리아 분리에 필요한 조직 표본의 많은 양의, ⅲ) 특정 미토콘드리아 전자 전달계 단지 서브 유닛의 손실 가능성 및 변경이 균질화 과정과입니다 원심 분리는 18 단계, 및 ⅳ) 미토콘드리아 기능 (18)을 방해 할 수 균질화 및 원심 분리 단계에서 반응성 산소 종의 생성 증가. 다운스 균질화 차동 원심 분리 방법의 장점은 밀도 구배 원심 분리 (20) 등의 기존의 방법에 관하여 호흡 실험 조 미토콘드리아를 분리하는 방법은 신속하고 미토콘드리아 단시간 내에 격리되어있다. 따라서 호흡 실험 1에서 수행 될 수있다시간. 또한, 상기 방법은 매우 효율적이고, 저렴하고 차동 원심 분리에 의해 수득 된 미토콘드리아 호흡율이 분석법에 사용될 수있다. 절연 미토콘드리아를 이용하여 미토콘드리아 산소 소비 조사 투과성이 섬유 또는 세포에 비해 여러 장점을 제공하지 않는다 : 미토콘드리아 기능 생체 에너지 방해 할 수있는 세포질 단백질과 유의 한 간섭; 휴대 permeabilization에 대한 필요가 없습니다; 및 미토콘드리아 호흡 사슬 복합체 기판은 절연 미토콘드리아에 직접 첨가 될 수있다.

골격근 미토콘드리아 호흡을 측정하는 다른 방법 중 하나가 사용 근섬유 구를 투과 가능하다. 절연 미토콘드리아 위에 투과성이 근육 섬유의 장점 중 일부는 I) 기계적 균질화 단계가 필요하지 않다하고, ⅱ) 조직 (몇 mg)의 매우 적은 양의 호흡율 분석법 필요하다. 페이지의 단점ermeabilized 근육 섬유는 섬유 다발의 미토콘드리아에 낮은 산소 확산이다. 이 확산 제한 호흡율 분석하는 동안 ADP의 더 많은 양을 필요로한다. 또 다른 방법은 매우 신속한 방법 및 미토콘드리아를 분리 차등 원심 분리 단계를 필요로하지 않는 전체 조직 균질 액 (22)의 사용이다. 전체 조직 파쇄 사용은 분리 중에 일부 미토콘드리아의 손실을 방지 할 수 있지만, 그러한 산소 소비 미토콘드리아 기능의 분석을 방해 할 수있는 세포질 다른 요인이있을 수있다.

호흡 분석을 위해 원유 미토콘드리아를 분리 차동 원심 분리를 마스터 한 후, 미래의 응용 프로그램은 미토콘드리아 외막 방지 TOM22 (외부 미토콘드리아 막 (22) 상 동체의 트랜스로 케이스 (translocase)) 항체 COUPL을 사용하는 등 새로운 기술을 통해 고립 된 미토콘드리아의 호흡 능력을 조사하는 것입니다에드 자석 구슬 21.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
ATP Sigma A 7699 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
EGTA fluka 3779 Chemical
Glutamate Sigma, G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) Merck 1.06129 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial Sigma P 8038 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser  schuett-biotec GmbH 3.201 011 Tissue homogenizer
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical

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References

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고해상도 호흡율 측정을위한 차동 원심 분리에 의한 골격근에서 본래 미토콘드리아의 분리
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Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).More

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).

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