Introduction
الطاقة الحيوية الميتوكوندريا وقدرات الجهاز التنفسي يمكن دراستها ليس فقط في الخلايا permeabilized أو ألياف ولكن أيضا في الميتوكوندريا المعزولة. في هذه الدراسة، وصفنا بروتوكول لعزل سليمة الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي باستخدام الطرد المركزي التفاضلي لقياس قياس التنفس عالية الدقة.
لعزل الميتوكوندريا سليمة لقياس التنفس والأنسجة متجانسة وعزل الميتوكوندريا بطريقة تفاضلية الطرد المركزي التقليدي. وتستند هذه الطريقة التفاضلية الطرد المركزي على centrifugations متسلسل (في سلسلة من زيادة السرعة) من قدم للمرة الأولى من قبل Pallade الخليط الأنسجة وزملاء العمل منذ ما يقرب من 70 عاما 1. ومفروم النسيج أولا باستخدام مقص ويتجانس الخليط ميكانيكيا في الخالط الزجاج مع مدقة فضفاضة. بعد ذلك يتم طرد جناسة في السرعة المنخفضة والناتجة بيليه الذي يحتوي الأنسجة دون انقطاع، الخلويةيتم تجاهل الحطام ونوى. ثم، يتم طرد طاف عدة مرات بسرعة عالية ويتم جمع جزء المخصب الميتوكوندريا. مزايا الطريقة التفاضلية الطرد المركزي لعزل الميتوكوندريا هي: ط) طريقة سريعة والميتوكوندريا يمكن أن تكون معزولة داخل 1-1.5 ساعة (يجب أن يتم تنفيذ التجارب في الجهاز التنفسي في أسرع وقت ممكن)؛ ب) أنها غير مكلفة. والثالث) أنه فعال جدا والميتوكوندريا التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التفاضلي والنقي بما فيه الكفاية لفحوصات قياس التنفس. عيوب طريقة الطرد المركزي المغاير لعزل الميتوكوندريا هي التي ط) الميتوكوندريا قد يحصل تلف وفكت خلال التجانس. ب) يمكن حلها تلوث الميتوكوندريا مع المكونات الخلوية الأخرى (بمزيد من غسل بيليه الميتوكوندريا مع الخطوات الطرد المركزي الإضافية)؛ ج) إمكانية اختيار القطعان الميتوكوندريا مختلفة، على سبيل المثال، خلال centrifugations التفاضلية الخطوات، معهد ماساتشوستس للتكنولوجياochondria مع انخفاض كثافة يمكن استبعاد 7؛ والرابع) يمكن قياس الخلوية المحيطة مفقود وإلا التنفس الأقصى النظري الميتوكوندريا. طريقة أخرى لعزل الميتوكوندريا لفحوصات قياس التنفس هو التدرج الكثافة الطرد المركزي 2. في هذه التقنية، والطبقات استخراج الأنسجة على حل السكروز أو التدرج Percoll (مع ارتفاع الكثافة في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي) وطرد في سرعة معينة، مما تسبب في الميتوكوندريا أن تكون معزولة من المكونات الخلوية الأخرى وفقا لمن الكثافة. وكثيرا ما يستخدم هذا الأسلوب لعزل الميتوكوندريا الدماغ مع تلوث منخفضة جدا من synaptosomes. ومع ذلك، الميتوكوندريا كبد الفئران معزولة بسبب كثافة التدرج الطرد المركزي الملوثة للغاية مع العضيات الخلوية الأخرى 3. واحد من أوجه القصور في هذه الطريقة هو أن التدرج السكروز موجودة في أنبوب الطرد المركزي قد تمزق ذلكلي الميتوكوندريا (صدمة التناضحي).
اعتمادا على نوع من الأنسجة. هناك بعض العوامل الهامة التي يجب مراعاتها لعزل الميتوكوندريا سليمة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. ضرورة الأولى هي التجانس الأنسجة بطريقة لطيفة. الأنسجة الرخوة مثل الكلى والدماغ والكبد تتطلب القوى الميكانيكية طيف تطبيقها خلال التجانس. وهذا يتناقض مع الأنسجة الصلبة مثل عضلة القلب والهيكل العظمي التي تتطلب القوى الميكانيكية أقوى من ذلك بكثير. عادة ما يتم التعامل مع الأنسجة المفروم مع بروتين قبل تجانس لتليين الأنسجة. وينبغي لجميع المخازن التي استخدمت خلال التجانس والطرد المركزي تكون الجليد البرد ويكون الرقم الهيدروجيني الفسيولوجية ذات الصلة مع القوة الأيونية وناضح متوافقة مع العصارة الخلوية 4، 5.
واحدة من مزايا الدراسة الطاقة الحيوية الميتوكوندريا المعزولة هو أن أغشية البلازما الخلوية لا تحتاج إلى أن تكون permeabilized مع المنظفات مثل ديجيتونين أو سابونين 4 و 6، والتي قد تؤثر سلبا على الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي. ميزة أخرى من الميتوكوندريا المعزولة هي غياب العوامل عصاري خلوي الأخرى، والتي قد تتداخل مع تحليل لوظائف الميتوكوندريا مثل استهلاك الأوكسجين. مساوئ استخدام الميتوكوندريا المعزولة هي اختيار المحتملة لبعض السكان الميتوكوندريا خلال الخطوات الطرد المركزي، والأضرار التي لحقت الميتوكوندريا خلال التجانس، وشرط لكميات عالية من العينات البيولوجية من أجل الحصول على محصول جيد من الميتوكوندريا معزولة 7 و 8.
بعد إجراء العزل، ومعدلات التنفس المجمعات الميتوكوندريا I-، ثانيا ورابعا-تعتمد (الدول 2 و 3 و 4) والمحدد باستخدام عالية الدقة قياس التنفس. لالمعقدة يحركها أنا التنفس، الغلوتاماتومالات وأضاف يليه ثنائي فسفات الأدينوزين (ADP). للتنفس معقدة يحركها الثاني، وأضاف تليها السكسينات من ADP. لالمعقدة يحركها الرابع التنفس، أسكوربات وtetramethylphenylendiamine (TMPD) تضاف تليها ADP 9، 10، 11، 12. تشير الدولة 2 إلى استهلاك الأكسجين في وجود ركائز وحدها. تشير الدولة 3 إلى استهلاك الأكسجين في وجود ركائز وشرطة أبوظبي. تشير الدولة 4 إلى استهلاك الأوكسجين بعد نضوب ADP. نسبة سيطرة الجهاز التنفسي (RCR) هو مؤشر اقتران إنتاج ATP استهلاك الأوكسجين ويتم حساب النسبة بين الدولة 3 و 4 الدولة 13 و 15.
باختصار، نحن تصف بروتوكول لعزل الميتوكوندريا العضلات الهيكلية الوظيفية وسليمة عن طريق الطرد المركزي التفاضلي واستخدام هذه mitochon معزولةdria للدراسات الفنية والطاقة البيولوجية مثل عالية الدقة قياس التنفس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتم أخذ خزعة العضلات رباعية الرؤوس من الخنازير مخدرة، والتي يتم عزل الميتوكوندريا بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. يستخدم الخنزير بعد ذلك لتجربة أخرى. يتم تنفيذ هذه الدراسة وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام حيوانات التجارب وبموافقة لجنة رعاية الحيوان في كانتون برن، سويسرا.
1. التجانس العضلات والهيكل العظمي والميتوكوندريا العزلة
- المكوس 5-10 عينة ز العضلة الرباعية الرؤوس من الخنازير مخدرة. في مقايسة الحالي، استخدم العضلات والهيكل العظمي الخنازير. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول أن تستخدم لعزل الميتوكوندريا من الأنواع الأخرى (على سبيل المثال، الفئران، والفئران، والبشرية، وغيرها).
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة من قبل أخصائي طبي من ذوي الخبرة في جراحة.- الخنازير وقور مع الكيتامين العضلي (20 ملغ / كلغ) وزيلازين (2 ملغ / كلغ)، قبل أن يسببها التخدير مع البينيةميدازولام وريدي (0.5 ملغ / كغ، بالإضافة إلى الأتروبين 0.02 مغ / كغ). الحفاظ على التخدير مع ضخ مستمر في الوريد من البروبوفول (4-8 ملغ / كغ لكل ساعة)، والفنتانيل (30 ميكروغرام / كغ في ح) أثناء الجراحة.
- على الفور تزج عينة الأنسجة في كوب تحتوي على 20 مل من العازلة العزلة الميتوكوندريا المثلج (الجدول 1).
ملاحظة: المخازن المؤقتة المستخدمة خلال التجانس، وينبغي أن يكون centrifugations الجليد الباردة ولها درجة الحموضة الفسيولوجية ذات الصلة مع القوة الأيونية وناضح متوافقة مع العصارة الخلوية. - وزن عينات الأنسجة في الدورق على توازن tared التحليلي. الفارغة التوازن مع كوب تحتوي على 20 مل من العازلة العزلة.
- ضع الكأس على دلو الجليد.
ملاحظة: إجراء كافة الخطوات المقبلة لإجراء التجانس في درجة حرارة دلو الجليد والحفاظ على جميع المخازن على دلو الجليد. - فرم العضلات والهيكل العظمي في الدورق (الحفاظ على الجليد) الى قطع صغيرة 1-2 ملم لمدة 3-4 دقيقة باستخدام sciss غرامةأملاح الإماهة الفموية.
- شطف الأنسجة المفروم في الكأس مرتين مع الثلج عازلة العزلة الباردة (20 مل كل خطوة الغسيل).
- تعليق الأنسجة في 10 مجلدا من المخزن المؤقت العزلة في وزن الأنسجة (ز) تحتوي على 5 ملغ البروتيني / ز الأنسجة.
- ضع الدورق في حمام الثلج على محرك مغناطيسي ويحرك المزيج لمدة 10 دقيقة.
- تمييع تعليق في الدورق مع 10 مجلدات إضافية من المخزن المؤقت العزلة في وزن الأنسجة (ز) تستكمل مع 0.2٪ (وزن / حجم) الزلال منزوع الدهن المصل البقري (BSA).
- صب كل من المخزن المؤقت العزلة تستكمل مع 0.2٪ BSA وشطف الأنسجة في الكأس مرتين مع الثلج عازلة العزلة الباردة تستكمل مع 0.2٪ BSA (20 مل كل خطوة الغسيل).
- Resuspend والأنسجة في 10 مجلدات من العازلة العزلة في وزن الأنسجة (ز) تستكمل مع 0.2٪ مع منزوع الدهن BSA.
- تجانس الأنسجة مع الخالط الزجاج شبه التلقائي (حافظ على الجليد) مع مدقة فضفاضة (10 السكتات الدماغية).
ملاحظة: Homogenizالبريد الأنسجة دائما بنفس الطريقة (نفس عدد من السكتات الدماغية، على سبيل المثال، 10 السكتات الدماغية). وهناك عدد أكبر من السكتات الدماغية قد يؤدي إلى تلف وفك الارتباط بين الميتوكوندريا. ويفضل، تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الآلي. يدويا (وذاتي) عينات الأنسجة المتجانس في المجانسة الزجاج قد ينتج نوعيات مختلفة من الميتوكوندريا المعزولة. - الطرد المركزي النسيج المتجانس في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 10000 ز س.
ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الخطوات الطرد المركزي في أجهزة الطرد المركزي مع الدوارات زاوية ثابتة. - تجاهل طاف باستخدام الماصة المصلية و resuspend بيليه في استكمال BSA-العزلة المتوسطة الجليد الباردة (10 مل / ز الأنسجة).
- الطرد المركزي تعليق في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على 350 ز س.
- حجز طاف باستخدام الماصة المصلية وتجاهل بيليه (الحطام الخلوي).
- تصفية طاف في الدورق (حافظ على الجليد) من خلال طبقتين من الشاش (17 المواضيع / سم 2) لإزالة الانقاض الخليةهو.
- الطرد المركزي تعليق تصفيتها في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 7000 ز س.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه الميتوكوندريا الخام في المنطقة العازلة العزلة (5 مل / ز الأنسجة) تستكمل مع 0.2٪ (وزن / حجم) BSA والطرد المركزي تعليق في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 7000 ز س.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه الميتوكوندريا الخام في غسل العازلة (الجدول 1). الطرد المركزي تعليق مرة أخرى عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 7000 ز س.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه الميتوكوندريا الخام في غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي تعليق مرة أخرى عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 7000 ز س.
- تجاهل طاف و resuspend بيليه الميتوكوندريا الخام في 1.0 مل من غسل العازلة.
- تحديد تركيز البروتين لتعليق الميتوكوندريا والحفاظ على تعليق الميتوكوندريا مركزة على الجليد.
ويمكن قياس تركيز البروتين باستخدام أي أسلوب قياسي: ملاحظة. - فقط قبللقياس التنفس المقايسات، resuspend وتعليق الميتوكوندريا في المخزن المؤقت التنفس إلى تركيز النهائي من 0.4 ملغ / مل بروتين الميتوكوندريا.
2. عالية الدقة قياس التنفس
- ماصة 2.1 مل من العازلة التنفس (الجدول 1) 16 في غرفة oxygraph عالية الدقة ويقلب المخزن المؤقت باستمرار باستخدام شريط التحريك المغناطيسي موجودة في الغرفة (700 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة حتى إشارة مستقر تدفق الأكسجين ل يتم الحصول على الأوكسجين الاستشعار البولاروجرافي.
ملاحظة: الأقطاب الأكسجين البولاروجرافي داخل كل غرفة oxygraph قياس تركيز الأكسجين وحساب استهلاك الأوكسجين (تدفق) في كل غرفة. يتم عرض تركيز الأكسجين ومعدلات استهلاك الأوكسجين (تدفق) في الوقت الحقيقي على الانترنت في جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج للحصول على البيانات وتحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل ضمان الحصول على نتائج دقيقة وموثوق بها، وينبغي أن يكون التصحيح خلفية الأكسجين أساسييقوم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
يضاف بدقة 2.1 مل من العازلة التنفس في غرفة للمعايرة وحدة تخزين غرفة النهائي من 2.0 مل بعد إغلاق سدادات: ملاحظة. - إجراء معايرة الهواء من الأوكسجين الاستشعار البولاروجرافي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة 17.
ملاحظة: أثناء معايرة الهواء، مع مرحلة الغاز الحاضر، فإن تركيز الأكسجين وسائل الإعلام تتوازن بناء على أمر من 15-20 دقيقة. تبعا لدرجة الحرارة والضغط الجوي، والذوبان من تركيز وسائل الإعلام -oxygen يمكن حساب. - بعد معايرة الهواء، نضح في والمتوسطة التنفس من غرفة oxygraph وإضافة 2.1 مل من تعليق الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ / مل بروتين الميتوكوندريا) من الخطوة 1.24 إلى غرفة للoxygraph.
ملاحظة: حجم المخزن المؤقت التنفس يعتمد على أداة إعداد والشركة المصنعة. عالية الدقة قياس التنفس، 2.1 مل من بو التنفسوأضاف ffer الى غرفة للمعايرة وحدة تخزين غرفة النهائي من 2.0 مل بعد إغلاق سدادات. - إغلاق غرفة oxygraph ذلك بإدخال سدادة.
- تحريك تعليق الميتوكوندريا باستمرار باستخدام شريط مغناطيسي اثارة موجودة في الغرفة (700 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية، والتنفس الخلوي رقم قياسي في الأساس لمدة 3-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
ملاحظة: تركيز الأكسجين والأكسجين إشارة تدفق يتم عرض في الوقت الحقيقي على الانترنت في جهاز الكمبيوتر باستخدام برنامج للحصول على البيانات وتحليل 17. - بعد ذلك، وضخ ركائز ومثبطات للتنفس الميتوكوندريا من خلال الموانئ حقن التيتانيوم من سدادات باستخدام البروتوكولات القياسية التالية.
3. مجمع التنفس نعتمد-I
- إعداد غرفة oxygraph التي تحتوي على تعليق الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 2،1-2،5 وبانتظار إشارة مستقرة.
- ضخ 12.5 ميكرولتر من 0.8 M مالات (5 ملي تركيز النهائي) و 10 ميكرولتر من 2 M الغلوتامات (10 ملي تركيز النهائي) في غرفة oxygraph تحتوي على تعليق الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ / مل) عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة غرفة و تسجيل التنفس الخلوي لمدة 3-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الحقن في الخطوات التالية من خلال الموانئ حقن التيتانيوم من سدادات باستخدام الحقن. - ضخ 10 ميكرولتر من 0.05 M ADP (0.25 ملم) في غرفة oxygraph عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة غرفة وتسجيل التنفس الميتوكوندريا حتى الزيادات إشارة الأكسجين تدفق، ثم تنخفض وتستقر (3-5 دقائق).
ملاحظة: هضبة التنفس بعد إضافة ADP إلى أن تركيز ADP كانت عالية وتشبع. اعتمادا على كمية من الميتوكوندريا تستخدم أثناء التنفس، ينبغي معاير تركيز ADPلمستقر الدولة 3 استهلاك الأوكسجين (التنفس القصوى). وإضافة ADP إلى تعليق الميتوكوندريا تحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين وإشارة الأكسجين تدفق سيزيد (الدولة 3 التنفس). بعد يتم استهلاك ADP، فإن إشارة الأكسجين تدفق نقصان (الدولة 4 التنفس).
4. مجمع التنفس الثانية التي تعتمد على
- إعداد غرفة oxygraph تحتوي على تعليق الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 2،1-2،5 وبانتظار إشارة مستقرة.
- حقن 2 ميكرولتر من 0.2 ملي روتينون (0.2 ميكرومتر) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة الغرفة باستخدام حقنة وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 3-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
ملاحظة: روتنون هو السم الخطير ويمكن أن يكون لها تأثير كبير على صحة الإنسان. - ضخ 20 ميكرولتر من 1 M السكسينات (10 ملم) في الفصل oxygraphويتحقق العنبر والتنفس الميتوكوندريا قياسي لمدة 3-5 دقائق حتى مستقر إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- ضخ 10 ميكرولتر من 0.05 M ADP (0.25 ملم) في غرفة oxygraph عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة غرفة وتسجيل التنفس الخلوي حتى الزيادات إشارة الأكسجين تدفق، وتستقر، ثم تنخفض وتستقر (3-5 دقائق).
ملاحظة: إضافة ADP إلى تعليق الميتوكوندريا تحفز زيادة في استهلاك الأوكسجين وإشارة الأكسجين تدفق سيزيد (الدولة 3 التنفس). بعد يتم استهلاك ADP، فإن إشارة الأكسجين تدفق نقصان (الدولة 4 التنفس).
5. مجمع التنفس التي تعتمد على الرابع
- إعداد غرفة oxygraph تحتوي على تعليق الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 2،1-2،5 من البروتوكول وبانتظار إشارة مستقرة.
- ثم ضخ 2.5 ميكرولتر من 0.8 ملي أسكوربات (1 ملم). بعد ذلك مباشرة ضخ 2.5 ميكرولتر من 0.2M TMPD (0.25 مم) و 10 ميكرولتر من 0.05 M ADP (0.25 ملم) في غرفة oxygraph والتنفس الخلوي رقم قياسي حتى الأكسجين زيادات إشارة تدفق واستقرار (3-5 دقائق).
- وأخيرا حقن 10 ميكرولتر من 1 M أزيد الصوديوم (5 ملم) 'تنبيه' إلى غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي حتى انخفاض إشارة الأكسجين تدفق واستقرار.
ملاحظة: أزيد الصوديوم هو السم الخطير وقد يكون لها تأثير كبير على صحة الإنسان.
6. السيتوكروم C اختبار
- إعداد غرفة oxygraph تحتوي على تعليق الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ / مل) بعد الإجراء هو موضح في الخطوات 2،1-2،5 من البروتوكول وبانتظار إشارة مستقرة.
- ضخ 12.5 ميكرولتر من 0.8 M مالات (5 ملي تركيز النهائي) و 10 ميكرولتر من 2 M الغلوتامات (10 ملي تركيز النهائي) في غرفة oxygraph تحتوي على تعليق الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ / مل) عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة الغرفةوسجل التنفس الخلوي لمدة 3-5 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
- ضخ 10 ميكرولتر من 0.5 M ADP (2.5 ملم) في غرفة oxygraph عن طريق ميناء حقن التيتانيوم سدادة غرفة والتنفس الميتوكوندريا قياسي حتى الزيادات إشارة الأكسجين تدفق، ثم تنخفض وتستقر (3-5 دقائق).
- وأخيرا، حقن 5 ميكرولتر من 4 مم السيتوكروم ج (10 ميكرومتر) في غرفة oxygraph وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5 دقائق حتى يتم التوصل إلى مستقرة إشارة الأكسجين تغير مستمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مجمع I-تعتمد التنفس
يتم تحديد أسعار معزولة الميتوكوندريا المعقدة نعتمد-I الجهاز التنفسي (الدول 2 و 3 و 4) استخدام عالية الدقة قياس التنفس (الشكل 1، رسم تخطيطي تمثيلي). ركائز أنا معقدة الميتوكوندريا، الغلوتامات ومالات، وأضاف تليها إضافة ADP. تشير الدولة 2 إلى استهلاك الأكسجين في وجود ركائز وحدها. تشير الدولة 3 إلى استهلاك الأكسجين في وجود ركائز وشرطة أبوظبي. تشير الدولة 4 إلى استهلاك الأوكسجين بعد نضوب ADP. RCR هو مؤشر للاقتران استهلاك الأكسجين لإنتاج ATP ويتم احتساب النسبة بين الدولة 3 و 4. الدولة كما هو مبين في الشكل رقم 1، على إضافة ADP، ويزيد من معدل التنفس الميتوكوندريا فورا (الدولة 3 التنفس)، و ثم يقلل (الدولة 4 التنفس) إلى مستويات جدا الصورةimilar إلى أن الدولة 2. وهذا يدل على RCR عالية ونزاهة الميتوكوندريا وحفظت جيدا أثناء إجراء العزل. الرقم 2 هو الرسم التمثيلي للقياس من انخفاض معدل التنفس الدولة 3 و RCR، مع ارتفاع حالة 4 معدل التنفس، مشيرا إلى العزلة الميتوكوندريا غير لائقة وغير الناجحة. معدل التنفس العالي في الدولة 4 هو مؤشر على بروتون الميتوكوندريا التسرب 15.
الشكل 1: العزلة الميتوكوندريا الناجحة: الميتوكوندريا النزاهة والحفاظ عليها بشكل جيد خلال إجراء العزل. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام الغلوتامات ومالات بمثابة ركائز (معقد التنفس نعتمد-I). يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). وأوكسييقلل تركيز جنرال بمرور الوقت مع استخدام الميتوكوندريا عزل الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (SX ملغم بروتين الميتوكوندريا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العزلة الميتوكوندريا فاشلة: الميتوكوندريا النزاهة لم يتم الحفاظ عليها جيدا أثناء إجراء العزل مشيرا إلى العزلة الميتوكوندريا غير لائقة. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام الغلوتامات ومالات بمثابة ركائز (معقد التنفس نعتمد-I). يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). يقلل تركيز الأكسجين مع مرور الوقت كما تستخدم الميتوكوندريا عزل التواجدلو الأكسجين. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (SX ملغم بروتين الميتوكوندريا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مجمع التنفس التي تعتمد على الثاني
يتم تحديد معزولة مجمع الميتوكوندريا وتيرة التنفس II-تعتمد (الدول 2 و 3 و 4) استخدام عالية الدقة قياس التنفس (الشكل 3، رسم تخطيطي تمثيلي). لهذا الاختبار، وأنا مجمع الميتوكوندريا هو تحول عن طريق إضافة روتينون، ثم السكسينات (الركيزة المعقدة II) يضاف تليها ADP. ويبين الشكل 3 أنه عند إضافة ADP، ويزيد من التنفس الميتوكوندريا على الفور، ويقلل من ثم إلى مستويات مشابهة جدا لتلك الدولة 2، مشيرا إلى الميتوكوندريا إلى جانب جيدا والتيسلامة الميتوكوندريا وحفظت جيدا خلال إجراء العزل. قيمة RCR المحسوبة لهذه التجربة النموذجية هي 4.23، وهو ما يتفق وثيق مع القيم هو مبين في الأدبيات المتوفرة 10، 11، 23). الرقم 4 هو مخطط تمثيلي لقياس انخفاض معدل التنفس الدولة 3 و RCR، مع ارتفاع معدل التنفس الدولة 4 يشير إلى عزلة غير ملائمة.
الرقم 3: العزلة الميتوكوندريا الناجحة: الميتوكوندريا النزاهة والحفاظ عليها بشكل جيد خلال إجراء العزل. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام السكسينات كما الركيزة (مجمع التنفس II-التابعة). يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأوكسجين (منحدرتركيز الأكسجين). يقلل تركيز الأكسجين مع مرور الوقت كما تستخدم الميتوكوندريا عزل الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (SX ملغم بروتين الميتوكوندريا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: العزلة الميتوكوندريا فاشلة: الميتوكوندريا النزاهة لم يتم الحفاظ عليها جيدا أثناء إجراء العزل مشيرا إلى عزلة غير ملائمة. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام السكسينات كما الركيزة (مجمع التنفس II-التابعة). يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). يقلل تركيز الأكسجين مع مرور الوقت كما mitoc معزولةhondria استخدام الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (SX ملغم بروتين الميتوكوندريا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
مجمع الرابع التي تعتمد على التنفس
معدلات معزولة الميتوكوندريا المعقدة التي تعتمد على الرابع التنفسية (الدول 2، 3) والمحدد باستخدام عالية الدقة قياس التنفس (الشكل 5، رسم تخطيطي تمثيلي). لهذا أسكوربات فحص / تضاف TMPD وشرطة أبوظبي، تليها أزيد الصوديوم لمنع الرابع معقدة.
ويفسر الفرق بين استهلاك الأوكسجين قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم كما الحقيقي التنفس الرابع معقدة. الرقم 5 هو مخطط تمثيلي لقياس آثافةement من ارتفاع معدل تعتمد على الرابع معقدة الدولة 3 التنفس مما يدل على أن سلامة الميتوكوندريا والحفاظ عليها جيدا أثناء إجراء العزل. في المقابل، الشكل (6) هو مخطط تمثيلي لقياس حالة انخفاض 3 يشير إلى عزلة غير ملائمة.
الرقم 5: العزلة الميتوكوندريا الناجحة: الميتوكوندريا النزاهة والحفاظ عليها بشكل جيد خلال إجراء العزل. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام أسكوربات / TMPD كما الركيزة (التنفس معقدة تعتمد-IV). يتم تفسير مجمع الرابع التنفس (الدولة 3) عن طريق طرح استهلاك الأوكسجين قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم. يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). يقلل تركيز الأكسجين مع مرور الوقت كما mitocho معزولةndria استخدام الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (SX ملغم بروتين الميتوكوندريا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: العزلة الميتوكوندريا فاشلة: الميتوكوندريا النزاهة لم يتم الحفاظ عليها جيدا أثناء إجراء العزل مشيرا إلى عزلة غير ملائمة. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام أسكوربات / TMPD كما الركيزة (التنفس معقدة تعتمد-IV). يتم تفسير مجمع الرابع التنفس (الدولة 3) عن طريق طرح استهلاك الأوكسجين قبل وبعد إضافة أزيد الصوديوم. يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). وبغية دراسته واقراره الأكسجينntration يقلل بمرور الوقت مع استخدام الميتوكوندريا عزل الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (SX ملغم بروتين الميتوكوندريا). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تقييم الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي باستخدام السيتوكروم ج
لتقييم جودة إعداد الميتوكوندريا، يتم تنفيذ اختبار السيتوكروم ج لتحديد الميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي، من خلال قياس التنفس الميتوكوندريا بعد إضافة لاحقة من الغلوتامات ومالات، ADP والسيتوكروم ج (ADP حفز مجمع الثانية التي تعتمد على الدولة 3 التنفس في بحضور السيتوكروم ج). كما هو مبين في الشكل 7، السيتوكروم ج لا يعزز المعقدة نعتمد-I الدولة 3 إعادة spiration من الميتوكوندريا المعزولة، مشيرا إلى أنه لا توجد خسائر في السيتوكروم ج من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا والحفاظ على السلامة الميتوكوندريا.
الرقم 7: السيتوكروم ج لا يعزز التنفس من الميتوكوندريا المعزولة: الحفاظ على السلامة الميتوكوندريا جيدا خلال إجراء العزل. اقتفاء أثر من عالية الدقة قياس التنفس باستخدام الغلوتامات / مالات كما الركيزة (معقد التنفس نعتمد-I). يمثل الخط الأزرق تركيز الأكسجين. ويمثل الخط الأحمر تدفق الأكسجين (المنحدر من تركيز الأكسجين). يقلل تركيز الأكسجين مع مرور الوقت كما تستخدم الميتوكوندريا عزل الأكسجين المتاحة. وأعرب عن استهلاك الأوكسجين كما بمول / (SX ملغم بروتين الميتوكوندريا).م / الملفات / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عازلة عزل الميتوكوندريا | |
| المواد الكيميائية | تركيز |
| بوكل | 100 ملي |
| MgSO 4 | 10 ملي |
| حمض السلفونيك morpholinopropane (اجتماعات الأطراف) | 50 ملي |
| حمض ethylenedinitrilotetraacetic (EGTA) | 1.0 ملم |
| ATP | 1.1 ملم |
| ودرجة الحموضة 7.4 | |
| غسل العازلة الميتوكوندريا | |
| المواد الكيميائية | تركيز |
| بوكل | 100 ملي |
| اجتماعات الأطراف | 50 ملي |
| EGTA | 0.5 ملم |
| ودرجة الحموضة 7.4 | |
| عازلة التنفس الميتوكوندريا 16 | |
| المواد الكيميائية | تركيز |
| سكر القصب | 110 ملي |
| EGTA | 0.5 ملم |
| MgCl 2 | 3.0 ملم |
| بوكل | 80 ملي |
| K-lactobionate | 60 ملي |
| KH 2 PO 4 | 10 ملي |
| التورين | 20 ملي |
| HEPES 20 ملي | |
| BSA | 1.0 جم / لتر |
| الرقم الهيدروجيني 7.1 | |
الجدول 1: تكوين مخازن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة وصفنا بروتوكول لعزل ذات جودة عالية، سليمة والمقرونة بإحكام الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي بواسطة الطرد المركزي التفاضلي والتي يمكن استخدامها للدراسات وظيفية مثل عالية الدقة قياس التنفس.
من أجل عزل الميتوكوندريا سليمة والمقرونة بإحكام، هناك بعض النقاط الهامة التي يجب بحثها في هذا البروتوكول. بعد حصاد الأنسجة العظمية، وينبغي أن تكون مغمورة على الفور في المخزن العزلة الميتوكوندريا الجليد الباردة. يجب أن تتم جميع الخطوات الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، وتعليق الميتوكوندريا يجب أن تبقى دائما على الجليد خلال العزلة. وينبغي أن يتم إجراء العزل في أسرع وقت ممكن. يجب طرد جناسة في أنابيب الطرد المركزي خالية من المنظفات نظيفة. في نهاية هذا الإجراء، يجب أن تبقى تعليق الميتوكوندريا المركز وأن تضعف فقط قبل قياس التنفس. منذ يتم التعبير عن بيانات قياس التنفس كما بمول في المؤسسة العامة الثانيةص مليغرام من البروتين الميتوكوندريا، فمن المهم استخدام أسلوب جيد لقياس دقيق لتركيز البروتين الميتوكوندريا بعد العزلة.
في بعض إجراءات العزل الميتوكوندريا، فإنه قد يحدث أن الميتوكوندريا هي فكت أو لا تستهلك الأكسجين بشكل صحيح باستخدام عالية الدقة قياس التنفس. للتغلب على هذه المشاكل، وينبغي دائما أن المتجانس الأنسجة بنفس الطريقة (نفس عدد من السكتات الدماغية) باستخدام الخالط مع مدقة فضفاضة (الخطوة 1.12). هنا، ونحن دائما تجانس الأنسجة العضلية الهيكلية باستخدام الخالط الآلي مع 10 السكتات الدماغية. وهناك عدد أكبر من السكتات الدماغية قد يؤدي إلى تلف وفك الارتباط بين الميتوكوندريا. يدويا (وذاتي) عينات الأنسجة المتجانس في المجانسة الزجاج قد ينتج نوعيات مختلفة من الميتوكوندريا المعزولة. تجميد الميتوكوندريا أيضا قد يؤدي إلى الميتوكوندريا وفكت واحد يجب التأكد من أن تتم centrifugations في 4 درجات مئوية، وليس أقل هذه الشركة المصرية للاتصالاتmperature. سلامة الميتوكوندريا قد تكون معرضة للخطر أيضا إذا كان الرقم الهيدروجيني للمحاليل غير صحيحة أو أنابيب الطرد المركزي ليست نظيفة. ينبغي للمرء التأكد من أن أنابيب الطرد المركزي خالية من المنظفات وغسلها بشكل صحيح.
أحد العوامل الهامة الأولى التي سينظر فيها خلال العزلة هو التجانس الأنسجة بطريقة لطيفة. الأنسجة الرخوة تتطلب القوى الميكانيكية طيف تطبيقها خلال التجانس، في حين أن الأنسجة الصلبة تتطلب القوى الميكانيكية أقوى من ذلك بكثير. يجب مخازن تستخدم خلال التجانس وcentrifugations تكون الجليد البرد ويكون الرقم الهيدروجيني الفسيولوجية ذات الصلة مع القوة الأيونية وناضح متوافقة مع العصارة الخلوية. لالأنسجة الصلبة مثل العضلات والهيكل العظمي، بعد تجانس الميكانيكية، البروتياز مثل التربسين يمكن أن تضاف إلى مزيد تفصيل الأنسجة 4، 5.
بعض القيود المفروضة على الميتوكوندريا معزولة، على أساس دالطرد المركزي ifferential هي ط) الميتوكوندريا ربما تضررت خلال التجانس والعزلة الإجراء 19، ثانيا) كميات كبيرة من العينات الأنسجة اللازمة لعزل الميتوكوندريا، ج) فقدان والتعديلات الممكنة في بعض الإلكترون الميتوكوندريا المجمعات سلسلة النقل مفارز خلال التجانس و الطرد المركزي الخطوات 18، والرابع) زيادة إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية خلال التجانس والطرد المركزي الخطوات، التي قد تتداخل مع وظيفة الميتوكوندريا 18. مزايا تجانس dounce وطريقة الطرد المركزي التفاضلي لعزل الميتوكوندريا الخام للتجارب الجهاز التنفسي فيما يتعلق بأساليب القائمة مثل التدرج الكثافة الطرد المركزي 20 هي أن طريقة سريعة ويتم عزل الميتوكوندريا في غضون فترة قصيرة من الزمن. لذلك التجارب الجهاز التنفسي يمكن أن يؤديها في 1ح. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الإجراء غير مكلفة وفعالة جدا والميتوكوندريا التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي التفاضلي يمكن أن تستخدم لفحوصات قياس التنفس. التحقيق في استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا باستخدام الميتوكوندريا المعزولة يقدم العديد من المزايا أكثر من الألياف permeabilized أو الخلايا: لا تدخل كبير مع البروتينات عصاري خلوي التي قد تتداخل مع وظيفة الميتوكوندريا والطاقة الحيوية. لا حاجة لpermeabilization الخلوية، وركائز المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا يمكن أن تضاف مباشرة إلى الميتوكوندريا المعزولة.
إحدى الطرق البديلة لقياس العضلات والهيكل العظمي التنفس الميتوكوندريا هو استخدام permeabilized ألياف العضلات 9. بعض من مزايا الألياف العضلية permeabilized على الميتوكوندريا المعزولة هي ط) لا حاجة لخطوة التجانس الميكانيكية و، ب) هناك حاجة إلى كميات صغيرة جدا من الأنسجة (قليل ملغ) لفحوصات قياس التنفس. وعيب عالألياف العضلية ermeabilized هو أقل انتشار الأوكسجين إلى الميتوكوندريا في حزمة من الألياف. يتطلب هذا التقييد نشر كميات كبيرة من شرطة أبوظبي خلال فحوصات قياس التنفس. طريقة أخرى بديلة هو استخدام الخليط النسيج كله 22، وهي طريقة سريعة جدا و لا يتطلب خطوات الطرد المركزي التفاضلية لعزل الميتوكوندريا. استخدام جناسة الأنسجة كله قد يمنع فقدان بعض الميتوكوندريا خلال عزلتهم، ولكن قد تكون هناك عوامل أخرى عصاري خلوي الحالية، والتي قد تتداخل مع تحليل لوظائف الميتوكوندريا مثل استهلاك الأوكسجين.
بعد اتقان الطرد المركزي التفاضلي لعزل الميتوكوندريا الخام لفحوصات الجهاز التنفسي، وتطبيقها في المستقبل هو للتحقيق في قدرات الجهاز التنفسي الميتوكوندريا المعزولة عبر تقنيات الناشئة مثل استخدام الغشاء الخارجي الميتوكوندريا مكافحة TOM22 (ترانسلوكاز من الخارجي الميتوكوندريا غشاء 22 homolog) الأجسام المضادة couplحبات مغناطيسية إد 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
