Introduction
Mitokondriella bioenergetik och andningskapacitet kan studeras inte bara i permeabiliserade celler eller fibrer utan även i isolerade mitokondrier. I den aktuella studien beskriver vi ett protokoll för att isolera intakta skelettmuskel mitokondrier med hjälp av differentialcentrifugering för hög upplösning respiration mätningar.
För att isolera intakta mitokondrier för respiration är vävnaden homogeniseras och mitokondrier isoleras genom en konventionell differentialcentrifugeringsmetoden. Differentialcentrifugeringsmetoden är baserad på sekventiella centrifuge (i en serie ökande hastighet) av vävnadshomogenat infördes först av Pallade och medarbetare nästan 70 år sedan en. Vävnaden först malet med sax och homogeniseras mekaniskt i en glashomogenisator med en löst sittande mortelstöt. Efteråt homogenatet centrifugeras vid låg hastighet och den resulterande pelleten som innehåller obruten vävnad, cellulärskräp och kärnor kastas. Sedan, supernatanten centrifugerades flera gånger med hög hastighet och den mitokondriella anrikad fraktion uppsamlas. Fördelarna med differentialcentrifugeringsmetoden för att isolera mitokondrierna är att: i) Metoden är snabb och mitokondrier kan isoleras inom 1-1,5 h (experiment andnings bör utföras så snabbt som möjligt); ii) det är billigt, och iii) det är mycket effektiv och mitokondrier erhålls genom differentiell centrifugering är tillräckligt ren för respiration analyser. Nackdelarna med differentiell centrifugering metod för att isolera mitokondrierna är att i) mitokondrier kan skadas och okopplade under homogenisering; ii) kontaminering av mitokondrierna med andra cellulära komponenter (skulle kunna lösas genom ytterligare tvättning den mitokondriella pelletten med ytterligare centrifugeringssteg); iii) möjligheten att välja olika mitokondriella subpopulationer, t.ex. under differentialcentrifuge steg, mitochondria med lägre tät kan uteslutas 7; och iv) mitokondriella cellulära omgivningen saknas och endast teoretisk maximal andning kan mätas. En annan metod för att isolera mitokondrier för respiration analyser är densitetsgradientcentrifugering två. I denna teknik är vävnadsextraktet skiktad över en lösning av sackaros eller en Percoll gradient (med högre densitet i botten av centrifugeringsröret) och centrifugerades vid en viss hastighet, vilket gör att mitokondrierna att vara isolerad från andra cellulära komponenter i enlighet med deras densiteter. Denna metod används ofta för att isolera hjärn mitokondrier med mycket låg förorening från synaptosomer. Emellertid är mitokondrier från råttlever isolerades genom densitetsgradientcentrifugering höggradigt förorenade med andra cellulära organeller 3. En av begränsningarna med denna metod är att den sackarosgradient närvarande i centrifugeringsröret kan brista såmig mitokondrier (osmotisk chock).
Beroende på vilken typ av vävnad; det finns några viktiga faktorer att tänka på för isolering av intakt mitokondrier genom differentialcentrifugering. Den första nödvändighet är att homogenisera vävnaden på ett skonsamt sätt. Mjuka vävnader såsom njure, hjärna och lever kräver milda mekaniska krafter som tillämpas under homogenisering. Detta står i kontrast med hårda vävnader, såsom hjärt- och skelettmuskler som kräver mycket starkare mekaniska krafter. Den malda vävnaden behandlas vanligen med proteinas före homogeniseringen för att mjuka vävnaden. Alla buffertar som används under homogenisering och centrifugering bör vara iskall och har ett fysiologiskt relevant pH med en jonisk och osmotisk styrka kompatibel med cytosolen 4, 5.
En av fördelarna med att studera isolerade mitokondrie bioenergetik är att cellplasmamembran behöver inte vara permeabiseras med detergenter såsom digitonin eller saponin 4, 6, som kan äventyra den mitokondriella yttermembranintegritet. En annan fördel med den isolerade mitokondrier är frånvaron av andra cytosoliska faktorer som kan störa analysen av mitokondriella funktioner som syreförbrukning. Nackdelarna med att använda de isolerade mitokondrier är möjliga urval av vissa mitokondriella populationer under centrifugeringsstegen, skada på mitokondrier under homogenisering, och kravet på stora mängder av biologiska prover för att få en bra avkastning på isolerade mitokondrier 7, 8.
Efter isoleringsförfarandet, andnings andelen mitokondriella komplex I-, II- och IV-beroende (stater 2, 3 och 4) bestäms med hjälp av hög upplösning respiration. För komplexa I driven andning, glutamatoch malat tillsättes följt av adenosindifosfat (ADP). För komplexa II driven andning, är succinat följt av ADP. För komplexa IV driven andning, askorbat och tetramethylphenylendiamine (TMPD) tillsätts följt av ADP 9, 10, 11, 12. State 2 avser syreförbrukning i närvaro av enbart substrat. Tillstånd 3 avser syreförbrukning i närvaro av substrat och ADP. State 4 avser syreförbrukning efter ADP utarmning. Den respiratoriska kontrollen förhållandet (RCR) är ett index av koppling av syreförbrukning ATP-produktion och beräknas som förhållandet mellan tillstånd 3 och stat 4 13, 15.
Sammanfattningsvis beskriver vi ett protokoll för att isolera funktionella och intakta skelettmuskel mitokondrier genom differentiell centrifugering och använda dessa isolerade mitochonDRIA för funktionella och bioenergetiska studier såsom hög upplösning respiration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Quadricepsmuskeln biopsi tas från en bedövad gris, från vilken mitokondrier isoleras genom differentialcentrifugering. Grisen används efteråt för ett annat experiment. Studien genomförs i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och med godkännande av Animal Care kommittén i kantonen Bern, Schweiz.
1. Skelettmuskel homogenisering och Mitokondriell Isolering
- Punkt 5-10 g quadriceps muskelprov från en bedövad gris. I föreliggande analys använder svin skelettmuskel. Detta protokoll kan också användas för att isolera mitokondrier från andra arter (t.ex. råtta, möss, människa, etc.).
OBS: Detta steg utförs av en specialistläkare med expertis inom kirurgi.- Stillsam grisar med intramuskulär ketamin (20 mg / kg) och xylazin (2 mg / kg), innan anestesi induceras med intravenös midazolam (0,5 mg / kg, plus atropin 0,02 mg / kg). Upprätthålla anestesi med kontinuerliga intravenösa infusioner av propofol (4-8 mg / kg per h) och fentanyl (30 mikrogram / kg per h) under operation.
- Omedelbart doppa vävnadsprovet i en bägare innehållande 20 ml iskall mitokondriell isoleringsbuffert (tabell 1).
OBS: Buffertar användes under homogenisering och centrifugering bör vara iskall och har ett fysiologiskt relevant pH med en jonisk och osmotisk styrka kompatibel med cytosolen. - Väg vävnadsprovet i bägaren på en analytisk tarerad balans. Tarera balans med bägare innehållande 20 ml isoleringsbuffert.
- Placera bägaren på en ishink.
OBS: Utför alla nästa steg för homogenisering förfarande vid ishink temperatur och hålla alla buffertar på isen skopan. - Finhacka skelettmuskulaturen i bägaren (hålla på is) till 1-2 mm små bitar för 3-4 minuter med fin saxarors.
- Skölj malet vävnaden i bägaren två gånger med iskall isoleringsbuffert (20 ml varje tvättsteg).
- Suspendera vävnaden i 10 volymer isoleringsbuffert per vävnadsvikt (g) innehållande 5 mg proteas / g vävnad.
- Placera bägaren i ett isbad på magnetomröraren och rör om i 10 min.
- Späd suspensionen i bägaren med ytterligare 10 volymer av isoleringsbuffert per vävnadsvikt (g) kompletterat med 0,2% (vikt / volym) avfettad bovint serumalbumin (BSA).
- Dekantera alla av isoleringsbuffert kompletterad med 0,2% BSA och skölj vävnaden i bägaren två gånger med iskall isoleringsbuffert kompletterad med 0,2% BSA (20 ml varje tvättsteg).
- Resuspendera vävnaden i 10 volymer isoleringsbuffert per vävnadsvikt (g) kompletterat med 0,2% med avfettad BSA.
- Homogenisera vävnaden med en halvautomatisk glashomogenisator (hålls på is) med en löst sittande mortelstöt (10 slag).
OBS: Homogenize vävnaden alltid på samma sätt (samma antal slag, t.ex., 10 slag). Ett högre antal slag kan skada och koppla loss mitokondrierna. Företrädesvis, homogenisera vävnaden med användning av en automatiserad homogenisator. Manuellt (och subjektivt) homogenisvävnadsprover i glas homogenisatorer kan producera olika kvaliteter av isolerade mitokondrier. - Centrifugera den homogeniserade vävnaden vid 4 ° C under 10 min vid 10000 x g.
OBS: Alla centrifugeringssteg utförs i centrifuger med fast vinkel rotorer. - Kassera supernatanten med hjälp av en serologisk pipett och suspendera pelleten i BSA-kompletterat iskall isoleringsmedium (10 ml / g vävnad).
- Centrifugera suspensionen vid 4 ° C under 10 min vid 350 x g.
- Reservera supernatanten med hjälp av en serologisk pipett och kassera pellet (cellrester).
- Filtrera supernatanten i en bägare (på is) genom två skikt av gasväv (17 trådar / cm 2) för att avlägsna cell DEBRär.
- Centrifugera den filtrerade suspensionen vid 4 ° C under 10 min vid 7000 x g.
- Kassera supernatanten och återsuspendera den råa mitokondriella pelletten i isoleringsbuffert (5 ml / g vävnad) med tillsats av 0,2% (vikt / volym) BSA och centrifugera suspensionen vid 4 ° C under 10 min vid 7000 x g.
- Kassera supernatanten och återsuspendera den råa mitokondriella pelletten i tvättbuffert (tabell 1). Centrifugera suspensionen igen vid 4 ° C under 10 min vid 7000 x g.
- Kassera supernatanten och återsuspendera den råa mitokondriella pelletten i tvättbuffert och centrifugera suspensionen igen vid 4 ° C under 10 min vid 7000 x g.
- Kassera supernatanten och resuspendera råa mitokondriella pelleten i 1,0 ml tvättbuffert.
- Bestämma proteinkoncentrationen av det mitokondriella suspensionen och hålla den koncentrerade mitokondriesuspension på is.
OBS: Proteinkoncentration kan mätas med användning av någon standardmetod. - just föreatt respiration analyser, resuspendera mitokondriella suspension i respirations buffert till en slutkoncentration av 0,4 mg / ml mitochondrial protein.
2. Högupplöst respiration
- Pipettera 2,1 ml av andning buffert (Tabell 1) 16 in i en med hög upplösning oxygraph kammaren och rör om bufferten kontinuerligt med användning av en magnetisk omrörarstav närvarande i kammaren (700 rpm) vid 37 ° C under 1 h tills en stabil syreflödet signal av den polarografisk syresensorn erhålls.
OBS: polarografisk syreelektroder inom varje oxygraph kammare mäta syrekoncentrationen och beräkna syreförbrukning (flödet) i varje kammare. Syrekoncentrationen och syreförbrukning (flux) visas i realtid på nätet i en dator med hjälp av programvara för datainsamling och analys. Dessutom, i syfte att säkerställa korrekta och tillförlitliga resultat, bör instrumentella syrebakgrundskorrigering varautfördes i enlighet med tillverkarens instruktioner.
OBS: Ljuset mäts noggrant 2,1 ml respiration buffert tillsätts in i kammaren för kalibrering av en slutlig kammarvolym på 2,0 ml efter stängning propparna. - Utför en luftkalibrering av polarografisk syresensorn enligt tillverkarens protokoll 17.
OBS! Under luftkalibreringen, med en gasfas närvarande kommer syrekoncentrationen media jämvikt i storleksordningen 15 till 20 min. Beroende på temperaturen, barometertryck, och lösligheten av medier -oxygen koncentration kan beräknas. - Efter luftkalibreringen, aspirera andningsmediet från oxygraph kammaren och tillsätt 2,1 ml isolerad mitokondriell suspension (0,4 mg / ml mitokondrie protein) från steg 1,24 till en kammare i oxygraph.
OBS: Volymen av andning buffert beror på instrumentet inrättas och tillverkare. För hög upplösning respiration, de 2,1 ml andnings buffer sättes in i kammaren för kalibrering av en slutlig kammarvolym på 2,0 ml efter stängning propparna. - Stäng oxygraph kammaren genom insättning av proppen.
- Rör om den mitokondriella suspensionen kontinuerligt med användning av en magnetisk omrörarstav närvarande i kammaren (700 rpm) vid 37 ° C och spela in cellulär andning vid baslinjen under 3-5 minuter tills en stabil syreflöde signal uppnås.
OBS: syrehalt och syreflöde signal visas i realtid på nätet i en dator med hjälp av programvara för datainsamling och analys 17. - Efteråt injicera substrat och inhibitorer för mitokondrie andning genom titaninjektions hamnar propparna med hjälp av följande standardprotokoll.
3. Komplex I-beroende Andnings
- Bereda en oxygraph kammare som innehåller den isolerade mitokondriesuspension (0,4 mg / ml) enligt det förfarande som beskrivs i steg 2.1-2.5 ochvänta på en stabil signal.
- Injicera 12,5 mikroliter av 0,8 M malat (5 mM slutlig koncentration) och 10 | il av 2 M glutamat (10 mM slutlig koncentration) in i oxygraph kammare som innehåller isolerade mitokondriesuspension (0,4 mg / ml) genom titaninjektionsöppningen hos kammaren proppen och registrera cellandningen i 3-5 minuter tills en stabil syreflödet signal uppnås.
OBS: Alla injektioner i de följande stegen utförs genom titaninjektions hamnar proppar använder sprutor. - Injicera 10 mikroliter av 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammaren genom titaninjektionsöppningen hos kammaren proppen och registrera mitokondriell andning tills signalen ökar syreflödet, sedan minskar och stabiliserar (3-5 min).
OBS: Platån av andning efter ADP dessutom tyder på att ADP-koncentration var hög och mätt. Beroende på mängden av mitokondrier som används under andning, bör ADP-koncentration titrerasför ett stabilt tillstånd 3 syreförbrukning (maximal andning). Tillsats av ADP till den mitokondriella suspensionen kommer att inducera en ökning av syreförbrukning och syreflödet signalen kommer att öka (tillstånd 3 andning). Efter ADP förbrukas, kommer syreflödet signalen minskar (tillstånd 4 andning).
4. Komplex II-beroende Respiration
- Bereda en oxygraph kammare som innehåller isolerade mitokondriesuspension (0,4 mg / ml) enligt det förfarande som beskrivs i steg 2.1-2.5 och vänta på en stabil signal.
- Injicera 2 mikroliter av 0,2 mM rotenon (0,2 | iM) "caution" in i oxygraph kammaren genom titaninjektionsöppningen hos kammaren proppen med hjälp av en spruta och spela in det cellandning under 3-5 minuter tills en stabil syreflöde signal uppnås.
OBS: Rotenon är en farlig gift och kan ha en betydande påverkan på människors hälsa. - Injicera 20 ^ il av en M succinat (10 mM) i oxygraph chbärnsten och spela mitokondrie andning under 3-5 minuter tills en stabil syreflödet signal uppnås.
- Injicera 10 mikroliter av 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammaren genom titaninjektionsöppningen hos kammaren proppen och registrera cellandningen tills signalen ökar syreflödet, stabiliserar, sedan minskar och stabiliserar (3-5 min).
OBS: Tillsats av ADP till den mitokondriella suspensionen kommer att inducera en ökning av syreförbrukning och syreflödet signalen kommer att öka (tillstånd 3 andning). Efter ADP förbrukas, kommer syreflödet signalen minskar (tillstånd 4 andning).
5. Komplex IV beroende Respiration
- Förbered en oxygraph kammare som innehåller isolerad mitokondriell suspension (0,4 mg / ml) enligt det förfarande som beskrivs i steg 2,1 till 2,5 i protokollet och vänta på en stabil signal.
- Sedan injicera 2,5 mikroliter av 0,8 mM askorbat (1 mM). Omedelbart därefter injicera 2,5 mikroliter av 0,2M TMPD (0,25 mM) och 10 mikroliter av 0,05 M ADP (0,25 mM) i oxygraph kammaren och spela in cellulär andning tills de syreflödessignalen ökar och stabiliserar (3-5 min).
- Slutligen injicera 10 mikroliter av en M natriumazid (5 mM) "caution" in i oxygraph kammaren och registrera cellandningen tills syreflödessignalen minskar och stabiliserar.
OBS: Natriumazid är ett farligt gift och kan ha en betydande påverkan på människors hälsa.
6. cytokrom C Test
- Förbered en oxygraph kammare som innehåller isolerad mitokondriell suspension (0,4 mg / ml) enligt det förfarande som beskrivs i steg 2,1 till 2,5 i protokollet och vänta på en stabil signal.
- Injicera 12,5 mikroliter av 0,8 M malat (5 mM slutlig koncentration) och 10 | il av 2 M glutamat (10 mM slutlig koncentration) in i oxygraph kammare som innehåller isolerade mitokondriesuspension (0,4 mg / ml) genom titaninjektionsöppningen hos kammaren proppenoch registrera cellulär andning under 3-5 minuter tills en stabil syreflöde signal uppnås.
- Injicera 10 mikroliter av 0,5 M ADP (2,5 mM) in i oxygraph kammaren genom titaninjektionsöppningen hos kammaren proppen och spela in mitochondrial respiration tills signalen ökar syreflödet, sedan minskar och stabiliserar (3-5 min).
- Slutligen, injicera 5 mikroliter av 4 mM cytokrom c (10 ^ M) in i oxygraph kammaren och registrera cellulär andning under 5 minuter tills en stabil syreflöde signal uppnås.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Komplex I-beroende andning
Isolerade mitokondriella komplexa I-beroende andningsfrekvens (stater 2, 3 och 4) bestäms med hjälp av hög upplösning respiration (Figur 1, ett representativt diagram). Mitokondriella komplexa I- substrat, glutamat och målat, tillsättes följt av tillsats av ADP. Tillståndet 2 hänför sig till syreförbrukningen i närvaro av de ensamma substrat. Tillstånd 3 avser syreförbrukning i närvaro av substraten och ADP. State 4 avser syreförbrukning efter ADP utarmning. RCR är ett index på kopplingen av syreförbrukning till ATP produktion och beräknas som förhållandet mellan tillstånd 3 och stat 4. Såsom visas i figur 1, efter tillsats av ADP, den mitokondriella andningsfrekvensen ökar omedelbart (tillstånd 3 andning), och då minskar (tillstånd 4 andning) till nivåer mycket similar som stats 2. Detta tyder på en hög RCR och att mitokondriell integritet är väl bevarad under isoleringsförfarandet. Figur 2 är ett representativt diagram över mätning av ett lågt tillstånd 3 andetagsfrekvens och RCR, med ett högt tillstånd 4 andningshastighet, vilket indikerar olämpligt och misslyckade mitokondriell isolering. En hög andningsfrekvens på statlig 4 är en indikator på mitokondriell proton läckage 15.
Figur 1: Lyckad mitokondriell isolering: mitokondriell integritet är väl bevarad under isoleringsförfarandet. Kurvor från den högupplösta respiration med hjälp av glutamat och målat som substrat (komplex I-beroende andning). Den blå linjen representerar syrehalt. Den röda linjen representerar syreflödet (lutning syrehalt). den oxigen koncentration minskar med tiden som isolerade mitokondrier använder tillgängligt syre. Syreförbrukning uttrycks som pmol / (sx mg mitokondriellt protein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Misslyckad mitokondriell isolering: mitokondriell integritet är inte väl bevarad under isoleringsförfarandet indikerar olämpligt mitokondriell isolering. Kurvor från den högupplösta respiration med hjälp av glutamat och målat som substrat (komplex I-beroende andning). Den blå linjen representerar syrehalt. Den röda linjen representerar syreflödet (lutning syrehalt). Syrekoncentrationen minskar med tiden som isolerade mitokondrier använder tillgänglle syre. Syreförbrukning uttrycks som pmol / (sx mg mitokondriellt protein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Komplex II-beroende respiration
Isolerad mitokondriell komplex II-beroende andningsfrekvens (stater 2, 3 och 4) bestäms med hjälp av hög upplösning respiration (Figur 3, ett representativt diagram). För denna analys är det mitokondriella komplex I inhiberas genom tillsats av rotenon, och sedan succinat (komplex II substrat) tillsätts, följt av ADP. Figur 3 visar att vid tillsats av ADP, mitokondriella andning ökar omedelbart, och sedan minskar till nivåer mycket liknar den i tillstånd 2, vilket indikerar väl kopplade mitokondrier och attmitokondriell integritet är väl bevarat under isoleringsförfarandet. Det beräknade RCR värdet för denna typiskt experiment är 4,23, vilket är i nära överensstämmelse med de värden som visas i den tillgängliga litteraturen 10, 11, 23). Figur 4 är ett representativt diagram över mätning av ett lågt tillstånd 3 andetagsfrekvens och RCR, med ett högt tillstånd 4 andningsfrekvens som indikerar olämplig isolering.
Figur 3: Lyckad mitokondriell isolering: mitokondriell integritet är väl bevarad under isoleringsförfarandet. Kurvor från den högupplösta respiration med hjälp av succinat som substrat (komplex II-beroende andning). Den blå linjen representerar syrehalt. Den röda linjen representerar syreflödet (lutningsyrekoncentration). Syrekoncentrationen minskar med tiden som isolerade mitokondrier använder tillgängligt syre. Syreförbrukning uttrycks som pmol / (sx mg mitokondriellt protein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Misslyckad mitokondriell isolering: mitokondriell integritet är inte väl bevarad under isoleringsförfarandet indikerar olämpligt isolering. Kurvor från den högupplösta respiration med hjälp av succinat som substrat (komplex II-beroende andning). Den blå linjen representerar syrehalt. Den röda linjen representerar syreflödet (lutning syrehalt). Syrekoncentrationen minskar med tiden som isolerade mitochondria använda det tillgängliga syret. Syreförbrukning uttrycks som pmol / (sx mg mitokondriellt protein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Komplex IV beroende andning
Isolerade mitokondriella komplex IV beroende andningsfrekvens (stater 2, 3) bestäms med hög upplösning respiration (Figur 5, ett representativt diagram). För denna analys askorbat / TMPD och ADP tillsättes, följt av natriumazid för att inhibera komplex IV.
Skillnaden mellan syreförbrukning före och efter tillsats av natriumazid tolkas som den verkliga komplexa IV andning. Figur 5 är ett representativt diagram av measurement av hög komplex IV-beroende tillstånd 3 andningsfrekvensen indikerar att mitokondriell integritet är väl bevarad under isoleringsförfarandet. I motsats härtill är fig 6 ett representativt diagram över mätning av ett lågt tillstånd 3 som indikerar olämplig isolering.
Figur 5: Lyckad mitokondriell isolering: mitokondriell integritet är väl bevarad under isoleringsförfarandet. Kurvor från den högupplösta respiration med hjälp av askorbat / TMPD som substrat (komplex IV beroende andning). Komplex IV andning (tillstånd 3) tolkas genom att subtrahera syreförbrukningen före och efter tillsats av natriumazid. Den blå linjen representerar syrehalt. Den röda linjen representerar syreflödet (lutning syrehalt). Syrekoncentrationen minskar med tiden som isolerade mitochondria använda det tillgängliga syret. Syreförbrukning uttrycks som pmol / (sx mg mitokondriellt protein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Misslyckad mitokondriell isolering: mitokondriell integritet är inte väl bevarad under isoleringsförfarandet indikerar olämpligt isolering. Kurvor från den högupplösta respiration med hjälp av askorbat / TMPD som substrat (komplex IV beroende andning). Komplex IV andning (tillstånd 3) tolkas genom att subtrahera syreförbrukningen före och efter tillsats av natriumazid. Den blå linjen representerar syrehalt. Den röda linjen representerar syreflödet (lutning syrehalt). Syre concentration minskar med tiden som isolerade mitokondrier använder tillgängligt syre. Syreförbrukning uttrycks som pmol / (sx mg mitokondriellt protein). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utvärdering av den mitokondriella yttre membran integritet med hjälp av cytokrom c
För att utvärdera kvaliteten på mitokondriell beredning, cytokrom c test för att bestämma mitokondrie yttre membran integritet, genom mätning av mitokondrie andning efter efterföljande tillsats av glutamat och målat, ADP och cytokrom c (ADP stimulerade komplex II-beroende tillstånd 3 andning i närvaro av cytokrom c). Såsom visas i figur 7, betyder cytokrom c inte öka komplex I-beroende tillstånd 3 re inspiration av den isolerade mitokondrier, vilket indikerar att det inte fanns någon förlust av cytokrom c från den mitokondriella yttre membranet och mitokondriell integritet skyddas.
Figur 7: Cytokrom c inte öka andning av den isolerade mitochondrial: mitokondriell integritet är väl bevarad under isoleringsförfarandet. Kurvor från den högupplösta respiration använder glutamat / malat som substrat (komplex I-beroende andning). Den blå linjen representerar syrehalt. Den röda linjen representerar syreflödet (lutning syrehalt). Syrekoncentrationen minskar med tiden som isolerade mitokondrier använder tillgängligt syre. Syreförbrukning uttrycks som pmol / (sx mg mitokondriellt protein).m / filer / ftp_upload / 55251 / 55251fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mitochondrial isoleringsbuffert | |
| Kemisk | Koncentration |
| KCl | 100 mM |
| MgSO 4 | 10 mM |
| morpholinopropane sulfonsyra (MOPS) | 50 mM |
| etylendinitrilotetraättiksyra (EGTA) | 1,0 mm |
| ATP | 1,1 mM |
| pH 7,4 | |
| Mitokondriell tvättbuffert | |
| Kemisk | Koncentration |
| KCl | 100 mM |
| MOPS | 50 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| pH 7,4 | |
| Mitokondriell andning buffert 16 | |
| Kemisk | Koncentration |
| sackaros | 110 mM |
| EGTA | 0,5 mM |
| MgCl2 | 3,0 mM |
| KCl | 80 mM |
| K-laktobionat | 60 mM |
| KH 2 PO 4 | 10 mM |
| taurin | 20 mM |
| Hepes 20 mM | |
| BSA | 1,0 g / L |
| pH 7,1 | |
Tabell 1: Sammansättningen av buffertarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuella studien beskriver vi ett protokoll för att isolera hög kvalitet, intakta och tätt kopplade skelettmuskel mitokondrier genom differentiell centrifugering som kan användas för funktionella studier såsom hög upplösning respiration.
För att isolera intakta och tätt kopplade mitokondrier, det finns några kritiska punkter som skall beaktas inom det nuvarande protokollet. Efter skörd av benvävnad, bör det omedelbart ned i iskall mitokondriell isoleringsbuffert. Alla centrifugeringssteg bör göras vid 4 ° C och mitokondriell avstängning bör hållas alltid på is under isolering. Isoleringsförfarandet bör ske så snabbt som möjligt. Homogenatet skall centrifugeras i rena tvättmedelsfria centrifugrör. I slutet av förfarandet skall den mitokondriella suspension hållas koncentrerat och spädas strax före respiration. Eftersom respiration Data uttrycks som pmol per sekund per milligram av mitokondrie-protein, är det viktigt att använda en bra teknik för att noggrant mäta den mitokondriella proteinkoncentrationen efter isoleringen.
I vissa mitokondriella isoleringsförfaranden, kan det hända att mitokondrierna är okopplade eller inte förbrukar syre på rätt sätt med hög upplösning respiration. För att övervinna dessa problem, bör vävnaden alltid homogeniseras på samma sätt (samma antal slag) med användning av homogenisator med löst sittande mortelstöt (steg 1,12). Här, vi homogenisera alltid skelettmuskelvävnaden med hjälp av en automatiserad homogenisator med 10 slag. Ett högre antal slag kan skada och koppla loss mitokondrierna. Manuellt (och subjektivt) homogenisvävnadsprover i glas homogenisatorer kan producera olika kvaliteter av isolerade mitokondrier. Frysning av mitokondrierna också kan resultera i okopplade mitokondrier och man bör se till att centrifuge görs vid 4 ° C och inte under denna temperature. Mitokondrie integritet kan äventyras även om pH-värdet i buffertlösningar är felaktig eller centrifugeringsrören är inte ren. Man bör se till att de centrifugeringsrören är detergent-fria och ordentligt tvättad.
En av de första viktiga faktorer som skall beaktas vid isolering är att homogenisera vävnaderna på ett skonsamt sätt. Mjuka vävnader kräver milda mekaniska krafter som tillämpas under homogenisering, medan hårda vävnader kräver mycket starkare mekaniska krafter. Buffertar som användes under homogenisering och centrifugering bör vara iskall och har ett fysiologiskt relevant pH med en jonisk och osmotisk styrka kompatibel med cytosolen. För hårda vävnader, såsom skelettmuskel, efter mekanisk homogenisering, proteaser såsom trypsin kan tillsättas för att ytterligare dela upp vävnaden 4, 5.
Några av begränsningarna i isolerade mitokondrier, baserat på differential centrifugering är i) eventuellt skadade mitokondrier under homogenisering och isoleringsproceduren 19, ii) stora mängder av vävnadsprover som krävs för mitokondrie isolering, iii) eventuell förlust och förändringar i vissa mitokondriella elektronkomplex transportkedjan subenheter under homogenisering och centrifugering steg 18, och iv) den ökade produktionen av reaktiva syreradikaler under homogenisering och centrifugeringssteg, som kan störa mitokondriefunktion 18. Fördelama med Dounce homogenisering och differentialcentrifugeringsmetoden för att isolera rå mitokondrier för experiment andnings med avseende på existerande metoder såsom densitetsgradientcentrifugering 20 är att metoden är snabb och mitokondrier isoleras inom en kort tidsperiod. Därför kan utföras experiment andnings inom enh. Dessutom är det förfarande billig, mycket effektiv och mitokondrierna erhållna genom differentiell centrifugering kan användas för respiration analyser. Undersökningen av den mitokondriella syreförbrukning med hjälp av isolerade mitokondrier erbjuder flera fördelar jämfört med permeabiliserade fibrer eller celler: ingen signifikant interferens med cytosoliska proteiner som kan störa mitokondriefunktion och bioenergetik; inget behov av cellulär permeabilisering; och substrat av de mitokondriella andningskedjan komplex kan tillsättas direkt till de isolerade mitokondrier.
En av de alternativa metoder för att mäta skelettmuskulaturen mitokondrie andning är användningen permeabiliserade muskelfibrer 9. Några av fördelarna med de permeabiliserade muskelfibrer över isolerade mitokondrier är i) ingen mekanisk homogeniseringssteget behövs och, ii) mycket små mängder av vävnad (några mg) krävs för respiration analyser. Nackdelen med permeabilized muskelfiber är lägre syrediffusion till mitokondrier i fiberknippet. Denna diffusion begränsning kräver större mängder ADP under respiration analyser. En annan alternativ metod är användningen av hela vävnadshomogenat 22, som är en mycket snabb metod och kräver inte differentialcentrifugeringssteg för att isolera mitokondrier. Användning av hela vävnadshomogenat kan förhindra förlust av vissa mitokondrier under sin isolering, men det kan finnas andra cytosoliska faktorer närvarande, som kan störa analysen av mitokondriella funktioner som syreförbrukning.
Efter mastedifferentialcentrifugering för att isolera rå mitokondrier för andnings analyser är en framtida program för att undersöka andnings kapacitet mitokondrier isolerade via ny teknik såsom användning av mitokondriell yttre membran anti-TOM22 (translokas av yttre mitokondriemembranet 22 homolog) antikropps coupled magnetiska kulor 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
| Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
| EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
| Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
| K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
| MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
| Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
| O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
| Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
| Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
| Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
| Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |
References
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R. Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation. J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).
- Hartwig, S., et al. A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation. Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells. Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Vuda, M., et al. Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs. Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).
- Corrêa, T. D., et al. Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis. Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).
- Jeger, V., et al. Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro. Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics. 3, Academic Press. San Diego. (2002).
- Chance, B., Williams, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers. Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).
- Graham, J. M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).
- Franko, A., et al. Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads. PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).
- Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates. Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).
- Lombardi, A., et al. Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis. FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).
