Introduction
线粒体生物能量学和呼吸能力不仅可以在透化的细胞或纤维，而且在分离线粒体进行研究。在本研究中，我们描述了一个协议，使用隔离差速离心高分辨率呼吸测量测量完整骨骼肌线粒体。
为了分离完整的线粒体为呼吸测量，组织是均质和线粒体通过常规差速离心法分离。的差速离心的方法是基于连续的离心（在一系列增加速度的）组织匀浆首先由Pallade引入和同事近70年前1。将组织用剪刀第一切碎并在玻璃匀浆用宽松杵机械匀化。之后将匀浆在低速和包含完整的组织中得到的沉淀，细胞离心碎片和细胞核被丢弃。然后，将上清液在高速离心几次和线粒体富集馏分被收集。的差速离心方法的优点来分离线粒体是：i）该方法是快速的和线粒体可以1-1.5小时内（呼吸实验应尽可能快地进行）来分离; ii）其是便宜;和iii）它是非常有效的，并通过差速离心获得的线粒体是呼吸测量测定足够纯的。差速离心方法的缺点以分离线粒体是ⅰ）线粒体可能损坏和均化过程中脱开; ii）与其它细胞组分线粒体（的污染可能由进一步洗涤线粒体沉淀用另外的离心步骤）来解决; iii）选择不同的线粒体亚群， 例如 ，在差分离心步骤的可能性，麻省理工学院ochondria较低致密可以排除7;和iv）线粒体细胞周围缺少和仅理论最大呼吸可以被测量。分离线粒体为呼吸测量测定法的另一种方法是在密度梯度离心2。在该技术中，组织提取物层叠在蔗糖或Percoll密度梯度（具有较高密度在离心管的底部）中的溶液，并在一定的速度离心，使线粒体根据从其他细胞组分中分离出来的密度。这种方法经常被用于脑线粒体与来自突触体非常低的污染隔离。然而，通过密度梯度离心分离大鼠肝线粒体是高度污染的其他细胞器3。这种方法的局限性是，存在于离心管中的蔗糖梯度可能破裂，以便我线粒体（渗透冲击）。
根据组织的类型;还有要考虑完整的线粒体通过差速离心分离有些重要的因素。首先需要在一个温和的方式来组织均匀。软组织，如肾，脑和肝需要均化期间施加温和的机械力。与此相反，硬组织如需要更强的机械力心肌和骨骼肌。组织糜通常与蛋白酶的同质软化组织之前处理。均化和离心分离期间使用的所有缓冲液应该是冰冷的，并有一个生理相关pH与胞浆4,5兼容离子和渗透强度。
一项研究中分离线粒体生物能量学的一个优点是，蜂窝质膜不需要是permeabilized用洗涤剂如毛地黄皂苷或皂苷4,6，这可能会危及线粒体外膜的完整性。分离的线粒体的另一个优点是不存在的其他胞质因子，这可能与线粒体功能，如氧消耗干扰分析。使用分离的线粒体的缺点是某些线粒体种群在离心步骤的可能的选择，均化过程中损坏线粒体，并且为了获得分离的线粒体7,8的良好产率的高量生物样品的要求。
分离过程后，线粒体复合物的呼吸速率I-，II-和IV依赖性（状态2，3和4）使用高分辨率呼吸测量确定的。对于复杂的I-驱动的呼吸，谷氨酸和苹果酸中，随后加入二磷酸腺苷（ADP）。对于复杂的Ⅱ-驱动呼吸，琥珀酸盐，然后加入由ADP。为复合物IV驱动呼吸，抗坏血酸和tetramethylphenylendiamine（TMPD）接着加入ADP 9，10，11，12。状态2是指氧消耗在单独基板的存在。状态3是指氧消耗在衬底和ADP的存在。国家4指的耗氧量ADP耗尽后。的呼吸控制率（RCR）是氧消耗ATP产生的耦合的索引，并且被计算为状态3和状态4 13，15之间的比率。
总之，我们描述了一种协议通过差速离心分离功能和完整的骨骼肌线粒体和使用这些分离mitochondria用于功能和生物能量研究，例如高分辨率呼吸测量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
股四头肌肌肉活检是从麻醉的猪，从线粒体通过差速离心分离出服用。猪是后来用于另一个实验。这项研究是根据健康指引全国学院为照顾和使用实验动物，并与广州瑞士伯尔尼的动物保健委员会批准执行。
1.骨骼肌同质化和线粒体隔离
- 消费税从麻醉猪5-10克股四头肌标本。在本测定中，使用猪骨骼肌。该协议也可以被用于分离来自其它物种的线粒体（ 例如 ，大鼠，小鼠，人， 等 ）。
注：该步骤是通过用在外科手术专长的医学专家进行。- 肌注氯胺酮（20毫克/公斤）和甲苯噻嗪（2毫克/公斤），猪稳重麻醉前诱导与内静脉咪达唑仑（0.5毫克/公斤，加阿托品0.02毫克/千克）。保持与手术期间异丙酚连续静脉输注（每股H 4-8毫克/千克）和芬太尼（每小时30微克/千克）麻醉。
- 立即浸泡在含有20毫升冰冷的线粒体隔离缓冲液（ 见表1）的烧杯中的组织样品。
同质化的过程中使用的缓冲区和离心应该是冰冷的，有一个生理相关pH与细胞质兼容离子和渗透强度：注意。 - 称重在分析配衡天平烧杯中的组织样品。去皮与含有20毫升分离缓冲液的烧杯中的平衡。
- 放在烧杯上一个冰桶。
注：执行所有在冰桶温度均匀化过程的下一步骤，并保持所有的缓冲区上的冰桶。 - 剁碎烧杯中的骨骼肌使用细sciss（保持在冰上）到1-2毫米小块3-4分钟口服补液盐。
- 用冰冷的分离缓冲液（20毫升，每次洗涤步骤）漂洗烧杯中的组织糜的两倍。
- 暂停在10体积每含有5mg蛋白酶/ g组织的组织重量（g）隔离缓冲器的组织。
- 放置烧杯中在磁性搅拌器冰浴，并搅拌10分钟。
- 稀释在烧杯中的悬浮液用额外的10体积每补充有0.2％（重量/体积）脱脂牛血清白蛋白（BSA）的组织重量（g）的分离缓冲液中。
- 滗所有补充有0.2％BSA的隔离缓冲液中，用补充有0.2％BSA（20毫升，每次洗涤工序）冰冷隔离缓冲器冲洗烧杯中的组织的两倍。
- 悬浮在10体积的每补充有0.2％与脱脂BSA的组织重量（g）隔离缓冲器的组织。
- 用均质半自动玻璃匀浆（放在冰上）用宽松杵（10杆）的组织。
注：HomogenizE在相同的方式始终组织（相同笔画数， 例如 ，10杆）。较高的笔画数可能会损坏和脱开线粒体。优选地，使用自动均化器均化该组织。手动（主观和）的玻璃匀浆组织匀浆样品可能会产生分离线粒体的不同特质。 - 离心机在4℃的均质化的组织为在10,000×g下10分钟。
注：所有离心步骤与固定角转子离心机进行。 - 使用血清吸管弃上清，悬浮在BSA-补充冰冷的分离培养基颗粒（10毫升/克组织）。
- 离心该悬浮液在4℃下在350×g下10分钟。
- 预留使用血清吸管将上清液弃沉淀（细胞碎片）。
- 过滤上清液成通过两层纱布的烧杯（置于冰上）（17线/厘米2），以除去细胞debr是。
- 离心机在4℃下经过滤的悬浮液以7,000×g的10分钟。
- 弃去上清，重悬在补充有0.2％（重量/体积）BSA和离心悬浮液中分离缓冲液（5毫升/克组织）粗线粒体沉淀在4℃以7,000×g的10分钟。
- 弃去上清，重悬在洗涤缓冲液（见表1）的粗线粒体沉淀。离心机在4℃下再次悬浮液以7,000×g的10分钟。
- 弃去上清，重悬在洗涤缓冲液的粗线粒体沉淀并以7,000×于4℃再次离心悬浮液10分钟g。
- 弃上清，悬浮粗颗粒的线粒体在1.0毫升洗涤缓冲液。
- 确定线粒体悬浮液的蛋白质浓度，并保持浓缩的线粒体悬浮液在冰上。
注：蛋白质浓度可以使用任何标准方法来测定。 - 前夕到呼吸测量测定法，重悬在呼吸缓冲器线粒体悬浮液至0.4毫克/毫升的线粒体蛋白的终浓度。
2.高分辨率呼吸测量
- 吸移管2.1毫升呼吸缓冲液（ 表1）16到一个高分辨率oxygraph室和搅拌缓冲器在37℃下连续地使用存在于所述腔室（700转）磁性搅拌棒进行1小时，直到稳定的氧通量信号得到极谱氧传感器。
注：各oxygraph腔内极谱氧电极测量氧浓度和各室内计算耗氧量（光通量）。氧浓度和耗氧速率（流量）正在使用的数据采集和分析软件显示实时在线在计算机中。此外，为了确保准确和可靠的结果，器乐氧背景校正应根据制造商的说明进行。
注：准确2.1毫升呼吸缓冲液闭挡块后添加到腔室为2.0 mL的最终室体积校准。 - 根据制造商的协议17执行极谱氧传感器的空气校准。
注：在空气校准，具有本气相，媒体氧气浓度将达到平衡的15-20分钟的量级。根据不同的温度，气压，和媒体 - 氧浓度的溶解度可以计算出来。 - 空气校准后，吸从oxygraph室呼吸介质和添加2.1毫升由步骤1.24孤立线粒体悬浮液（0.4毫克/毫升线粒体蛋白）向oxygraph的腔室。
注：呼吸缓冲区的容量取决于设置仪表和制造商。对于高分辨率呼吸测量，2.1毫升呼吸马步FFER正在关闭塞子后添加到腔室为2.0 mL的最终室体积校准。 - 由止动器的插入关闭oxygraph室中。
- 搅拌线粒体悬浮液连续地使用存在于所述腔室（700转），在37℃在基线磁性搅拌棒并记录细胞呼吸3-5分钟，直到一个稳定的氧通量信号得以实现。
注意：氧浓度和氧通量信号正在使用的数据采集和分析17软件显示实时在线在计算机中。 - 之后，注入底物和抑制剂用于通过使用以下标准协议的挡块的钛喷射口线粒体呼吸。
3.复杂我依赖呼吸
- 制备含有分离的线粒体悬浮液（0.4毫克/毫升）按照步骤2.1-2.5和描述的方法的oxygraph室等待稳定的信号。
- 注入12.5微升的0.8M的苹果酸（5mM的终浓度）和2M的谷氨酸10μL的（10毫米终浓度）至含有分离的线粒体悬浮液（0.4毫克/毫升）通过腔室止动件的钛喷射口和oxygraph室直到一个稳定的氧气流量信号实现了创记录的细胞呼吸3-5分钟。
注意：在下面的步骤的所有注射通过使用注射器塞子的钛喷射口进行。 - 注入的0.05M的ADP（0.25毫摩尔）进oxygraph室10微升通过室止动件的钛注射口和记录线粒体呼吸，直到氧通量信号增加，然后减小，稳定（3-5分钟）。
注意：ADP加入后呼吸高原表明ADP浓度高，饱和。取决于呼吸期间使用线粒体的量的ADP浓度应该滴定一个稳定的状态3耗氧量（最大呼吸）。 ADP到线粒体悬浮液的除将引起在氧消耗的增加和氧通量信号将增加（状态3呼吸）。 ADP的被消耗后，氧通量信号将降低（状态4呼吸）。
4.复合物II依赖呼吸
- 制备oxygraph室包含以下步骤2.1-2.5中描述，并等待一个稳定的信号的步骤分离的线粒体悬浮液（0.4毫克/毫升）。
- 注入0.2mM的鱼藤酮（0.2μM）“警告”的2微升到通过使用注射器腔室止动件的钛喷射口oxygraph室并记录3-5分钟的细胞呼吸，直到稳定的氧通量信号得以实现。
注：鱼藤酮是一种危险的毒药，可能对人体健康有显著的影响。 - 注射1M的琥珀酸酯（10毫米）的20微升至oxygraph通道琥珀3-5分钟记录线粒体呼吸，直到一个稳定的氧气流量信号来实现的。
- 注入的0.05M的ADP（0.25毫摩尔）进oxygraph室10微升通过室止动件的钛注入口，并记录细胞呼吸，直到氧通量信号的增加，稳定，然后下降并稳定（3-5分钟）。
注意：ADP到线粒体悬浮液中加入将引起在氧消耗的增加和氧通量信号将增加（状态3呼吸）。 ADP的被消耗后，氧通量信号将降低（状态4呼吸）。
5.复合物IV依赖呼吸
- 制备含有分离的线粒体悬浮以下步骤2.1到协议2.5和等待稳定的信号中描述的方法的oxygraph室（0.4毫克/毫升）。
- 再注入2.5微升0.8毫米抗坏血酸（1毫米）。此后立即注入0.2 2.5微升中号TMPD（0.25毫摩尔）和0.05摩尔的ADP（0.25毫摩尔）进oxygraph腔和记录细胞呼吸，直到氧通量信号增加10μL的并稳定（3-5分钟）。
- 最后注入的1M叠氮化钠（5毫摩）'小心“入oxygraph室的10微升并记录细胞呼吸，直到氧通量信号下降并稳定。
注：叠氮化钠是一种危险的毒药，可能对人体健康有显著影响。
6.细胞色素C测试
- 制备含有分离的线粒体悬浮以下步骤2.1到协议2.5和等待稳定的信号中描述的方法的oxygraph室（0.4毫克/毫升）。
- 注入12.5微升的0.8M的苹果酸（5mM的终浓度）和2M的谷氨酸10μL的（10毫米终浓度）至含有分离的线粒体悬浮液（0.4毫克/毫升）通过腔室止动件的钛喷射口oxygraph室并记录细胞呼吸3-5分钟，直到一个稳定的氧通量信号得以实现。
- 注入0.5M的ADP（2.5毫摩尔）到oxygraph室10微升通过腔室挡块和记录线粒体呼吸，直到氧通量信号增加的钛注入口，然后下降并稳定（3-5分钟）。
- 最后，注入4毫色素c（10μM）插入oxygraph室的5微升和直到一个稳定的氧通量信号实现记录细胞呼吸5分钟。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
复杂的I-依赖呼吸
分离的线粒体复合物I依赖呼吸速率（状态2，3和4）使用高分辨率呼吸测量（ 图1，一个代表性的图表）来确定。线粒体复合物I底物，谷氨酸和苹果酸盐，接着加入加入的ADP。状态2是指氧的消耗，仅在基片的存在。状态3是指氧消耗在衬底和ADP的存在。国家4指的耗氧量ADP耗尽后。 RCR是氧气消耗对ATP产生的耦合的索引，并且被计算为状态3和状态4之间的比率。 如图1所示，在加入ADP，线粒体呼吸速率增加立即（状态3呼吸）的，并然后下降（状态4呼吸）的水平非常小号imilar到该状态2.这表明高RCR和线粒体完整性隔离过程中保存完好。 图2是低态3呼吸速率和RCR的测量的代表图，具有很高的状态4呼吸速率，指示不恰当的和不成功的线粒体隔离。在国家4A高呼吸速率是线粒体质子泄漏15的指标。
图1： 成功线粒体隔离：线粒体完整性分离过程中保存完好。使用谷氨酸和苹果酸作为底物（络合物I依赖呼吸）从高分辨率呼吸测量描。蓝线代表氧气浓度。红线代表氧流量（氧气浓度的斜率）。该氧作为孤立的线粒体使用可用的氧气随着时间的推移根浓度降低。氧消耗表示为皮摩尔/（SX毫克线粒体蛋白）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：不成功线粒体隔离：线粒体完整性指示不当线粒体隔离的隔离过程中不保存完好。使用谷氨酸和苹果酸作为底物（络合物I依赖呼吸）从高分辨率呼吸测量描。蓝线代表氧气浓度。红线代表氧流量（氧气浓度的斜率）。中的氧浓度随着时间的推移而减小作为分离线粒体使用availab乐氧气。氧消耗表示为皮摩尔/（SX毫克线粒体蛋白）。 请点击此处查看该图的放大版本。
复合物II依赖呼吸
分离的线粒体复合物II依赖呼吸速率（状态2，3和4）使用高分辨率呼吸测量（ 图3中 ，代表图）测定的。对于该测定法，线粒体复合物I通过加入鱼藤酮的抑制，然后琥珀酸酯（复合体II衬底），然后加入由ADP。 图3表明，在加入ADP的，紧接在线粒体呼吸的增加，然后降低到水平非常相似，状态2，表明良好的耦合线粒体和线粒体完整性分离过程中保存完好。这个典型的实验中所计算的RCR值是4.23，这与在现有的文献10，11，23）中所示的值接近一致。 图4是一个低状态3呼吸速率和RCR的测量的代表图，与表示不适当隔离高状态4呼吸速率。
图3： 成功线粒体隔离：线粒体完整性分离过程中保存完好。使用琥珀酸盐作为底物（复合体II依赖呼吸）高分辨率呼吸测量描。蓝线代表氧气浓度。红线代表氧流量（的斜率氧浓度）。作为分离线粒体使用可用氧气随时间的氧浓度降低。氧消耗表示为皮摩尔/（SX毫克线粒体蛋白）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 不成功线粒体隔离：线粒体完整性指示不合适隔离分离过程期间不保存完好。使用琥珀酸盐作为底物（复合体II依赖呼吸）高分辨率呼吸测量描。蓝线代表氧气浓度。红线代表氧流量（氧气浓度的斜率）。中的氧浓度随着时间的推移孤立mitoc减小hondria使用可用的氧。氧消耗表示为皮摩尔/（SX毫克线粒体蛋白）。 请点击此处查看该图的放大版本。
复合物IV依赖呼吸
分离的线粒体复合物IV依赖性呼吸速率（状态2，3）使用高分辨率呼吸测量（ 图5，一个代表图）来确定。对于该测定抗坏血酸/ TMPD和ADP添加，随后叠氮化钠来抑制复合物IV。
之前和加入叠氮化钠后氧耗之间的差值被解释为真实复合物IV呼吸。 图5是测量电的代表图高复合物IV相关状态3呼吸，表明线粒体完整性隔离过程中保存完好率键相。与此相反， 图6是表示不适当隔离低状态3的测量的代表图。
图5： 成功线粒体隔离：线粒体完整性分离过程中保存完好。使用抗坏血酸盐/ TMPD作为底物（复合物IV依赖性呼吸）高分辨率呼吸测量描。复合物IV呼吸（状态3）由前和加入叠氮化钠后减去耗氧解释。蓝线代表氧气浓度。红线代表氧流量（氧气浓度的斜率）。中的氧浓度随着时间的推移孤立mitocho减小ndria使用可用的氧。氧消耗表示为皮摩尔/（SX毫克线粒体蛋白）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6： 不成功线粒体隔离：线粒体完整性指示不当隔离隔离过程中不保存完好。使用抗坏血酸盐/ TMPD作为底物（复合物IV依赖性呼吸）高分辨率呼吸测量描。复合物IV呼吸（状态3）由前和加入叠氮化钠后减去耗氧解释。蓝线代表氧气浓度。红线代表氧流量（氧气浓度的斜率）。氧concentration作为分离线粒体使用可用氧气随时间降低。氧消耗表示为皮摩尔/（SX毫克线粒体蛋白）。 请点击此处查看该图的放大版本。
使用细胞色素C线粒体外膜的完整性的评价
以评估线粒体制剂的质量，进行色素c测试以确定随后加入谷氨酸和苹果酸盐，ADP和细胞色素C的后线粒体外膜的完整性，通过线粒体呼吸测量（ADP刺激复合物II依赖性状态3呼吸中色素c的存在下）。 如图7中所示，细胞色素C不增强复合物I相关状态3重分离的线粒体的spiration，这表明没有细胞色素c损失从线粒体外膜和线粒体完整性被保存下来。
图 7： 细胞色素c的不增强的分离的 线粒体 的呼吸 ： 线粒体完整性在隔离过程中很好地保存。使用谷氨酸/苹果酸盐作为底物（络合物I依赖呼吸）高分辨率呼吸测量描。蓝线代表氧气浓度。红线代表氧流量（氧气浓度的斜率）。作为分离线粒体使用可用氧气随时间的氧浓度降低。氧消耗表示为皮摩尔/（SX毫克线粒体蛋白）。M /文件/ ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg“目标=”_空白“> 点击此处查看该图的放大版本。
| 线粒体隔离缓冲区 | |
| 化学 | 浓度 |
| 氯化钾 | 100毫米 |
| 硫酸镁 | 10毫 |
| 吗啉磺酸（MOPS） | 50毫米 |
| 乙二胺乙酸（EGTA） | 1.0毫米 |
| ATP | 1.1毫米 |
| pH值7.4 | |
| 线粒体洗涤液 | |
| 化学 | 浓度 |
| 氯化钾 | 100毫米 |
| MOPS | 50毫米 |
| EGTA | 0.5毫米 |
| pH值7.4 | |
| 线粒体呼吸缓冲区 16 | |
| 化学 | 浓度 |
| 蔗糖 | 110毫米 |
| EGTA | 0.5毫米 |
| 氯化镁 | 3.0毫米 |
| 氯化钾 | 80毫米 |
| K-乳糖 | 60毫米 |
| KH 2 PO 4 | 10毫 |
| 牛磺酸 | 20毫米 |
| HEPES 20毫米 | |
| BSA | 为1.0μg/μl |
| pH值7.1 | |
表1：缓冲剂的组合物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在本研究中，我们描述一个协议以分离高品质的，完整和差速离心紧密耦合骨骼肌线粒体可用于功能性研究，例如高分辨率呼吸测量。
为了分离完整和紧耦合线粒体，有要在本协议中考虑的一些关键点。收获骨骼组织后，应立即浸入冰冷线粒体隔离缓冲器。所有离心步骤应在4℃进行，并线粒体悬浮液应该总是在冰上分离过程中被保持。分离过程应尽可能快地完成。将匀浆应干净无洗涤剂离心管离心。在该过程结束时，线粒体悬浮液应保持浓缩并稀释至呼吸运动刚刚之前。因为呼吸测量数据表示为每秒的pe皮摩尔线粒体蛋白中的R毫克，它是用一个很好的技术来精确测量隔离后线粒体蛋白浓度非常重要。
在一些线粒体分离步骤，它可能发生在线粒体是未偶联或适当使用高分辨率呼吸测量不消耗氧气。为了克服这些问题，该组织应始终以相同的方式（相同数量的笔画）使用与宽松杵（步骤1.12）的匀浆。在这里，我们总是使用自动均化10招均匀的骨骼肌组织。较高的笔画数可能会损坏和脱开线粒体。手动（主观和）的玻璃匀浆组织匀浆样品可能会产生分离线粒体的不同特质。线粒体的冻结也可能导致非耦合线粒体和一个应该确保离心在4℃下完成，不低于本德温度。线粒体完整性可能受到损害，以及如果该缓冲溶液的pH值是不正确或在离心管是不干净。每个人都应该确保离心管是清洁剂和无洗净。
一的分离过程中要考虑的第一个重要的因素是在温和的方式匀化的组织。软组织需要在同质化应用温和的机械力，而硬组织需要更强大的机械力。同质化和离心过程中使用的缓冲液应该是冰冷的，有一个生理相关pH与细胞质兼容离子和渗透力。用于硬组织如骨骼肌，机械均化后，可加入蛋白酶，如胰蛋白酶，进一步分解所述组织4,5。
一些分离的线粒体的限制，基于对D。微分离心是i）所述均质化和分离步骤19期间可能损坏线粒体，ii）所述大量的线粒体隔离所需的组织标本，ⅲ）中均化可能发生的损失和改变在某些线粒体电子传递链复合体亚基和离心步骤18，以及iv）在生产过程中均化和离心步骤的活性氧，这可能与线粒体功能18干扰的增加。的DOUNCE匀浆和差速离心方法的优点为呼吸实验粗线粒体隔离相对于现有的方法，如密度梯度离心20是，该方法是快速和线粒体的时间很短的时间内分离。因此，呼吸实验可以在1进行H。此外，该过程是廉价的，非常有效的并通过差速离心获得的线粒体可用于呼吸测量测定。用分离的线粒体的线粒体的氧消耗量的调查提供超过透纤维或细胞几个优点：与可能与线粒体功能和生物能干扰胞质蛋白无显著干扰;不需要细胞透化;和线粒体呼吸链复合物的底物，可直接加入到分离线粒体。
之一的替代方法来测量骨骼肌线粒体呼吸是采用透肌纤维9。某些透化肌纤维过度分离线粒体的优点是：i）不需要机械均质化步骤和ii）所需要的呼吸测量测定组织（几毫克）的极少量。 p的缺点ermeabilized肌纤维是低级氧扩散到在纤维束中的线粒体。这种扩散限制要求时呼吸计量检测更大量的ADP的。另一替代方法是使用整个组织匀浆22的，这是一种非常快速的方法，并且不需要差速离心步骤以分离线粒体。整个组织匀浆的使用可能阻止一些线粒体的丧失其隔离期间，但也可以存在其他胞质因子，这可能与线粒体功能，如氧消耗干扰分析。
掌握了差速离心分离线粒体原油呼吸试验后，未来的应用是通过研究新兴技术分离线粒体的呼吸能力，如使用线粒体外膜抗TOM22（线粒体外膜22同源物的移位）抗体coupl编磁珠21。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
