Abstract
إعداد العينات هو المفتاح للكشف عن الأمثل والتصور من التحاليل في الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) التصوير الطيف الكتلي (IMS) التجارب بمساعدة مصفوفة. يمكن تحديد البروتوكول المناسب لمتابعة جميع مراحل عملية إعداد العينات من الصعب كما يجب أن يكون الأمثل كل خطوة ليتوافق مع خصائص فريدة من التحاليل من الفائدة. وتنطوي هذه العملية ليس فقط إيجاد مصفوفة متوافقة يمكن أن يلتفظ وتأيين جزيئات ذات الاهتمام بكفاءة، ولكن أيضا اختيار تقنية المصفوفة ترسب المناسبة. على سبيل المثال، وهي تقنية المصفوفة ترسب الرطب، الذي ينطوي على حل مصفوفة في المذيبات، هو الافضل لالامتزاز من معظم البروتينات والببتيدات، في حين أن تقنيات المصفوفة ترسب الجافة فعالة بشكل خاص للتأين من الدهون. تم الإبلاغ عن التسامي كوسيلة فعالة للغاية من ترسب مصفوفة الجاف للكشف عن نسبة الدهون في الأنسجة عن طريق MALDI IMS بسبب homogeneiتي واي لترسب مصفوفة الكريستال والحد الأدنى من عدم تمركز تحليلها بالمقارنة مع العديد من الأساليب ترسب الرطب 1 و 2. على نطاق واسع، فإنه ينطوي على وضع عينة ومصفوفة مسحوق في غرفة مختومة فراغ مع العينات الضغط على سطح بارد. ثم يتم إنزال الجهاز في حمام ساخن (الرمل أو النفط)، مما أدى إلى التسامي مصفوفة مسحوق على سطح عينة الأنسجة تبريده. نحن هنا وصف بروتوكول التسامي باستخدام 1،5-diaminonaphthalene (DAN) مصفوفة للكشف وتصور gangliosides في الدماغ الفئران باستخدام MALDI IMS.
Introduction
مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين (MALDI) التصوير الطيف الكتلي (IMS) أصبحت سعى للغاية بعد تقنية لرؤية التوزيع المكاني للدهون، والببتيدات والبروتينات عبر السطوح عينة سليمة. MALDI IMS كان يعرف سابقا باسم تقنية تحليلية لالتحاليل تنقيته قبل، ولكن في السنوات الأخيرة، فقد كان لافتا الانتباه في العديد من التخصصات الأخرى بسبب القدرة على الجمع بين دقة قياس الطيف الكتلي مع ارتفاع القرار نقاط مرجعية التشريحية / البصرية دون تحتاج لأي وضع العلامات الخارجي. مع استمرار تجمع علمي من الباحثين الاستفادة من هذه التقنية في النمو، وهناك زيادة الحاجة إلى بروتوكولات سهلة لمتابعة موحدة للمساعدة في تطوير وتعظيم الاستفادة من التجارب IMS. Gangliosides، مجموعة من الدهون غشاء فيرة للغاية في النظام العصبي المركزي، وتعتبر مثالية لإجراء التجارب MALDI IMS كما مواقعها، وجزءا لا يتجزأ من داخل الغشاء، يجعل SPECI معينوفاق المستحيل للكشف عن استخدام التقليدية المناعي وضع العلامات. بالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا، وذلك باستخدام MALDI IMS، أن هذه الدهون، التي تعمل كما جهري من الإشارات الخلوية، من بين أمور أخرى، لديها أنماط التوزيع التشريحي فريدة من نوعها في الدماغ القوارض الصحي التي يتم تعديلها بعد إصابات الدماغ 3، 4، 5. تقع Gangliosides في مجموعة والشامل أعلى بالمقارنة مع معظم أنواع الدهون، وبالتالي فهي أكثر ملاءمة لمنصة MALDI التصوير.
الشكل 1: سير العمل من MALDI IMS تجربة. الرسم البياني لسير العمل العام من تجربة MALDI IMS باستخدام التسامي. هو مقطوع الأنسجة المجمدة في -80 درجة مئوية في ناظم البرد و 10 ميكرومتر أقسام هي التي شنت ذوبان الجليد على الشرائح ايتو موصل. ثم يتم وضع الشريحة في مجفف حتى التسامي. سليتندس دي في جهاز التسامي ويتم تطبيق طبقة حتى من مصفوفة على سطح عينة الأنسجة. يتم تجميد عينات بين عشية وضحاها في الثلاجة -20 درجة مئوية ثم توضع في مجفف لمدة 10 دقيقة. مرة واحدة وقد تم تطبيق المعايير، يتم إدراج العينات في الصك MALDI حيث يتم توجيه الليزر عبر الأنسجة مما تسبب جزيئات المستوعبة في مصفوفة لتأيين. السفر الأيونات أسفل أنبوب الطيران ومنفصلة على أساس كتلتها (الوقت من الطيران / TOF) حتى وصولها إلى كاشف. يتم عرض المعلومات على وفرة الأيونية في التحاليل ضمن الكتلة للتهمة (م / ض) مجموعة محددة سلفا على حد سواء صورة الجزيئية والطيف الشامل. ويمكن استخدام هذه البيانات لكلا تصور وقياس وفرة الأيونية الحليلة المصالح داخل الأنسجة المصورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
إعداد عينةلMALDI IMS غير متغيرة بصورة كبيرة حيث أن كل خطوة من خطوات العملية يجب أن تكون مخصصة للالتحاليل من الفائدة. والسمة المميزة لتجاربه التي تستند MALDI-هو استخدام طلاء مصفوفة المتوضعة على سطح العينة قبل التحليل. بالإضافة إلى دور امتصاص ونقل الطاقة من الإشعاع من الليزر أثناء عملية الاجتثاث، مصفوفة يخدم أيضا لعزل التحاليل المختلفة من العينة، مما يسهل تحليل المركبات من الفائدة 6 و 7. تطبيق متجانس من مصفوفة لسطح العينة هي الخطوة الأكثر أهمية في عملية إعداد العينات. غير لائق مصفوفة ترسب يمكن أن يؤدي إلى كبيرة تشكيلات غير متجانسة مصفوفة الكريستال وتطوير الأعمال الفنية، وانخفاض ايون إشارة، وضعف استنساخ 7.
نظرا لتقارب بعض المصفوفات لعزل التحاليل محددة، ونوع من مصفوفة اختيار لتجربة يمكنتغيير كبير في النتيجة. المصفوفات المستخدمة في التصوير من البروتينات والببتيدات غالبا ما تختلف عن تلك المستخدمة لنسبة الدهون في التصوير وعملية تعقيدا بسبب الحاجة إلى إجراءات إضافية مثل الغسيل والإماهة الخطوات من أجل الكشف عن إشارات بنجاح من الأنسجة. على الرغم من وجود غسل خطوات لتعزيز الإشارات الدهون 8، فهي ليست شرطا مسبقا للكشف عن معظم أنواع الدهون. عند اختيار مصفوفة لتجربة الدهون التصوير، فمن المهم النظر في قطبية الدهون من الاهتمام حيث سيؤدي ذلك إلى تضييق نطاق المصفوفات مناسبة. على سبيل المثال، gangliosides تحتوي على بقايا حمض اللعابي الذي منحهم الاستقطاب السلبي العام. وهناك عدد من المصفوفات التي يمكن أن يلتفظ بفعالية وتأيين gangliosides من الأنسجة. ومع ذلك، هناك عوامل مثل قمم المشتقة من مصفوفة في الطيف والاستقرار في المصفوفة تحت فراغ يجب أن تؤخذ قيد النظر. 1،5-diaminonapthalene (DAN) مصفوفة مستقرة بما فيه الكفاية في ظل ظروف أداة فراغ بالنسبة لغالبية تطبيقات التصوير وأظهرت درجة عالية من الحساسية لالامتزاز الدهون، ويمكن استخدامها لتحليل الدهون في كل من وسائط أيون الإيجابية والسلبية 2. DAN مصفوفة، بالمقارنة مع غيرها من المصفوفات السلبي الدهون تقارب مثل حمض dihydroxybenzoic (DHB)، 9-aminoacridine (9-AA)، و5-كلورو-2-mercaptobenzothiazole (CMBT)، وكان قادرا على يلتفظ gangliosides من دماغ الفئران أكثر كفاءة الأنسجة في وضع الأيونات السالبة (مخطوطة قيد الإعداد).
اختيار الطريقة الملائمة لترسب مصفوفة غير ذات أهمية متساوية للاختيار المصفوفة نفسها. طرق مصفوفة ترسب الرطب حيث يذوب المصفوفة الصلبة في المذيبات العضوية، وأودعت التي تعمل بالهواء المضغوط أو آليا الرشاشات أو راصدي، هي فعالة بشكل خاص لالامتزاز من البروتينات والببتيدات كسائل يتخلل العينة للسماح للخارجction من المركبات وشارك في بلورة مع المصفوفة. على الرغم من أن هذه التقنيات يمكن أن تستخدم أيضا لتطبيقات الدهون، عدم التمركز تحليلها ومصفوفة متفاوتة تشكيلات الكريستال والحدوث بسبب وفرة عالية وقابلية ذوبان الدهون في المذيبات، وخاصة في الأنسجة 2 و 9. لأن الدهون هي المتأينة بسهولة من الأنسجة الجافة التقنيات ترسب مصفوفة مثل التسامي، وتقديم بسيط، والتكلفة بديل فعال للرشاشات في حين التحايل على العديد من العيب من هذه التقنيات. ويعزى نجاح التسامي في التجارب MALDI IMS إلى ميزات مثل التشكل الجريزوفولفين المصفوفة مما يزيد من مساحة السطح لمصفوفة الحليلة ملزمة، وزيادة نقاء مصفوفة، ومتجانسة ترسب مصفوفة مما يؤدي إلى زيادة استنساخ مقارنة مع تقنيات المصفوفة الرطب 1 و 10.
التسامي invoالتلاميذ تسخين مصفوفة مسحوق تحت فراغ تحت سطح العينة تبريد مما أدى إلى الحالة الصلبة إلى غاز مرحلة الانتقال من مصفوفة مسحوق تليها ترسب على سطح عينات الأنسجة على الفور. خلال التسامي، ويمكن التحكم ترسب مصفوفة بعوامل مختلفة مثل الساعة ودرجة الحرارة والضغط لتقديم نتائج استنساخه للغاية. تجربة التسامي واحدة يمكن أن تتخذ في أي مكان 5-20 دقيقة اعتمادا على نوع من مصفوفة محددة، والتي يمكن إعادة استخدامها عدة مرات قبل التخلص منها. جهاز يمكن شراؤها تجاريا في جزء صغير من سعر الرشاشات الآلية ويسهل تفكيكها للتنظيف والصيانة. منخفضة التكلفة والبساطة النسبية لهذه التقنية ترسب مصفوفة تجعله مثاليا للباحثين بداية أو التوسع فيها تطبيقات الدهون التصوير في MALDI IMS. على الرغم من أن المعلومات بالتفصيل بروتوكولات للتسامي من الأنسجة لIMS تم الإبلاغ عن 11، وعدد قليل بروتوكولات موحدة توجد ثهيك التركيز على العمل الأساسية المعنية مع إجراء تجربة التسامي لتصوير الدهون كتلة عالية في وضع الأيونات السالبة، مما يجعل من الصعب تحديد الأسلوب دون محاكمة واسعة والخطأ. ما يلي هو بروتوكول تجريبي يهدف إلى سد هذه الفجوة من أجل التسامي DAN مصفوفة على أقسام دماغ الفئران للتصوير عالية الدقة والكشف عن gangliosides.
الشكل 2: التسامي جهاز. صورة (A) والرسم التخطيطي (ب) من جهاز التسامي. توصيل مضخة الفراغ أنابيب المطاط إلى فخ بارد مليئة 300 مل من الايثانول. فخ البارد ثم يتم توصيلها عن طريق أنابيب المطاط إلى جهاز التسامي. يتكون الجهاز يتكون من قطعتين منفصلتين من الأواني الزجاجية التي مختومة مع المعدن U-المفصل. النصف العلوي من sublimatorيحتوي المكثف وهي مليئة طين الجليد. وسجلت لوحة العينة على الجزء السفلي من المكثف، داخل جهاز والزجاج مغلق. يحتوي على النصف السفلي من جهاز التسامي مصفوفة DAN، انتشرت التي تواجه بالتساوي لوحة عينة. خلال التسامي، يتم وضع جهاز والزجاج على حمام الرمل تسخينه إلى 140 درجة مئوية بحلول طبق ساخن أسفله مباشرة. مسبار درجة الحرارة يساعد على الحفاظ على درجة حرارة ثابتة طوال التجربة التسامي من خلال ردود الفعل لدرجة حرارة حمام الرمل بالمقارنة مع درجة الحرارة مسبقا للتجربة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع إجراءات التعامل مع الحيوانات المذكورة أدناه التمسك جامعة جنة رعاية الحيوان يسترن اونتاريو في (2016-014).
1. الأنسجة إعداد وباجتزاء
- استخراج أنسجة الدماغ من الفئران من خلال عملية تعرف باسم "الطازجة المجمدة استخراج" (الغذاء مقابل التعليم).
- الموت ببطء الفئران مع جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال ومراقبة ردود الفعل في الأطراف. مرة واحدة قد توقفت عن ردود الفعل، وقطع رأس فأر باستخدام المقصلة.
- بعناية فصل العضلات والأنسجة الأخرى من الجمجمة باستخدام مشرط. استخدام ملقط قطع العظام لكسر في الجمجمة لفضح الدماغ، بدءا من قاعدة الجمجمة (الثقبة ماغنوم) إلى الجزء الأمامي.
- مرة واحدة يتعرض لها المخ، حلج القطن بعناية بها مع ملعقة جراحية ووضع على الفور على الثلج الجاف المسحوق لتجميد فلاش.
ملاحظة: إن الدماغ يكون مرن جدا. لذلك، واتخاذ الحذر الشديد عند وضع الدماغ علىثلج جاف. إذا تم سحق الدماغ أو الضغط على أي سطح، فإنه سيتم تغيير شكله وتجميد في هذا الموقف.
- إزالة الأنسجة المجمدة الطازجة (لا مع perfused الفورمالديهايد أو جزءا لا يتجزأ من أكتوبر) من - 80 ° C الفريزر وتوضع على الثلج الجاف.
- ضع عدة قطرات من الماء على حامل ناظم البرد ومكان على أي من الثلج الجاف أو شريط تجميد ناظم البرد. الصحافة الأنسجة طفيفة على حامل ناظم البرد حيث يبدأ لتجميد وعقد حتى يتجمد الماء حول قاعدة النسيج والمراسي في مكانه. إضافة كميات إضافية من الماء لزيادة تأمين الأنسجة على حامل إذا لزم الأمر.
وتستخدم المياه بدلا من وسائل الاعلام أكتوبر لتركيب الأنسجة من أجل تجنب التلوث من النسيج مع المركبات التي يمكن أن تؤثر على الكشف عن الإشارة المطلوبة: ملاحظة. - الأنسجة موقف في ناظم البرد. قسم الأنسجة تصل إلى الموقع التشريحي المطلوب. تأكد من أن سماكة القطع ما بين 8-12 ميكرون.
ملاحظة: عندما باجتزاء الأنسجة في ناظم البرد الطائفيالأجهزة، فإنه لا بد أن المواد منفصلة مثل شفرات، فرش، القضبان المضادة للدوران، وأصحاب استخدامها من أجل تجنب التلوث مع تضمين المركبات. كما ينبغي تنظيفها من الداخل ناظم البرد تماما مع الايثانول قبل الاستخدام. - باستخدام ناظم البرد المضادة للشريط القوائم، ببطء قسم بالارض أقسام الأنسجة. يمكن أن تحدث ثقوب أو علامات على الأنسجة إذا وضع شريط القوائم غير صحيحة أو شفرة هو ممل. نقل الأنسجة إلى مركز تشريح منصة باستخدام فرشاة التلوين نظيفة.
- متزايد
- تجميد الشرائح الموصلة أو لوحات معدنية عن طريق وضعها في ناظم البرد أثناء تقطيع. عندما يتم تجميد الشريحة تماما، نقل بعناية الأنسجة مقطوع على سطح موصل من الشريحة باستخدام فرشاة التلوين نظيفة. مرة واحدة يتم وضع جميع أقسام الأنسجة بشكل صحيح على الشريحة، ووضع الإصبع تحت الشريحة، مقابل الأنسجة، والصحافة حتى يذوب هذا الباب.
ملاحظة: أقسام قد أضعاف أو حليقة أثناء عملية الذوبان عندمااستخدام هذا الأسلوب في تصاعد مستمر. يمكن تخفيض هذا عن طريق الحفاظ على الشريحة في ناظم البرد عند ذوبان الأنسجة. إذا أصبحت هذه القضايا الإشكالية، كبديل لذلك، يتم سرد دافئ جبل الأسلوب أدناه. - بدلا من ذلك، أخذ درجة حرارة الغرفة الإنديوم والقصدير أكسيد (ايتو) الشرائح (أو لوحة معدنية) واضغط برفق لأسفل على قسم الأنسجة المجمدة على سطح منصة تشريح، جنبا موصل أسفل. وسوف يؤدي ذلك إلى قسم الأنسجة ذوبان بالتساوي على سطح الشريحة مع القليل من الشباك أو قابلة للطي من الأنسجة.
ملاحظة: قد تظهر التكثيف أسفل المقطع عند تركيب باستخدام هذه الطريقة التي قد تؤدي إلى فقدان بعض البروتينات والدهون.
- تجميد الشرائح الموصلة أو لوحات معدنية عن طريق وضعها في ناظم البرد أثناء تقطيع. عندما يتم تجميد الشريحة تماما، نقل بعناية الأنسجة مقطوع على سطح موصل من الشريحة باستخدام فرشاة التلوين نظيفة. مرة واحدة يتم وضع جميع أقسام الأنسجة بشكل صحيح على الشريحة، ووضع الإصبع تحت الشريحة، مقابل الأنسجة، والصحافة حتى يذوب هذا الباب.
- وضع الشرائح مع الأنسجة في مجفف لل5-10 دقيقة.
2. Sublimator جهاز مجموعة المتابعة
ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوات في غطاء الدخان.
- وضع حمام الرمل في وعاء الألومنيوم على طبق ساخن، مع طبق ساخن على رفع مقص المعادنمن مساحة مناسبة (أي أكبر من صفيحة ساخنة). بدوره على طبق ساخن وضبط درجة الحرارة إلى 140 درجة مئوية.
ملاحظة: نقطة انصهار لDAN مصفوفة ما بين 187-190 درجة مئوية. لا تتجاوز درجة الحرارة هذه على موقد.- إذا تم تجهيز طبق ساخن في درجة حرارة ردود الفعل التحقيق، واستخدامها لمراقبة درجة حرارة الرمال في كافة مراحل التجربة والتأكد من درجة حرارة الاتساق. هذه الميزة يمكن أن تساعد مع استنساخ التجربة في مختلف التجارب التسامي.
ملاحظة: يجب أن ترد حمام الرمل في وعاء الألومنيوم كما وعاء زجاجي قد تتحطم عند درجات حرارة عالية.
- إذا تم تجهيز طبق ساخن في درجة حرارة ردود الفعل التحقيق، واستخدامها لمراقبة درجة حرارة الرمال في كافة مراحل التجربة والتأكد من درجة حرارة الاتساق. هذه الميزة يمكن أن تساعد مع استنساخ التجربة في مختلف التجارب التسامي.
- وضع 300 ملغ من DAN مصفوفة على السطح السفلي للجهاز التسامي. وضع مصفوفة في وسط الجهاز وانتشرت حتى في طبقة في عرض تقريبي وطول الشريحة يجري مصعد.
تنبيه: DAN مصفوفة سامة. ولذلك، من المهم ارتداء القفازات، والأقنعة، والسلامةنظارات واقية في جميع الأوقات عند التعامل مع المصفوفة المجفف. يجب أن يتم تخزين DAN في الظلام كما أنها خفيفة حساسة. - الشريط لوحة معدنية على السطح الداخلي للجهاز مع لوحة صنع اتصال مباشر مع الجزء السفلي من المكثف من أجل ضمان التوزيع المتساوي للحرارة التبريد عبر كامل سطح الشريحة خلال التسامي. بدلا من ذلك، الرمال أسفل المكثف لضمان سطح مستو.
- وضع الشريط على طول الحواف الخارجية للوحة والتمسك الجانبين من الأواني الزجاجية الداخلية. إذا تم وضع الشريط في إطار لوحة وتلتزم الجزء السفلي من سطح الزجاج الداخلي، قد لا يكون توزيع درجة الحرارة حتى ويمكن أن يؤدي إلى توزيع غير متكافئ مصفوفة على سطح الشريحة.
- الشريط فارغ (اختبار) ينزلق بشكل مائل على سطح لوحة معدنية مع الشريط وضعت مرة أخرى على الحواف الخارجية للشريحة.
- ربط الأجزاء العلوية والسفلية من الجهاز، ثإيث المطاط يا الدائري في الوسط لضمان وجود ختم كاملة.
- وضع معدن U-مفصل حول مركز الجهاز وتشديد الرذائل حتى يتم اغلاق النصف العلوي والسفلي من الجهاز بإحكام معا. ضع في المعدن يا الدائري فوق حمام الرمل.
- تأخذ حفنة من الثلج المجروش ووضعه في المكثف. ملء مكثف ¼ إلى ½ كامل مع الماء البارد لخلق طين الجليد. سوف طين الجليد تبريد صفيحة معدنية في داخل الجهاز وبعد ذلك الشريحة نلتزم به. انتظر 5 دقائق على الأقل لدرجة الحرارة للوصول إلى حالة مستقرة.
- صب 300 مل من الايثانول في حاوية فخ الباردة ووضع الأواني الزجاجية في وعاء. إسقاط 2-3 قطع صغيرة من الثلج الجاف في الإيثانول في قاع الإناء فخ الباردة. فخ المدخلات البارد لديه أنبوب زجاجي جارية إلى أسفل الاسطوانة، في حين أن الإنتاج لا.
- توصيل مضخة فراغ لانتاج فخ البارد باستخدام أنابيب مطاطية. استخدام قطعة أخرى من المطاطأنابيب لربط مدخلات فخ بارد للجهاز التسامي. تأكد من أن الأنابيب يتم تأمين بإحكام باستخدام مشابك معدنية إذا كانت متوفرة.
- استخدام مضخة فراغ لتقديم فراغ من 30 - 50 طن متري. السماح للمضخة لتشغيل لمدة 5 دقائق على الأقل للضغط موازنة. قد يكون من الرذائل في U-حلقة من جهاز التسامي إلى تشديد مرة أخرى يتم تشغيل المضخة فراغ على بسبب الضغط انخفض في الجهاز.
ملاحظة: يوصى بشدة أن مقياس فراغ أن تعلق على مضخة لمراقبة ضغط الفراغ خلال التجربة واختبار للكشف عن التسربات في الضغط من أجل تحقيق أعلى استنساخ محتمل بين التجارب. ومع ذلك، فقد تم تصميم معظم مضخات للحفاظ على الضغط المستمر، وبالتالي فإن مقياس قد لا يكون من الضروري للمستخدمين ذوي الخبرة. بالإضافة إلى ذلك، ختم فراغ الشحوم يمكن استخدامها للمساعدة في الحفاظ على ضغط الفراغ.
3. التسامي
- تأكد من أن درجة حرارة حمام الرمل له STABILأوتوماتيكية في 140 درجة مئوية، وأن يتم تأمين الجهاز في المعدن يا الدائري فوق حمام الرمل مع جميع أنابيب اتصال والفراغ قيد التشغيل.
- تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 7 دقائق ولكن لا تبدأ الموقت. ببطء رفع رفع مقص والرمل حمام تصل إلى جهاز التسامي حتى U-مفصل من sublimator هو أعلى بكثير من المعادن يا الدائري. هذه المساحة الإضافية يسمح لتعديل الجهاز على الرمال.
- اضغط بسرعة sublimator بلطف على سطح الرمال للتأكد من أن الجهاز هو الجلوس بالتساوي على الرمال، ومن ثم تبدأ على الفور الموقت.
- عندما يبدو الموقت، إيقاف مضخة فراغ وخفض بعناية رفع مقص حتى sublimator لم يعد لمس حمام الرمل ويجلس بشكل آمن في المعدن يا الدائري.
- ببطء تخفيف صمام تنفيس الجزئي للافراج عن الضغط في الجهاز. قم بفك الشبك المعدني حول أنابيب مطاطية للجهاز التسامي وتبدأ ببطء لتخفيف الأنبوب. وبمجرد أن رووقد خففت أنبوب BBER قليلا، وثني الأنبوب إلى جانب واحد للسماح للضغط المتبقية من الفرار.
- عندما يعود الضغط المحيطة، وإزالة بعناية أنابيب المطاط من جهاز التسامي.
- تخفيف الرذائل على U-مفصل من أجهزة وإزالتها. بعناية فصل شطري جهاز التسامي وسحب قبالة الشريحة من الجزء العلوي من الأواني الزجاجية الداخلية. فحص شريحة لتأكيد وتوزيع المصفوفة.
ملاحظة: إذا مصفوفة متفاوتة، مصفوفة مسحوق في الجزء السفلي من sublimator يمكن تعديل أوضاعها أو جهاز sublimator يمكن تعديل أوضاعها في الرمال لالشريحة التالية. عملية التسامي يمكن أن يتكرر عدة مرات باستخدام نفس المصفوفة، ومع ذلك، فإن مصفوفة تصبح في نهاية المطاف أكثر قتامة من التعرض للحرارة المتكررة وكمية من مسحوق سيقلل مثل هذا الوقت التسامي سوف يتعين تعديلها قليلا لتعويض. لهذا السبب، من المهم رصد مبلغ باي مصفوفةمصعد نانوغرام بعد كل تجربة لضمان الاتساق في ترسب مصفوفة بين الشرائح - إذا كان التوزيع وكمية من مصفوفة مصعد كافية، الشريط شريحة جديدة مع الأنسجة على الداخل من sublimator وتكرار القسم 3.
ملاحظة: لمراقبة الجودة (QC) الأغراض، وكمية من مصفوفة مصعد يمكن قياسها بعد كل تجربة وزنها عن طريق الشريحة قبل وبعد التسامي وقسمة الوزن من مصفوفة مصعد مع المساحة السطحية للشريحة 2، تجدر الإشارة إلى أن ويرجع ذلك إلى عدم الدقة في معظم جداول وراء 4 نقاط عشرية والتباين بين المقاييس، ينبغي أن تستخدم هذه القياسات سوى دليل لترسب مصفوفة الأمثل بدلا من وسيلة قابلة للقياس الكمي تماما QC ما لم يتم استخدام توازن عالية الدقة (انظر الشكل 3).
4. الأنسجة التخزين / الإماهة
- بعد التسامي، وتخزين الشرائح في حاوية مغلقة أو كاس صغيرETTE في كيس من البلاستيك مختوم.
- احتضان الشرائح في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو بين عشية وضحاها.
ملاحظة: إن الهدف من عملية التجميد هو بمثابة خطوة الإماهة عن الامتزاز من المواد الأنسجة في المصفوفة. وقد تبين أيضا عملية التجميد لمنع تدهور إشارات الدهون لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع عند تخزينها في -80 ° C 12. لهذا السبب، فإن مقدار الوقت يتم تخزين العينات في الثلاجة يمكن أن تختلف إلى درجة معينة لتتناسب مع احتياجات مجرب دون تغيير ملحوظ الكشف عن إشارة (كما لوحظ في مختبرنا). ومع ذلك، لاحظنا بعض تلون المصفوفة عندما يتم تجميد العينات لمدة أطول من 24 ساعة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. وبالتالي، فإننا نوصي تصوير الأنسجة مصعد قبل ذلك الوقت أو تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية لفترات حضانة أطول. - إزالة الشرائح من الفريزر (وعاء) ومكان في مجفف لل5-10 دقيقة.
5. التصوير و Analysis
- إزالة الشرائح من مجفف وتطبيق معايير أداة لضمان دقة الجماعية لأداة MALDI أثناء التصوير. ونوع من المعايير تختلف تبعا الأجهزة. وتطبق المعايير عموما بالتساوي عبر الشريحة بأكملها، الأنسجة المحيطة للتصوير (الشكل 3D).
- إدراج شريحة إلى أداة MALDI واتبع تعليمات الشركة الصانعة للتجارب التصوير (يجب أن يكون الأمثل طرق أداة ل1000 - مجموعة الشامل 2000). وقد حصلت الممثلة نتيجة (الشكل 4) في وضع سلبي reflectron مع النقطية 70 ميكرون و 20 طلقات / الطيف (اكتساب الوقت ~ 2 ساعة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عند الانتهاء من التجربة التسامي، ويفصل شطري جهاز الزجاج في غطاء الدخان والشرائح، مسجلة إلى المكثف، ويمكن إزالتها (الشكل 3A). عند هذه النقطة، ينبغي دراسة شريحة لالتوزيع غير المتكافئ مصفوفة والوقت ودرجة الحرارة، أو وضع الجهاز في الحمام الرمال قد يكون من الضروري تعديل لالشريحة التالية. وهناك الناجحة DAN التسامي التجربة يؤدي حتى طلاء رمادي / مصفوفة البني على طول سطح الشريحة حيث الخصائص التشريحية للأنسجة يمكن تصور واضح وكمية من مصفوفة على شريحة زجاجية تشبه لكمية على النسيج (الشكل 3B). على سبيل المثال، إذا تم مصعد الكثير من مصفوفة على الأنسجة، وسمك مصفوفة تغطي ملامح النسيج وفقط الشكل العام سيكون ملحوظ. ومع ذلك، إذا كان مصعد مصفوفة صغيرة جدا، فإن الأنسجة هالقد مظهر أغمق من بقية الشرائح (الشكل 3C). كلا كثيرا وسوف مصفوفة قليلة جدا يؤدي إلى ضعف الإشارة في الصك MALDI. لأغراض مراقبة الجودة، وتوماس وآخرون. وزن كمية من مصفوفة المودعة على الشريحة وتقسيم الوزن عن طريق المساحة السطحية للشريحة. وذكرت أنها مبلغ الأمثل للترسب مصفوفة لعدة مصفوفات بما في ذلك DAN (110 ميكروغرام / سم ²) 2. على الرغم من أن معظم أرصدة تفتقر إلى الدقة اللازمة لتكرار مثل هذه النتائج، حاولنا هذه الطريقة في مراقبة الجودة؛ ولكن نظرا لدرجة عالية من التباين، يمكننا تقديم المشورة فقط مجموعة مناسبة من ترسب مصفوفة وجدت لتكون مرتبطة ناجحة مقابل تجارب فاشلة التسامي مع DAN المصفوفة كما هو محدد من خلال الكشف عن إشارة في الصك. ارتبطت قياس مصفوفة من أقل من 100 ميكروغرام / سم ² مع "القليل جدا" شروط مصفوفة بينما كان قياس فوق 140 ميكروغرام / سم ²يرتبط مع "بدرجة كبيرة". تم العثور على ترسب مصفوفة ما بين 100 و 140 ميكروغرام / سم ² أن تكون الكمية المثلى للتصوير مع DAN المصفوفة. ينبغي تطبيق معايير معايرة على شريحة زجاجية حول عينات الأنسجة لضمان دقة الجماعية لإشارات IMS الكشف عن (الشكل 3D)
في تجربة MALDI IMS، وصورة الجزيئية تسمح التصور للتوزيع المكاني لتحليلها من الفائدة جنبا إلى جنب مع أي نوع من الأنواع غير المعروفة التي قد تكون موجودة في مجموعة والشامل معينة. تم مضافين الصور الجزيئية للgangliosides في هذه التجربة باستخدام برنامج ImageJ لإظهار التوزيع التشريحي للعديد من الأنواع غانغليوزيد عبر المناطق القشرية وتحت القشرية من الدماغ الفئران (الشكل 4A). وgangliosides الأكثر وفرة في الدماغ هي الأنواع A-سلسلة GD1a وGM1 ولكن أيضا تحتوي على gangliosides GM2 وGM3 التي يمكن أن تكون جميع وجدت بين1،000-2،000 م / مجموعة ض الشامل، مجموعة الشامل أعلى من معظم الدهون الدماغ المشتركة، مما يجعل هذه gangliosides السهل التعرف على طول الطيف (الشكل 4B). وفرة الأيونية من كل الأنواع غانغليوزيد يمكن استخدامها لشبه تحديد الاختلافات أو التغيرات في الأنواع غانغليوزيد داخل الصورة نفسها. لأن كمية معينة من التباين في العينة الإعدادية لا يمكن تجنبها في IMS، بين تعتبر مقارنات المسح الضوئي لتكون شبه كمي.
الرقم 3. DAN التسامي. نتائج ممثلة من التسامي من DAN مصفوفة على أنسجة دماغ الفئران. (A) وعند الانتهاء من التسامي، ويفصل شطري الجهاز وتتم إزالة الشريحة من المكثف. (ب) DAN مصفوفة ينتشر بالتساوي عبر عدة أقسام الأنسجة دماغ الفئران على سطح الشريحة للسماح repr للغايةالنتائج oducible (بين 100-150 ميكروغرام / سم ²). (ج) أمثلة من تجارب التسامي فشلت حيث مصفوفة القليل جدا (يسار - <90 ميكروغرام / سم ²) (اليمين أو الكثير من مصفوفة -> أودع 150 ميكروغرام / سم ²). أيضا مصفوفة قليلا وسوف يؤدي في الامتزاز كاف من التحاليل، في حين أن الكثير من مصفوفة لن تسمح ليزر لاختراق إلى الأنسجة خلال الاستحواذ، مما أدى إلى الكشف عن أيون منخفض. (D) الشريحة التي تحتوي على أقسام الأنسجة دماغ الفئران مصعد مع معايير مصفوفة ومعايرة DAN تطبيق مستعدة لإدراجها في الصك MALDI للتصوير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. MALDI IMS من Gangliosides في دماغ الفئران. Representativالبريد MALDI IMS صورة الجزيئية والطيف الشامل من gangliosides في الدماغ الفئران بعد التسامي مع DAN المصفوفة. الصورة الجزيئية هي مزيج مركب من الأنواع غانغليوزيد متعددة في الطيف مضافين وpseudocolored باستخدام برنامج J صورة لإظهار التوزيع التشريحي فريدة من الأنواع غانغليوزيد في جميع أنحاء الدماغ. الأنواع GM1d18: 1 (أحمر، كتلة ~ 1547 دا)، GM1d20: 1 (الأخضر وكتلة ~ 1573 دا)، GM3d18: 1 (الأزرق وكتلة ~ 1178 دا)، وGM3d20: 1 (البط البري والكتلة ~ 1207 دا) هي ممثلة. يعرض الطيف الكتلي وفرة الأيونية في التحاليل في غضون 1000 - مجموعة كتلة 2000. وصفت gangliosides A-سلسلة كبير على طول الطيف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تفاصيل هذا العمل بروتوكول موحد من التسامي مصفوفة على الأنسجة للكشف عن الدهون سالبة الشحنة، مثل gangliosides، في التجارب MALDI IMS. إعداد نموذج لMALDI IMS متغير بدرجة كبيرة، ويجب أن تكون مخصصة لتتناسب مع خصائص فريدة من نوعها لتحليلها من الفائدة. تطبيق مصفوفة على سطح عينة الأنسجة هو جانب هام من عملية إعداد العينات بالنسبة لنوعية النتائج في IMS. وينبغي إيلاء عناية خاصة عند اختيار المصفوفات، وضمان أن المصفوفة متوافق مع تحليلها من الفائدة وخالية من القطع الأثرية المشتقة من مصفوفة في الطيف. التسامي هو الجافة مصفوفة تقنية ترسيب الذي يوفر درجة عالية من التجانس مصفوفة وضوح الشمس مع عدم التمركز القليل من الدهون في الأنسجة. DAN مصفوفة على وجه الخصوص أظهرت درجة عالية من الحساسية للالامتزاز من مجموعة من الدهون غشاء سالبة الشحنة تسمى gangliosides، كما هو موضح في دماغ الفئرانأقسام، ومستقرة في ظل فراغ لفترات طويلة من الوقت، مما يسمح للتوافق مع معظم تطبيقات التصوير. DAN مصفوفة لها فائدة إضافية تتمثل في وجود أيضا قابلية عالية للأنواع الدهون موجبة الشحنة، وبالتالي زيادة براعة هذا مصفوفة لتطبيقات MALDI IMS 2. كما تجدر الإشارة إلى أن أنواع الدهون متعددة، بما في ذلك الدهون الفوسفاتية، ويمكن الكشف في وقت واحد عند استخدام هذا البروتوكول IMS.
فحص دقيق لخصائص DAN مصفوفة بالمقارنة مع 9 المصفوفات الأخرى المستخدمة عادة قد نشرت سابقا 2. في هذه المقالة، تسلط الضوء على الكتاب زيادة حساسية DAN مصفوفة في وضع الأيونات السالبة بالمقارنة مع المصفوفات الأخرى فحصها وكذلك القدرة على التصوير عالية الدقة باستخدام DAN. تم العثور على DAN مصفوفة لديهم أعلى مستوى من الأداء العام للأيونات القطبية السلبية. ومن المثير للاهتمام، أن يقوم EQUA كذلك LLY لأيونات القطبية إيجابية. المصفوفات الأخرى الشائعة التي أظهرت قابلية عالية للأيونات القطبية السلبية تشمل هيئة الصحة بدبي، DHB، و9-AA. كفاءة إدارة الشؤون الإنسانية في شكل مصفوفة محدودة بسبب استقرارها منخفضة في ظل فراغ مما يجعله غير عملي بالنسبة لمعظم تطبيقات التصوير 2. 9-AA له فائدة من إنتاج منخفضة الضوضاء الخلفية وتخصيب أظهرت إشارات سلفاتيد في 750 - مجموعة كتلة 950 في وضع سلبي مقارنة DHB مصفوفة 13. على الرغم من أن ثبت DHB أن تكون فعالة جدا في وضع إيجابي، فإنه يؤدي إلى تخفيض قطبية سلبية إشارة أيون بالمقارنة مع DAN مصفوفة 2. أظهر DAN المصفوفة أيضا زيادة حساسية في وضع الأيونات السالبة في نطاق الشامل السفلي (650-950) مقارنة DHB 2. بالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن أن DHB يمكن أن تشكل مجموعات مصفوفة كبيرة في الأيونات السالبة وضع ما يصل إلى 750 دا 2.
> وقد وصفت طريقة أخرى لمصفوفة الترسيب الجاف من قبل Puolitaival وآخرون. ، والذي يتم تمرير مصفوفة أرض الواقع من خلال منخل ناعم وتوضع على سطح العينة. الكتاب مقارنة هذه الطريقة الجافة من ترسب مصفوفة مصفوفة اليدوي تقنية الرذاذ الرطب، ووجدت أنها أعطت إشارة مماثلة لالفوسفورية في 450 - مجموعة كتلة 1200 14. استخدمت دراسة واحدة على حد سواء التسامي وجاف طلاء مع غربال لدراسة التعبير فوسفورية، ومع ذلك، فإن الكتاب لم يعلق على كيفية مقارنة الطريقتين من حيث دقة وضوح الصورة أو أيون العائد إشارة 15.
من أجل ضمان أوسع نطاق ممكن من التطبيق، كان بروتوكول قدم العمل الأساسية التي من شأنها أن تسمح لكل من المستخدمين الجدد وأكثر تخصصا من MALDI IMS لتحقيق نتائج استنساخه للغاية لمجموعة واسعة من التطبيقات الدهون التصوير. ومع ذلك، بروتوكولات التسامي يمكن تعديلها لتلبية UNIQUالظروف ه من التجربة. على سبيل المثال، ما يرام ترسب مصفوفة وضوح الشمس التي تقدمها التسامي يسمح للخيار عكس ترتيب وإعداد العينات من قبل الشرائح قبل طلاء / لوحات مع مصفوفة قبل تركيب الأنسجة. المصفوفة يمكن مصعد على سطح موصل مسبقا وتخزينها في بيئة مظلمة لاستخدامها لاحقا وبالتالي تقليل الوقت اللازم لإعداد عينة بعد باجتزاء مع الحفاظ على حساسية عالية للكشف عن الدهون 16 و 17. تعديل آخر التي يمكن تقديمها لهذا البروتوكول لتعزيز إشارة للكشف عن الدهون هو غسل 2 دقيقة مع فورمات الأمونيوم 8.
على الرغم من التسامي يمكن الالتفاف العديد من المآخذ على معظم تقنيات الترسيب الرطب، مثل أصغر حجما، وأكثر تجانسا مصفوفة الكريستال ترسب 1، انخفض تمركز التحاليل، والتكلفة المنخفضة بالمقارنة مع الرشاشات الآلية، لذلكلي تقلب في عملية إعداد عينة أمر لا مفر منه. في حالة التسامي، وهناك العديد من العوامل التي قد تسبب الخلافات دقيقة من تجربة إلى أخرى، ويمكن أن تشمل ما يلي التي لوحظت في مختبرنا. يمكن أن يكون هناك اختلافات في الموقف من جهاز التسامي على الرمال. عند تشغيل العديد من التجارب التسامي-العودة إلى الوراء، والرمل في حمام الرمل قد تبدأ في تغيير موقفها والتي يمكن أن تؤثر على تشتت الحرارة في جميع أنحاء حمام الرمل. يمكن تسطيح الرمل قبل كل جولة من التسامي أيضا تغيير تشتت الحرارة والرمال التي تم النازحين قد يستغرق وقتا طويلا للعودة إلى درجة حرارة موحدة. قد يكون من الضروري تعديل طفيف بين كل جولة للتعويض عن الرمال المتحركة في حمام الرمل الوقت التسامي. بدلا من ذلك، استخدام حمام الزيت قد يؤدي إلى تشتت الحرارة أكثر تجانسا.
ثانيا، كمية من مصفوفة في الجزء السفلي من sublimator يمكن أن تختلف. DAN ماتريس لديه مظهر رمادي ملتف ولديه ميل لتشكيل مجموعات كبيرة. هذه المجموعات يمكن تقسيم يدويا وترتيبها في الجزء السفلي من sublimator ولكن لا يمكن القضاء عليها تماما. سوف مجموعات كبيرة من مصفوفة يستغرق وقتا أطول لتسخين وتسامى من القطع الصغيرة التي يمكن أن تؤثر على المنتج النهائي من التسامي.
إخراج فراغ على جهاز التسامي هو عامل حاسم آخر. وأضاف أن معظم sublimators مع انتاج فراغ واحد على وهو يعلق أنابيب لتوصيله إلى مضخة فراغ خلال التسامي. لأنه يتم تنظيم الضغط على هذا الجانب من الجهاز، قد يكون هناك تفاوت طفيف من ترسب مصفوفة، مع أكثر إيداعها على الجانب مع الإخراج فراغ. وهذا يمكن أن يعوض إلى حد ما عن طريق تحويل أي موقف الجهاز في الرمال، والموقف من المصفوفة في الجزء السفلي من sublimator، أو عن طريق تغيير موقف الشريحة / لوحة على المكثف. هذه حقيقةأملاح الإماهة الفموية هي العوائق الرئيسية لهذه التقنية التسامي، ولهذا السبب لا بد من تشغيل شريحة اختبار من خلال عملية التسامي قبل تشغيل العينة التجريبية حتى ذلك الوقت يمكن تعديلها للتعويض عن هذه المتغيرات.
آخر العيب ذكرت التسامي هو أن الكشف عن التحاليل الجماعية ارتفاع محدود بسبب استخراج تحليلها كافية و / أو خلط مع المصفوفة. خطوة الإماهة بعد التسامي يمكن أن تساعد في سحب هذه التحاليل الجماعية أعلى للتحايل على هذه المسألة. ويتحقق ذلك عادة ما تستخدم غرفة الرطوبة 18. ومع ذلك، يتم إضافة خطوة تجميد في هذا البروتوكول بعد التسامي الذي يحقق نفس الغرض. تجميد والذوبان لاحق (في مجفف) من العينات قبل الإدراج في الصك MALDI يسبب تكاثف لتشكيل على سطح العينة التي rehydrates مؤقتا العينة للسماح لاستخراج الدهون الجماعية أعلى مع الحفاظ على منظمة الشفافية الدوليةssue لتحليل 12 و 17.
وعموما، التسامي هو طريقة فعالة حساسة للغاية وتكلفة تطبيق مصفوفة للكشف عن نسبة الدهون في التجارب MALDI IMS. في الواقع، وقد لاحظت مجموعتنا تحسينات كبيرة على النتائج IMS عندما انتقلنا من استخدام وسيلة الهواء رذاذ 3 إلى طريقة التسامي 4 لترسب مصفوفة. هذا البروتوكول هو المناسب لعدد من التطبيقات الدهون التصوير ولكن يمكن تعديلها لتتناسب مع احتياجات المجرب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
