Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution

doi: 10.3791/55251 Published: March 8, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

bioénergétique mitochondrial et les capacités respiratoires peuvent être étudiés non seulement dans des cellules ou des fibres perméabilisées, mais aussi dans les mitochondries isolées. Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler les mitochondries intactes du muscle squelettique en utilisant la centrifugation différentielle pour les mesures de respirométrie à haute résolution.

Pour isoler les mitochondries intactes pour respirométrie, le tissu est homogénéisé et les mitochondries sont isolées par un procédé de centrifugation différentielle classique. La méthode de centrifugation différentielle est basée sur centrifugations séquentielles (dans une série de vitesse croissante) des broyats de tissus a été introduit par Pallade et collègues de travail il y a près de 70 ans 1. Le tissu est tout d'abord hachée avec des ciseaux et homogénéisés mécaniquement dans un homogénéisateur en verre avec un pilon ample. Ensuite, l'homogénat est centrifugé à faible vitesse et le culot résultant qui contient du tissu intact, cellulaireles débris et les noyaux sont jetés. Ensuite, on centrifuge le surnageant à plusieurs reprises à grande vitesse, et la fraction enrichie est recueillie mitochondriale. Les avantages de la méthode de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries sont les suivantes: i) la méthode est rapide et mitochondries peut être isolé au sein de 1-1,5 h (expériences respiratoires doivent être effectuées aussi vite que possible); ii) il est peu coûteux; et iii) il est très efficace et les mitochondries obtenues par centrifugation différentielle sont suffisamment pur pour les essais de respirométrie. Les inconvénients de la méthode de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries sont que i) les mitochondries pourraient être endommagés et découplées pendant l'homogénéisation; ii) la contamination des mitochondries avec d'autres composants cellulaires (pouvait être résolu par un nouveau lavage du culot de mitochondries avec des étapes de centrifugation supplémentaires); iii) la possibilité de sélectionner différentes sous - populations mitochondriales, par exemple, au cours de centrifugations différentielles étapes, mitochondria avec dense inférieure peut être exclue 7; et iv) l'entourant cellulaire est absent et que la respiration mitochondriale maximale théorique peut être mesurée. Une autre méthode pour isoler les mitochondries pour les essais de respirométrie est la centrifugation en gradient de densité 2. Dans cette technique, l'extrait de tissu est déposé en couche sur une solution de saccharose ou d'un gradient de Percoll (avec une densité plus élevée au fond du tube de centrifugation) et on centrifuge à une certaine vitesse, ce qui provoque la mitochondrie être isolée des autres composants cellulaires en fonction de leur les densités. Cette méthode est souvent utilisée pour isoler les mitochondries du cerveau avec une très faible contamination par des synaptosomes. Cependant, les mitochondries de foie de rat isolés par centrifugation à gradient de densité sont fortement contaminés par d' autres organelles cellulaires 3. Une des limitations de ce procédé est que le gradient de saccharose présente dans le tube de centrifugation peut se rompre sime mitochondries (choc osmotique).

Selon le type de tissu; il y a des facteurs importants à considérer pour l'isolement des mitochondries intactes par centrifugation différentielle. La première nécessité est d'homogénéiser les tissus d'une manière douce. des tissus mous tels que le rein, le cerveau et le foie ont besoin des forces mécaniques appliquées lors de l'homogénéisation douce. Cela contraste avec les tissus durs tels que le muscle cardiaque et squelettique qui nécessitent des forces mécaniques beaucoup plus fortes. Le tissu émincé est habituellement traitée par la protéinase avant l'homogénéisation pour adoucir le tissu. Tous les tampons utilisés lors de l' homogénéisation et la centrifugation doit être refroidi à la glace et ont un pH physiologique pertinent avec une force ionique et osmotique compatible avec cytosol 4, 5.

L'un des avantages d'étudier bioénergétique mitochondrial isolé est que les membranes plasmiques cellulaires ne doivent pas être permeabilisées avec des détergents tels que la saponine ou la digitonine 4, 6, ce qui peut compromettre l'intégrité de la membrane externe mitochondriale. Un autre avantage des mitochondries isolées est l'absence d'autres facteurs cytosoliques qui peuvent interférer avec l'analyse des fonctions mitochondriales telles que la consommation d'oxygène. Les inconvénients de l' utilisation des mitochondries isolées sont la sélection éventuelle de certaines populations mitochondriales au cours des étapes de centrifugation, des dommages à la mitochondrie lors de l' homogénéisation, et l'exigence de grandes quantités d'échantillons biologiques afin d'obtenir un bon rendement de mitochondries isolées 7, 8.

Après la procédure d'isolement, les taux respiratoires des complexes mitochondriaux I-, II- et IV-dépendants (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l'aide à haute résolution respirométrie. Pour complexe conduit I-respiration, glutamateet malate sont ajoutés, suivis de l'adénosine diphosphate (ADP). Pour la respiration complexe entraînée II, succinate est ajouté, suivi par ADP. Pour complexe entraîné IV-respiration, ascorbate et tetramethylphenylendiamine (TMPD) sont ajoutés , suivis par ADP 9, 10, 11, 12. L'état 2 se réfère à la consommation d'oxygène en présence des seuls substrats. Etat 3 se réfère à la consommation d'oxygène en présence de substrats et l'ADP. État 4 se réfère à la consommation d'oxygène après ADP épuisement. Le rapport de contrôle respiratoire (RCR) est un indice de couplage de la production d'ATP de la consommation d'oxygène et est calculé comme le rapport entre l' état 3 et de l' état 4 13, 15.

En résumé, nous décrivons un protocole pour isoler les mitochondries des muscles squelettiques et fonctionnelles intactes par centrifugation différentielle et utiliser ces mitochon isolédria pour des études fonctionnelles et bioénergétiques telles que haute résolution respirométrie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La biopsie du muscle quadriceps est prélevé à partir d'un porc anesthésié, à partir de laquelle les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. Le cochon est utilisé par la suite pour une autre expérience. L'étude est réalisée en conformité avec les National Institutes of Health des lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et avec l'approbation du Comité du canton de Berne, Suisse Animal Care.

1. Skeletal Homogénéisation musculaire et mitochondrial Isolation

  1. Accise 5-10 échantillon g quadriceps musculaires à partir d' un porc anesthésié. Dans le présent essai, utilisez le muscle squelettique porcin. Ce protocole peut également être utilisé pour isoler les mitochondries à partir d' autres espèces (par exemple, le rat, la souris, l' homme, etc.).
    REMARQUE: Cette étape est effectuée par un médecin spécialiste avec une expertise en chirurgie.
    1. porcs rassis avec de la kétamine par voie intramusculaire (20 mg / kg) et de xylazine (2 mg / kg), avant l'anesthésie est induite par intra-midazolam veineuse (0,5 mg / kg, plus atropine 0,02 mg / kg). Maintenir une anesthésie par perfusion continue par voie intraveineuse de propofol (4-8 mg / kg par h) et de fentanyl (30 ug / kg et par heure) pendant une intervention chirurgicale.
  2. Immerger immédiatement l'échantillon de tissu dans un bêcher contenant 20 ml de tampon d'isolement mitochondriale glacé (tableau 1).
    NOTE: Tampons utilisés pendant l'homogénéisation et centrifugations devraient être de la glace froide et ont un pH physiologique pertinent avec une force ionique et osmotique compatible avec cytosol.
  3. Peser l'échantillon de tissu dans le bécher sur un équilibre taré analytique. Tarer la balance avec le bêcher contenant 20 ml de tampon d'isolement.
  4. Placer le bécher sur un seau à glace.
    REMARQUE: Effectuer toutes les prochaines étapes de la procédure d'homogénéisation à la température de seau à glace et de garder tous les tampons sur le seau à glace.
  5. Émincer le muscle squelettique dans le bécher (garder sur la glace) dans 1-2 mm de petits morceaux de 3-4 min en utilisant bien Scisseurs.
  6. Rincer le tissu haché dans le bécher deux fois avec un tampon d'isolement de la glace froide (20 ml de chaque étape de lavage).
  7. Suspendre le tissu dans 10 volumes de tampon d'isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​contenant 5 mg de protéase / g de tissu.
  8. Placer le bécher dans un bain de glace sur l'agitateur magnétique et agiter pendant 10 min.
  9. Diluer la suspension dans le bêcher avec 10 volumes supplémentaires du tampon d'isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​additionné de 0,2% (poids / volume) d'albumine sérique délipidée bovine (BSA).
  10. Transvaser la totalité du tampon d'isolement supplémenté avec 0,2% de BSA et rinçage du tissu dans le récipient deux fois avec du tampon d'isolement froid complémenté avec 0,2% de SAB (20 ml à chaque étape de lavage).
  11. Remettre en suspension le tissu dans 10 volumes de tampon d'isolement par rapport au poids du tissu (g) ​​additionné de 0,2% de BSA dégraissée.
  12. Homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur en verre semi-automatique (conservés sur la glace) avec un pilon ample (10 coups).
    NOTE: Homogenize le tissu toujours de la même manière (le même nombre de traits, par exemple 10 coups). Un nombre plus élevé de coups peut endommager et découpler les mitochondries. De préférence, l'homogénéisation du tissu à l'aide d'un homogénéiseur automatisé. Manuellement (et subjectivement) les échantillons de tissus homogénéisés dans homogénéisateurs de verre peuvent produire différentes qualités de mitochondries isolées.
  13. Centrifuger le tissu homogénéisé à 4 ° C pendant 10 min à 10 000 x g.
    REMARQUE: Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées dans des centrifugeuses avec des rotors à angle fixe.
  14. Jeter le surnageant à l'aide d'une pipette sérologique et resuspendre le culot dans un milieu d'isolement glacé BSA supplémenté (10 ml / g de tissu).
  15. Centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 10 min à 350 x g.
  16. Réserver le surnageant à l'aide d'une pipette sérologique et jeter le culot (débris cellulaires).
  17. Filtrer le surnageant dans un bécher (conservé dans la glace) à travers deux couches de gaze (17 fils / cm 2) pour enlever debr cellulaireest.
  18. Centrifuger la suspension filtrée à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
  19. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot de mitochondries brut dans le tampon d'isolement (5 ml / g de tissu) additionné de 0,2% (poids / volume) de BSA et centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
  20. Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans un tampon de lavage (tableau 1). Centrifuger la suspension à nouveau à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
  21. Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans un tampon de lavage et centrifuger la suspension à nouveau à 4 ° C pendant 10 min à 7000 x g.
  22. Jeter le surnageant et remettre le culot mitochondrial brut dans 1,0 ml de tampon de lavage.
  23. Déterminer la concentration en protéines de la suspension mitochondriale et de garder la suspension mitochondriale concentrée sur la glace.
    REMARQUE: La concentration en protéine peut être mesurée en utilisant une méthode standard.
  24. Juste avantrespirométrie pour les essais, remettre en suspension la suspension mitochondriale dans le tampon de respiration à une concentration finale de 0,4 mg / ml de protéine mitochondriale.

2. haute résolution Respirométrie

  1. Pipette 2,1 ml de tampon de respiration (tableau 1) 16 dans une chambre de oxygraphe haute résolution et remuer le tampon en continu en utilisant une barre d'agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C pendant 1 h jusqu'à ce qu'un signal de flux stable d'oxygène le capteur d'oxygène polarographique est obtenu.
    REMARQUE: des électrodes d'oxygène polarographiques à l'intérieur de chaque chambre de oxygraphe mesurer la concentration en oxygène et de calculer la consommation d'oxygène (flux) à l'intérieur de chaque chambre. La concentration en oxygène et le taux de consommation d'oxygène (flux) sont affichés en temps réel en ligne dans un ordinateur en utilisant un logiciel d'acquisition et d'analyse des données. En outre, afin de garantir des résultats précis et fiables, l'oxygène instrumental correction de fond doit êtreeffectuée selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE: avec précision 2,1 ml de tampon respiratoire est ajouté dans la chambre pour l'étalonnage d'un volume de la chambre finale de 2,0 mL après la fermeture des bouchons.
  2. Effectuer un étalonnage à l'air du capteur d'oxygène polarographique selon les protocoles du fabricant 17.
    REMARQUE: Lors de l'étalonnage de l'air, avec une phase gazeuse présente, la concentration en oxygène des médias sera équilibrer l'ordre de 15 à 20 min. En fonction de la température, la pression barométrique, et la solubilité de la concentration des médias peut être calculée.
  3. Après étalonnage à l'air, aspirer le milieu de la respiration de la chambre de oxygraphe et ajouter 2,1 ml de la suspension mitochondriale isolée (0,4 mg / mL de protéine mitochondriale) de l'étape 1.24 dans une chambre du oxygraphe.
    NOTE: Le volume de tampon de respiration dépend de l'instrument mis en place et le fabricant. Pour la résolution haute respirométrie, 2,1 mL de bu de respirationffer est ajouté dans la chambre pour l'étalonnage d'un volume de la chambre finale de 2,0 mL après la fermeture des bouchons.
  4. Fermer la chambre de oxygraphe par insertion du bouchon.
  5. Incorporer la suspension mitochondriale en continu en utilisant une barre d'agitation magnétique présent dans la chambre (700 rpm) à 37 ° C et la respiration cellulaire record à la ligne de base pendant 3-5 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
    Remarque: la concentration en oxygène et le signal de flux d'oxygène sont affichées en temps réel en ligne sur un ordinateur en utilisant un logiciel pour l' acquisition et l' analyse 17 des données.
  6. Par la suite, injecter des substrats et des inhibiteurs de la respiration mitochondriale par les orifices des bouchons en utilisant les protocoles standards suivants d'injection de titane.

3. Complexe Respiration I-dépendante

  1. Préparer une chambre de oxygraphe contenant la suspension mitochondriale isolée (0,4 mg / ml) suivant le mode opératoire décrit dans les étapes 2,1-2,5 etattendre un signal stable.
  2. Injecter 12,5 ul de 0,8 M malate (5 mM concentration finale) et 10 ul de 2 M de glutamate (10 mM de concentration finale) dans la chambre de oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / ml) à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
    NOTE: Toutes les injections dans les étapes suivantes sont effectuées par les ports de bouchons en utilisant des seringues d'injection de titane.
  3. Injecter 10 ul de 0,05 M d'ADP (0,25 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration mitochondriale jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes).
    NOTE: Le plateau de la respiration après addition d'ADP indique que la concentration d'ADP était élevée et saturante. En fonction de la quantité de mitochondries utilisées au cours de la respiration, la concentration d'ADP doit être titréepour un état 3 consommation d'oxygène stable (respiration maximale). L'addition d'ADP à la suspension mitochondriale va induire une augmentation de la consommation d'oxygène et le signal de flux d'oxygène augmente (état 3 respiration). Après l'ADP est consommée, le signal de flux d'oxygène diminue (état 4 respiration).

4. Complexe de la respiration II-dépendante

  1. Préparer une chambre d'oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1-2.5 et d'attendre un signal stable.
  2. Injecter 2 pi de roténone 0,2 mM (0,2 uM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de la chambre à l'aide d'une seringue et d'enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
    NOTE: La roténone est un poison dangereux et peut avoir un impact significatif sur la santé humaine.
  3. Injecter 20 ul de 1 M de succinate (10 mM) dans le ch oxygrapheambre et enregistrer la respiration mitochondriale pendant 3-5 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable est atteint.
  4. Injecter 10 ul de 0,05 M d'ADP (0,25 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambre et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, stabilise, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes).
    NOTE: L'addition d'ADP à la suspension mitochondriale va induire une augmentation de la consommation d'oxygène et le signal de flux d'oxygène augmente (état 3 respiration). Après l'ADP est consommée, le signal de flux d'oxygène diminue (état 4 respiration).

5. Complexe IV-dépendante Respiration

  1. Préparer une chambre d'oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1 à 2.5 du protocole et attendre un signal stable.
  2. Injecter ensuite 2,5 ul de 0,8 mM d'ascorbate (1 mM). Immédiatement après l'injection de 2,5 ul de 0,2M TMPD (0,25 mM) et 10 pi de 0,05 M d'ADP (0,25 mM) dans la chambre de respiration cellulaire et oxygraphe enregistrement jusqu'à ce que le flux d'oxygène signal augmente et se stabilise (3-5 minutes).
  3. Enfin, l'injection de 10 pl de 1 M d'azoture de sodium (5 mM) "ATTENTION" dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire jusqu'à ce que le flux d'oxygène diminue de signal et se stabilise.
    NOTE: L'azoture de sodium est un poison dangereux et peut avoir un impact significatif sur la santé humaine.

6. Cytochrome C test

  1. Préparer une chambre d'oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / mL) en suivant la procédure décrite dans les étapes 2.1 à 2.5 du protocole et attendre un signal stable.
  2. Injecter 12,5 ul de 0,8 M malate (5 mM concentration finale) et 10 ul de 2 M de glutamate (10 mM de concentration finale) dans la chambre de oxygraphe suspension contenant des mitochondries isolées (0,4 mg / ml) à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de chambreet enregistrer la respiration cellulaire pendant 3-5 minutes jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.
  3. Injecter 10 ul de 0,5 M d'ADP (2,5 mM) dans la chambre de oxygraphe à travers l'orifice d'injection de titane du bouchon de la chambre et l'enregistrement de la respiration mitochondriale jusqu'à ce que le signal de flux d'oxygène augmente, puis diminue et se stabilise (3-5 minutes).
  4. Enfin, l'injection de 5 ul de 4 mM de cytochrome c (10 uM) dans la chambre de oxygraphe et enregistrer la respiration cellulaire pendant 5 min jusqu'à ce qu'un signal de flux d'oxygène stable soit atteint.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Complexe I-dépendante la respiration

Taux isolés mitochondrial complexes I-dépendante des voies respiratoires (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l' aide à haute résolution respirométrie (Figure 1, un schéma représentant). I substrats complexes mitochondriaux, le glutamate et le malate, sont ajoutés, suivis par l'addition d'ADP. L'état 2 se réfère à la consommation d'oxygène en présence des seuls substrats. Etat 3 se réfère à la consommation d'oxygène en présence des substrats et l'ADP. État 4 se réfère à la consommation d'oxygène après ADP épuisement. RCR est un index de couplage de la consommation d'oxygène pour la production d'ATP et est calculé comme le rapport entre l' état 3 et de l' état 4. Comme le montre la figure 1, lors de l' addition d'ADP, le taux de respiration mitochondriale augmente immédiatement (état 3 respiration), et puis diminue (état 4 respiration) à des niveaux très similar à celle de l'état 2. Ceci indique une grande RCR et que l'intégrité mitochondriale est bien conservée durant la procédure d'isolement. Figure 2 est un schéma représentatif de la mesure d'un faible taux de respiration à l' état 3 et RCR, avec un taux de respiration à l' état 4 élevé, indiquant l' isolement mitochondrial inappropriée et sans succès. Un taux de respiration élevé à l' état 4 est un indicateur de protons mitochondrial leakiness 15.

Figure 1
Figure 1: isolement mitochondrial réussie: mitochondrial intégrité est bien préservée au cours de la procédure d'isolement. Tracés de la haute résolution à l'aide de respirométrie le glutamate et le malate en tant que substrats (complexe de la respiration I-dépendant). La ligne bleue représente la concentration en oxygène. La ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). L'oxyconcentration gen diminue au fil du temps que les mitochondries isolées utilisent l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sx mg de protéine mitochondriale). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: isolement mitochondrial Unsuccessful: mitochondrial intégrité est pas bien conservé au cours de la procédure d'isolement indiquant inapproprié isolement mitochondrial. Tracés de la haute résolution à l'aide de respirométrie le glutamate et le malate en tant que substrats (complexe de la respiration I-dépendant). La ligne bleue représente la concentration en oxygène. La ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). La concentration en oxygène diminue dans le temps que les mitochondries isolées utilisent la available oxygène. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sx mg de protéine mitochondriale). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

II respiration complexe dépendant

Complexes mitochondrial Isolated taux respiratoires II-dépendants (états 2, 3 et 4) sont déterminées à l' aide à haute résolution respirométrie (figure 3, un schéma représentant). Pour ce dosage, le complexe I mitochondrial est inhibée par l'addition de la roténone, puis succinate (substrat complexe II) est ajouté, suivi par l'ADP. La figure 3 montre que lors de l' addition d'ADP, de la respiration mitochondriale augmente immédiatement et diminue ensuite à des niveaux très similaires à celles de l' état 2 indiquant mitochondries bien couplées et quel'intégrité mitochondriale est bien conservé au cours de la procédure d'isolement. La valeur RCR calculée pour cette expérience typique est de 4,23, ce qui est en accord étroit avec les valeurs indiquées dans la littérature disponible 10, 11, 23). Figure 4 est un schéma représentatif de la mesure d'un faible taux de respiration à l' état 3 et RCR, avec un taux élevé de respiration à l' état 4 indiquant l' isolement inapproprié.

figure 3
Figure 3: isolement mitochondrial réussie: mitochondrial intégrité est bien préservée au cours de la procédure d'isolement. Tracés de la respirométrie haute résolution en utilisant succinate comme substrat (complexe respiration II-dépendant). La ligne bleue représente la concentration en oxygène. La ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente dela concentration en oxygène). La concentration en oxygène diminue dans le temps que les mitochondries isolées utilisent l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sx mg de protéine mitochondriale). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: isolement mitochondrial Unsuccessful: mitochondrial intégrité est pas bien conservé au cours de la procédure d'isolement indiquant l' isolement inapproprié. Tracés de la respirométrie haute résolution en utilisant succinate comme substrat (complexe respiration II-dépendant). La ligne bleue représente la concentration en oxygène. La ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). La concentration en oxygène diminue au fil du temps Mitoc isoléhondria utilisent l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sx mg de protéine mitochondriale). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Complexe IV-dépendante la respiration

Taux isolés mitochondrial complexes IV-dépendante des voies respiratoires (états 2, 3) sont déterminées à l' aide à haute résolution respirométrie (figure 5, un schéma représentant). Pour ce dosage ascorbate / TMPD et ADP sont ajoutés, suivis par l'azoture de sodium pour inhiber le complexe IV.

La différence entre la consommation d'oxygène avant et après l'addition de l'azoture de sodium est interprété comme étant le véritable complexe IV respiration. La figure 5 est un schéma représentatif d'mesurestion d'un état 3 taux élevé complexe IV-dépendante respiration indiquant que l'intégrité mitochondriale est bien conservée durant la procédure d'isolement. En revanche, la figure 6 est un schéma représentatif de la mesure d'un état bas 3 indiquant l' isolement inapproprié.

Figure 5
Figure 5: isolement mitochondrial réussie: mitochondrial intégrité est bien préservée au cours de la procédure d'isolement. Tracés de la respirométrie haute résolution en utilisant ascorbate / TMPD comme substrat (IV-dépendante respiration complexe). Complexe IV respiration (état 3) est interprétée en soustrayant la consommation d'oxygène avant et après l'addition de l'azoture de sodium. La ligne bleue représente la concentration en oxygène. La ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). La concentration en oxygène diminue au fil du temps mitocho isoléndria utiliser l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sx mg de protéine mitochondriale). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: isolement mitochondrial Unsuccessful: mitochondrial intégrité est pas bien conservé au cours de la procédure d'isolement indiquant l' isolement inapproprié. Tracés de la respirométrie haute résolution en utilisant ascorbate / TMPD comme substrat (IV-dépendante respiration complexe). Complexe IV respiration (état 3) est interprétée en soustrayant la consommation d'oxygène avant et après l'addition de l'azoture de sodium. La ligne bleue représente la concentration en oxygène. La ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). L'oxygène concentration diminue au fil du temps que les mitochondries isolées utilisent l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sx mg de protéine mitochondriale). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Évaluation de l'intégrité de la membrane externe mitochondriale en utilisant le cytochrome c

Afin d'évaluer la qualité de la préparation mitochondriale, le test du cytochrome c est effectuée pour déterminer l'intégrité de la membrane externe des mitochondries, par mesure de la respiration mitochondriale après l'addition subséquente du glutamate et le malate, l'ADP et le cytochrome c (ADP stimulée II du complexe dépendant de l'état 3 la respiration dans le présence de cytochrome c). Comme on le voit sur la figure 7, le cytochrome c ne favorise pas complexe I dépendant de l' état 3 re spiration des mitochondries isolées, ce qui indique qu'il n'y a eu aucune perte de cytochrome c de la membrane externe mitochondriale et de l'intégrité mitochondriale est conservée.

Figure 6
Figure 7: Cytochrome c ne renforce pas la respiration de l'mitochondrial isolée: l' intégrité mitochondriale est bien conservé au cours de la procédure d'isolement. Tracés de la respirométrie haute résolution en utilisant le glutamate / malate comme substrat (complexe de la respiration I-dépendant). La ligne bleue représente la concentration en oxygène. La ligne rouge représente le débit d'oxygène (pente de la concentration en oxygène). La concentration en oxygène diminue dans le temps que les mitochondries isolées utilisent l'oxygène disponible. La consommation d'oxygène est exprimée en pmol / (sx mg de protéine mitochondriale).m / files / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Tampon d'isolement mitochondrial
Chimique Concentration
KCl 100 mM
MgSO4 10 mM,
acide sulfonique morpholinopropane (MOPS) 50 mM,
l'acide éthylènedinitrilot (EGTA) 1,0 mM
ATP 1,1 mM
pH 7,4
Un tampon de lavage mitochondrial
Chimique Concentration
KCl 100 mM
MOPS 50 mM,
EGTA 0,5 mM
pH 7,4
Un tampon de 16 respiration mitochondriale
Chimique Concentration
Saccharose 110 mM
EGTA 0,5 mM
MgCl2 3,0 mM
KCl 80 mM
K-lactobionate 60 mM
KH 2 PO 4 10 mM,
taurine 20 mM,
Hepes 20 mM,
BSA 1,0 g / l
pH 7,1

Tableau 1: Composition des tampons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dans la présente étude, nous décrivons un protocole pour isoler de haute qualité, intact et étroitement couplées mitochondries des muscles squelettiques par centrifugation différentielle qui peuvent être utilisés pour des études fonctionnelles telles que haute résolution respirométrie.

Afin d'isoler les mitochondries intactes et étroitement couplées, il y a quelques points critiques à prendre en considération dans le présent protocole. Après avoir récolté le tissu osseux, il doit être immédiatement immergé dans un tampon d'isolement mitochondriale glacée. Toutes les étapes de centrifugation doivent être effectuées à 4 ° C et la suspension mitochondriale devraient être maintenus toujours sur la glace lors de l'isolement. La procédure d'isolement doit se faire le plus rapidement possible. L'homogénat doit être centrifugé dans des tubes de centrifugeuse sans détergent propre. A la fin de la procédure, la suspension mitochondriale doit être maintenu concentré et être diluée juste avant Respirométrie. Puisque les données de respirométrie sont exprimés en pmol par seconde per milligramme de protéine mitochondriale, il est important d'utiliser une bonne technique pour mesurer avec précision la concentration de la protéine mitochondriale après l'isolement.

Dans certaines procédures d'isolement des mitochondries, il peut arriver que les mitochondries sont découplés ou ne consomment pas l'oxygène correctement à l'aide de haute résolution respirométrie. Pour surmonter ces problèmes, le tissu doit toujours être homogénéisée de la même manière (le même nombre de coups) à l'aide de l'homogénéisateur avec le pilon ample (étape 1.12). Ici, nous avons homogénéisé toujours le tissu musculaire squelettique en utilisant un homogénéisateur automatisé avec 10 coups. Un nombre plus élevé de coups peut endommager et découpler les mitochondries. Manuellement (et subjectivement) les échantillons de tissus homogénéisés dans homogénéisateurs de verre peuvent produire différentes qualités de mitochondries isolées. La congélation des mitochondries peut aussi entraîner des mitochondries découplés et il faut faire en sorte que centrifugations sont effectuées à 4 ° C et non en dessous de ce température. L'intégrité mitochondriale peut être compromise et si le pH des solutions tampons est incorrecte ou les tubes de centrifugation ne sont pas propres. Il faut faire en sorte que les tubes de centrifugation sont sans détergent et correctement lavés.

L'un des premiers facteurs importants à considérer lors de l'isolement consiste à homogénéiser les tissus d'une manière douce. Les tissus mous exigent des forces mécaniques douces appliquées pendant l'homogénéisation, tandis que les tissus durs nécessitent des forces mécaniques beaucoup plus fortes. Les tampons utilisés lors de l'homogénéisation et centrifugations doit être refroidi à la glace et ont un pH physiologique pertinent avec une force ionique et osmotique compatible avec cytosol. Pour les tissus durs tels que le muscle squelettique, après homogénéisation mécanique, des protéases telles que la trypsine peuvent être ajoutés à désagréger davantage le tissu 4, 5.

Quelques-unes des limitations des mitochondries isolées, sur la base dcentrifugation ifferential sont : i) les mitochondries éventuellement endommagées au cours de l'homogénéisation et l' isolement procédure 19, ii) les grandes quantités d'échantillons de tissus nécessaires pour l'isolement des mitochondries, iii) la perte et la transformation possible dans certains électrons mitochondriale des complexes de la chaîne de transport des sous - unités pendant l' homogénéisation et centrifugation étapes 18, et iv) la production accrue des espèces réactives de l' oxygène pendant l' homogénéisation et de centrifugation étapes, qui peuvent interférer avec la fonction mitochondriale 18. Les avantages de l'homogénéisation Dounce et la méthode de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries brut pour les expériences des voies respiratoires par rapport aux méthodes existantes , telles que un gradient de densité centrifugation 20 sont que le procédé est rapide et les mitochondries sont isolées à l' intérieur d' une courte période de temps. Par conséquent, les expériences respiratoires peuvent être effectuées dans 1h. En outre, le procédé est peu coûteux, très efficaces et les mitochondries obtenues par centrifugation différentielle peut être utilisé pour des essais de respirométrie. L'enquête sur la consommation d'oxygène mitochondriale utilisant les mitochondries isolées offre plusieurs avantages par rapport aux fibres ou cellules perméabilisées: pas d'interférence significative avec des protéines cytosoliques qui peuvent interférer avec la fonction mitochondriale et bioénergétique; pas besoin de perméabilisation cellulaire; et les substrats des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale peuvent être ajoutés directement aux mitochondries isolées.

L' une des méthodes alternatives pour mesurer le muscle squelettique respiration mitochondriale est l'utilisation perméabilisées fibres musculaires 9. Certains des avantages des fibres musculaires perméabilisées plus mitochondries isolées sont i) aucune étape d'homogénéisation mécanique est nécessaire et, ii) de très petites quantités de tissu (quelques mg) sont nécessaires pour les essais de respirométrie. L'inconvénient de pla fibre musculaire ermeabilized est la diffusion de l'oxygène inférieure à la mitochondrie dans le faisceau de fibres. Cette restriction de diffusion nécessite de grandes quantités d'ADP au cours des essais de respirométrie. Une autre méthode alternative consiste à utiliser des homogénats de tissus entiers 22, qui est une méthode très rapide et ne nécessite pas les étapes de centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries. Utilisation d'homogénat de tissu entier peut empêcher la perte de certaines mitochondries lors de leur isolement, mais il peut y avoir d'autres facteurs cytosoliques présents, qui peuvent interférer avec l'analyse des fonctions mitochondriales telles que la consommation d'oxygène.

Après avoir maîtrisé la centrifugation différentielle pour isoler les mitochondries brut pour les essais respiratoires, une application future est d'étudier les capacités respiratoires des mitochondries isolées par des techniques émergentes telles que l'utilisation de la membrane externe mitochondriale anti-TOM22 (translocase de mitochondriale externe membrane 22 homologue) anticorps couplbilles magnétiques ed 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADP Sigma A 4386 Chemical
Antimycin A Sigma A 8674 Chemical, dissolve in ethanol
Ascorbate Merck 1.00127 Chemical
ATP Sigma A 7699 Chemical
BSA Sigma A 6003 Chemical
EGTA fluka 3779 Chemical
Glutamate Sigma, G 1626 Chemical
Hepes Sigma H 7523 Chemical
KCl Merck 1.04936 Chemical
KH2PO4 Merck 1.04873 Chemical
K-lactobionate Sigma L 2398 Chemical
MgCl2 Sigma M 9272 Chemical
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) Merck 1.06129 Chemical
O2k-Core: Oxygraph-2k  Oroboros Instruments 10000-02 High-resolution respirometry instrument
Proteinase, bacterial Sigma P 8038 Chemical
Sodium azide Sigma S2002 Chemical
Rotenone Sigma R 8875 Chemical, dissolve in ethanol
Succinate Sigma S 2378 Chemical
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser  schuett-biotec GmbH 3.201 011 Tissue homogenizer
Taurine Sigma T 8691 Chemical
TMPD Sigma T 3134 Chemical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
  2. Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55, (2), 698-707 (1990).
  3. Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9, (11), 3209-3214 (2009).
  4. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
  5. Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
  6. Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416, (2), 218-227 (2011).
  7. Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3, (6), 965-976 (2008).
  8. Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, (4), 1041-1053 (2013).
  9. Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41, (10), 1837-1845 (2009).
  10. Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18, (2), 217-230 (2012).
  11. Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42, (8), e550-e559 (2014).
  12. Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
  13. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
  14. Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435, (2), 297-312 (2011).
  16. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, (20), 11080-11085 (2000).
  17. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
  18. Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6, (3), e18317 (2011).
  19. Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9, (6), 1032-1046 (2010).
  20. Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
  21. Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8, (12), 382392 (2013).
  22. Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11, (5), 722-728 (2011).
  23. Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475, (2), 84-88 (2000).
Isolement des mitochondries Intact du muscle squelettique par centrifugation différentielle pour respirométriques mesures haute résolution
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).More

Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements. J. Vis. Exp. (121), e55251, doi:10.3791/55251 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter