Introduction
bioenergetics מיטוכונדריאלי וקיבולות נשימה ניתן ללמוד לא רק בתאי permeabilized או סיבים אלא גם במיטוכונדריה מבודדת. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד שלם באמצעות צנטריפוגה הפרש למדידות respirometry ברזולוציה גבוהה.
כדי לבודד המיטוכונדריה תילן respirometry, הרקמה הומוגני המיטוכונדריה מבודד על ידי שיטת צנטריפוגה הפרש קונבנציונלית. שיטת צנטריפוגה ההפרש בוסס על centrifugations הרציף (בסדרה של גברת מהירות) של homogenates הרקמות הוצגה לראשונה על ידי Pallade ועמיתים לעבודה כמעט 70 שנים לפני 1. הרקמה טחונה ראשונה באמצעות מספריים הומוגני מכאני בתוך homogenizer זכוכית עם עלי רפוי. לאחר מכן homogenate הוא centrifuged במהירות נמוכה לבין הגלולה וכתוצאה המכילה רקמות רצופות, סלולריתפסולת גרעינים נמחקות. ואז, supernatant היא centrifuged מספר פעמים במהירות גבוהה השבר מועשר המיטוכונדריה נאסף. היתרונות של שיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הוא כי: i) השיטה היא מהירה המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת בתוך 1-1.5 שעות (ניסויי נשימה צריכות להתבצע מהר ככל האפשר); ii) הוא זול; ו- III) הוא יעיל מאוד ואת המיטוכונדריה מתקבלת על ידי צנטריפוגה הפרש טהורה מספיק עבור מבחני respirometry. החסרונות של השיטה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הם כי אני) המיטוכונדריה עלול להיגרם מכך נזק ו זוגיים במהלך המגון; ii) את הזיהום של המיטוכונדריה עם מרכיבים תאיים אחרים (יכול להיפתר על ידי שטיפה נוספת גלולת המיטוכונדריה עם צעדים צנטריפוגה נוספים); iii) את האפשרות של בחירה תת-אוכלוסיות המיטוכונדריה שונות, למשל, במהלך שלבי centrifugations ההפרש, mitochondria עם צפופה תחתונה ניתן לשלול 7; ו- IV) בסלולרי המיטוכונדריה שמסביב חסר ורק הנשימה המקסימלי התיאורטית ניתן למדוד. שיטה נוספת לבודד המיטוכונדריה לצורך מבחני respirometry הוא שיפוע צפיפות צנטריפוגה 2. בטכניקה זו, תמצית הרקמות מונחת על פני פתרון של סוכרוז או שיפוע Percoll (עם צפיפות גבוהה יותר בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה) ו centrifuged במהירות מסוימת, גרימת המיטוכונדריה כדי להיות מבודדת מרכיבים תאיים אחרים על פי שלהם צפיפויות. שיטה זו משמשת לעתים קרובות לבודד המיטוכונדריה מוח עם זיהום נמוך מאוד מן synaptosomes. עם זאת, המיטוכונדריה הכבד עכברוש המבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מזוהם מאוד עם אברונים תאיים אחרים 3. אחת המגבלות של שיטה זו היא כי נוכח שיפוע סוכרוז בצינור צנטריפוגה עלול להיקרע כךהמיטוכונדריה לי (הלם אוסמוטי).
בהתאם לסוג של רקמות; ישנם כמה גורמים חשובים שיש להביא בחשבון עבור הבידוד של המיטוכונדריה שלם על ידי צנטריפוגה הפרש. הצורך הראשון הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות כגון כליות, מוח וכבד דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון. זאת לעומת רקמות קשות כגון שריר לב ו שלד שדורשים הרבה כוחות מכאניים חזקים. הרקמה הטחונה מטופל בדרך כלל עם proteinase לפני המגון לרכך את הרקמה. כל המאגרים המשמשים במהלך המגון צנטריפוגה צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol 4, 5.
אחד היתרונות של לימוד bioenergetics המיטוכונדריה מבודד הוא כי ממברנות פלזמה הסלולר לא צריך להיות permeabilized עם דטרגנטים כגון digitonin או saponin 4, 6, אשר עלול לסכן את שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. יתרון נוסף של המיטוכונדריה המבודד הוא עדר גורמי cytosolic אחרים, אשר עלולים להפריע הניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן. החסרונות של שימוש המיטוכונדריה המבודד הם הבחירה האפשרית של אוכלוסיות המיטוכונדריה מסוימות במהלך שלבי צנטריפוגה, הפגיעה במיטוכונדריה במהלך הומוגניות, ואת דרישת כמויות גבוהות של דגימות ביולוגיות על מנת לקבל תשואה טובה של המיטוכונדריה מבודד 7, 8.
לאחר שהסתיים הליך הבידוד, שיעורי הנשימה של המיטוכונדריה מתחמי אני-, II- ו- IV תלויות (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. לנשימה מורכבת מונחה לי, גלוטמטו malate מתווספים ואחריו diphosphate אדנוזין (ADP). לנשימה שנייה מונחה מורכבת, succinate מתווסף ואחריו ADP. שכן, נשימת IV מונחה מורכב ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD) מתווסף ואחריו 9 ADP, 10, 11, 12. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות מצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) הינו מדד של צימוד של ייצור ATP צריכת החמצן, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4 13, 15.
לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד פונקציונלי ללא פגע על ידי צנטריפוגה הפרש ולהשתמש mitochon מבודדdria ללימודים פונקציונליים bioenergetic כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הביופסיה השרירה ארבעה הראשים נלקחת חזיר מורדם, שממנו המיטוכונדריה מבודד על ידי צנטריפוגה הפרש. החזיר משמש לאחר מכן עבור ניסוי נוסף. המחקר מתבצע בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור ועדת טיפול בבעלי חיים של קנטון ברן, שוויץ.
1. המגון שרירי השלד ובידוד מיטוכונדריאלי
- בלו 5-10 ארבעה גרמו דגימת שריר מ חזיר מורדם. ב assay מופיע, השתמשו בשרירי שלד חזיריים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד המיטוכונדריה ממינים אחרים (למשל, חולדה, עכברים, אדם, וכו '.).
הערה: שלב זה מתבצע על ידי מומחה רפואי עם התמחות בכירורגיה.- חזירים שלווים עם קטמין תוך שרירית (20 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (2 מ"ג / ק"ג), לפני הרדמה מושרה עם התוךmidazolam ורידי (0.5 מ"ג / ק"ג, בתוספת אטרופין 0.02 מ"ג / ק"ג). לשמור על הרדמה עם חליטות תוך ורידי רציף של propofol (4-8 מ"ג / ק"ג ח) ו- פנטניל (30 מיקרוגרם / ק"ג ח) במהלך הניתוח.
- מיד לטבול את דגימת רקמה בתוך כוס המכילה 20 מ"ל של חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח (טבלה 1).
הערה: חוצצי שימוש במהלך המגון ו centrifugations צריך להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol. - לשקול את דגימת רקמה בכוס על איזון tared אנליטי. טרה את האיזון עם כוס המכילה 20 מ"ל של חיץ בידוד.
- מניח את הכוס על דלי קרח.
הערה: בצע את כל השלבים הבאים עבור ההליך המגון בטמפרטורה דלי קרח ולשמור את כל המאגרים על דלי הקרח. - לרכך את שרירי השלד בכוס (לשמור על הקרח) לחתיכות קטנות 1-2 מ"מ במשך 3-4 דקות באמצעות sciss בסדרORS.
- יש לשטוף את רקמת טחון בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר כקרח (20 מיליליטר כל צעד כביסה).
- להשעות את הרקמה 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) המכיל רקמות 5 מ"ג פרוטאז / g.
- מניח את הכוס באמבט קרח על stirrer המגנטי ומערבבים במשך 10 דקות.
- לדלל את ההשעיה בכוס עם 10 כרכים נוספים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) אלבומין בסרום שור נטול שומן (BSA).
- למזוג את כל חיץ הבידוד השלים עם 0.2% BSA ולשטוף את הרקמה בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר קרח בתוספת 0.2% BSA (20 מיליליטר כל צעד כביסה).
- Resuspend רקמת ב 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% עם נטול שומן BSA.
- Homogenize רקם עם homogenizer זכוכית חצי אוטומטי (כל זמן על קרח) עם עלי רפוי (10 משייכות).
הערה: Homogenizדואר הרקמה תמיד באותו אופן (אותו מספר משיכות, למשל, 10 משיכות). מספר גבוה יותר של שבץ עלול לגרום נזק ו לנתק את המיטוכונדריה. רצוי, homogenize הרקמה באמצעות homogenizer אוטומטי. באופן ידני (וסובייקטיבית) דגימות רקמת הומוגני homogenizers זכוכית עשויות לייצר איכויות שונות של המיטוכונדריה מבודד. - צנטריפוגה רקמת הומוגני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 10,000 x ז.
הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעים צנטריפוגות עם רוטורים בזווית קבועים. - בטל supernatant באמצעות pipet סרולוגיות ו resuspend גלולה במדיום בידוד קר כקרח-בתוספת BSA (10 מ"ל / גרם רקמה).
- צנטריפוגה ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב g x 350.
- שומרים לעצמנו את supernatant באמצעות pipet סרולוגיות וזורקים את הכדור (פסולת הסלולר).
- סנן את supernatant לתוך מבחנה (לשמור על הקרח) באמצעות שתי שכבות של גזה (17 האשכולות / 2 ס"מ) להסיר תאים debrהוא.
- צנטריפוגה ההשעיה המסוננת על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז.
- בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר הבידוד (5 רקמות מיליליטר / g) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) BSA ו צנטריפוגות ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז.
- בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית חיץ לשטוף (טבלה 1). צנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x ז.
- בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר לשטוף בצנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x גרם.
- בטל supernatant ו resuspend גלולה המיטוכונדריה גולמי 1.0 מ"ל של חיץ לשטוף.
- קביעת ריכוז החלבון של ההשעיה המיטוכונדריה ולשמור ההשעיה המיטוכונדריה המרוכזת על קרח.
הערה: ריכוז חלבון ניתן למדוד באמצעות כל שיטה סטנדרטית. - זמן קצר לפניכדי respirometry מבחני, resuspend ההשעיה המיטוכונדריה למאגר הנשימה לריכוז סופי של חלבון 0.4 מ"ג / מ"ל המיטוכונדריה.
2. ברזולוציה גבוהה Respirometry
- 2.1 פיפטה מ"ל הנשימה חיץ (טבלה 1) 16 לתוך תא oxygraph ברזולוציה גבוהה ומערבבים למאגר ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטית הנוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 ° C עבור 1 ח עד אות השטף חמצן יציבה של חיישן חמצן polarographic מתקבל.
הערה: אלקטרודות חמצן Polarographic בתוך כל תא oxygraph למדוד את ריכוז החמצן ולחשב צריכת חמצן (שטף) בתוך כל תא. ריכוז החמצן ושיעורי צריכת חמצן (שטף) מוצגים בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח. בנוסף, על מנת להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות, תיקון רקע חמצן אינסטרומנטלי צריך להיותנעשה על פי הוראות היצרן.
הערה: מדויק 2.1 מיליליטר של חיץ נשימה מתווספת לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. - בצע כיול אוויר של חיישן חמצן polarographic פי הפרוטוקולים של יצרן 17.
הערה: במהלך כיול אוויר, עם מתנת שלב גז, ריכוז חמצן התקשורת יהיה לאזן בסדר גודל של 15-20 דקות. בהתאם טמפרטורה, לחץ ברומטרי, מסיסות של -oxygen ריכוז התקשורת ניתן לחשב. - לאחר כיול אוויר, לשאוב את המדיום הנשימה מהאולם oxygraph ולהוסיף 2.1 מ"ל של השעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / חלבון המיטוכונדריה מ"ל) משלב 1.24 אל חדר של oxygraph.
הערה: היקף מאגר נשימה תלוי במכשיר להגדיר ויצרן. לקבלת respirometry ברזולוציה גבוהה, 2.1 מ"ל של bu הנשימהffer מתווסף לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. - סגור את תא oxygraph ידי החדרת את הפקק.
- מערבב את ההשעיה המיטוכונדריה ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטי נוכחי בתא (700 סל"ד) בשעה 37 ° C ו- נשימה תאית שיא בתחילת המחקר במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
הערה: ריכוז החמצן ואת אות שטף חמצן מוצג בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח 17. - לאחר מכן, להזריק מצעים ומעכבים לנשימת המיטוכונדריה דרך יציאות הזרקה טיטניום של הפקקים באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים הבאים.
נשימת 3. אני תלוי Complex
- הכן תא oxygraph המכיל את ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציבה.
- להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ"מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ"מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמרית להקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
הערה: כל הזריקות בשלבים הבאים מבוצעות דרך יציאות הזרקה טיטניום של פקקים באמצעות מזרקים. - להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה המיטוכונדריאלי עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות).
הערה: הרמה של נשימה לאחר תוספת ADP עולה כי ריכוז ADP היה גבוה להרוות. בהתאם לכמות של המיטוכונדריה בשימוש במהלך הנשימה, ריכוז ADP יש טיטרציהעבור צריכת חמצן מדינת 3 יציבה (נשימה מקסימלי). תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4).
4. נשימה השנייה תלויה Complex
- הכן תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציב.
- להזריק 2 μL של 0.2 rotenone מ"מ (0.2 מיקרומטר) 'זהירות' החדרת oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי באמצעות מזרק ולהקליט את הנשימה התאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
הערה: Rotenone הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם. - להזריק 20 μL של 1 succinate M (10 מ"מ) לתוך ch oxygraphענבר נשימה המיטוכונדריאלי שיא 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
- להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף חמצן, מייצב, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות).
הערה: תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4).
5. נשימה IV התלוי Complex
- הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ"ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה.
- ואז להזריק 2.5 μL של ascorbate 0.8 מ"מ (1 מ"מ). מיד לאחר מכן להזריק 2.5 μL של 0.2M TMPD (0.25 מ"מ) ו -10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ"מ) לתוך תא oxygraph ואת הנשימה התאית שיא עד מגביר אות השטף חמצן ומייצב (3-5 דקות).
- לבסוף להזריק 10 μL של 1 M יזיד הנתרן (5 מ"מ) 'זהירות' החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת.
הערה: אזיד הנתרן הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם.
6. ציטוכרום C מבחן
- הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ"ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה.
- להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ"מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ"מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ"ג / מ"ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמריתולהקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
- להזריק 10 μL של 0.5 M ADP (2.5 מ"מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי נשימה המיטוכונדריאלי שיא עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורדת ומייצב (3-5 דקות).
- לבסוף, להזריק 5 μL של ציטוכרום C 4 מ"מ (10 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית במשך 5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אני תלוי קומפלקס נשימה
שיעורי נשימה שאני תלוי מורכבים המיטוכונדריה מבודד (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 1, דיאגרמה נציג). מצעים שאני מורכבים מיטוכונדריאלי, גלוטמט malate, מתווספים ואחריו תוספת של ADP. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות של המצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. RCR הינו מדד של צימוד של צריכת חמצן ייצור ATP, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4. כפי שניתן לראות בתרשים 1, על תוספת של ADP, קצב הנשימה המיטוכונדריאלי מיד (הנשימה המדינה 3), ו ולאחר מכן יורד (מדינת 4 נשימה) לרמות מאוד שלimilar לזה של המדינה 2. זה מצביע על RCR גבוהה וכי שלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך הליך בבידוד. איור 2 הוא דיאגרמה נציג למדידת קצב נשימה נמוכה מדינת 3 ו RCR, עם קצב נשימת מדינת 4 גבוה, המעיד על בידוד המיטוכונדריה הולם ולא מוצלח. שיעור נשימה גבוה מדינת 4 מהווה אינדיקטור leakiness פרוטון המיטוכונדריה 15.
איור 1: בידוד המיטוכונדריה מוצלח: שלמות המיטוכונדריה נשמר היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות גלוטמט malate כמו מצעים (נשימה שאני תלוי מורכבת). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). אצטילןריכוז gen פוחת עם הזמן כמו המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ"ג חלבון המיטוכונדריה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: בידוד המיטוכונדריה פעולה נכשל: המיטוכונדריה שלמה לא נשמר גם במהלך הליך הבידוד המציין בידוד המיטוכונדריה הולם. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות גלוטמט malate כמו מצעים (נשימה שאני תלוי מורכבת). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל המיטוכונדריה מבודד להשתמש availabחמצן le. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ"ג חלבון המיטוכונדריה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
נשימה השנייה תלויה Complex
מורכב המיטוכונדריה מבודד השנייה תלויים שיעורי נשימה (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 3, דיאגרמה נציג). עבור assay זה, ואני מורכב המיטוכונדריה מעוכב על ידי התוספת של rotenone, ולאחר מכן succinate (המצע II המורכב) מתווסף ואחריו ADP. איור 3 מראה כי עם תוספת של ADP, מגדילת הנשימה המיטוכונדריאלי מייד, ולאחר מכן יורד לרמות מאוד דומות לזה של המדינה 2, מציין המיטוכונדריה גם מצמיד וכישלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך ההליך בבידוד. שווי RCR שחושב ניסוי טיפוסי זה הוא 4.23, אשר עולה בקנה אחד הדוק עם הערכים המוצגים בספרות הזמינה 10, 11, 23). איור 4 היא דיאגרמה נציג למדידת קצב הנשימה נמוך המדינה 3 ו RCR, עם קצב הנשימה המדינה 4 גבוה המעיד בידוד הולם.
איור 3: בידוד המיטוכונדריה מוצלח: שלמות המיטוכונדריה נשמר היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות succinate כמו מצע (מורכבות נשימה השנייה תלויה). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפועריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ"ג חלבון המיטוכונדריה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: בידוד המיטוכונדריה פעולה נכשל: המיטוכונדריה שלמה לא נשמר גם במהלך הליך הבידוד המציין בידוד הולם. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות succinate כמו מצע (מורכבות נשימה השנייה תלויה). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל mitoc מבודדhondria להשתמש החמצן הזמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ"ג חלבון המיטוכונדריה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
IV תלוי קומפלקס נשימה
שיעורי נשימה IV התלוי מורכבים המיטוכונדריה מבודד (מדינות 2, 3) נקבע באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 5, דיאגרמה נציג). לקבלת ascorbate assay זה / TMPD ו ADP מתווספים, ואחריו אזיד הנתרן לעכב IV מורכבים.
ההבדל בין צריכת חמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן מתפרש נשימת IV המורכבת האמיתית. איור 5 הוא דיאגרמה נציג measurement של קצב נשימת מדינת 3 IV התלוי מורכב גבוה המציין שלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך הליך בבידוד. לעומת זאת, איור 6 היא דיאגרמה נציג מדידה של מדינה נמוכה 3 המציין בידוד הולם.
איור 5: בידוד המיטוכונדריה מוצלח: שלמות המיטוכונדריה נשמר היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות ascorbate / TMPD כמו מצע (נשימה מורכבת IV-תלוי). IV נשימה מורכבת (מדינה 3) מתפרשת על ידי הפחתת צריכת החמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן. הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל mitocho מבודדndria להשתמש החמצן הזמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ"ג חלבון המיטוכונדריה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: בידוד המיטוכונדריה פעולה נכשל: המיטוכונדריה שלמה לא נשמר גם במהלך הליך הבידוד המציין בידוד הולם. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות ascorbate / TMPD כמו מצע (נשימה מורכבת IV-תלוי). IV נשימה מורכבת (מדינה 3) מתפרשת על ידי הפחתת צריכת החמצן לפני ואחרי תוספת של אזיד הנתרן. הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). Conce החמצןntration פוחת עם הזמן כמו המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ"ג חלבון המיטוכונדריה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הערכה של שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה באמצעות ציטוכרום C
כדי להעריך את איכות כנת המיטוכונדריה, מבחן ציטוכרום C מתבצע על מנת לקבוע שלמות הממברנה חיצונית של המיטוכונדריה, על ידי מדידת הנשימה המיטוכונדריאלי לאחר התוספת הבאה של גלוטמט Malate, ADP ו ציטוכרום C (ADP מגורה מורכבת נשימה השנייה תלויה מדינת 3 נוכחות של ציטוכרום C). כפי שניתן לראות בתרשים 7, ציטוכרום C אינו לשפר מורכב שאני תלוי מדינת 3 מחדש spiration של המיטוכונדריה המבודד, המציין כי לא היה פסד של ציטוכרום C מן הקרום החיצוני המיטוכונדריה ויושרת המיטוכונדריה נשמרה.
איור 7: ציטוכרום C אינו לשפר נשימה של המיטוכונדריה המבודד: שלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך ההליך בבידוד. העתקים מן respirometry ברזולוציה הגבוהה באמצעות גלוטמט / Malate כמו מצע (נשימה שאני תלוי מורכבת). הקו הכחול מייצג ריכוז חמצן. הקו האדום מייצג את זרימת החמצן (שיפוע ריכוז חמצן). ריכוז החמצן יורדת עם הזמן, ככל המיטוכונדריה מבודד להשתמש חמצן זמין. צריכת חמצן מבוטאת pmol / (SX מ"ג חלבון המיטוכונדריה).מ '/ קבצים / ftp_upload / 55,251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| חיץ בידוד מיטוכונדריאלי | |
| כִּימִי | ריכוז |
| KCl | 100 מ"מ |
| MgSO 4 | 10 מ"מ |
| חומצת sulphonic morpholinopropane (מגבים) | 50 מ"מ |
| חומצה ethylenedinitrilotetraacetic (EGTA) | 1.0 מ"מ |
| ATP | 1.1 מ"מ |
| pH 7.4 | |
| חיץ כביסה מיטוכונדריאלי | |
| כִּימִי | ריכוז |
| KCl | 100 מ"מ |
| מגבים | 50 מ"מ |
| EGTA | 0.5 מ"מ |
| pH 7.4 | |
| חיץ הנשימה מיטוכונדריאלי 16 | |
| כִּימִי | ריכוז |
| סוכרוז | 110 מ"מ |
| EGTA | 0.5 מ"מ |
| MgCl 2 | 3.0 מ"מ |
| KCl | 80 מ"מ |
| K-lactobionate | 60 מ"מ |
| KH 2 PO 4 | 10 מ"מ |
| טאורין | 20 מ"מ |
| Hepes 20 מ"מ | |
| BSA | 1.0 גר '/ ל |
| pH 7.1 | |
טבלה 1: רכב מאגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבודד באיכות גבוהה, ללא פגם ו המיטוכונדריה שרירי שלד מצמיד בחוזקה על ידי צנטריפוגה הפרש אשר ניתן להשתמש בם עבור מחקרים תפקודיים כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.
כדי לבודד המיטוכונדריה שלם מצמידים בחוזקה, יש כמה נקודות קריטיות כדי להיחשב בתוך הפרוטוקול הנוכחי. לאחר קצירת רקמות השלד, זה צריך להיות שקוע מיד חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח. כל צעדי צנטריפוגה צריכים להיעשות על 4 מעלות צלזיוס השעית המיטוכונדריה צריכה להישמר תמיד על קרח במהלך בידוד. הליך הבידוד צריך להיעשות כמה שיותר מהר. את homogenate צריך להיות centrifuged צינורות צנטריפוגות חומר ניקוי ללא נקיים. בסוף ההליך, השעית המיטוכונדריה צריכה להישמר מרוכזת תדולל רק לפני respirometry. בהיעדר נתוני respirometry מבוטאים pmol לכל PE השנימיליגרם r של חלבון המיטוכונדריה, חשוב להשתמש בטכניקה טובה למדוד את ריכוז החלבון המיטוכונדריה במדויק לאחר הבידוד.
בחלק נהלי בידוד המיטוכונדריה, זה יכול לקרות כי המיטוכונדריה הוא זוגיים או לא צורך חמצן כראוי באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי להתגבר על בעיות אלה, הרקמה תמיד צריכה להיות הומוגני באותו אופן (באותו מספר המשייכות) באמצעות homogenizer עם העלי הרפוי (שלב 1.12). כאן, אנו תמיד homogenize הרקמה שרירי השלד באמצעות homogenizer אוטומטית עם 10 משיכות. מספר גבוה יותר של שבץ עלול לגרום נזק ו לנתק את המיטוכונדריה. באופן ידני (וסובייקטיבית) דגימות רקמת הומוגני homogenizers זכוכית עשויות לייצר איכויות שונות של המיטוכונדריה מבודד. הקפאה של המיטוכונדריה גם עלולה לגרום המיטוכונדריה זוגי ואחד צריך לוודא centrifugations נעשה על 4 מעלות צלזיוס ולא מתחתיו te זהmperature. היושרה המיטוכונדריה עלולה לסכן גם אם ה- pH של תמיסות בופר שגוי או צינורות צנטריפוגה אינם נקיים. יש לוודא כי הצינורות צנטריפוגה הם נטולי חומרי ניקוי נשטף כראוי.
אחד הגורמים החשובים הראשונים כדי להיחשב במהלך הבידוד הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון, ואילו רקמות קשות דורשות כוחות מכאניים חזקים יותר. חוצצי שימוש במהלך המגון ו centrifugations צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol. עבור רקמות קשות כגון שרירי שלד, לאחר המגון מכאני, פרוטאזות כגון טריפסין ניתן להוסיף עוד disaggregate הרקמה 4, 5.
חלק מן המגבלות של המיטוכונדריה מבודד, מבוסס על דצנטריפוגה ifferential הם i) המיטוכונדריה הפגומה ואולי במהלך הליך המגון ובידוד 19, ii) כמויות הגדולות של דגימות הרקמה נדרשו עבור בידוד המיטוכונדריה, iii) האובדן והשינויים האפשריים יחידות משנת מתחמי שרשרת העברת אלקטרונים מסוימות המיטוכונדריה במהלך המגון ו צנטריפוגה צעדי 18, ו- IV) הייצור המוגבר של מיני חמצן הגיב במהלך שלבי המגון צנטריפוגה, אשר יכול לגרום להפרעות בתפקוד המיטוכונדריה 18. היתרונות של הומוגניזציה dounce ושיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה גולמי לניסויים הנשימה ביחס לשיטות הקיימות כגון צנטריפוגה שיפוע צפיפות 20 הם כי השיטה היא מהירה המיטוכונדריה מבודדים בתוך פרק זמן קצר. לכן ניסויי נשימה יכולים להתבצע בתוך 1ח. בנוסף, הנוהל הוא זול, יעיל מאוד במיטוכונדריה שהושג על ידי צנטריפוגה ההפרש יכול לשמש מבחני respirometry. חקירת צריכת החמצן המיטוכונדריה באמצעות המיטוכונדריה מבודד מציעה מספר יתרונות על פני סיבי permeabilized או תאים: אין הפרעה משמעותית עם חלבוני cytosolic שעשוי להפריע לתפקוד המיטוכונדריה bioenergetics; אין צורך permeabilization הסלולר; מצעים של מתחמי שרשרת הנשימה במיטוכונדריה ניתן להוסיף ישירות אל המיטוכונדריה המבודד.
אחת השיטות חלופה למדוד הנשימה שריר השלד המיטוכונדריה הוא permeabilized השימוש סיבי שריר 9. חלק מן היתרונות של סיבי שריר permeabilized על המיטוכונדריה בודד הוא i) שום צעד המגון מכאני נחוץ, ii) כמויות קטנות מאוד של רקמות (כמה מ"ג) נדרשים עבור מבחני respirometry. החיסרון של pסיבי שריר ermeabilized הוא דיפוזיה החמצן הנמוכה אל במיטוכונדריה של צרור הסיבים. הגבלת דיפוזיה זו דורשת כמויות גדולות יותר של ADP במהלך מבחני respirometry. שיטה חלופית נוספת היא שימוש homogenates כולו רקמות 22, שהיא שיטה מהירה מאוד ואינו דורש צעדי צנטריפוגה הפרש לבודד המיטוכונדריה. שימוש homogenate רקמות כולו עשוי למנוע אובדן של כמה המיטוכונדריה במהלך הבידוד שלהם, אך ייתכנו גורמים cytosolic אחרים הנוכחי, אשר עלולה להפריע ניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן.
לאחר שהתמחה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה גולמי עבור מבחני הנשימה, יישום בעתיד היא לחקור את יכולות הנשימה של המיטוכונדריה מבודד באמצעות טכניקות המתעוררים כגון שימוש הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה אנטי TOM22 (translocase של homolog 22 קרום המיטוכונדריה החיצוני) נוגדן-couplחרוזים מגנטיים ed 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
