Abstract
샘플 준비는 최적의 검출 및 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 이미징 질량 분석 (IMS) 실험 분석의 시각화를위한 열쇠입니다. 각 단계는 관심있는 분석의 고유 한 특성에 적합하도록 최적화해야합니다으로 샘플 준비 과정을 통해 수행 할 수있는 적절한 프로토콜을 결정하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 프로세스는 탈착 효율적 관심 분자를 이온화 할 수있는 호환 가능한 행렬을 발견 할뿐만 아니라 적절한 매트릭스 증착 기술을 선택하지 포함한다. 건조 매트릭스 증착 기술은 지질의 이온화에 특히 효과적인 반면, 예를 들어 용매에 용해 매트릭스를 수반 행렬 습식 증착 기술은, 대부분의 단백질 및 펩티드의 탈착 우수하다. 승화 인해 homogenei MALDI IMS에 의해 조직 내 지질의 검출 용 드라이 매트릭스 증착하는 매우 효율적인 방법으로보고되어왔다매트릭스 액정 증착 최소 분석 비국 재화의 TY 많은 습식 증착 방법 1, 2에 비해. 대체로, 그것은 차가운 표면에 가압 샘플과 진공 밀봉 챔버에서 샘플 가루 행렬을 배치하는 것을 포함한다. 장치는 냉각 된 조직 샘플의 표면 상에 분말 형 행렬의 승화 결과, 가열 조 (모래 또는 기름)으로 저하된다. 여기에서 우리는 MALDI IMS를 사용하여 쥐의 뇌에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 1,5- 디아 미노 (DAN) 매트릭스를 사용하여 승화 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 이미징 질량 분석 (IMS)되고 고도로 추구 그대로 샘플 표면에 걸쳐 지질, 펩타이드 및 단백질의 공간적 분포의 시각화를위한 기술 후. MALDI IMS는 이전에 미리 정제의 분석을위한 분석 기술로 알려져 있지만, 최근에는, 그 때문에없이 고해상도 영상 / 해부학 적 기준점과 질량 분석의 정확성을 결합 할 수있는 능력의 많은 분야에서 주목을 받고있다 외부 표시를 위해 필요합니다. 이 기술을 이용하여 연구의 과학적 풀 성장을 계속하기 때문에, IMS 실험의 개발 및 최적화를 지원하기 위해 표준화되고 쉽게 추적 프로토콜에 대한 필요성이 증가된다. 강글리오사이드, 중추 신경계에서 매우 풍부한 세포막 지질 그룹 멤브레인 내에 내장의 위치뿐만 MALDI IMS 실험 이상적은 특정하게 정시기존의 면역 라벨을 사용하여 탐지하는 것은 불가능 말이지. 또한, 우리는 세포 신호 전달의 조절 자로서 기능이 지질은, 다른 것들 중에서도, 뇌 손상 3, 4, 5 이후에 변경된다 건강한 쥐 뇌 고유의 해부학 적 분포 패턴을 가지고, MALDI IMS를 사용하여 도시 하였다. 강글리오사이드는 대부분 지질 종에 비해 더 높은 질량 범위에 위치하고, 따라서 MALDI 이미징 플랫폼에 가장 적합한다.
그림 1 : MALDI IMS 실험의 워크 플로우. 승화를 사용하여 MALDI IMS 실험의 일반적인 워크 플로 다이어그램. -80 ° C에서 냉동 조직은 저온 유지 장치로 구분되며, 10 μm의 섹션은 해동 전도성 ITO 슬라이드에 장착합니다. 슬라이드는 다음 승화 될 때까지 데시 케이 터에 배치됩니다. SLI는DES는 승화 장치에 삽입하고 행렬의 짝수 층은 조직 샘플의 표면에 도포된다. 시료를 10 분 동안 데시 케이 터에 배치 된 -20 ℃ 냉동고에서 밤새 동결. 기준이 적용 되었다면, 시료에 레이저가 이온화 매트릭스 분자의 이탈을 야기하는 조직을 가로 질러 지향되는 MALDI 기기에 삽입된다. 이온은 검출기에 도달 할 때까지 자신의 질량 (비행 시간 형 / TOF)을 기반으로 비행 튜브와 분리를 이동한다. 소정의 질량 - 대 - 전하 (m / z) 범위 내에서 분석의 이온 풍요 로움에 대한 정보는 분자 영상과 질량 스펙트럼 모두로 표시됩니다. 이 데이터는 시각화 영상화 조직 내의 관심 분석 물질의 이온 풍부 정량화 모두에 사용될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
샘플 준비프로세스의 각 단계는 관심의 분석에 정의해야합니다으로 MALDI IMS에 대한 높은 변수입니다. MALDI 기반 실험의 정의 기능은 분석하기 전에 샘플 표면 상에 증착 된 코팅 기질의 사용이다. 흡수 및 제거 프로세스 중에 레이저로부터 방사 에너지를 전달하는 역할 이외에도, 상기 매트릭스는 또한 그에 대한 관심 (6, 7)의 화합물의 분석을 용이하게 샘플로부터 여러 분석 물을 분리하는 역할을한다. 시료 표면에 대한 매트릭스의 균질 한 애플리케이션은 시료 준비 과정에서 가장 중요한 단계이다. 부적절한 매트릭스 증착은 큰 이종 매트릭스 결정 형성과 유물의 개발, 낮은 이온 신호와 가난한 재현성 7로 이어질 수 있습니다.
특정 매트릭스의 친화 특정 분석 물을 분리하기 위하여, 행렬의 형태는 실험 선정 인해 수상당히 결과를 변경. 단백질 및 펩티드의 이미징에 사용되는 기질은 종종 촬상 지질에 사용되는 것과 상이하고, 처리는 또한 그러한 성공적 조직으로부터의 신호를 검출하기 위해 세척 및 재수 화 단계와 같은 추가의 절차에 대한 필요성에 의해 복잡해진다. 세척 단계는 지질 신호 (8)의 향상을 위해 존재하지만, 이들은 대부분 지질 종의 검출을위한 전제 조건 아니다. 지질 이미징 실험의 매트릭스를 선택하는 경우, 적합한 행렬의 범위를 좁히는 것 등이 주목 지질의 극성을 고려하는 것이 중요하다. 예를 들어, 강글리오사이드는 그들에게 전반적으로 부정적인 극성을 제공 시알 산 잔기를 포함한다. 효과적으로 탈착 및 조직으로부터 강글리오사이드를 이온화 수 행렬들이있다; 그러나, 스펙트럼 진공하에 매트릭스의 안정성 행렬 유래의 피크와 같은 요인을 고려하에 수행되어야한다. 1,5-diaminonapthalene (DAN) 행렬 이미징 애플리케이션의 대부분의 악기 진공 상태에서 충분히 안정하고, 지질 탈착 고감도를 입증하고 양성 및 음성 이온 모드 둘 모두에서 지질의 분석에 이용 될 수있다. 이러한 히드 록시 벤조산 (DHB) -9- aminoacridine (9-AA) 및 5- 클로로 -2- 머 캅토 벤조 티아 졸 (CMBT) 다른 네거티브 지질 친 화성 매트릭스에 비해 DAN 매트릭스는 가장 효율적으로 쥐 뇌에서 강글리오사이드를 탈착 할 수 있었다 음이온 모드 (준비 원고)의 조직.
매트릭스 증착의 적절한 방법을 선택하면 행렬 자체를 선택하는 동일한 중요하다. 액체 추가를 허용하는 샘플 침투를 고체 매트릭스는 유기 용매에 용해시키고, 공압에 의해 증착 또는 분무기 또는 감시인 자동화 항 젖은 매트릭스 증착 방법은 단백질 및 펩티드의 탈착에 특히 효과적매트릭스와 화합물 및 공동 결정의 ction. 이러한 기술은 또한 지질 애플리케이션 분석 비편 재화 얼룩 매트릭스 액정 형성을 위해 사용될 수 있지만, 특히 조직이,도 9에 의한 지질 용매에의 높은 용해성 풍부 공통 사건이된다. 지질 용이 조직에서 이온화되므로 이러한 기술의 단점의 대부분을 회피하면서, 예컨대 승화 건조 매트릭스 증착 기술은 분무기에 간단하고 비용 효율적인 대안을 제공한다. MALDI IMS 실험에서 승화의 성공은 습식 매트릭스 기술 1, 10에 비해 증가 재현성 선도 같은 결합 매트릭스 분석 물질에 대한 면적을 증가 미세 매트릭스 형태 증가 매트릭스 순도 및 균일 한 매트릭스 증착 등의 기능에 기인한다.
승화 invo바로 조직 샘플의 표면 상에 증착 한 다음 분쇄 된 매트릭스 기체 상 전이 고체 결과 냉각 된 샘플의 표면 아래에 진공 분말 행렬 가열 아이브. 승화 동안 매트릭스 증착 시간, 온도 및 재현성이 높은 결과를 제공하는 압력과 같은 다양한 요인들에 의해 제어 될 수있다. 하나의 승화 실험은 폐기하기 전에 여러 번 재사용 될 수있는 선택된 기질의 종류에 따라 5 내지 20 분에 걸릴 수있다. 이 장치는 자동 분무기의 가격의 일부에서 상업적으로 구입하실 수 있습니다 쉽게 청소 및 유지 보수를 위해 따로 촬영됩니다. 낮은 비용과이 행렬 증착 기술의 상대적 단순 시작 또는 MALDI IMS 지질 이미징 애플리케이션에 확장 연구자에 이상적이다. IMS에 대한 조직의 승화 프로토콜 디테일 정보 (11)에보고되었지만, 몇몇 표준 프로토콜 w 존재HICH 어려운 광범위한 시행 착오없이 기술을 확립 할 수있게, 음이온 모드에서 높은 질량 지질을 이미징 승화 실험을 수행과 관련된 기본적인 흐름에 초점을 맞춘다. 다음은 고해상도 이미지 및 갱글 검출하는 쥐 뇌 부 상 DAN 행렬의 승화 그 격차를 목표 실험 프로토콜이다.
그림 2 : 승화 장치. 사진 (A) 및 승화 장치의 개략도 (B). 진공 펌프를 에탄올 300 mL로 채워진 냉각 트랩에 고무관으로 연결된다. 콜드 트랩은 다음 승화 장치 고무관으로 연결된다. 장치는 금속 U 조인트와 함께 밀봉 유리의 두 개의 분리 된 조각들로 구성된다. 승화의 위쪽 절반얼음 비자금으로 가득 콘덴서가 포함되어 있습니다. 샘플 플레이트는 유리 밀봉 장치 내부에, 콘덴서의 하부에 녹화된다. 승화 장치의 하단은 균일하게 샘플 플레이트에 직면 퍼져 DAN 행렬을 포함하고 있습니다. 승화하는 동안, 유리 장치 바로 아래에, 핫 플레이트에 의해 140 ℃로 가열 한 모래 욕에 배치된다. 온도 프로브 실험에 대한 설정 온도와 비교하여 모래 욕 온도 피드백을 통해 승화 실험을하는 동안 안정된 온도를 유지하는 데 도움. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물의 처리 절차는 웨스턴 온타리오의 동물 관리위원회 (2016-014) 대학을 준수 설명.
1. 조직 준비 및 단면
- "신선한 냉동 추출"(FFE)로 알려진 과정을 통해 쥐에서 뇌 조직의 압축을 풉니 다.
- 펜토 바르 비탈 나트륨의 과다 복용과 함께 쥐를 안락사와 사지의 반사 신경을 모니터링 할 수 있습니다. 모든 반사 신경이 중단되면, 단두대를 사용하여 쥐의 머리를 절단.
- 조심스럽게 메스를 사용하여 두개골에서 근육과 다른 조직을 분리합니다. 전방 부분에 두개골 (난원 매그넘)의 기초부터 시작하여 뇌를 노출하기 위해 두개골을 깰 뼈 절단 집게를 사용합니다.
- 뇌가 노출되면, 조심스럽게 수술 주걱으로 그것을 밖으로 퍼 즉시 플래시 동결에 대한 분쇄 된 드라이 아이스에 배치합니다.
주 : 뇌가 매우 가단 될 것입니다. 에 뇌를 배치 할 때 따라서 세심한주의를 기울입니다드라이 아이스. 뇌 분쇄 또는 표면에 대하여 가압되는 경우에는 그 형상을 변경하고, 그 위치에서 정지한다.
- 드라이 아이스에 80 ° C 냉장고 및 장소 - 신선한 냉동 조직 (안 포름 알데히드 관류 또는 OCT에서 포함)를 제거합니다.
- 드라이 아이스 또는 저온 유지 동결 바 중 하나에 저온 유지 장치 홀더와 장소에 물 몇 방울을 배치합니다. 를 눌러 조직 가볍게 저온 유지 장치 홀더에 그것은 조직의 기초 주위에 물이 정지 될 때까지 동결 길게하기 시작 제자리에 앵커. 필요한 경우 추가 홀더에 조직을 확보하기 위해 추가 물을 추가합니다.
주 : 물은 원하는 신호의 검출에 영향을 미칠 수있는 화합물과 조직의 오염을 피하기 위해 조직을 장착하는 대신 간섭 단층 매체로 사용된다. - 저온 유지 장치의 위치 조직. 원하는 해부학 적 위치까지 제 조직. 12 μm의 - 절단 두께가 8 사이에 있는지 확인하십시오.
참고 : 경우 공동 저온 유지 장치에 조직을 절편디바이스는, 이러한 블레이드, 브러쉬, 안티 - 롤 바, 홀더 별도의 재료 화합물 매립 오염을 방지하기 위해 사용되는 것이 필수적이다. 그라 이오 스탯의 내부는 완전히 사용하기 전에 에탄올로 청소해야합니다. - 그라 이오 스탯 안티 - 롤 바를 사용하여 천천히 섹션 조직 섹션을 평평. 롤 바의 위치가 올바르지 않거나 날이 무딘 경우 조직에 구멍 또는 표시가 발생할 수 있습니다. 깨끗한 붓을 사용하여 플랫폼을 슬라이스의 중심으로 조직을 이동합니다.
- 설치
- 슬라이싱하는 동안 저온 유지 장치에 배치함으로써 도전 슬라이드 또는 금속판을 고정. 슬라이드가 완전히 고정되면 신중 깨끗한 붓을 사용하여 슬라이드의 도전성 표면에 단면 조직을 움직인다. 모든 조직 절편을 슬라이드에 올바르게 배치되면 섹션을 해동 할 때까지, 슬라이드 아래에 손가락을 배치 조직 반대를 누릅니다.
참고 : 섹션은 접거나 해동 과정시시 컬 수있다이 설치 방법을 사용하여. 이것은 조직을 해동시 저온 유지 장치에서 슬라이드 유지함으로써 감소 될 수있다. 이러한 문제가 문제가 될 경우, 대안, 따뜻한 장착 방법은 아래에 나열되어 있습니다. - 다르게는, 실온 인듐 - 주석 산화물 (ITO)의 슬라이드 (금속 플레이트)를 가지고 가볍게, 슬라이싱 플랫폼 표면에 냉동 조직 절편에 도전면을 아래로 누른다. 이것은 균일 작은 컬링 또는 조직 폴딩 슬라이드의 표면에 조직 절편 녹고 이어질 것이다.
참고 : 설치 특정 단백질과 지질의 손실을 초래할 수있는이 방법을 사용하면 결로가 섹션 아래에 표시 될 수 있습니다.
- 슬라이싱하는 동안 저온 유지 장치에 배치함으로써 도전 슬라이드 또는 금속판을 고정. 슬라이드가 완전히 고정되면 신중 깨끗한 붓을 사용하여 슬라이드의 도전성 표면에 단면 조직을 움직인다. 모든 조직 절편을 슬라이드에 올바르게 배치되면 섹션을 해동 할 때까지, 슬라이드 아래에 손가락을 배치 조직 반대를 누릅니다.
- 10 분 - 5 데시 케이 터에서 조직과 슬라이드를 놓습니다.
2. 승화의 장치 셋업
참고 : 흄 후드에서 다음 단계를 수행합니다.
- 금속 가위 리프트에 핫 플레이트, 핫 플레이트에 알루미늄 용기에 모래 목욕을 배치해당 면적 (핫 플레이트보다 즉, 큰)의. 핫 플레이트를 켜고 140 ° C까지 온도를 설정합니다.
참고 : DAN 매트릭스의 융점이 187 사이입니다 - ° 190 C. 열판의 온도를 초과하지 마십시오.- 핫 플레이트의 온도 피드백 프로브가 장착 된 경우, 실험을하는 동안, 모래의 온도를 모니터링하고 온도 일관성을 보장하기 위해 사용. 이 기능은 다양한 승화 실험에서 실험의 재현성을 지원 할 수 있습니다.
주 : 모래 목욕은 고온에서 깨질 수있는 유리 용기로 알루미늄 용기에 포함되어야한다.
- 핫 플레이트의 온도 피드백 프로브가 장착 된 경우, 실험을하는 동안, 모래의 온도를 모니터링하고 온도 일관성을 보장하기 위해 사용. 이 기능은 다양한 승화 실험에서 실험의 재현성을 지원 할 수 있습니다.
- 승화 장치의 바닥면에 DAN 행렬 300mg의 배치. 장치의 중심부에 매트릭스를 놓고 승화되는 대략 폭과 슬라이드의 길이가 균일 한 층에 확산.
주의 : DAN 행렬 독성이다. 따라서, 중요한 마모 장갑, 마스크 및 안전성은항상 고글 분말 행렬을 처리 할 때. 이 빛에 민감로 DAN 어둠에 보관해야합니다. - 플레이트 승화 중에 슬라이드의 표면 전체에 걸쳐 냉각 온도의 균일 한 분포를 확보하기 위해서는 콘덴서의 바닥과 직접 접촉과 장치의 내부 표면 상에 금속판 테이프입니다. 대안 적으로, 모래 콘덴서의 바닥은 평탄면을 확보한다.
- 플레이트의 바깥 쪽 가장자리를 따라 테이프를 놓고 유리 내부의 측면에 부착. 테이프가 플레이트 아래에 배치하고, 내측 유리 표면의 하단에 부착되는 경우, 온도 분포가도 없을 수 있고, 상기 슬라이드의 표면에 걸쳐 불균일 한 매트릭스 분포 될 수있다.
- 빈 (테스트)를 테이프로 다시 슬라이드의 외측 가장자리에 배치 된 테이프와 상기 금속 플레이트의 표면을 가로 질러 대각선으로 밀어.
- w는, 장치의 상부 및 하부 부분을 연결중간에 고무 O 링 i 번째 완전한 밀봉을 보장합니다.
- 장치의 중심을 금속 U 조인트를 배치하고, 장치의 상부 및 하부 절반이 함께 단단히 밀봉까지 악을 조인다. 모래 목욕 위의 금속 O 링에 놓습니다.
- 분쇄 된 얼음의 소수를 타고 콘덴서에 넣습니다. 얼음 비자금을 만드는 차가운 물 전체 1/2 ¼ 콘덴서를 입력합니다. 아이스 슬러시는 부착 장치의 내부이어서 슬라이드 금속판을 냉각한다. 정상 상태에 도달하도록 온도를 적어도 5 분을 기다린다.
- 콜드 트랩 용기에 에탄올 300 mL로 붓고 용기로 유리를 배치합니다. 콜드 트랩 용기의 바닥에 에탄올에 드라이 아이스의 3 작은 조각 - 2를 삭제합니다. 출력이되지 않는 반면에 냉각 트랩 입력은 상기 실린더의 하단에 실행 유리관있다.
- 고무 튜브를 이용하여 콜드 트랩 출력 진공 펌프를 연결한다. 고무의 다른 부분을 사용하여튜브는 승화 장치에 냉각 트랩 입력을 연결합니다. 튜브가 단단히 가능한 경우 금속 클램프를 사용하여 고정되어 있는지 확인합니다.
- 50mT의 - (30)의 진공을 제공하는 진공 펌프를 사용한다. 펌프가 압력 평형 적어도 5 분 동안 실행할 수 있습니다. 진공 펌프 때문에 장치의 감소 압력이 설정되면 승화 장치의 U-링에 바이스 다시 강화해야 할 수 있습니다.
주 : 고 진공 게이지가 실험 기간 동안 진공의 압력을 모니터링하고 실험의 가장 높은 재현성을 달성하기 위해서 압력 누출 테스트는 펌프에 연결하는 것을 추천합니다. 그러나, 대부분의 펌프는 따라서 게이지는 숙련 된 사용자를위한 필수하지 않을 수 있습니다, 일정한 압력을 유지하도록 설계되었습니다. 또한, 진공 밀봉 그리스 진공 압력을 유지하는 데 도움이 될 수있다.
3. 승화
- 모래 목욕 온도가 STABIL이 있는지 확인140 ° C에서 상기 장치가 연결되어있는 모든 튜브 모래 욕 상기 금속 O 링에 고정되어, 진공 상태에 있는지화된.
- 7 분 타이머를 설정하지만 타이머를 시작하지 마십시오. 승화의 U-관절이 잘 금속 O 링 위에까지 천천히 승화 장치에 가위 리프트와 모래 목욕을 위로 올립니다. 이 여분의 공간은 모래에 장치의 조정을 할 수 있습니다.
- 신속 장치는 모래에 균등하게 앉아 있는지 확인하기 위해 모래 표면에 부드럽게 승화를 누른 다음 바로 타이머를 시작합니다.
- 타이머가 울리면, 진공 펌프의 전원을 끄고 조심스럽게 승화 더 이상 모래 목욕을 터치하고, 금속 O 링에 안전하게 앉아 때까지 가위 리프트를 내립니다.
- 천천히 장치 내의 압력을 해제 마이크로 배기 밸브를 풀고. 승화 장치의 고무 튜브 주위에 금속 클램프를 풀고 천천히 튜브를 느슨하게 시작합니다. RU에 한 번bber 튜브가 약간 완화되어, 잔류 압력이 탈출 할 수 있도록 일측에 상기 튜브 구부러.
- 주위 압력 반환 조심스럽게 승화 장치에서 고무 튜브를 제거합니다.
- 장치의 U-관절에 나쁜를 풀고 제거합니다. 조심스럽게 승화 장치의 두 부분을 분리하고 내부 유리의 상단에서 슬라이드를 당깁니다. 매트릭스 분포를도 확인하는 슬라이드를 검사합니다.
주 : 매트릭스 요철이면 승화의 바닥 분말 매트릭스는 재배치 될 수 있거나 승화 장치가 다음 슬라이드 모래에 재배치 될 수있다. 승화 공정이 동일한 매트릭스를 이용하여 여러 번 반복 할 수 있지만, 매트릭스 결국 승화 시간을 보상하기 위해 약간의 조정해야 할 것 같은 감소 반복 열 노출 분말의 양에서 어둡게 될 것이다. 이러한 이유로, 매트릭스 BEI의 양을 모니터하는 것이 중요NG는 슬라이드 사이의 매트릭스 증착의 일관성을 보장하기 위해 각 실험 후 승화 - 승화 행렬의 분포 및 양이 충분하면, 승화 반복 섹션 (3)의 내부에 조직과 새로운 슬라이드 테이프.
주 : 품질 관리 (QC)을 위해, 승화 행렬의 양은 전에 승화 후 슬라이드를 계량하고 상기 슬라이드 (2)의 표면적을 갖는 승화 매트릭스의 무게를 분할하여 각 실험 후 측정 할 수 있고, 그것은 주목해야한다 높은 정밀도 균형을 사용하지 않는 QC의 완전 정량화 수단 반대로 인해 4 소수점 포인트와 비늘 사이의 변화 이후 가장 저울의 정밀도의 부족으로, 이러한 측정은 최적의 매트릭스 증착을위한 가이드를 사용한다 (그림 참조 3).
4. 조직 저장 / 재수
- 승화 후, 저장소는 밀폐 용기 또는 작은 카스에 슬라이드밀봉 된 비닐 봉지에두기가.
- 2 시간 또는 하룻밤 -20 ° C의 냉동고에서 슬라이드를 품어.
주 : 냉동 프로세스의 목적은 매트릭스 조직에 물질의 탈착을위한 재수 단계로서 작용한다. 냉동 프로세스는 C 12 -80 °에 저장 될 때까지 1 주간 지질 신호의 열화를 방지하는 것으로 나타났다. 이러한 이유로, 샘플 냉동실에 저장되는 시간의 양이 상당히 (연구실에서 관찰 된 바와 같이) 신호 검출을 변경하지 않고 실험자의 필요에 따라 어느 정도 변할 수있다. 샘플은 -20 ° C에서 이상 24 시간 동안 냉동 그러나, 우리는 행렬의 일부 변색을 발견했습니다. 따라서, 우리는 그 시간 전에 승화 조직 이미징 이상 배양 기간 동안 -80 ° C에서 조직을 저장하는 것이 좋습니다. - 10 분 - 5 데시 케이 터에서 냉장고 (컨테이너)과 장소에서 슬라이드를 제거합니다.
5. 이미징 및nalysis
- 데시 케이 터에서 슬라이드를 제거하고 촬영하는 동안 MALDI 악기의 질량 정확성을 보장하기 위해 장비 기준을 적용합니다. 표준의 유형은 장비에 따라 달라집니다. 표준은 일반적으로 (그림 3D) 영상화하는 주변 조직, 전체 슬라이드에 걸쳐 균등하게 적용됩니다.
- MALDI 악기에 슬라이드를 삽입하고 영상 실험에 대한 제조업체의 지침 (악기 방법은 1000에 최적화되어야한다 - 2,000 질량 범위)에 따릅니다. 대표 결과 (그림 4)는 70 μm의 래스터 20 촬영 / 스펙트럼 (획득 시간 ~ 2 시간)으로 reflectron 부정적인 모드에 인수되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
승화 실험 종료 후, 유리에있어서의 두 개의 반쪽들은 응축기를 녹화, 흄 후드와 슬라이드에서 분리된다 (도 3a)를 제거 할 수있다. 이 시점에서, 슬라이드, 다음 슬라이드 조정되어야 할 수도 모래 욕에있어서의 불균일 한 매트릭스 분포, 시간, 온도, 또는 위치를 조사한다. 성공적인 DAN 승화 실험 조직의 해부학 적 특징이 명확하게 가시화 될 수있는 슬라이드 글라스 슬라이드 행렬의 양 표면을 따라 회색 / 갈색 행렬의 짝수 코팅 될 것이다하는 조직의 양 비슷 (그림 3B). 너무 매트릭스 조직에 승화 한 경우, 예를 들어, 매트릭스의 두께가 뚜렷한 것이다 조직 만 일반적인 형태의 기능을 포함한다. 너무 작은 행렬이 승화되는 경우, 조직은 헥타르 것슬라이드 (그림 3C)의 나머지 부분보다 어두운 외관을했습니다. 둘 다 너무 너무 작은 행렬은 MALDI 악기 가난한 신호가 발생합니다. 품질 관리 목적을 위해, 토마스 등의 알. 슬라이드 상에 증착 행렬의 양을 칭량하고, 슬라이드의 표면 면적으로 나눈 중량. 그들은 DAN (110 μg의 / cm²) 2 등 여러 가지 행렬에 대한 행렬 증착의 최적의 양을보고했다. 가장 균형 결과는 복제를 위해 필요한 정밀도가 부족했지만, 우리는 QC이 방법을 시도 하였다; 그러나, 변동의 높은 수준으로, 우리는 기기에서의 신호 검출을 통해 결정된 발견 매트릭스 증착 적절한 범위가 DAN 행렬 실패 승화 실험 대 성공적인 연관 조언 할 수있다. 140 μg의 위 / cm²의 측정 동안 아래에 100 μg의 / cm²의 매트릭스 측정은 "너무 작은"매트릭스 조건과 연관이 있었다"너무 많이"와 관련. 100 및 140 μg의 / cm² 간의 매트릭스 증착 DAN 행렬 이미징을위한 최적 량이었다. 보정 표준 IMS 검출 신호의 질량 정확도를 보장하기 위해, 조직 샘플의 주위에 유리 슬라이드에 도포한다 (도 3D)
MALDI IMS 실험에서, 분자 영상은 소정의 질량 범위에 존재할 수있는 임의의 알려지지 않은 종과 함께 피검의 공간적 분포의 시각화를 허용한다. 이 실험에서 강글리오사이드의 분자 영상은 래트 뇌 (도 4a)의 피질 및 피질 영역에 걸쳐 여러 갱글 리오 종의 해부학 적 분포를 보여 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 적층했다. 뇌에서 가장 풍부한 강글리오사이드는 A-시리즈 종 GD1a와 GM1 강글리오사이드뿐만 아니라 GM2과 GM3 모든 사이에서 발견 할 수 있습니다 포함되어스펙트럼 (그림 4B)을 따라 쉽게 식별 할 수 이러한 강글리오사이드을 1,000-2,000 m / z 질량 범위, 가장 일반적인 뇌 지질보다 높은 질량 범위. 각 강글 리오 시드 종의 이온 풍요가 사용할 수있는 동일한 이미지 내 강글 리오 시드 종의 차이 또는 변화를 반 정량화. 스캔 비교는 반 정량적 인 것으로 간주 사이 샘플 준비 가변성 일정량이 IMS에 회피 할 수 있기 때문이다.
3. DAN 승화 그림. 쥐의 뇌 조직에 DAN 행렬의 승화의 대표 결과. 승화 종료하면 (A)은, 장치의 두 부분을 분리하고, 슬라이드는 응축기로부터 제거된다. (B) DAN 행렬은 매우를 repr 허용하도록 슬라이드의 표면에 다수의 래트 뇌 조직 절편 고르게 퍼지는oducible 결과 (100 사이 - 150 μg의 / cm²). (C) (좌 - <90 μg의 / cm²) 또는 너무 매트릭스 (우측 -> 너무 적은 매트릭스 실패 승화 실험 예 150 μg의 / cm²)을 증착 하였다. 너무 많은 매트릭스 레이저가 낮은 이온 검출 결과, 취득시 조직에 침투하는 것을 허용하지 않습니다 동안 너무 작은 행렬은 분석의 부족 탈착 발생합니다. (D) 적용 DAN 행렬 및 교정 표준을 승화 쥐의 뇌 조직 섹션을 포함하는 슬라이드 이미징을위한 MALDI 기기에 삽입 준비가되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 쥐 뇌에서 강글리오사이드 4. MALDI IMS. Representativ전자 MALDI IMS 분자 영상과 DAN 행렬 승화 후 쥐의 뇌에 강글리오사이드의 질량 스펙트럼. 분자 영상 중첩 스펙트럼 여러 갱글 종의 복합체이며, 뇌 강글 리오 시드에 걸쳐 종의 독특한 해부학 적 분포를 표시하는 이미지 J 소프트웨어를 이용하여 모조 착색. 종 GM1d18 : 1 (빨강, 대량 ~ 1547 다), GM1d20 : 1 (녹색, 대량 ~ 1573 다), GM3d18 : 1 (파란색, 대량 ~ 1178 다), 및 GM3d20 : 1 (청록, 대량 ~ 1207 다)가 있습니다 표현. 질량 범위 000 - 1000 내의 분석 물의 질량 스펙트럼 표시 이온 풍부. 주요 A-시리즈 강글리오사이드는 스펙트럼 함께 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 작품은 MALDI IMS 실험에서 같은 강글리오사이드와 같은 음으로 하전 된 지질의 검출을위한 조직에 매트릭스 승화의 표준화 된 프로토콜을 자세히 설명합니다. MALDI IMS에 대한 샘플 준비는 매우 다양하고 관심있는 분석의 고유 한 특성에 맞게 사용자 정의 할 수 있어야합니다. 조직 샘플의 표면 상에 매트릭스의 적용은 IMS에서의 검색 결과의 품질에 관해서 시료 준비 과정의 중요한 측면이다. 매트릭스가 관심의 분석과 호환되며 스펙트럼의 매트릭스에서 파생 된 유물의 무료 보장, 행렬을 선택할 때 특별한주의를 기울여야한다. 승화 조직에서 지질의 작은 비편 재화와 매트릭스 액정 균질성 고도를 제공 건조 매트릭스 증착 기술이다. 특히 DAN 행렬 쥐 뇌에서 입증 된 바와 같이, 강글리오사이드라는 음전하 막 지질 그룹의 탈착 고감도를 도시섹션, 및 이미징 대부분의 응용 프로그램과의 호환성을 허용, 장시간 진공 하에서 안정적입니다. DAN 행렬은 양전하 지질 종에 대한 높은 친 화성을 갖는, 따라서 MALDI IMS 애플리케이션이이 행렬의 다양성을 증가시키는 추가 이점을 갖는다. 또한이 IMS 프로토콜을 사용할 때 인지질 등의 여러 지질 종, 동시에 검출 될 수 있음에 유의해야한다.
9 일반적으로 사용되는 행렬에 비해 DAN 행렬의 특성에 대한 철저한 검사 이전에 2 게시되었습니다. DAN을 사용하여 고해상도로 촬상하는 기능뿐만 아니라, 다른 검사 행렬에 비해,이 문서에서, 저자는 음이온 모드 DAN 행렬의 증가 된 감도를 강조. DAN 행렬 극성 이온에 대한 높은 전반적인 성능을 갖는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도,이 등식을 수행에서야 잘 양극 이온. 극성 이온에 대한 높은 선호도를 보여 주었다 다른 일반적인 행렬은 DHA, DHB, 9-AA를 포함한다. 기재 인 DHA의 효율성은 대부분의 이미징 애플리케이션이 것은 실용적이지 진공 하에서 낮은 안정성에 의해 제한된다. DHB 매트릭스 (13)에 비해 음의 모드 질량 범위 950 - 9 AA 낮은 소음 및 750 sulfatide 신호 입증 농축 제조의 이점을 갖는다. DHB는 양 모드에서 매우 효과적인 것으로 도시되었지만,이 DAN 행렬이에 비해 낮은 극성의 이온 신호를 산출한다. DHB 2 비교 - DAN 행렬은 낮은 질량 범위 (950 650)에 음이온 모드에서 증가 감도를 보여 주었다. 또한, DHB는 750에 음이온 모드까지 다이 상당한 매트릭스 클러스터를 형성 할 수있는 것으로보고되었다.
동부 등에 의해 설명되었다. 어느 지상 행렬 미세한 체를 통과하고, 시료 표면 상에 침착. 저자는 젖은 행렬 수동 스프레이 기술로 매트릭스 증착이 건조 방법을 비교하고 그들이 450의 인지질에 대한 비교 신호를 준 것으로 나타났습니다 - 1,200 질량 범위 14. 한 연구는 그러나, 저자는 두 가지 기술은 이미지 해상도 또는 이온 신호 수율 (15)의 측면에서 비교하는 방법에 대해서는 언급하지 않았다, 인지질 발현을 조사 체로 승화 건조 코팅을 모두 사용했다.
적용 가능한 여러가지을 보장하기 위해, 제시된 프로토콜은 MALDI IMS의 신규하고보다 전문 사용자 지질 촬상 다양한 애플리케이션에 매우 재현 가능한 결과를 달성 할 수 있도록 기본 흐름이었다. 그러나, 승화 프로토콜은 UNIQU 맞게 수정 될 수있다실험 예 사정. 예를 들면, 승화에 의해 제공된 미세 매트릭스 액정 증착 프리 코팅 슬라이드하여 시료 준비의 순서를 반대로 옵션 / 매트릭스 플레이트 전 조직에 장착 가능하다. 매트릭스는 미리 도전성 표면에 승화 때문에 여전히 지질 검출부 (16), (17)에 대한 높은 감도를 유지하면서, 샘플 준비 시간 후 절편 감소 나중에 사용하기 위해 어두운 환경에서 저장 될 수있다. 지질의 검출 신호를 향상시키기 위해 이러한 프로토콜이 만들어 질 수있는 또 다른 변형 예는 포름산 암모늄 (8)와 2 분간 세척한다.
승화는 작은 대부분의 습식 증착 기술의 단점의 대부분을 회피 할 수 있지만,보다 균질 매트릭스 결정 석출 1이므로, 자동화 스프레이와 비교 분석의 비국 재화 및 낮은 비용을 감소샘플 제조 프로세스 나 변동이 불가피하다. 승화의 경우에, 다른 한 실험에서 미세한 차이가 발생할 수 있고, 우리 실험실에서 관찰 한 다음을 포함 할 수있는 여러 요인들이있다. 모래에 승화 장치의 위치에 차이가있을 수 있습니다. 백투백 승화 여러 실험을 실행하는 경우, 샌드 배스에서 모래 모래 욕에 걸쳐 열 분산에 영향을 미칠 수있는 그 위치를 이동하기 시작할 수있다. 승화의 각 라운드하기 전에 모래를 평평하게하면 균일 한 온도로 돌아가려면 시간이 걸릴 수 있습니다 변위 된 모래로 열 분산을 변경할 수 있습니다. 승화 시간 모래 욕으로 모래 시프트를 보상하기 위해 각 라운드간에 약간 조정될 필요가있다. 대안 적으로, 오일 욕을 사용하면보다 균일 한 열 분산을 초래할 수도있다.
둘째, 승화 하단의 매트릭스의 양이 달라질 수있다. DAN 마트X는 큰 덩어리의 회색 외관이 큰 클러스터를 형성하는 경향이있다. 이러한 클러스터들은 수동으로 망가와 승화의 하부에 배치되지만 완전히 제거 할 수는 없습니다. 행렬의 대형 클러스터는 가열 승화의 최종 제품에 영향을 미칠 수있는 작은 조각보다 승화하는 데 시간이 더 소요됩니다.
승화 장치에서 진공 출력은 또 다른 중요한 인자이다. 대부분 sublimators은 튜브가 승화하는 동안, 진공 펌프에 연결 부착 된 상 단일 진공 출력 만들어진다. 압력은 장치의 측면에서 규제되고 있기 때문에, 더욱 진공 출력 측에 증착되면서, 매트릭스 증착 약간 편차가있을 수있다. 이것은 어느 정도 모래에있어서의 위치를 이동함으로써, 승화의 바닥 행렬의 위치 또는 응축기의 슬라이드 / 플레이트의 위치를 변경함으로써 보상 될 수있다. 이러한 사실ORS는 승화 방식의 주 단점이 있으며 이러한 이유로 그 시간은 이러한 변수를 보상하도록 조절 될 수 있도록 실험 예를 실행하기 전에 승화 과정을 통해 테스트 슬라이드를 실행하는 것이 중요하다.
승화의 다른보고 단점은 높은 질량 분석 물의 검출은 불충분 분석 추출 및 / 또는 매트릭스와 혼합에 의해 제한된다는 것이다. 승화 후의 재수 단계는이 문제를 회피하기 위해 이러한 높은 질량 분석을 꺼내 도움이 될 수 있습니다. 이것은 일반적으로, 습도 챔버 (18)를 사용하여 달성된다. 그러나,이 프로토콜에 동결 단계는 동일한 목적을 달성 승화 후에 첨가된다. 말디 기기에 삽입하기 전에 샘플의 동결 (건조기)에서 후속 해동는 TI를 유지하면서 임시 높은 질량 지질의 추출을 허용하도록 샘플 재수 샘플의 표면 상에 형성하는 응축을 야기분석 (12), (17)에 대한 ssue.
전반적으로, 승화 MALDI IMS 실험에서 지질의 검출을위한 행렬 애플리케이션의 고감도 및 비용 효율적인 방법이다. 우리는 매트릭스 증착 승화 방법 4 공기 스프레이 방법 3을 사용하여 이동 할 때 실제로, 우리 그룹은 IMS 결과에 상당한 개선을 발견했습니다. 본 프로토콜은 지질 촬상 다수의 애플리케이션에 적합하지만, 실험자의 요구에 적합하도록 변형 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
