Introduction
Mitokondrie bioenergetik og respiratoriske kapacitet kan studeres ikke blot i permeabiliserede celler eller fibre, men også i isolerede mitokondrier. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en protokol til at isolere intakte skelet muskel mitokondrier bruger differential centrifugering i høj opløsning respirometri målinger.
For at isolere intakte mitokondrier for respirometri, vævet homogeniseres og mitokondrier isoleres ved en konventionel differential centrifugering metode. Den differentielle centrifugering Metoden er baseret på sekventielle centrifugeringer (i en serie af stigende hastighed) af vævshomogenisater blev først indført ved Pallade og medarbejdere næsten 70 år siden en. Vævet først hakket med en saks og homogeniseret mekanisk i en glashomogenisator med en løstsiddende pistil. Bagefter Homogenatet centrifugeres ved lav hastighed, og den resulterende pellet, der indeholder ubrudt væv, cellulæresnavs og kerner kasseres. Derefter supernatanten centrifugeret flere gange ved høj hastighed og det mitokondriske berigede fraktion opsamles. Fordelene ved differentialcentrifugering metode til isolering mitokondrier er, at: i) metoden er hurtig og mitokondrier kan isoleres inden 1-1,5 timer (bør udføres respiratoriske eksperimenter så hurtig som muligt); ii) den er billig; og iii) det er meget effektiv og de opnåede ved differential centrifugering mitokondrier er ren nok til respirometri analyser. Ulemperne ved differentialcentrifugering metode til at isolere mitokondrier er at i) mitokondrier kan blive beskadiget og frakoblet under homogenisering; ii) forurening af mitokondrier med andre cellulære bestanddele (kunne løses ved yderligere vask mitokondrie pellet med yderligere centrifugeringstrin); iii) muligheden for at vælge forskellige mitochondriale subpopulationer, f.eks under differentielle centrifugeringer trin, mitochondria med lavere tætte kan udelukkes 7; og iv) det mitokondriske cellulær omgivende mangler, og kun den teoretiske maksimale respiration kan måles. En anden fremgangsmåde til isolering mitokondrier for respirometri assays er densitetsgradientcentrifugering 2. Ved denne teknik er vævet ekstrakt overtrukket over en opløsning af saccharose eller en Percoll-gradient (med højere densitet ved bunden af centrifugerør) og centrifugeres med en bestemt hastighed, forårsager mitokondrier, der skal isoleres fra andre cellulære komponenter i henhold til deres tætheder. Denne metode anvendes ofte til at isolere hjernens mitokondrier med meget lav forurening fra synaptosomer. Imidlertid er de rottelever mitokondrier isoleret ved densitetsgradientcentrifugering stærkt forurenet med andre cellulære organeller 3. En af begrænsningerne ved denne fremgangsmåde er, at saccharosegradient stede i centrifugerør kan briste såmig mitokondrier (osmotisk chok).
Afhængigt af typen af væv; der er nogle vigtige faktorer at overveje til isolering af intakt mitokondrier ved differential centrifugering. Den første nødvendighed er at homogenisere væv på en skånsom måde. Blødt væv, såsom nyre, hjerne og lever kræver forsigtig mekanisk kræfter, der påføres under homogenisering. Dette står i modsætning til hårde væv, såsom hjerte- og skeletmuskulatur, der kræver meget stærkere mekaniske kræfter. Det hakkede væv er normalt behandlet med proteinase forud for homogeniseringen at blødgøre vævet. Alle puffere anvendt under homogenisering og centrifugering bør være iskold og har en fysiologisk relevant pH med en ionisk og osmotisk styrke kompatibel med cytosol 4, 5.
En af fordelene ved at studere isoleret mitokondrielle bioenergetik er, at cellulære plasmamembraner ikke behøver at være permeabilized med detergenter såsom digitonin eller saponin 4, 6, som kan kompromittere den mitokondriske ydre membran integritet. En anden fordel af det isolerede mitokondrier er fraværet af andre cytosoliske faktorer, som kan forstyrre analysen af de mitochondriale funktioner såsom iltforbrug. Ulemperne ved anvendelse af de isolerede mitokondrier er muligheden for at vælge bestemte mitokondriske populationer under centrifugeringstrin, skader på mitokondrier under homogenisering, og kravet om store mængder biologiske prøver for at opnå et godt udbytte af isolerede mitokondrier 7, 8.
Efter isolation procedure, de respiratoriske satser for mitokondrie komplekser I-, II- og IV-afhængige (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjælp af høj opløsning respirometri. For komplekse I-drevet respiration, glutamatog malat er tilsat efterfulgt af adenosindiphosphat (ADP). For komplekse II-drevet respiration, er succinat tilsat efterfulgt af ADP. For komplekse IV-drevet respiration, ascorbat og tetramethylphenylendiamine (TMPD) tilsættes efterfulgt af ADP 9, 10, 11, 12. Tilstand 2 vedrører konsum oxygen i nærvær af substrater alene. Tilstand 3 henviser til iltforbruget i nærvær af substrater og ADP. State 4 henviser til iltforbrug efter ADP udtynding. Den respiratoriske kontrol ratio (RCR) er et indeks af kobling for iltforbrug ATP produktion og er beregnet som forholdet mellem stat 3 og stat 4 13, 15.
Sammenfattende beskriver vi en protokol til at isolere funktionelle og intakte skeletmuskulatur mitokondrier ved differential centrifugering og bruge disse isolerede mitochonDRIA for funktionelle og bioenergetic undersøgelser såsom høj opløsning respirometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Quadriceps muskel biopsi er taget fra en bedøvet gris, hvorfra mitokondrier isoleres ved differentialcentrifugering. Grisen bliver brugt bagefter for et andet eksperiment. Undersøgelsen er udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og med godkendelse af Animal Care udvalg af Canton Bern, Schweiz.
1. Skeletal Muscle Homogenisering og Mitokondriel Isolation
- Excise 5-10 g quadriceps muskel eksemplar fra en bedøvet gris. I det foreliggende assay, bruge porcin skeletmuskel. Denne protokol kan også anvendes til isolering mitokondrier fra andre arter (f.eks, rotte, mus, menneske, osv.).
BEMÆRK: Dette trin udføres af en speciallæge med ekspertise i kirurgi.- Adstadige svin med intramuskulær ketamin (20 mg / kg) og xylazin (2 mg / kg), før anæstesi induceres med intravenøs midazolam (0,5 mg / kg, plus atropin 0,02 mg / kg). Vedligehold anæstesi med kontinuerlige intravenøse infusioner af propofol (4-8 mg / kg pr time) og fentanyl (30 pg / kg pr h) under kirurgi.
- Fordybe straks vævsprøven i et bægerglas indeholdende 20 ml iskold mitokondrisk isolation puffer (tabel 1).
BEMÆRK: Buffere anvendes under homogenisering og centrifugeringer bør være iskold og har en fysiologisk relevant pH med en ionisk og osmotisk styrke kompatibel med cytosol. - Afvejes vævsprøven i bægerglasset på en analytisk tareret balance. Tarere balance med bægerglas, der indeholder 20 ml isolation buffer.
- Bægerglasset anbringes på en isspand.
BEMÆRK: Udfør alle de næste skridt for den procedure, homogenisering ved isspand temperatur og holde alle buffere på isen spand. - Hakke skeletmuskulaturen i bægeret (holde på is) i 1-2 mm små stykker for 3-4 min med fin scissors.
- Skyl det hakkede væv i bægerglasset to gange med iskold isolation puffer (20 ml hver vasketrin).
- Suspender vævet i 10 volumener isolation buffer pr vævsvægt (g) indeholdende 5 mg protease / g væv.
- Anbring bægerglasset i et isbad på magnetomrøreren og omrør i 10 min.
- Suspensionen fortyndes i bægerglasset med yderligere 10 volumener isolation buffer pr vævsvægt (g) suppleret med 0,2% (vægt / volumen) fedtfrit bovint serumalbumin (BSA).
- Dekanteres alle isoleringen puffer suppleret med 0,2% BSA og skyl vævet i bægerglasset to gange med iskold isolation puffer suppleret med 0,2% BSA (20 ml af hver vasketrin).
- Resuspender vævet i 10 volumener isolation puffer pr vævsvægt (g) suppleret med 0,2% med affedtet BSA.
- Homogenisere vævet med en halvautomatisk glashomogenisator (holdt på is) med en løstsiddende pistil (10 slag).
BEMÆRK: Homogenize vævet altid på den samme måde (det samme antal slag, fx 10 slag). Et højere antal slag kan beskadige og afkoble mitokondrier. Fortrinsvis homogenisere vævet anvendelse af en automatiseret homogenisator. Manuelt (og subjektivt) homogeniserede vævsprøver i glas homogenisatorer kan udvise forskellige kvaliteter af isolerede mitokondrier. - Centrifuger homogeniserede væv ved 4 ° C i 10 minutter ved 10.000 x g.
BEMÆRK: udføres Alle centrifugeringstrin i centrifuger med fast vinkel rotorer. - Supernatanten kasseres under anvendelse af en serologisk pipette og pellet resuspenderes i BSA-suppleret iskoldt isolation medium (10 ml / g væv).
- Centrifuger suspensionen ved 4 ° C i 10 minutter ved 350 x g.
- Reserve supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette og kassér pillen (cellulært debris).
- Filtreres supernatanten i et bægerglas (holdt på is) gennem to lag gaze (17 tråde / cm2) for at fjerne celle Debrer.
- Centrifuger den filtrerede suspension ved 4 ° C i 10 minutter ved 7.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og resuspender rå mitochondrial pellet ved isoleringen buffer (5 ml / g væv) suppleret med 0,2% (vægt / volumen) BSA og centrifugeres suspensionen ved 4 ° C i 10 minutter ved 7.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og resuspender rå mitochondrial pellet i vaskebuffer (tabel 1). Centrifuger suspensionen igen ved 4 ° C i 10 minutter ved 7.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og resuspender rå mitochondrial pellet i vaskebuffer og centrifugeres suspensionen igen ved 4 ° C i 10 minutter ved 7.000 x g.
- Supernatanten fjernes, og resuspender rå mitochondrial pellet i 1,0 ml vaskebuffer.
- Bestem proteinkoncentration det mitokondrielle suspension og holde den koncentrerede mitokondrie suspension på is.
BEMÆRK: Proteinkoncentration kan måles ved hjælp af enhver standardfremgangsmåde. - lige førat respirometri assays, resuspender mitokondrie suspension i respiration buffer til en slutkoncentration på 0,4 mg / ml mitokondrie-protein.
2. Høj opløsning respirometri
- Pipetter 2,1 ml af respiration puffer (tabel 1) 16 i en høj opløsning oxygraph kammer og rør bufferen kontinuerligt under anvendelse af en magnetisk omrøringsstang stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C i 1 time, indtil et stabilt oxygen flux signal den polarografisk ilt sensoren er opnået.
BEMÆRK: polarografisk ilt elektroder inden for hver oxygraph kammer måle iltkoncentrationen og beregne iltforbrug (flux) inden for hver kammer. Koncentrationen af ilt og forbrug ilt satser (flux) vises real-time online i en computer ved hjælp af software til indsamling og analyse af data. Desuden for at sikre nøjagtige og pålidelige resultater, bør korrektion instrumental oxygen baggrund væreudført ifølge producentens anvisninger.
BEMÆRK: Præcist 2,1 ml af respiration puffer tilsættes til kammeret til kalibrering af et endeligt kammer volumen på 2,0 ml efter lukning propperne. - Udfør en luft kalibrering af polarografisk oxygensensor ifølge producentens protokoller 17.
BEMÆRK: Under luft kalibrering, med en gasfase til stede, vil koncentrationen medierne oxygen ækvilibrere i størrelsesordenen 15-20 min. Afhængigt af temperaturen, barometertryk, og opløseligheden af medier -Godt luftskifte koncentration kan beregnes. - Efter luftkalibrering, aspirere respiration medium fra oxygraph kammer og tilsæt 2,1 ml af isolerede mitokondrie suspension (0,4 mg / mL mitokondrie protein) fra trin 1,24 til et kammer i oxygraph.
BEMÆRK: Mængden af respiration buffer afhænger af instrumentet oprettet og producent. For høj opløsning respirometri, de 2,1 ml respiration buffer tilsættes ind i kammeret til kalibrering af et endeligt kammer volumen på 2,0 ml efter lukning propperne. - Luk oxygraph kammer ved indføring af proppen.
- Omrør mitokondrielle suspension kontinuerligt under anvendelse af en magnetisk omrøringsstang stede i kammeret (700 rpm) ved 37 ° C og optage cellulære respiration ved baseline i 3-5 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
BEMÆRK: Koncentrationen af ilt og ilt flux signal vises real-time online i en computer ved hjælp af software til indsamling og analyse 17 data. - Bagefter injicere substrater og inhibitorer for mitokondrie respiration gennem titanium injektion havne i propperne ved hjælp af følgende standard protokoller.
3. Kompleks I-afhængige Respiration
- Forbered en oxygraph kammer, der indeholder den isolerede mitokondrie suspension (0,4 mg / ml) efter den er beskrevet i trin 2.1-2.5 og procedurevente på et stabilt signal.
- Injicer 12.5 pi 0,8 M malat (5 mM slutkoncentration) og 10 pi 2 M glutamat (10 mM slutkoncentration) i oxygraph kammer indeholdende isolerede mitokondrie suspension (0,4 mg / ml) gennem titanium injektionsporten af kammeret prop og optage cellulære respiration i 3-5 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
BEMÆRK: Alle injektioner i følgende trin udføres gennem titanium injektion havne propper bruger sprøjter. - Injicer 10 pi 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammeret gennem titanium injektionsporten af kammeret prop og registrere mitokondrielle respiration indtil oxygen flux stiger, så aftager og stabiliserer (3-5 min).
BEMÆRK: plateau af respiration efter ADP tilføjelse viser, at ADP koncentration var høj og mættende. Afhængig af mængden af mitokondrier anvendes under respiration, bør ADP koncentration titreresfor en stabil tilstand 3 iltforbrug (maksimal respiration). Tilsætning af ADP til det mitokondrielle suspension vil inducere en stigning i oxygenforbrug og oxygen flux signalet vil stige (tilstand 3 respiration). Efter ADP forbruges, vil oxygen flux signalet falde (tilstand 4 respiration).
4. Kompleks II-afhængig Respiration
- Forbered en oxygraph kammer, der indeholder isolerede mitokondrie suspension (0,4 mg / ml) efter den er beskrevet i trin 2.1-2.5 og vente på et stabilt signal procedure.
- Injicer 2 pi 0,2 mM rotenon (0,2 uM) »PAS« i oxygraph kammeret gennem titanium injektionsporten af kammeret prop anvendelse af en sprøjte og registrere den cellulære respiration i 3-5 min, indtil der opnås en stabil oxygen flux signal.
BEMÆRK: Rotenone er en farlig gift og kan have en betydelig indvirkning på menneskers sundhed. - Injicer 20 pi 1 M succinat (10 mM) i oxygraph lmrav og optage mitokondriel respiration i 3-5 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
- Injicer 10 pi 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammeret gennem titanium injektionsporten af kammeret prop og optage cellulære respiration indtil oxygen flux stiger, stabiliserer, derefter aftager og stabiliserer (3-5 min).
BEMÆRK: Tilsætning af ADP til det mitokondrielle suspension vil inducere en stigning i oxygenforbrug og oxygen flux signalet vil stige (tilstand 3 respiration). Efter ADP forbruges, vil oxygen flux signalet falde (tilstand 4 respiration).
5. Kompleks IV-afhængig Respiration
- Forbered en oxygraph kammer, der indeholder isolerede mitokondrie suspension (0,4 mg / ml) efter den er beskrevet i trin 2.1 til 2.5 i protokollen og vente på et stabilt signal procedure.
- Derefter injiceres 2,5 pi 0,8 mM ascorbat (1 mM). Umiddelbart derefter injicere 2,5 pi på 0,2M TMPD (0,25 mM) og 10 pi 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration indtil oxygen flux signal stigninger og stabiliserer (3-5 min).
- Endelig injicere 10 pi 1 M natriumazid (5 mM) "ADVARSEL" ind i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration indtil signal aftager oxygen flux og stabiliserer.
BEMÆRK: Natriumazid er en farlig gift og kan have en betydelig indvirkning på menneskers sundhed.
6. Cytochrom C Test
- Forbered en oxygraph kammer, der indeholder isolerede mitokondrie suspension (0,4 mg / ml) efter den er beskrevet i trin 2.1 til 2.5 i protokollen og vente på et stabilt signal procedure.
- Injicer 12.5 pi 0,8 M malat (5 mM slutkoncentration) og 10 pi 2 M glutamat (10 mM slutkoncentration) i oxygraph kammer indeholdende isolerede mitokondrie suspension (0,4 mg / ml) gennem titanium injektionsporten af kammeret propog optage cellulære respiration i 3-5 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
- Injicer 10 pi 0,5 M ADP (2,5 mM) i oxygraph kammeret gennem titanium injektionsporten af kammeret prop og optage mitokondrielle respiration indtil oxygen flux stiger, så aftager og stabiliserer (3-5 min).
- Endelig injicere 5 pi 4 mM cytochrom c (10 uM) i oxygraph kammeret og optage cellulære respiration i 5 min, indtil en stabil oxygen flux signal opnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kompleks I-afhængige respiration
Isolerede mitokondrie komplekse I-afhængige respiratoriske satser (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjælp af høj-opløsning respirometri (figur 1, en repræsentant diagram). Mitochondriale komplekse I substrater, glutamat og malat, tilsættes efterfulgt af tilsætningen af ADP. State 2 henviser til iltforbruget i overværelse af alene substrater. Tilstand 3 vedrører konsum oxygen i nærvær af substraterne og ADP. State 4 henviser til iltforbrug efter ADP udtynding. RCR er et indeks af koblingen for iltforbrug til ATP-produktion og beregnes som forholdet mellem tilstand 3 og stat 4. Som vist i figur 1, ved tilsætning af ADP, de mitokondrielle respiration stiger øjeblikkeligt (tilstand 3 respiration), og derefter falder (state 4 respiration) til niveauer meget similar som i staten 2. Dette indikerer en høj RCR og at mitokondrie integritet er velbevaret under isolation procedure. Figur 2 er et repræsentativt diagram af måling af en lav tilstand 3 respirationsrate og RCR, med en høj tilstand 4 respirationsfrekvens, hvilket indikerer upassende og mislykkede mitokondriel isolation. En høj respiration hastighed tilstand 4 er en indikator for mitokondrie proton utætheder 15.
Figur 1: Vellykket mitokondrie isolation: mitokondrie integritet er velbevaret under isolation procedure. Tracings fra høj opløsning respirometri bruger glutamat og malat som substrater (komplekst I-afhængige respiration). Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen. Den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Den oxygen koncentration falder med tiden som isolerede mitokondrier bruger ilt. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sx mg mitokondrieprotein). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mislykket mitokondrie isolation: mitokondrie integritet er ikke godt bevaret under isolation procedure indikerer upassende mitokondrie isolation. Tracings fra høj opløsning respirometri bruger glutamat og malat som substrater (komplekst I-afhængige respiration). Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen. Den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Iltkoncentrationen falder over tid som isolerede mitokondrier bruger tilgængle oxygen. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sx mg mitokondrieprotein). Klik her for at se en større version af dette tal.
Kompleks II-afhængige respiration
Isoleret mitokondrie komplekse II-afhængige respiratoriske satser (stater 2, 3 og 4) bestemmes ved hjælp af høj-opløsning respirometri (figur 3, en repræsentant diagram). Til dette assay den mitokondriske kompleks I inhiberes ved tilsætning af rotenon, og derefter succinat (kompleks II substrat) tilsættes efterfulgt af ADP. Figur 3 viser, at ved tilsætning af ADP, de mitokondrielle respiration stiger øjeblikkeligt, og derefter aftager til niveauer meget ligner den i tilstand 2, hvilket indikerer well-koblede mitokondrier, og atmitokondriel integritet er velbevaret under isolationsproceduren. Den beregnede RCR-værdi for denne typisk eksperiment er 4,23, hvilket er i god overensstemmelse med de i den tilgængelige litteratur 10, 11, 23) værdier. Figur 4 er et repræsentativt diagram af måling af en lav tilstand 3 respirationsrate og RCR, med en høj tilstand 4 respirationsfrekvens indikerer upassende isolation.
Figur 3: Vellykket mitokondrie isolation: mitokondrie integritet er velbevaret under isolation procedure. Tracings fra høj opløsning respirometri hjælp succinat som substrat (kompleks II-afhængige respiration). Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen. Den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældningoxygenkoncentration). Iltkoncentrationen falder over tid som isolerede mitokondrier bruger ilt. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sx mg mitokondrieprotein). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Mislykket mitokondrie isolation: mitokondrie integritet er ikke godt bevaret under isolation procedure indikerer upassende isolation. Tracings fra høj opløsning respirometri hjælp succinat som substrat (kompleks II-afhængige respiration). Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen. Den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Iltkoncentrationen falder over tid som isolerede mitochondria bruger ilt. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sx mg mitokondrieprotein). Klik her for at se en større version af dette tal.
Kompleks IV-afhængige respiration
Isolerede mitokondrie komplekse IV-afhængige respiratoriske satser (stater 2, 3) bestemmes ved hjælp af høj opløsning respirometri (figur 5, et repræsentativt diagram). Til dette assay ascorbat / TMPD og ADP tilsættes, efterfulgt af natriumazid for at inhibere kompleks IV.
Forskellen mellem oxygenforbrug før og efter tilsætningen af natriumazid fortolkes som den ægte kompleks IV åndedræt. Figur 5 er et repræsentativt diagram af measurement af høj kompleks IV-afhængig tilstand 3 respirationsfrekvens indikerer, at mitokondriel integritet er velbevaret under isolering procedure. I modsætning hertil figur 6 er et repræsentativt diagram af måling af en lav tilstand 3 indikerer upassende isolation.
Figur 5: Vellykket mitokondrie isolation: mitokondrie integritet er velbevaret under isolation procedure. Tracings fra høj opløsning respirometri hjælp ascorbat / TMPD som substrat (kompleks IV-afhængige respiration). Kompleks IV respiration (tilstand 3) fortolkes ved at fratrække iltforbrug før og efter tilsætning af natriumazid. Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen. Den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Iltkoncentrationen falder over tid som isolerede mitochondria bruge ilt. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sx mg mitokondrieprotein). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Mislykket mitokondrie isolation: mitokondrie integritet er ikke godt bevaret under isolation procedure indikerer upassende isolation. Tracings fra høj opløsning respirometri hjælp ascorbat / TMPD som substrat (kompleks IV-afhængige respiration). Kompleks IV respiration (tilstand 3) fortolkes ved at fratrække iltforbrug før og efter tilsætning af natriumazid. Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen. Den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Ilt koncentration aftager med tiden som isolerede mitokondrier bruger ilt. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sx mg mitokondrieprotein). Klik her for at se en større version af dette tal.
Evaluering af den mitokondriske ydre membran integritet under anvendelse cytochrom c
At evaluere kvaliteten af mitokondrie præparat, er cytochrom c-test udført for at bestemme mitokondriel ydre membran integritet, ved måling af mitokondriel respiration efter efterfølgende tilsætning af glutamat og malat, ADP og cytochrom c (ADP stimulerede kompleks II-afhængig tilstand 3 respiration i tilstedeværelsen af cytochrom c). Som vist i figur 7, er cytochrom c ikke forbedre kompleks I-afhængige tilstand 3 re spiration af det isolerede mitokondrier, hvilket indikerer, at der ikke var noget tab af cytochrom c fra den mitokondriske ydre membran og mitokondriel integritet bevares.
Figur 7: Cytochrom c ikke øge respiration af den isolerede mitokondrie: mitokondrie integritet er velbevaret under isolation procedure. Tracings fra høj opløsning respirometri hjælp glutamat / malat som substrat (kompleks I-afhængige respiration). Den blå linje repræsenterer iltkoncentrationen. Den røde linje repræsenterer oxygen flow (hældning oxygenkoncentration). Iltkoncentrationen falder over tid som isolerede mitokondrier bruger ilt. Iltforbruget udtrykkes som pmol / (sx mg mitokondrieprotein).m / filer / ftp_upload / 55.251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
| Mitokondriel isolation puffer | |
| Kemisk | Koncentration |
| KCI | 100 mM |
| MgSO4 | 10 mM |
| morpholinopropan sulfonsyre (MOPS) | 50 mM |
| ethylenedinitrilotetraacetic syre (EGTA) | 1,0 mM |
| ATP | 1,1 mm |
| pH 7,4 | |
| Mitokondriel vaskebuffer | |
| Kemisk | Koncentration |
| KCI | 100 mM |
| MOPS | 50 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| pH 7,4 | |
| Mitokondrie respiration buffer 16 | |
| Kemisk | Koncentration |
| saccharose | 110 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| MgCl2 | 3,0 mM |
| KCI | 80 mM |
| K-lactobionat | 60 mM |
| KH 2 PO 4 | 10 mM |
| Taurin | 20 mM |
| Hepes 20 mM | |
| BSA | 1,0 g / l |
| pH 7,1 | |
Tabel 1: Sammensætningen af buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I nærværende undersøgelse beskriver vi en protokol til at isolere høj kvalitet, intakt og tæt koblede skeletmuskulatur mitokondrier ved differential centrifugering, som kan anvendes til funktionelle undersøgelser såsom høj opløsning respirometri.
For at isolere intakte og stramt koblede mitokondrier, er der nogle kritiske punkter, der skal overvejes inden for den nuværende protokol. Efter høst af knoglevæv, skal det straks nedsænket i iskold mitokondrie isolation puffer. Alle centrifugeringstrin bør ske ved 4 ° C og mitokondrie suspension bør holdes altid på is under isolation. Proceduren Isoleringen bør ske så hurtigt som muligt. Homogenatet bør centrifugeres i rene detergent-fri centrifugerør. Ved afslutningen af proceduren bør den mitokondriske suspension holdes koncentreres og fortyndes lige før respirometri. Da respirometri data udtrykkes som pmol per sekund per milligram mitokondrieprotein, er det vigtigt at anvende en god teknik til nøjagtigt at måle det mitokondrielle protein koncentrationen efter isolation.
I nogle mitokondrie isolationsprocedurer, kan det ske, at mitokondrierne er koblet eller ikke forbruge ilt ordentligt med høj opløsning respirometri. For at overvinde disse problemer, bør vævet altid homogeniseres på samme måde (det samme antal slag) ved hjælp af homogenisatoren med løstsiddende pistil (trin 1.12). Her, vi altid homogenisere skeletmuskelvævet anvendelse af en automatiseret homogenisator med 10 slag. Et højere antal slag kan beskadige og afkoble mitokondrier. Manuelt (og subjektivt) homogeniserede vævsprøver i glas homogenisatorer kan udvise forskellige kvaliteter af isolerede mitokondrier. Indefrysning af mitokondrier kan også resultere i afkoblede mitokondrier og man skal sørge for, at centrifugeringer er færdig ved 4 ° C og ikke under denne temperature. Den mitokondrie integritet kan være kompromitteret så godt, hvis pH-værdien af de heri løsninger er forkert eller centrifugeringsfaciliteterne rørene ikke er rene. Man skal sørge for, at centrifugering rør er vaskemiddel-fri og korrekt vaskes.
En af de første vigtige faktorer, der skal overvejes under isolering er at homogenisere væv på en skånsom måde. Bløde væv kræver forsigtig mekanisk kræfter, der påføres under homogenisering, hvorimod hårde væv kræver meget stærkere mekaniske kræfter. Anvendte buffere under homogenisering og centrifugeringer bør være iskold og har en fysiologisk relevant pH med en ionisk og osmotisk styrke kompatibel med cytosol. Til hårde væv, såsom skeletmuskel, efter mekanisk homogenisering, kan tilsættes proteaser, såsom trypsin yderligere at opsplitte vævet 4, 5.
Nogle af begrænsningerne i isolerede mitokondrier, baseret på differential centrifugering er i) eventuelt beskadigede mitokondrier under homogenisering og isolation procedure 19, ii) de store mængder vævsprøverne kræves til mitokondrisk isolation, iii) det mulige tab og ændringer i visse mitokondrie elektrontransportkæden komplekser underenheder under homogenisering og centrifugeringstrin 18, og iv) den forøgede produktion af reaktive oxygenarter under homogenisering og centrifugeringstrin, som kan forstyrre mitokondriefunktion 18. Fordelene ved dounce homogenisering og differentialcentrifugering metode til isolering rå mitokondrier for respiratoriske eksperimenter med hensyn til eksisterende metoder såsom densitetsgradientcentrifugering 20 er, at metoden er hurtig og mitokondrier er isolerede i en kort periode. Derfor kan udføres respiratoriske eksperimenter inden for 1h. Desuden er proceduren billig, meget effektiv og mitokondrier opnået ved differentialcentrifugering kan anvendes til respirometri assays. Undersøgelsen af mitokondrie iltforbrug hjælp isolerede mitokondrier tilbyder flere fordele i forhold til permeabiliserede fibre eller celler: Ingen signifikant interferens med cytosoliske proteiner, der kan forstyrre mitokondriefunktionen og bioenergetik; ikke behov for cellulær permeabilisering; og substrater af de mitochondriale respiratoriske kæde-komplekser kan tilsættes direkte til de isolerede mitokondrier.
En af de alternative metoder til måling skeletmuskler mitokondriel respiration er anvendelsen permeabiliseret muskelfibre 9. Nogle af fordelene ved de permeabiliseret muskelfibre end isolerede mitokondrier er i) ikke er behov for mekanisk homogeniseringstrin og, ii) der kræves meget små mængder væv (få mg) for respirometri assays. Ulempen ved permeabilized muskelfibrene den nedre iltdiffusion til mitokondrierne i fiberbundtet. Denne diffusionsbegrænsning kræver større mængder af ADP under respirometri assays. En anden alternativ fremgangsmåde er anvendelsen af hele vævshomogenater 22, som er en meget hurtig metode og kræver ikke differentielle centrifugeringstrin til isolering af mitokondrier. Anvendelse af hele vævshomogenat kan forhindre tab af nogle mitokondrier i løbet af deres isolation, men der kan være andre cytosoliske faktorer til stede, som kan forstyrre analysen af de mitokondrie funktioner såsom iltforbrug.
Efter mastering forskellen centrifugering for at isolere rå mitokondrier for respiratoriske analyser, en fremtidig anvendelse er at undersøge de respiratoriske kapacitet mitokondrier isolerede via nye teknikker såsom at bruge mitokondrie ydre membran anti-TOM22 (translocase af ydre mitokondrielle membran 22 homolog) antistof-par, Med magnetiske perler 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
