Introduction
Митохондриальные биоэнергетика и дыхательные способности могут быть изучены не только в проницаемыми клеток или волокон, но и в изолированных митохондриях. В настоящем исследовании мы опишем протокол, чтобы изолировать неповрежденных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования для измерения респирометрии с высокой разрешающей способностью.
Чтобы изолировать интактные митохондрии для респирометрии, ткань гомогенизируют и митохондрии изолированы с помощью обычного метода дифференциального центрифугирования. Метод дифференциального центрифугирования основан на последовательном центрифугировани (в серии увеличения скорости) тканевых гомогенатах впервые был введен Pallade и сотрудниками почти 70 лет назад 1. Ткань сначала фарша с помощью ножниц и гомогенизируют механически в стеклянном гомогенизаторе с рыхлой облегающие пестиком. Затем гомогенат центрифугируют при низкой скорости и образующийс осадок, который содержит сплошную ткань, клеточныймусора и ядер отбрасывают. Затем надосадочную жидкость центрифугируют несколько раз на высокой скорости и митохондриальные обогащенную фракцию собирают. Преимущества метода дифференциального центрифугирования, чтобы изолировать митохондрии, что: I) метод быстр и митохондрии, могут быть выделены в течение 1-1,5 ч (дыхательные эксперименты должны быть выполнены как можно быстрее); б) это недорого; и III) она является очень эффективным и митохондрии, полученные с помощью дифференциального центрифугирования достаточно чистым для использования респирометрии анализов. К недостаткам метода дифференциального центрифугирования, чтобы изолировать митохондрии, что я) митохондрии могут быть повреждены и отсоединен во время гомогенизации; б) загрязнение митохондрий с другими клеточными компонентами (может быть решена путем дальнейшей промывки митохондриальная гранул с дополнительными шагами центрифугирование); III) возможность выбора различных митохондриальных субпопуляции, например, во время дифференциальные центрифугировани шагов, митochondria с более низкой плотной могут быть исключены 7; и IV) митохондриальный сотовой окружающих отсутствует, и только теоретическое максимальное дыхание может быть измерено. Другой метод , чтобы изолировать митохондрии для респирометрии анализов градиент плотности Центрифугирование 2. В этой технике, экстракт ткани наслаивается над раствором сахарозы или градиентом Percoll (с более высокой плотностью в нижней части центрифугирование трубки) и центрифугировали при определенной скорости, в результате чего митохондрии быть изолированы от других клеточных компонентов в соответствии с их плотности. Этот метод часто используется, чтобы изолировать митохондрии мозга с очень низким загрязнения от синаптосомах. Тем не менее, митохондрии печени крысы , выделенные центрифугирования в градиенте плотности сильно загрязнены с другими клеточных органелл 3. Одним из недостатков этого метода является то, что градиент сахарозы присутствует в центрифужную пробирку может треснуть такменя митохондрии (осмотический шок).
В зависимости от типа ткани; Есть некоторые важные факторы, которые необходимо учитывать для выделения неповрежденной митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Первой необходимости является гомогенизация тканей в мягкой форме. Мягкие ткани, такие как почки, мозг и печень требуют нежные механические силы, применяемые в процессе гомогенизации. Это контрастирует с твердыми тканями, такими как сердца и скелетных мышц, которые требуют гораздо более сильные механические силы. Измельченной ткани, как правило, обрабатывают протеиназой до гомогенизации, чтобы размягчить ткани. Все буферы , используемые в процессе гомогенизации и центрифугирования должны быть ледяная и имеют физиологическую соответствующий рН с ионной и осмотической силы , совместимой с цитозоле 4, 5.
Одним из преимуществ изучения изоляции митохондриальные биоэнергетика является то, что клеточная плазматические мембраны не должны быть permeabiтрализованную с моющими средствами , такими как дигитонина или сапонина 4, 6, которые могут привести к нарушению целостности митохондриальной наружной мембраны. Еще одно преимущество изолированного митохондрий является отсутствие других цитозольных факторов, которые могут препятствовать анализу митохондриальных функций, таких как потребление кислорода. Недостатки использования выделенных митохондрии возможный выбор некоторых митохондриальных популяций во время стадий центрифугирование, повреждение митохондрий в процессе гомогенизации, а также потребность в больших количеств биологических образцов, чтобы получить хороший выход изолированных митохондрий 7, 8.
После процедуры изоляции, частота дыхания митохондриальных комплексов I-, II- и IV-зависимые состояния (2, 3 и 4) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии. Для сложных I управляемых дыхания, глутамати малат добавляют с последующим аденозиндифосфатом (ДПА). Для получения сложного дыхания II приводом, сукцинат с последующим добавлением АДФ. Для комплексного IV управляемых дыхания, аскорбат и tetramethylphenylendiamine (ТМФД) добавляют с последующим АДФ 9, 10, 11, 12. Состояние 2 относится к потреблению кислорода в присутствии одних субстратов. Состояние 3 относится к потреблению кислорода в присутствии субстратов и АДФ. Состояние 4 относится к потреблению кислорода после истощения АДФ. Дыхательный коэффициент (RCR) является индексом сцепления производства АТФ потребления кислорода и рассчитывается как отношение между состоянием 3 и состояние 4 13, 15.
В заключение, мы опишем протокол для выделения функциональных и неповрежденные скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования и использовать эти изолированные mitochonDria функциональных и биоэнергетических исследований, таких как высокого разрешения респирометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Четырехглавой мышцы биопсия взята из анестезированной свиньи, из которой митохондрии выделяют дифференциального центрифугирования. Свинья используется впоследствии для другого эксперимента. Исследование проводится в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов по уходу и использованию экспериментальных животных и с одобрения Animal Care комитета кантона Берн, Швейцария.
1. скелетных мышц Гомогенизация и Митохондриальная Изоляция
- Акцизный 5-10 г четырехглавой мышцы образец из анестезированной в свинью. В данном анализе используют свиную скелетных мышц. Этот протокол также может быть использован для выделения митохондрии из других видов (например, крысы, мыши, человека и др.).
Примечание: Этот шаг выполняется врачом-специалистом с опытом в области хирургии.- Седативный свиней с внутримышечным введением кетамина (20 мг / кг) и ксилазина (2 мг / кг), перед наркозом индуцируется с интравенозный мидазолама (0,5 мг / кг, плюс атропин 0,02 мг / кг). Поддержание анестезии с непрерывным внутривенным инфузий пропофола (4-8 мг / кг в час) и фентанила (30 мкг / кг в час) во время операции.
- Немедленно погрузить образец ткани в химический стакан , содержащий 20 мл охлажденного на льду буфера митохондриальной изоляции (таблица 1).
Примечание: Буферы используются во время гомогенизации и центрифугирования должны быть ледяная и имеют физиологическую соответствующий рН с ионной и осмотической силы, совместимой с цитозоле. - Взвесьте образец ткани в химическом стакане на аналитических тарированный баланса. Тарирования с химический стакан, содержащий 20 мл буфера для изоляции.
- Поместите стакан на ведро льда.
Примечание: Выполните все следующие шаги для процедуры гомогенизации при температуре ведро льда и сохранить все буферы на ведро льда. - Фарш скелетных мышц в стакане (держать на льду) в 1-2 мм мелкие кусочки в течение 3-4 мин с использованием тонких scissПРС.
- Ополосните измельченной ткани в стакане со льдом дважды буфером холодной изоляции (20 мл каждая отмывкой).
- Подвешивание ткани в 10 объемах буфера изоляции на массу ткани (г), содержащий 5 мг протеазы / г ткани.
- Стакан помещают в баню со льдом на магнитной мешалкой и перемешивают в течение 10 мин.
- Разбавляют суспензию в химическом стакане с дополнительными 10 объемами буфера изоляции на массу ткани (г), дополненной 0,2% (вес / объем) обезжиренный бычий сывороточный альбумин (БСА).
- Влить весь буфер изоляции, дополненной 0,2% БСА и полоскание ткани в стакане дважды со льдом буфером холодной изоляции, дополненной 0,2% БСА (20 мл каждый раз отмывкой).
- Ресуспендируют ткани в 10 объемах буфера изоляции на массу ткани (г), дополненной 0,2% с обезжиренной БСА.
- Однородный ткани с полуавтоматической стеклянной гомогенизатора (держали на льду) с рыхлым облегающие пестика (10 ударов).
Примечание: Homogenizе ткани всегда таким же образом (одинаковое количество ударов, например, 10 ударов). Большее количество ударов может привести к повреждению и расцепить митохондрии. Предпочтительно гомогенизировать ткани с использованием автоматического гомогенизатора. Вручную (и субъективно) образцы гомогенизированные ткани в стеклянных гомогенизаторов может производить различные качества изолированных митохондрий. - Центрифуга гомогенизированной ткани при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 10000 х г.
Примечание: Все стадии центрифугирования выполняются в центрифугах с угловым ротором. - Жидкость над осадком сливают с помощью серологической пипетки и ресуспендируют осадок в БСА-добавляемой ледяным изолирующей среды (10 мл / г ткани).
- Центрифуга суспензии при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 350 х г.
- Резервный супернатант с помощью серологических пипеткой и отбросить осадок (остатков клеток).
- Фильтр супернатант в стакан (держали на льду) через два слоя марли (17 нитей / см 2) для удаления клеток Debrявляется.
- Центрифуга отфильтрованный суспензию при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
- Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальной гранул в буфере изоляции (5 мл / г ткани), дополненной 0,2% (вес / объем) БСА и центрифуге суспензии при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
- Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальной гранул в промывочном буфере (таблица 1). Центрифуга суспензия снова при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
- Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальной осадок в буфере для промывки и центрифугировать суспензия снова при температуре 4 ° С в течение 10 мин при 7000 х г.
- Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют сырой митохондриальные гранулы в 1,0 мл буфера для промывки.
- Определить концентрацию белка в митохондриальной суспензии, и держать концентрированную митохондриальной суспензии на льду.
Примечание: Концентрация белка может быть измерена с помощью любого стандартного метода. - Непосредственно передна респирометрии анализы, ресуспендируют митохондриальной суспензии в буфере дыхания до конечной концентрации 0,4 мг / мл митохондриального белка.
2. Высокое разрешение респирометрии
- Пипетка 2,1 мл дыхания буфера (таблица 1) 16 в oxygraph камеру с высокой разрешающей способностью и размешать буфер непрерывно с помощью магнитной мешалки в камере (700 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 1 ч до тех пор , сигнал стабильный поток кислорода из полярографический датчик кислорода получается.
Примечание: Полярографические электроды кислорода внутри каждой oxygraph камере измеряют концентрацию кислорода и рассчитать потребление кислорода (потока) в каждой камере. Концентрация кислорода и скорости потребления кислорода (потока) отображаются в режиме реального времени в Интернете на компьютере, используя программное обеспечение для сбора и анализа данных. Кроме того, для того, чтобы обеспечить точные и надежные результаты, инструментальное кислородный коррекция фона должна бытьосуществляется в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: точно 2,1 мл буфера дыхания добавляют в камеру для калибровки конечного объема камеры 2,0 мл после закрытия стопоров. - Провести калибровку воздуха полярографическому кислородного датчика в соответствии с протоколами изготовителя 17.
Примечание: В процессе калибровки воздуха, с газовой фазой, присутствующей, концентрация кислорода, средства массовой информации будут уравновешиваться от порядка 15-20 мин. В зависимости от температуры, барометрического давления и растворимости концентрации средств массовой -кислород можно рассчитать. - После калибровки воздуха, аспирация дыхание среды из камеры oxygraph и добавляют 2,1 мл изолированной митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл митохондриального белка) со стадии 1,24 к камере oxygraph.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера дыхания зависит от инструмента настройки и производителя. Для получения высокого разрешения респирометрии, 2,1 мл дыхания бушельffer добавляется в камеру для калибровки конечного объема камеры 2,0 мл после закрытия стопоров. - Закройте oxygraph камеру путем вставки стопора.
- Перемешать митохондриальную приостановку непрерывно с помощью магнитной мешалки в камере (700 оборотов в минуту) при 37 ° C и запись клеточного дыхания на исходном уровне в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
Примечание: Концентрация кислорода и сигнала поток кислорода отображаются в режиме реального времени в Интернете на компьютере с помощью программного обеспечения для сбора и анализа данных 17. - Затем вводят субстраты и ингибиторы для митохондриального дыхания через нагнетательную титана портов стопоров с использованием следующих стандартных протоколов.
3. Комплекс I-зависимой Дыхательный
- Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированную митохондриальную приостановку (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1-2.5 иждать стабильного сигнала.
- Вводят 12,5 мкл 0,8 М малат (5 мМ конечная концентрация) и 10 мкл 2 М глутамата (10 мМ конечная концентрация) в oxygraph камеру, содержащую изолированную митохондриальную суспензию (0,4 мг / мл) через нагнетательную титана порт камеры пробкой и запись клеточное дыхание в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все инъекции в следующие шаги выполняются через нагнетательные титана портов пробками с использованием шприцев. - Вводят 10 мкл 0,05 М АДФ (0,25 мМ) в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопором и не записывать дыхание митохондрий, пока сигнал возрастает поток кислорода, а затем уменьшается и стабилизируется (3-5 мин).
Примечание: Плато дыхания после АДФ того указывает, что концентрация АДФ была высокой и насыщением. В зависимости от количества митохондрий, используемых в процессе дыхания, концентрации АДФ следует титроватьдля стабильного состояния 3 потребления кислорода (максимальное дыхание). Добавление АДФ к митохондриальной суспензии будет вызывать увеличение потребления кислорода и сигнал потока кислорода будет возрастать (состояние 3 дыхания). После того, как АДФ потребляется, сигнал поток кислорода будет уменьшаться (состояние 4 дыхания).
4. Комплекс II-зависимой Дыхательный
- Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированный митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1-2.5 и ждать стабильного сигнала.
- Вводят 2 мкл 0,2 мМ ротенону (0,2 мкМ) «Внимание» в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопора с помощью шприца и не записывают клеточное дыхание в течение 3-5 мин, пока не будет достигнут устойчивый сигнал поток кислорода.
Примечание: Ротенон является опасным ядом и может оказать существенное влияние на здоровье человека. - Вводят 20 мкл 1 М сукцинат (10 мМ) в oxygraph чянтарь и запись митохондриального дыхания в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала потока кислорода достигается.
- Вводят 10 мкл 0,05 М АДФ (0,25 мМ) в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопором и не записывать клеточное дыхание, пока сигнал возрастает поток кислорода, стабилизирует, а затем уменьшается и стабилизируется (3-5 мин).
Примечание: Добавление АДФ к митохондриальной суспензии будет вызывать увеличение потребления кислорода и сигнал потока кислорода будет возрастать (состояние 3 дыхания). После того, как АДФ потребляется, сигнал поток кислорода будет уменьшаться (состояние 4 дыхания).
5. Комплекс IV-зависимой Дыхательный
- Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированный митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1 до 2.5 протокола и ждать стабильного сигнала.
- Затем вводят 2,5 мкл 0,8 мМ аскорбата (1 мМ). Сразу же после этого вводят 2,5 мкл 0,2М TMPD (0,25 мМ) и 10 мкл 0,05 М АДФ (0,25 мМ) в oxygraph камеру и записывать клеточного дыхания до тех пор пока кислорода потока сигнала увеличивается и стабилизируется (3-5 мин).
- Наконец вводят 10 мкл 1 М азида натрия (5 мМ) «Внимание» в oxygraph камеру и не записывать клеточное дыхание до нормализации сигнала потока кислорода и стабилизирует.
Примечание: азид натрия представляет собой опасный яд и может оказать существенное влияние на здоровье человека.
6. цитохром C Test
- Подготовьте oxygraph камеру, содержащую изолированный митохондриальной суспензии (0,4 мг / мл) в соответствии с процедурой, описанной в пунктах 2.1 до 2.5 протокола и ждать стабильного сигнала.
- Вводят 12,5 мкл 0,8 М малат (5 мМ конечная концентрация) и 10 мкл 2 М глутамата (10 мМ конечная концентрация) в oxygraph камеру, содержащую изолированную митохондриальную суспензию (0,4 мг / мл) через нагнетательную титана порт камеры стопороми запись клеточное дыхание в течение 3-5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
- Вводят 10 мкл 0,5 М АДФ (2,5 мМ) в oxygraph камеру через титановой инжекционного порта камеры стопором и записывать митохондриального дыхания, пока сигнал увеличивается поток кислорода, а затем уменьшается и стабилизируется (3-5 мин).
- И, наконец, вводят 5 мкл 4 мМ цитохрома с (10 мкМ) в oxygraph камеру и записывать клеточное дыхание в течение 5 мин до получения стабильного сигнала поток кислорода не будет достигнута.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Комплекс I-зависимого дыхания
Изолированные митохондриальные сложные частота дыхания I-зависимых состояний (2, 3 и 4) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии (рисунок 1, представитель диаграмма). Митохондриальные сложные субстраты I, глутамат и малат, добавляются с последующим добавлением АДФ. Состояние 2 относится к потреблению кислорода в присутствии одних субстратов. Состояние 3 относится к потреблению кислорода в присутствии субстратов и АДФ. Состояние 4 относится к потреблению кислорода после истощения АДФ. РКР является показателем муфте потребления кислорода к продукции АТФ и рассчитывается как отношение между состоянием 3 и состояния 4. Как показано на рисунке 1, при добавлении АДФ, увеличивается частота дыхания митохондриальной немедленно (состояние 3 дыхания), и затем уменьшается (состояние 4 дыхания) до уровней очень ыimilar к тому, что государства 2. Это указывает на высокую RCR и что митохондриальная целостность хорошо сохраняется во время процедуры изоляции. На рисунке 2 представлена схема последовательности измерения низкого состояния 3 частоты дыхания и RCR, с высоким состояние 4 частоты дыхания, что указывает на неуместное и неудачную митохондриальной изоляции. Высокая частота дыхания в состоянии 4 является индикатором митохондриальная протонов неплотности 15.
Рисунок 1: Успешное митохондриальной изоляции: митохондриальная целостность хорошо сохраняется во время процедуры изоляции. Прориси от высокого разрешения с использованием респирометрии глутамат и малат в качестве субстратов (комплекс I-зависимого дыхания). Синяя линия представляет концентрацию кислорода. Красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). оксиКонцентрация поколения уменьшается с течением времени, как изолированные митохондрии используют имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается как пмоль / мг (Sx митохондриального белка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Неудачный митохондриальная изоляция: митохондриальная целостность не хорошо сохраняется во время процедуры изоляции , указывающей неуместное митохондриальной изоляции. Прориси от высокого разрешения с использованием респирометрии глутамат и малат в качестве субстратов (комплекс I-зависимого дыхания). Синяя линия представляет концентрацию кислорода. Красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). Концентрация кислорода уменьшается с течением времени, как изолированные митохондрии используют Доступнле кислорода. Потребление кислорода выражается как пмоль / мг (Sx митохондриального белка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Комплекс II-зависимого дыхания
Изолированные митохондриальный комплекс II-зависимые частота дыхания (состояния 2, 3 и 4) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии (рисунок 3, представитель диаграмма). Для этого теста, митохондриальный комплекс I ингибируется добавлением ротенону, а затем сукцинат (комплекс II субстрат) с последующим добавлением АДФ. На рисунке 3 показано , что при добавлении АДФ, то дыхание митохондрий возрастает сразу, а затем уменьшается до уровня , очень похож на состояние 2, что указывает на хорошо моноблочной митохондрии и чтомитохондриальная целостность хорошо сохраняется во время процедуры изоляции. Рассчитанное значение РКР для этого типичного эксперимента 4,23, который находится в тесном согласии со значениями , показанными в доступной литературе 10, 11, 23). На фиг.4 представлена схема последовательности измерения низкого состояния 3 частоты дыхания и RCR, с высокой частотой дыхания состояние 4 , указывающей неуместное изоляцию.
Рисунок 3: Успешное митохондриальной изоляции: митохондриальная целостность хорошо сохраняется во время процедуры изоляции. Прориси от высокого разрешения респирометрии с использованием сукцината в качестве субстрата (комплекса II-зависимого дыхания). Синяя линия представляет концентрацию кислорода. Красная линия представляет собой поток кислорода (наклонконцентрация кислорода). Концентрация кислорода уменьшается с течением времени, как изолированные митохондрии используют имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается как пмоль / мг (Sx митохондриального белка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Неудачный митохондриальная изоляция: митохондриальная целостность не хорошо сохраняется во время процедуры изоляции , указывающей неуместное изоляцию. Прориси от высокого разрешения респирометрии с использованием сукцината в качестве субстрата (комплекса II-зависимого дыхания). Синяя линия представляет концентрацию кислорода. Красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). Концентрация кислорода уменьшается с течением времени, как изолированный mitochondria использовать имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается как пмоль / мг (Sx митохондриального белка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Комплекс IV-зависимого дыхания
Изолированные митохондриальные комплекс IV-зависимый частота дыхания (состояния 2, 3) определяются с использованием высокого разрешения респирометрии (рисунок 5, представитель диаграмму). Для этого анализа аскорбат / TMPD и АОД, с последующим азида натрия для ингибирования сложного IV.
Разница между потреблением кислорода до и после добавления азида натрия интерпретируется как реальный сложный IV дыхания. На фиг.5 представлена схема последовательности из измерения дement высокого сложного состояния 3 частоты дыхания IV-зависимой, указывающей, что митохондриальная целостность хорошо сохраняется во время процедуры изоляции. В противоположность этому , на фиг.6 блок - схема последовательности измерения низкого состояния 3 , обозначая несоответствующее изоляцию.
Рисунок 5: Успешное митохондриальной изоляции: митохондриальная целостность хорошо сохраняется во время процедуры изоляции. Прориси от высокого разрешения респирометрии с использованием аскорбата / ТМФД в качестве субстрата (комплекса IV-зависимого дыхания). Комплекс IV дыхание (состояние 3) интерпретируется путем вычитания потребления кислорода до и после добавления азида натрия. Синяя линия представляет концентрацию кислорода. Красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). Концентрация кислорода уменьшается с течением времени, как изолированный mitochondria использовать имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается как пмоль / мг (Sx митохондриального белка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Неудачный митохондриальная изоляция: митохондриальная целостность не хорошо сохраняется во время процедуры изоляции , указывающей неуместное изоляцию. Прориси от высокого разрешения респирометрии с использованием аскорбата / ТМФД в качестве субстрата (комплекса IV-зависимого дыхания). Комплекс IV дыхание (состояние 3) интерпретируется путем вычитания потребления кислорода до и после добавления азида натрия. Синяя линия представляет концентрацию кислорода. Красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). Кислород Concentration уменьшается с течением времени, как изолированные митохондрии используют имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается как пмоль / мг (Sx митохондриального белка). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Оценка целостности митохондриальной наружной мембраны с использованием цитохром с
Для того, чтобы оценить качество митохондриальной препарата, цитохром с тест проводится для определения митохондриальной целостности наружной мембраны, путем измерения митохондриального дыхания после последующего добавления глутамат и малат, АДФ и цитохрома с (АДФ стимулируется Комплекс II-зависимую состояние 3 дыхания в наличие цитохрома с). Как показано на рисунке 7, цитохром с не способствует укреплению сложного I-зависимого состояния 3 ре spiration изолированного митохондрий, указывая, что не было никаких потерь цитохрома с из митохондриальной наружной мембраны и сохраняется митохондриальная целостность.
Рисунок 7: Цитохром с не усиливает дыхание изолированного митохондриальной: митохондриальная целостность хорошо сохраняется во время процедуры изоляции. Прориси от высокого разрешения респирометрии с использованием глутамата / малат в качестве субстрата (комплекс I-зависимого дыхания). Синяя линия представляет концентрацию кислорода. Красная линия представляет собой поток кислорода (наклон концентрации кислорода). Концентрация кислорода уменьшается с течением времени, как изолированные митохондрии используют имеющийся кислород. Потребление кислорода выражается как пмоль / мг (Sx митохондриального белка).м / файлы / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Митохондриальная буфер изоляции | |
| химическая | концентрация |
| KCl | 100 мМ |
| MgSO 4 | 10 мМ |
| morpholinopropane сульфокислоты (МОПС) | 50 мМ |
| ethylenedinitrilotetraacetic кислота (EGTA) | 1,0 мМ |
| АТФ | 1,1 мМ |
| рН 7,4 | |
| Митохондриальная промывочный буфер | |
| химическая | концентрация |
| KCl | 100 мМ |
| МОПС | 50 мМ |
| EGTA | 0,5 мМ |
| рН 7,4 | |
| Митохондриальная буфер 16 дыхания | |
| химическая | концентрация |
| Сахароза | 110 мМ |
| EGTA | 0,5 мМ |
| MgCl 2 | 3,0 мМ |
| KCl | 80 мМ |
| K-лактобионат | 60 мМ |
| KH 2 PO 4 | 10 мМ |
| Таурин | 20 мМ |
| Hepes 20 мМ | |
| БСА | 1,0 г / л |
| рН 7,1 | |
Таблица 1: Состав буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании мы опишем протокол для изоляции высокого качества, нетронутыми и тесно связанных скелетных мышц митохондрии с помощью дифференциального центрифугирования, которые могут быть использованы для функциональных исследований, таких как высокого разрешения респирометрии.
Для того, чтобы изолировать неповрежденных и плотно соединенных митохондрии, есть некоторые критические точки, которые необходимо учитывать в рамках настоящего протокола. После сбора скелетной ткани, она должна быть немедленно погружали в ледяную митохондриальной буфере изоляции. Все стадии центрифугирования должно быть сделано при температуре 4 ° С и митохондриального подвески следует держать всегда на льду во время изоляции. Процедура изоляции должно быть сделано как можно быстрее. Гомогенат центрифугируют следует в чистых моющих свободных центрифужные пробирки. В конце процедуры, митохондриальная суспензия должна быть концентрированной и разбавлять непосредственно перед респирометрии. Так как данные респирометрии выражены в виде пмоль на второй заземляющийR миллиграмм белка митохондрий, важно использовать хороший метод для точного измерения митохондриальной концентрации белка после выделения.
В некоторых митохондриальных процедур выделения, может случиться так, что митохондрии расцепкой или не потребляют кислород надлежащим образом с помощью высокого разрешения респирометрии. Для преодоления этих проблем, ткань всегда следует гомогенизировать таким же образом (то же количество ударов) с помощью гомогенизатора с рыхлой облегающие пестиком (этап 1.12). Здесь мы всегда гомогенизацию ткани скелетных мышц с использованием автоматического гомогенизатора с 10 ударов. Большее количество ударов может привести к повреждению и расцепить митохондрии. Вручную (и субъективно) образцы гомогенизированные ткани в стеклянных гомогенизаторов может производить различные качества изолированных митохондрий. Замораживание митохондрий также может привести к несвязанных митохондрий, и нужно убедиться, что выполняются центрифугирования при 4 ° С и не ниже этого тэmperature. Митохондриальная целостность может быть поставлена под угрозу, а если рН буферных растворов является неправильным или центрифужные пробирки не являются чистыми. Следует убедиться, что центрифугирование трубки моющего средства свободные и правильно мыть.
Одним из первых важных факторов, которые будут рассмотрены в процессе выделения является гомогенизация тканей в мягкой форме. Мягкие ткани требуют нежные механические силы, применяемые в процессе гомогенизации, в то время как твердые ткани требуют гораздо более сильные механические силы. Буферы, используемые в процессе гомогенизации и центрифугировани должны быть ледяная и имеют физиологическую соответствующий рН с ионной и осмотической силы, совместимой с цитозоле. Для получения твердых тканей , таких как скелетные мышцы, после механической гомогенизации, протеаз , таких как трипсин могут быть добавлены к дальнейшему дезагрегации ткани 4, 5.
Некоторые из ограничений изолированной митохондрии, на основе Differential центрифугирование являются I) , возможно , поврежденные митохондрии во время процедуры гомогенизации и изоляции 19, II) большие количества образцов тканей , необходимых для митохондриальной изоляции, III) возможные потери и изменения в некоторых митохондриальной цепи переноса электронов комплексов субъединиц во время гомогенизации и центрифугирование шаги 18 и IV) увеличение производства активных форм кислорода в процессе гомогенизации и центрифугирования шаги, которые могут препятствовать митохондриальной функции 18. Преимущества гомогенизатора Даунса гомогенизация и методом дифференциального центрифугирования для выделения сырой митохондрии для дыхательных экспериментов по отношению к существующим методам , таким как центрифугирование в градиенте плотности 20, что метод быстр и митохондрии изолированы в течение короткого периода времени. Поэтому дыхательные эксперименты могут быть выполнены в пределах 1час Кроме того, эта процедура является недорогим, очень эффективным и митохондрии, полученные с помощью дифференциального центрифугирования могут быть использованы для респирометрии анализов. Исследование митохондриальной потребления кислорода с использованием изолированных митохондрии предлагает несколько преимуществ по сравнению с проницаемыми волокон или клеток: никаких существенных помех цитозольных белков, которые могут мешать митохондриальной функции и биоэнергетики; нет необходимости в клеточной проницаемости; и субстраты митохондриальных цепных комплексов дыхательных могут быть добавлены непосредственно в изолированных митохондриях.
Одним из альтернативных методов измерения скелетных мышц дыхание митохондрий является использование проницаемыми мышечных волокон 9. Некоторые из преимуществ проницаемыми мышечных волокон над изолированных митохондриях я) никакой механической гомогенизации шаг не требуется, и, б) очень небольшое количество ткани (несколько мг) необходимы для респирометрии анализов. Недостатком рermeabilized мышечных волокон является нижняя диффузия кислорода в митохондрии в пучке волокон. Это ограничение диффузии требует больших количеств АДФ в течение респирометрии анализов. Другой альтернативный способ заключается в использовании гомогената цельной ткани 22, что является очень быстрым методом и не требует дифференциальных стадии центрифугирования , чтобы изолировать митохондрии. Использование гомогената цельной ткани может предотвратить потерю некоторых митохондрий в процессе их выделения, но могут быть и другие цитозольных факторы, присутствующие, которые могут взаимодействовать с анализом митохондриальных функций, таких как потребление кислорода.
После освоения дифференциального центрифугирования для выделения сырой митохондрии для дыхательных анализов, будущее применение является исследование дыхательных потенциала митохондрий, выделенных с помощью новых методов, таких как использование митохондриальной наружной мембраны против TOM22 (транслоказе из внешней митохондриальной мембраны 22 гомолога) антитело-couplEd магнитные шарики 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
