Introduction
Mitokondrie bioenergi og luftveis kapasiteter kan studeres ikke bare i permeabilized celler eller fibre, men også i isolerte mitokondrier. I denne studien beskriver vi en protokoll for å isolere intakt skjelettmuskel mitokondriene ved bruk av differensiell sentrifugering i høy oppløsning respirometri målinger.
For å isolere intakte mitokondriene for respirometri, er vevet homogenisert og mitokondrier isoleres ved hjelp av en konvensjonell differensialsentrifugeringsmetoden. Differensialsentrifugeringsmetoden er basert på sekvensielle sentrifugeringer (i en serie av økende hastighet) av vevshomogenater ble først introdusert av Pallade og kolleger nesten 70 år siden en. Vevet er første hakket med saks og homogenisert mekanisk i et glass homogenisator med en løstsittende stampe. Deretter homogenatet sentrifugeres ved lav hastighet, og den resulterende pelleten som inneholder ubrutt vev, celledeltrusk og kjerner blir forkastet. Deretter blir supernatanten sentrifugert flere ganger med høy hastighet og den mitokondrielle anrikede fraksjon oppsamles. Fordelene med den differensialsentrifugering metode for å isolere mitokondrier er at: i) av fremgangsmåten er rask og mitokondriene kan isoleres i løpet av 1-1,5 timer (luftveis forsøk bør utføres så raskt som mulig); ii) det er billig; og iii) det er svært effektiv og mitokondriene innhentet av differensialsentrifugering er ren nok for respirometri analyser. Ulempene ved differensialsentrifugering metode for å isolere mitokondrier er at i) mitokondriene kan bli skadet og frakobles under homogenisering; ii) forurensning av mitokondrier med andre cellulære komponenter (kunne løses ved ytterligere vasking av den mitokondrielle pellet med ytterligere sentrifugeringstrinn); iii) muligheten for å velge ulike mitokondrie subpopulasjoner, f.eks, under differensialsentrifugering trinnene, mitochondria med lavere tetthet kan utelukkes 7; og iv) den mitokondrielle celleomgivende mangler, og bare den teoretiske maksimale respirasjon kan måles. En annen metode for å isolere mitokondriene for respirometri assays er det densitetsgradientsentrifugering 2. I denne teknikken blir vevsekstrakt lagt over en løsning av sakkarose eller en Percoll-gradient (med høyere densitet ved bunnen av sentrifugerøret) og sentrifugert ved en viss hastighet, forårsaker mitokondriene til å bli isolert fra andre cellulære komponenter i henhold til sin densiteter. Denne metoden blir ofte brukt for å isolere hjernen mitokondriene med meget lav forurensning fra synaptosomer. Imidlertid er rottelever-mitokondria isolert ved tetthetsgradient sentrifugering sterkt forurenset med andre cellulære organeller 3. En av begrensningene ved denne metode er at det sukrose-gradient til stede i sentrifugerøret kan briste såmeg mitokondrier (osmotisk sjokk).
Avhengig av typen av vev; er det noen viktige faktorer å vurdere for isolering av intakte mitokondria ved differensiell sentrifugering. Den første nødvendighet er å homogenisere vevet på en skånsom måte. Myke vev som nyre, hjerne og lever kreve milde mekaniske krefter brukes under homogenisering. Dette i motsetning til harde vev som hjerte- og skjelettmuskulatur som krever mye sterkere mekaniske krefter. Det oppmalte vev blir vanligvis behandlet med proteinase før homogeniseringen for å myke opp vev. Alle bufferne som ble anvendt i løpet av homogenisering og sentrifugering bør være iskald og har en fysiologisk relevant pH med en ionisk og osmotisk styrke kompatibel med cytosol 4, 5.
En av fordelene med å studere isolerte mitokondrielle Bioenergi er at celleplasmamembranen ikke trenger å være permeabilized med vaskemidler som digitonin eller saponin 4, 6, noe som kan kompromittere mitokondrie ytre membran integritet. En annen fordel med den isolerte mitokondrier er fraværet av andre cytosoliske faktorer, som kan forstyrre analysen av mitokondrie funksjoner som oksygenforbruk. Ulempene ved å bruke de isolerte mitokondrier er den mulige valg av visse mitokondrielle populasjoner under sentrifugeringstrinn, skader på mitokondriene i løpet av homogeniseringen, og behovet for store mengder biologiske prøver for å oppnå et godt utbytte av isolerte mitokondrier 7, 8.
Etter isoleringsprosedyren, åndedretts priser av mitokondrielle komplekser I-, II- og IV-avhengige (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjelp av høy oppløsning respirometri. For komplekse I-drevet åndedrett, glutamatog malat blir tilsatt etterfulgt av adenosindifosfat (ADP). For kompleks II-drevet respirasjon, er succinate tilsatt etterfulgt av ADP. For komplekse IV-drevet åndedrett, askorbat og tetramethylphenylendiamine (TMPD) blir tilsatt, etterfulgt av ADP 9, 10, 11, 12. Tilstand 2 refererer til oksygenforbruk i nærvær av substrater alene. Tilstand 3 viser til oksygenforbruk i nærvær av substrater og ADP. State 4 refererer til oksygenforbruk etter ADP uttømming. Åndedrettskontroll forholdet (RCR) er en indeks av kobling av oksygenforbruk ATP produksjon og beregnes som forholdet mellom stat tre og stat 4 13, 15.
Oppsummert beskriver vi en protokoll for å isolere funksjonelle og intakte skjelettmuskel mitokondriene ved differensialsentrifugering og bruke disse isolert mitochondria for funksjonell og bioenergetisk studier som høy oppløsning respirometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Quadriceps muskelen biopsi tatt fra en bedøvede gris, hvorfra mitokondrier er isolert ved differensiell sentrifugering. Grisen brukes etterpå for et annet eksperiment. Studien er utført i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr og med godkjenning av Animal Care komité i Canton Bern, Sveits.
1. Skeletal Muscle Homogenisering og mitokondrie Isolation
- Vesenet 5-10 g quadriceps muskelprøve fra en bedøvet gris. I den foreliggende analyse ved å bruke svine-skjelettmuskel. Denne protokollen kan også brukes til å isolere mitokondriene fra andre arter (f.eks, rotte, mus, menneske, osv.).
MERK: Dette trinnet er utført av en medisinsk spesialist med kompetanse innen kirurgi.- Sedate griser med intramuskulær ketamin (20 mg / kg) og xylazin (2 mg / kg), før anestesi indusert med intravenøs midazolam (0,5 mg / kg, i tillegg til atropin 0,02 mg / kg). Opprettholde bedøvelse med kontinuerlig intravenøs infusjon av propofol (4-8 mg / kg pr time) og fentanyl (30 ug / kg per time) under kirurgi.
- Umiddelbart dyppes vevsprøve i et begerglass inneholdende 20 ml iskald mitokondriell isolasjonsbuffer (tabell 1).
MERK: Buffere brukes under homogenisering og sentrifugering bør være iskald og har en fysiologisk relevant pH med en ionisk og osmotisk styrke kompatibel med cytosol. - Veie vevsprøve i begerglasset på en analytisk tarerte balanse. Kalibrer vekten med begeret inneholder 20 ml av isolasjon buffer.
- Plasser begeret på en isbøtte.
MERK: Utfør alle de neste trinnene for homogenisering prosedyren på isen bøtte temperatur og holder alle buffere på isen bøtte. - Finhakk skjelettmuskulatur i begeret (holde på is) i 1-2 mm små biter for 3-4 min med fint scissORS.
- Skyll hakket vev i begerglasset to ganger med iskald isoleringsbuffer (20 ml hver vasketrinn).
- Suspendere vevet i 10 volumer av isolasjonsbuffer pr vev vekt (g) inneholdende 5 mg protease / g vev.
- Sett begerglass i et isbad på magnetrøreren og omrør i 10 min.
- Fortynn suspensjon i begerglasset med flere 10 volumer av isolasjonsbuffer pr vev vekt (g) supplert med 0,2% (vekt / volum) fettfri bovint serumalbumin (BSA).
- Dekanter alle av isoleringsbuffer supplert med 0,2% BSA og skyll vevet i begerglasset to ganger med iskald isoleringsbuffer supplert med 0,2% BSA (20 ml hver vasketrinn).
- Resuspender vevet i 10 volumer av isolasjonsbuffer pr vev vekt (g) supplert med 0,2% med avfettet BSA.
- Homogenisere vev med en halvautomatisk glass homogenisator (holdt på is) med en løstsittende stampe (10 slag).
MERK: Homogenize vevet alltid på samme måte (samme antall slag, f.eks, 10 slag). Et høyere antall slag kan skade og frakopling mitokondriene. Fortrinnsvis homogenisere vev ved hjelp av en automatisert homogenisator. Manuelt (og subjektivt) homogenis vevsprøver i glasshomogenisatorer kan gi ulike kvaliteter av isolerte mitokondrier. - Sentrifuger den homogeniserte vev ved 4 ° C i 10 min ved 10000 x g.
MERK: Alle sentrifugeringstrinn er utført i sentrifuger med fast vinkel rotorer. - Kast supernatanten ved hjelp av en serologisk pipette og resuspender pelleten i BSA-supplert iskald isoleringsmedium (10 ml / g vev).
- Sentrifuger suspensjonen ved 4 ° C i 10 minutter ved 350 x g.
- Forbeholder supernatanten ved hjelp av en serologisk pipette og kast pellet (cellerester).
- Filtrere supernatanten i et begerglass (holdes på is) gjennom to lag av gasbind (17 tråder / cm 2) for å fjerne celle Debrer.
- Sentrifuger suspensjonen filtrert ved 4 ° C i 10 min ved 7000 x g.
- Kast supernatanten og resuspender den rå mitokondrial pellet i isoleringsbuffer (5 ml / g vev) supplert med 0,2% (vekt / volum) BSA og sentrifuger av suspensjonen ved 4 ° C i 10 min ved 7000 x g.
- Kast supernatanten og resuspender den rå mitokondrial pellet i vaskebuffer (tabell 1). Sentrifuger suspensjonen igjen ved 4 ° C i 10 min ved 7000 x g.
- Kast supernatanten og resuspender den rå mitokondrial pellet i vaskebuffer og Sentrifuger suspensjonen igjen ved 4 ° C i 10 min ved 7000 x g.
- Kast supernatanten og resuspender den rå mitokondrial pellet i 1,0 ml vaskebuffer.
- Bestem proteinkonsentrasjonen i det mitokondrielle suspensjonen og holde den konsentrerte mitokondrielle suspensjonen på is.
MERK: Proteinkonsentrasjonen kan måles ved bruk av hvilken som helst standardmetode. - like førtil respirometri analyser, resuspender mitokondrie suspensjonen i åndedrett buffer til en endelig konsentrasjon på 0,4 mg / ml mitokondrie protein.
2. Høy oppløsning respirometri
- Pipetter 2,1 ml av respirasjon buffer (tabell 1) 16 inn i en høy-oppløsning oxygraph kammeret og omrør buffer kontinuerlig ved hjelp av en magnetisk rørestav til stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C i 1 time inntil en stabil oksygenfluks signal av det oppnås den polarografisk oksygensensoren.
MERK: polarographic oksygen elektroder innenfor hver oxygraph kammer måle oksygenkonsentrasjon og beregne oksygenforbruk (flux) i hvert kammer. Oksygenkonsentrasjonen og oksygen forbruk priser (flux) vises i sanntid i en datamaskin ved hjelp av programvare for datainnsamling og analyse. I tillegg, for å sikre nøyaktige og pålitelige resultater, bør instrumental oksygen bakgrunnskorrigering bliutført i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Nøyaktig 2,1 ml åndedrett buffer tilsettes inn i kammeret for kalibrering av en endelig kammervolum på 2,0 ml etter stengetid stopperne. - Utføre en luft kalibrering av polarografisk oksygensensor ifølge produsentens protokoller 17.
MERK: Under luft kalibrering, med en gassfase til stede, vil medieoksygenkonsentrasjonen i likevekt i størrelsesorden av 15-20 min. Avhengig av temperatur, lufttrykk, og løseligheten av mediet -oxygen konsentrasjon kan beregnes. - Etter luft kalibrering, Aspirer respirasjonen mediet fra oxygraph kammeret og tilsett 2,1 ml av isolerte mitokondrie suspensjon (0,4 mg / ml mitokondrie protein) fra trinn 1,24 til et kammer i oxygraph.
MERK: Volumet av respirasjon buffer avhenger instrumentet satt opp og produsent. For høy oppløsning respirometri, de 2,1 ml av respirator buffer legges inn i kammeret for kalibrering av en endelig kammervolum på 2,0 ml etter stengetid stopperne. - Lukk oxygraph kammeret ved innføring av proppen.
- Omrør den mitokondrielle suspensjonen kontinuerlig ved hjelp av en magnetisk rørestav til stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C og registrering cellulær respirasjon ved utgangspunktet i 3-5 minutter inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
MERK: oksygenkonsentrasjon og oksygen flux signal vises i sanntid i en datamaskin ved hjelp av programvare for datainnsamling og analyse 17. - Etterpå injisere substrater og hemmere for mitokondrielle respirasjonen gjennom titan injeksjons portene på stopperne ved hjelp av følgende standardprotokoller.
3. Complex Jeg avhengig respirasjon
- Fremstille en oxygraph kammer inneholdende det isolerte mitokondrielle suspensjon (0,4 mg / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 2.1-2.5 ogvente på et stabilt signal.
- Injiser 12,5 pl 0,8 M malat (5 mM sluttkonsentrasjon) og 10 ul av 2 M glutamat (10 mM sluttkonsentrasjon) i den oxygraph kammer inneholdende isolert mitokondriell suspensjon (0,4 mg / ml) inn i titan-injeksjonsåpningen i kammeret stopperen og posten cellulær respirasjon i 3-5 minutter inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
MERK: Alle injeksjoner i de følgende trinnene er utført gjennom titan injeksjonshavnene stoppere som bruker sprøyter. - Injisere 10 pl av 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammeret gjennom titaninjeksjonsåpningen av kammeret stopperen og registrere mitokondriell respirasjon inntil oksygenfluks signalet øker, så avtar og stabiliserer (3-5 min).
MERK: Platået respirasjon etter ADP tillegg indikerer at ADP-konsentrasjonen var høy og mettende. Avhengig av mengden av mitokondrier som brukes under respirasjonen, bør ADP-konsentrasjon titreresfor en stabil tilstand 3 oksygenforbruk (maksimal respirasjon). Tilsetning av ADP til den mitokondrielle suspensjonen vil indusere en økning i oksygenforbruk og oksygenfluksen signalet vil øke (tilstand 3 respirasjon). Etter at ADP er fortært, vil oksygen flux signal reduseres (tilstand 4 åndedrett).
4. Complex II-avhengig respirasjon
- Fremstille en oxygraph kammer inneholdende isolert mitokondriell suspensjon (0,4 mg / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 2.1-2.5 og vente på et stabilt signal.
- Injiser 2 pl 0,2 mM rotenon (0,2 pM) 'fare' inn i det oxygraph kammeret gjennom titaninjeksjonsåpningen av kammeret stopperen ved hjelp av en sprøyte og registrere cellulær respirasjon i 3-5 minutter inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
MERK: Rotenon er en farlig gift og kan ha en betydelig innvirkning på menneskers helse. - Injisere 20 pl av 1 M succinat (10 mM) i oxygraph chamber og rekord mitokondriell respirasjon for 3-5 min til en stabil oksygen fluks signal er oppnådd.
- Injisere 10 pl av 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammeret gjennom titaninjeksjonsåpningen av kammeret stopperen og registrere cellulær respirasjon inntil oksygenfluks signalet øker, stabiliserer seg og deretter avtar og stabiliserer (3-5 min).
MERK: Tilsetning av ADP til mitokondrie suspensjon vil indusere en økning i oksygenforbruk og oksygen flux signalet vil øke (tilstand 3 åndedrett). Etter at ADP er fortært, vil oksygen flux signal reduseres (tilstand 4 åndedrett).
5. Kompleks IV avhengig respirasjon
- Fremstille en oxygraph kammer inneholdende isolert mitokondriell suspensjon (0,4 mg / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 2.1 til 2.5 i protokollen og vente på et stabilt signal.
- Deretter injiseres 2,5 mL av 0,8 mM askorbat (1 mM). Umiddelbart deretter injisere 2,5 ul av 0,2M TMPD (0,25 mM) og 10 ul av 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammeret og plate cellulær respirasjon inntil oksygenfluks signalet øker og stabiliserer (3-5 min).
- Endelig injisere 10 pl av 1 M natriumazid (5 mM) 'fare' inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon inntil oksygen fluks signal reduseres og stabiliseres.
MERK: Natriumazid er en farlig gift og kan ha en betydelig innvirkning på menneskers helse.
6. Cytokrom C Test
- Fremstille en oxygraph kammer inneholdende isolert mitokondriell suspensjon (0,4 mg / ml) ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 2.1 til 2.5 i protokollen og vente på et stabilt signal.
- Injiser 12,5 pl 0,8 M malat (5 mM sluttkonsentrasjon) og 10 ul av 2 M glutamat (10 mM sluttkonsentrasjon) i den oxygraph kammer inneholdende isolert mitokondriell suspensjon (0,4 mg / ml) inn i titan-injeksjonsåpningen i kammeret stopperenog registrere cellulær respirasjon i 3-5 minutter inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
- Injisere 10 pl 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret gjennom titaninjeksjonsåpningen av kammeret stopperen og plate mitokondriell respirasjon inntil oksygenfluks signalet øker, så avtar og stabiliserer (3-5 min).
- Til slutt, injisere 5 pl 4 mM cytokrom c (10 uM) inn i oxygraph kammeret og registrere cellulær respirasjon i 5 minutter inntil en stabil oksygenfluks signal er oppnådd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Complex Jeg avhengig respirasjon
Isolerte mitokondrie komplekse I avhengige luftveiene priser (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjelp av høy oppløsning respirometri (figur 1, en representant diagram). Mitokondrie komplekse substrater I, glutamat og malat, blir tilsatt etterfulgt av tilsetning av ADP. Tilstand 2 refererer til oksygenforbruk i nærvær av substratene alene. Tilstand 3 viser til oksygenforbruk i nærvær av substratene og ADP. State 4 refererer til oksygenforbruk etter ADP uttømming. RCR er en indeks av koplingen av oksygenforbruk for ATP produksjon, og er beregnet som forholdet mellom tilstand 3 og tilstand 4. Som vist i figur 1, ved tilsetning av ADP, de mitokondriell respirasjon hastigheten øker umiddelbart (tilstand 3 respirasjon), og deretter avtar (tilstand 4 respirasjon) til nivåer svært similar til at stats 2. Dette indikerer en høy RCR og at mitokondrienes integritet er godt bevart under isoleringsprosedyren. Figur 2 er et representativt diagram for måling av en lav tilstand 3 pusterytme og RCR, med en høy tilstand 4 respirasjonsfrekvens, noe som indikerer upassende og mislykket mitokondrie isolasjon. En høy respirasjonsfrekvens på tilstand 4 er en indikator på mitokondrie proton leakiness 15.
Figur 1: Vellykket mitokondrie isolasjon: mitokondrie integritet er godt bevart under isoleringsprosedyren. Tracings fra den høyoppløselige respirometri bruker glutamat og malat som underlag (kompleks I avhengig åndedrett). Den blå linjen viser oksygenkonsentrasjon. Den røde linjen representerer oksygenstrømmen (helling av oksygenkonsentrasjon). den oksygen konsentrasjonen avtar over tid som isolerte mitokondrier bruke tilgjengelig oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sx mg mitokondrie protein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Mislykket mitokondrie isolasjon: mitokondrie integritet er ikke godt bevart under isoleringsprosedyren som indikerer upassende mitokondrie isolasjon. Tracings fra den høyoppløselige respirometri bruker glutamat og malat som underlag (kompleks I avhengig åndedrett). Den blå linjen viser oksygenkonsentrasjon. Den røde linjen representerer oksygenstrømmen (helling av oksygenkonsentrasjon). Oksygenkonsentrasjonen avtar over tid som isolerte mitokondrier bruke tilgjengele oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sx mg mitokondrie protein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Kompleks II-avhengig respirasjon
Isolert mitokondrie komplekse II-avhengige luftveiene priser (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjelp av høy oppløsning respirometri (figur 3, en representant diagram). For denne analysen, er det mitokondrielle kompleks I inhiberes ved tilsetning av rotenon, og deretter succinat (kompleks II substrat) blir tilsatt, etterfulgt av ADP. Figur 3 viser at ved tilsetning av ADP, mitokondrie respirasjon øker med en gang, og deretter avtar til et nivå meget lik den i tilstand 2, som indikerer godt sammen mitokondrier, og atmitokondriell integritet er godt bevart under isoleringsprosedyren. Den beregnede RCR verdi for dette typisk forsøk er 4,23, som er i nær overensstemmelse med de verdier som er vist i den tilgjengelige litteratur 10, 11, 23). Figur 4 er et representativt diagram for måling av en lav tilstand 3 pusterytme og RCR, med en høy tilstand 4 respirasjonsfrekvens indikerer upassende isolasjon.
Figur 3: Vellykket mitokondrie isolasjon: mitokondrie integritet er godt bevart under isoleringsprosedyren. Tracings fra den høyoppløselige respirometri hjelp succinate som substrat (kompleks II avhengig åndedrett). Den blå linjen viser oksygenkonsentrasjon. Den røde linjen representerer oksygen (helling avoksygenkonsentrasjon). Oksygenkonsentrasjonen avtar over tid som isolerte mitokondrier å anvende det tilgjengelige oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sx mg mitokondrie protein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Mislykket mitokondrie isolasjon: mitokondrie integritet er ikke godt bevart under isoleringsprosedyren som indikerer upassende isolasjon. Tracings fra den høyoppløselige respirometri hjelp succinate som substrat (kompleks II avhengig åndedrett). Den blå linjen viser oksygenkonsentrasjon. Den røde linjen representerer oksygenstrømmen (helling av oksygenkonsentrasjon). Oksygenkonsentrasjonen avtar over tid, i isolerte mitochondria bruke tilgjengelig oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sx mg mitokondrie protein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Kompleks IV-avhengige respirasjon
Isolerte mitokondrie komplekse luftveiene priser IV avhengige (stater 2, 3) bestemmes ved hjelp av høy oppløsning respirometri (Figur 5, en representant diagram). For denne analysen askorbat / ADP TMPD og blir tilsatt, fulgt av natriumazid for å hemme kompleks IV.
Forskjellen mellom oksygenforbruk før og etter tilsetning av natriumazid tolkes som den virkelige kompleks IV åndedrett. Figur 5 viser et representativt diagram av Måltement av en høy kompleks IV avhengig tilstand 3 pusterytme som indikerer at mitokondrie integritet er godt bevart under isoleringsprosedyren. I motsetning til dette, figur 6 er et representativt diagram for måling av en lav tilstand 3 angir upassende isolasjon.
Figur 5: Vellykket mitokondrie isolasjon: mitokondrie integritet er godt bevart under isoleringsprosedyren. Tracings fra den høyoppløselige respirometri hjelp askorbat / TMPD som substrat (kompleks IV avhengig åndedrett). Komplekset IV respirasjon (tilstand 3) blir tolket ved å subtrahere den oksygenforbruk før og etter tilsetning av natriumazid. Den blå linjen viser oksygenkonsentrasjon. Den røde linjen representerer oksygenstrømmen (helling av oksygenkonsentrasjon). Oksygenkonsentrasjonen avtar over tid, i isolerte mitochondria bruke tilgjengelig oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sx mg mitokondrie protein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Mislykket mitokondrie isolasjon: mitokondrie integritet er ikke godt bevart under isoleringsprosedyren som indikerer upassende isolasjon. Tracings fra den høyoppløselige respirometri hjelp askorbat / TMPD som substrat (kompleks IV avhengig åndedrett). Komplekset IV respirasjon (tilstand 3) blir tolket ved å subtrahere den oksygenforbruk før og etter tilsetning av natriumazid. Den blå linjen viser oksygenkonsentrasjon. Den røde linjen representerer oksygenstrømmen (helling av oksygenkonsentrasjon). Oksygen concentration avtar over tid som isolerte mitokondrier bruke tilgjengelig oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sx mg mitokondrie protein). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Evaluering av den mitokondrielle ytre membranintegritet ved hjelp av cytokrom c
For å evaluere kvaliteten av mitokondriell preparat, er cytokrom c test utføres for å bestemme mitokondrie ytre membranintegritet, ved måling av mitokondriell respirasjon etter den etterfølgende tilsetning av glutamat og malat, ADP og cytokrom c (ADP-stimulerte kompleks II avhengig tilstand 3 åndedrett i tilstedeværelsen av cytokrom c). Som vist i figur 7, ikke cytokrom c ikke forbedre kompleks I avhengig tilstand 3 re inspira- sjon av det isolerte mitokondrier, som indikerer at det ikke var noe tap av cytokrom c fra mitokondrie ytre membran og mitokondrielle integritet bevares.
Figur 7: Cytokrom c ikke øke respirasjon av det isolerte mitochondrial: mitokondriell integritet er godt bevart under isoleringsprosedyren. Tracings fra den høyoppløselige respirometri bruker glutamat / malat som substrat (kompleks I avhengig åndedrett). Den blå linjen viser oksygenkonsentrasjon. Den røde linjen representerer oksygenstrømmen (helling av oksygenkonsentrasjon). Oksygenkonsentrasjonen avtar over tid som isolerte mitokondrier å anvende det tilgjengelige oksygen. Oksygenforbruket er uttrykt som pmol / (sx mg mitokondrie protein).m / filer / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Mitokondrie isolasjon buffer | |
| Kjemisk | Konsentrasjon |
| KCl | 100 mm |
| MgSO4 | 10 mm |
| morfolinopropan sulfonsyre (MOPS) | 50 mm |
| ethylenedinitrilotetraacetic eddiksyre (EGTA) | 1,0 mm |
| ATP | 1,1 mm |
| pH 7.4 | |
| Mitokondrie vaskebuffer | |
| Kjemisk | Konsentrasjon |
| KCl | 100 mm |
| MOPS | 50 mm |
| EGTA | 0,5 mm |
| pH 7.4 | |
| Mitokondrie respirasjon buffer 16 | |
| Kjemisk | Konsentrasjon |
| sukrose | 110 mm |
| EGTA | 0,5 mm |
| MgCl2 | 3,0 mm |
| KCl | 80 mm |
| K-laktobionat | 60 mm |
| KH 2 PO 4 | 10 mm |
| taurin | 20 mm |
| Hepes 20 mm | |
| BSA | 1,0 g / l |
| pH 7,1 | |
Tabell 1: Sammensetning av buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I foreliggende studie beskriver vi en protokoll for å isolere høy kvalitet, intakt og tett koplet skjelettmuskel mitokondria ved differensiell sentrifugering som kan anvendes for funksjonelle studier som høy-oppløsning respirometri.
For å isolere intakte og tett koblede mitokondrier, er det noen kritiske punkter som skal vurderes innenfor dagens protokollen. Etter høsting skjelettvevet, bør det umiddelbart nedsenket i iskald mitokondriell isolasjon buffer. Alle sentrifugeringstrinn bør gjøres ved 4 ° C og mitokondrie suspensjon bør holdes alltid på is under isolasjon. Isoleringsprosedyren bør utføres så raskt som mulig. Homogenatet skal sentrifugeres i rene detergent-fri sentrifugerør. Ved slutten av fremgangsmåten, bør det mitokondrielle suspensjonen holdes konsentrert og fortynnes like før respirometri. Siden respirometri data er uttrykt som pmol per sekund per milligram mitokondrie protein, er det viktig å benytte en god teknikk for å måle den mitokondrielle proteinkonsentrasjonen etter isolering.
I noen mitokondrie isolasjonsprosedyrer, kan det skje at mitokondriene er frikoblet eller ikke forbruke oksygen ordentlig ved hjelp av høy oppløsning respirometri. For å overvinne disse problemene, må vevet alltid bli homogenisert på samme måte (samme antall slag) ved hjelp av homogenisator med løstsittende pistill (trinn 1.12). Her har vi homogen alltid skjelettmuskulatur vev ved hjelp av en automatisert homogenisator med 10 slag. Et høyere antall slag kan skade og frakopling mitokondriene. Manuelt (og subjektivt) homogenis vevsprøver i glasshomogenisatorer kan gi ulike kvaliteter av isolerte mitokondrier. Frysing av mitokondriene også kan resultere i koblede mitokondrier og man bør sørge for at sentrifugeringer er gjort ved 4 ° C og ikke under denne temperature. Den mitokondrielle integritet kan bli svekket i tillegg hvis pH i bufferløsninger er feil eller sentrifuge rør er ikke rent. Man bør sørge for at sentrifuge rør er vaskemiddel-fri og ordentlig vasket.
En av de første viktige faktorer som skal vurderes i løpet av isolasjon er å homogenisere vevet på en skånsom måte. Myke vev krever milde mekaniske krefter brukes under homogenisering, mens harde vev krever mye sterkere mekaniske krefter. Buffere som anvendes under homogeniseringen og sentrifugeringer bør være iskald og har en fysiologisk relevant pH med en ionisk og osmotisk styrke kompatibel med cytosol. For harde vev slik som skjelettmuskel, etter mekanisk homogenisering, proteaser som trypsin kan tilsettes for ytterligere å disaggregert vevet 4, 5.
Noen av begrensningene i isolerte mitokondrier, basert på differential sentrifugering er i) eventuelt skadede mitokondriene i løpet av homogeniseringen og isoleringsprosedyren 19, ii) de store mengder av de vevsprøver som kreves for den mitokondrielle isolasjon, iii) det mulig tap og forandringer i visse mitokondrielle elektrontransportkjeden komplekser subenheter i løpet av homogenisering og sentrifugering trinn 18, og iv) den økte produksjon av reaktive oksygenarter i løpet av homogenisering og sentrifugeringstrinn, som kan forstyrre mitokondriefunksjon 18. Fordelene med den Dounce homogenisering og differensial-sentrifugeringsmetoden for å isolere urene mitokondriene for respiratoriske eksperimenter med hensyn til de eksisterende metoder slik som tetthetsgradient-sentrifugering 20 er at fremgangsmåten er rask og mitokondriene er isolert innen en kort tidsperiode. Derfor respiratoriske eksperimenter kan utføres i løpet av etth. I tillegg er fremgangsmåten billig, meget effektiv og mitokondriene er oppnådd ved differensiell sentrifugering kan anvendes for respirometri analyser. Etterforskningen av mitokondrie oksygenforbruk ved hjelp av isolerte mitokondrier har flere fordeler fremfor permeabilized fibre eller celler: ingen signifikant interferens med cytosoliske proteiner som kan forstyrre mitokondriefunksjon og bioenergi; ikke noe behov for cellulær permeabiliseringen; og substrater av mitokondrie respiratoriske kjede-komplekser kan tilsettes direkte til de isolerte mitokondrier.
En av de alternative metoder for å måle skjelettmuskulatur mitokondriell respirasjon er bruken permeabilisert muskelfibre 9. Noen av fordelene ved de permeabiliserte muskelfibre enn isolerte mitokondrier er i) ingen mekanisk homogenisering trinn er nødvendig, og, ii) meget små mengder av vev (noen få mg) er nødvendig for respirometri analyser. Ulempen ved permeabilized muskelfiber er den nedre oksygendiffusjon til mitokondriene i fiberbunten. Denne diffusjon begrensningen krever større mengder av ADP under respirometri analyser. En annen alternativ metode er bruken av hele vevshomogenater 22, som er en meget rask metode og krever ikke fremgangsmåten for differensialsentrifugering for å isolere mitokondriene. Bruk av hele vevhomogenat kan hindre tap av noen mitokondrier i løpet av deres isolasjon, men det kan være andre cytosoliske faktorer tilstede, noe som kan forstyrre analysen av mitokondrie funksjoner som oksygenforbruk.
Etter å mestre differensialsentrifugering for å isolere råolje mitokondriene for luftveis analyser, er en fremtidig program for å undersøke luftkapasiteter mitochondria isolert via nye teknikker for eksempel ved hjelp mitokondrie ytre membran anti-TOM22 (translokase av ytre mitokondriemembranen 22 homolog) antistoff-par,ed magnetiske kuler 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
