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Neuroscience

Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa

Published: March 23, 2017 doi: 10.3791/55254

Abstract

A preparação da amostra é a chave para a detecção e a visualização de analitos em experiências com laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) óptima. Determinação do protocolo apropriado para seguir em todo o processo de preparação da amostra pode ser difícil já que cada passo tem de ser optimizado para satisfazer as características únicas dos analitos de interesse. Este processo envolve não só em encontrar uma matriz compatível que pode desorver e ionizam as moléculas de interesse de forma eficiente, mas também seleccionar a técnica de deposição de matriz apropriada. Por exemplo, uma técnica de deposição húmida da matriz, o que implica a dissolução de uma matriz no solvente, é superior para a dessorção da maior parte das proteínas e péptidos, enquanto que as técnicas de deposição de matriz secas são particularmente eficazes para a ionização de lípidos. A sublimação foi classificado como um método altamente eficiente de deposição da matriz seco para a detecção de lípidos no tecido por MALDI IMS devido à homogeneity de deposição de cristais de matriz e mínima deslocalização analito, em comparação com muitos métodos de deposição molhadas 1, 2. Em termos gerais, que envolve colocar uma amostra em pó e a matriz em uma câmara de vácuo com as amostras pressionada contra uma superfície fria. O aparelho é então reduzido para um banho aquecido (areia ou óleo), resultando em sublimação da matriz em pó sobre a superfície da amostra de tecido arrefecida. Descrevemos aqui um protocolo de sublimação utilizando 1,5-diaminonaftaleno matriz (DAN) para a detecção e a visualização de gangliósidos no cérebro de rato utilizando MALDI IMS.

Introduction

laser assistida por matriz de Dessorção / ionização (MALDI) Imagiologia espectrometria de massa (IMS) está a tornar-se uma técnica muito procurado para a visualização da distribuição espacial dos lípidos, péptidos e proteínas através de superfícies intactas de amostra. MALDI IMS foi anteriormente conhecido como uma técnica analítica para analitos pré-purificado, mas em anos recentes, tem-se chamar a atenção em muitas outras disciplinas por causa da capacidade de combinar a precisão de espectrometria de massa com pontos de referência de alta resolução visuais / anatómicas sem a precisa para qualquer rotulagem externo. Como a associação científica dos investigadores que utilizam esta técnica continua a crescer, há um aumento da necessidade de protocolos, fácil de seguir normalizados para auxiliar no desenvolvimento e optimização das experiências IMS. Os gangliósidos, um grupo de lípidos da membrana altamente abundantes no sistema nervoso central, são ideais para experiências MALDI IMS como a sua localização, incorporado no interior da membrana, faz certa especificidadees impossível detectar utilizando Imuno-rotulagem convencional. Adicionalmente, temos mostrado, utilizando MALDI IMS, de que estes lípidos, que funcionam como moduladores da sinalização celular, entre outras coisas, têm perfis de distribuição anatómica original no cérebro de roedores saudáveis que são modificadas após a lesão cerebral 3, 4, 5. Os gangliósidos estão localizados a uma gama de massa mais elevada em comparação com a maioria das espécies de lípidos, e são, assim, mais adequado para a plataforma de imagem MALDI.

figura 1
Figura 1: Fluxo de trabalho de MALDI IMS Experiment. Diagrama do fluxo de trabalho geral de uma experiência MALDI IMS usando sublimação. Tecido congelado a -80 ° C é seccionado num criostato e 10 uM secções são montadas em lâminas de degelo ITO condutoras. A lâmina é então colocado num excicador até sublimação. Slides são inseridas no aparelho de sublimação e mesmo uma camada de matriz é aplicada à superfície da amostra de tecido. As amostras são congeladas durante a noite num congelador a -20 ° C e depois colocada num excicador durante 10 minutos. Uma vez que tenham sido aplicados os padrões, as amostras são inseridas no instrumento MALDI onde um laser é dirigido através do tecido, causando moléculas dessorvidas na matriz para ionizar. Os íons de viajar para baixo um tubo de vôo e separada com base em sua massa (time-of-flight / TOF) até chegar ao detector. A informação sobre a abundância iónica de analitos num (m / z) gama predeterminada de massa-carga é apresentada como uma imagem de ambos molecular e espectro de massa. Estes dados podem ser utilizados para visualizar e quantificar tanto a abundância iónica do analito de interesse dentro do tecido impressa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Preparação de amostrapara MALDI IMS é altamente variável à medida que cada etapa do processo deve ser personalizado para os analitos de interesse. A característica definidora de experiências baseadas em MALDI é o uso de um revestimento de matriz depositada sobre a superfície da amostra antes da análise. Em adição à função de absorver e transferir energia de radiação do laser durante o processo de ablação, a matriz também serve para isolar vários analitos a partir da amostra, facilitando assim a análise de compostos de interesse 6, 7. aplicação homogénea da matriz para a superfície da amostra é a etapa mais importante no processo de preparação de amostras. Deposição de matriz inadequada pode levar a grandes formações heterogêneas cristal matriz e o desenvolvimento de artefatos, sinal de iões de baixa e pouca reprodutibilidade 7.

Devido à afinidade de certas matrizes para isolar analitos específicos, do tipo de matriz seleccionado de um experimento podealterar significativamente o resultado. As matrizes utilizadas para geração de imagens de proteínas e péptidos são muitas vezes diferentes das utilizadas para a lípidos de imagem e o processo é ainda mais complicado pela necessidade de procedimentos adicionais, tais como passos de lavagem e re-hidratação, a fim de detectar sinais com sucesso a partir de tecido. Embora existam etapas de lavagem para o reforço de sinais de lipídios 8, eles não são um pré-requisito para a detecção da maioria das espécies de lipídios. Ao seleccionar uma matriz para uma experiência de imagem de lípidos, é importante ter em conta a polaridade do lípido de interesse como isso vai limitar a gama de matrizes adequadas. Por exemplo, gangliósidos contêm resíduos de ácido siálico, que lhes dão uma polaridade negativa global. Há um certo número de matrizes que podem eficazmente de s sorver e ionizar gangliósidos de tecido; No entanto, factores tais como picos de matriz derivada do espectro e estabilidade da matriz sob vácuo deve ser levado em consideração. 1,5-diaminonapthalene (DUma matriz) é suficientemente estável sob condições de vácuo instrumento para a maioria das aplicações de imagem e demonstrou um elevado grau de sensibilidade para a dessorção lipídica e pode ser utilizado para a análise de lípidos em ambos os modos de iões positivos e negativos 2. matriz DAN, quando comparada com outras matrizes de afinidade lipídica negativa, tais como o ácido di-hidroxibenzóico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazole (CMBT), foi capaz de dessorver mais eficientemente gangliosidos de cérebro de rato tecido no modo de iões negativos (manuscrito em preparação).

Selecionando o método adequado para a deposição de matriz é de igual importância para a seleção da própria matriz. métodos de deposição de matriz molhado em que a matriz sólida é dissolvido num solvente orgânico, e depositadas por pneumático ou pulverizadores ou observadores automatizadas, são particularmente eficazes para a dessorção de proteínas e péptidos como o líquido penetra a amostra para permitir adicionalcção de compostos e de co-cristalização com a matriz. Embora estas técnicas também podem ser usados para aplicações de lipídios, deslocalização de analitos e formações de cristal da matriz irregular são ocorrências comuns devido à grande abundância e solubilidade de lipídios na solventes, particularmente no tecido 2, 9. Porque os lípidos são prontamente ionizadas a partir de tecidos, técnicas de deposição de matriz seco, tal como a sublimação, oferecem uma alternativa de custo simples, eficaz para pulverizadores, contornando muitos dos desvantagem destas técnicas. O sucesso da sublimação em experiências MALDI IMS é atribuído a funções tais como a morfologia da matriz microcristalina que aumenta a área de superfície para a matriz de ligação para a substância analisável, o aumento da pureza da matriz, e deposição de matriz homogénea que conduzem ao aumento da reprodutibilidade da matriz em comparação com as técnicas sanitária 1, 10.

invo sublimaçãoLves aquecimento de uma matriz em pó sob vácuo imediatamente abaixo de uma superfície de uma amostra arrefecida resultante em sólido de transição de fase gasosa da matriz em pó seguido de deposição sobre a superfície da amostra de tecido. Durante a sublimação, a deposição de matriz pode ser controlada por factores variáveis, tais como tempo, temperatura e pressão para proporcionar resultados altamente reprodutíveis. Uma experiência única sublimação pode levar de 5 a 20 minutos, dependendo do tipo de matriz seleccionado, o qual pode ser re-utilizada várias vezes antes da sua eliminação. O aparelho pode ser adquirido comercialmente a uma fracção do preço de pulverizadores automáticos e é facilmente desmontado para limpeza e manutenção. O baixo custo e relativa simplicidade dessa técnica deposição de matriz tornam ideal para pesquisadores iniciantes ou expandindo aplicações de imagem lipídico em MALDI IMS. Embora a informação detalhando protocolos para a sublimação dos tecidos para IMS foram relatados 11, alguns protocolos padronizados existem which focar o fluxo de trabalho básico envolvido com a realização de um experimento de sublimação para imagiologia lipídios de alta massa no modo de iões negativos, o que torna difícil estabelecer a técnica sem extensa tentativa e erro. O que se segue é um protocolo experimental com o objetivo de preencher essa lacuna para a sublimação da matriz DAN em secções de cérebro de rato para imagens de alta resolução e detecção de gangliosídeos.

Figura 2
Figura 2: A sublimação Aparelho. A fotografia (A) e diagrama esquemático (B) do aparelho de sublimação. A bomba de vácuo ligada a um tubo de borracha para uma armadilha fria cheio com 300 ml de etanol. A câmara de frio é então ligado por tubos de borracha para o aparelho de sublimação. O aparelho é constituído por duas peças separadas de material de vidro que são seladas juntamente com um metal de L-articular. A metade superior da sublimadorcontém o condensador que é enchido com lama de gelo. A placa de amostra é gravado na parte inferior do condensador, no interior do aparelho de vidro selado. A metade inferior do aparelho de sublimação contém a matriz DAN, espalhar-se uniformemente em frente da placa de amostra. Durante a sublimação, o aparelho de vidro é colocada sobre um banho de areia aquecida a 140 ° C por uma placa quente directamente por baixo dele. A sonda de temperatura ajuda a manter uma temperatura estável durante todo o experimento sublimação através de realimentação da temperatura do banho de areia em comparação com a temperatura predefinida para o experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

Todos os procedimentos de manipulação animal descrito abaixo aderir à Universidade do comitê de cuidados com os animais de Western Ontario (2016-014).

1. Preparação de tecidos e Seccionamento

  1. Extraia o tecido cerebral de ratos através de um processo conhecido como "Fresco Congelado Extraction" (FFE).
    1. Euthanize o rato com uma overdose de pentobarbital de sódio e monitorar reflexos nos membros. Uma vez que todos os reflexos cessaram, cortar a cabeça do rato, utilizando uma guilhotina.
    2. Cuidadosamente separar os músculos e outros tecidos do crânio utilizando um bisturi. Use uma pinça de corte de osso para quebrar o crânio para expor o cérebro, a partir da base do crânio (buraco occipital) para a porção anterior.
    3. Uma vez que o cérebro é exposto, colher-a cuidadosamente com uma espátula cirúrgica e colocar imediatamente em gelo seco esmagado para o flash de congelamento.
      NOTA: O cérebro vai ser muito maleável. Portanto, tome cuidado extremo ao colocar o cérebro emgelo seco. Se o cérebro é esmagado ou pressionado de encontro a uma superfície, que vai alterar a sua forma e congelar nessa posição.
  2. Remover o tecido fresco congelado (não perfundidos com formaldeído ou incorporado em OCT) de - 80 ° C freezer e colocar no gelo seco.
  3. Coloque algumas gotas de água sobre um suporte de criostato e colocar em gelo seco ou barra de congelamento criostato. Imprensa tecido levemente no suporte criostato, uma vez que começa a congelar e segure até que a água congela em torno da base do tecido e ancora-lo no lugar. Adiciona-se água adicional para proteger ainda mais o tecido sobre o titular, se necessário.
    NOTA: A água é utilizada, em vez de meios de outubro de tecido de montagem, a fim de evitar a contaminação do tecido com os compostos que podem afectar a detecção do sinal desejado.
  4. tecidos posição no criostato. Secção de tecido até ao local anatómico desejado. Certifique-se de que a espessura de corte é entre 8-12 mm.
    NOTA: Quando o corte de tecidos em criostato comunaldispositivos, é imperativo que os materiais separados, tais como lâminas, escovas, barras estabilizadoras, e os titulares de ser utilizada, a fim de evitar a contaminação com a incorporação de compostos. O interior do criostato também devem ser limpos cuidadosamente com etanol antes do uso.
  5. Usando a barra anti-roll criostato, lentamente secção achatada secções de tecido. Furos ou marcas no tecido pode ocorrer se a colocação de barra de rolo está incorreto ou lâmina é maçante. Mova o tecido para o centro de cortar plataforma, usando pincéis limpos.
  6. Montagem
    1. Congelar lâminas condutoras ou placas de metal, colocando-os no criostato, enquanto cortando. Quando o slide é completamente congelado, mova com cuidado o tecido seccionado para a superfície condutora da lâmina utilizando pincéis limpos. Uma vez que todas as secções de tecido são posicionados corretamente no slide, coloque um dedo sob o slide, em frente ao tecido, e pressione até que a secção descongela.
      NOTA: As Secções podem dobrar ou enrolar-se durante o processo de descongelamento quandousando este método de montagem. Este pode ser reduzido, mantendo a corrediça no criostato quando o descongelamento do tecido. Se estas questões tornar-se problemática, uma alternativa, warm-mount método é listado abaixo.
    2. Alternativamente, dê uma temperatura ambiente de índio-estanho Oxide (ITO) de slides (ou placa de metal) e pressione levemente para baixo na seção de tecido congelado na superfície da plataforma do corte, o lado condutora para baixo. Isto conduzirá à secção de tecido descongelamento uniformemente sobre a superfície da lâmina com pouco de ondulação ou a dobragem do tecido.
      NOTA: A condensação pode aparecer abaixo da seção na montagem usando este método que pode levar a perda de certas proteínas e lipídios.
  7. Colocar as lâminas com o tecido em um exsicador para 5 - 10 min.

2. sublimador Aparelho Set-up

NOTA: Execute estas etapas em um exaustor.

  1. Coloque um banho de areia num recipiente de alumínio em um prato quente, com a placa quente em um elevador de metal tesourade área de superfície adequado (por exemplo maior do que a placa quente). Ligar a placa de aquecimento e ajustar a temperatura para 140 ° C.
    NOTA: O ponto de fusão para a matriz DAN é entre 187-190 ° C. Não exceda esta temperatura sobre a placa.
    1. Se a placa de aquecimento está equipado com uma sonda de realimentação de temperatura, usá-lo para monitorar a temperatura de areia ao longo da experiência e assegurar a consistência da temperatura. Esse recurso pode ajudar com reprodutibilidade experiência em vários experimentos de sublimação.
      NOTA: O banho de areia deve ser contido dentro de um recipiente de alumínio como um recipiente de vidro pode se quebrar a altas temperaturas.
  2. Coloque 300 mg de matriz de DAN sobre a superfície inferior do aparelho de sublimação. Coloque a matriz no centro do aparelho e espalhar-se numa camada uniforme na largura e no comprimento da lâmina aproximada sendo sublimada.
    CUIDADO: matriz DAN é tóxico. Portanto, é importante usar luvas, máscaras, e segurançaóculos de proteção em todos os momentos ao manusear a matriz em pó. DAN devem ser armazenadas no escuro, pois é sensível à luz.
  3. Tape uma placa de metal para a superfície interior do aparelho, com a placa que faz contacto directo com o fundo do condensador, de modo a assegurar uma distribuição uniforme da temperatura de arrefecimento através de toda a superfície da lâmina durante a sublimação. Alternativamente, a areia do fundo do condensador para assegurar uma superfície plana.
    1. Colocar a fita ao longo das bordas exteriores da placa e aderir aos lados do material de vidro interior. Se a fita adesiva é colocada sob a placa e adere à parte inferior da superfície de vidro interior, a distribuição de temperatura pode não ser uniforme e pode resultar na distribuição desigual da matriz sobre a superfície da lâmina.
    2. Tape um espaço em branco (teste) deslize em diagonal através da superfície da placa de metal com a fita de novo colocada sobre os bordos exteriores da corrediça.
  4. Ligar as porções superior e inferior do aparelho, Wom uma borracha O-ring no meio para assegurar uma vedação completa.
  5. Coloque um metal L-articular em torno do centro do aparelho e apertar vícios até a metade superior e inferior do aparelho são hermeticamente fechadas em conjunto. Colocar no metal de O-ring acima do banho de areia.
  6. Pegue um punhado de gelo picado e colocá-lo no condensador. Preencha condensador de ¼ a ½ cheio com água fria para criar lama gelo. A lama de gelo irá arrefecer a placa de metal no interior do aparelho e subsequentemente a corrediça aderida a ela. Espere pelo menos 5 minutos para que a temperatura chegar a um estado estacionário.
  7. Pour 300 ml de etanol no recipiente armadilha fria e colocar o material de vidro para dentro do recipiente. Redução de 2 - 3 pequenos pedaços de gelo seco, para o etanol na parte inferior do recipiente armadilha fria. A entrada de câmara de frio tem um tubo de vidro de correr para o fundo do cilindro, enquanto que a saída não.
  8. Ligue a bomba de vácuo para a saída de câmara de frio utilizando tubos de borracha. Use outro pedaço de borrachatubagem de entrada para ligar a câmara de frio para o aparelho de sublimação. Certifique-se de que o tubo esteja bem preso com grampos de metal, se disponível.
  9. Utilizar a bomba de vácuo para proporcionar um vácuo de 30 - 50 mT. Deixe a bomba funcionar durante pelo menos 5 minutos para equilíbrio de pressão. Vícios de L-anel de aparelho de sublimação pode ter que ser novamente apertados uma vez que a bomba de vácuo é ligada por causa da diminuição da pressão no aparelho.
    NOTA: É altamente recomendável que um indicador de vácuo ser ligado à bomba para monitorar a pressão de vácuo durante a experiência e para testar a existência de fugas de pressão, a fim de alcançar a mais alta reprodutibilidade possível entre experiências. No entanto, a maioria das bombas são concebidos para manter uma pressão constante, por conseguinte, o medidor pode não ser essencial que os utilizadores experientes. Além disso, o selo de vácuo gordura podem ser usadas para ajudar a manter a pressão de vácuo.

3. A sublimação

  1. Certifique-se de que a temperatura do banho de areia tem stabilizado a 140 ° C e que o aparelho é fixado no metal de O-ring acima do banho de areia com toda a tubagem ligado e o vácuo ligada.
  2. Definir temporizador para 7 min, mas não iniciar o temporizador. Lentamente levantar o elevador de tesoura e areia banho até o aparelho de sublimação até o U-conjunta do sublimador está bem acima do metal O-ring. Este espaço extra permite o ajuste do aparelho sobre a areia.
    1. Pressione rapidamente a sublimador suavemente na superfície da areia para garantir que o aparelho está sentado uniformemente sobre a areia, e em seguida, iniciar imediatamente o temporizador.
  3. Quando o temporizador soa, desligue a bomba de vácuo e baixe cuidadosamente o elevador de tesoura até o sublimador não está tocando o banho de areia e está bem presa no metal O-ring.
    1. Lentamente solte a válvula de micro-vent para liberar a pressão no aparelho. Solte a braçadeira de metal ao redor do tubo de borracha do aparelho sublimação e lentamente começam a soltar o tubo. Uma vez que o rubber tubo foi afrouxado ligeiramente, dobrar o tubo de um lado para permitir que a pressão residual de escapar.
    2. Quando os retornos de pressão ambiente, remova cuidadosamente o tubo de borracha do aparelho sublimação.
  4. Solte os vícios do U-joint do aparelho e remover. Cuidadosamente separar as duas metades do aparelho de sublimação e retirar o slide a partir do topo do objeto de vidro interior. Examina a corrediça para confirmar a distribuição uniforme da matriz.
    NOTA: Se a matriz é desigual, a matriz em pó na parte inferior da sublimador pode ser reposicionada ou sublimador o aparelho pode ser reposicionada na areia para o slide seguinte. O processo de sublimação pode ser repetido várias vezes utilizando a mesma matriz, no entanto, a matriz acabará por se tornar mais escura por exposição repetida de calor e a quantidade de pó irá diminuir de tal forma que o tempo de sublimação terá de ser ligeiramente ajustados para compensar. Por esta razão, é importante controlar a quantidade de matriz being sublimou após cada experimento para assegurar a coerência na deposição de matriz entre os slides
  5. Se a distribuição e quantidade de matriz sublimada é suficiente, grave um novo slide com o tecido para o interior da Secção sublimador e repita 3.
    NOTA: Para o controlo de qualidade (QC) fins, a quantidade de matriz sublimado pode ser medida após cada experiência por pesagem do diapositivo antes e após sublimação e dividindo o peso da matriz sublimada com a área de superfície da lâmina 2, deve notar-se que devido à falta de precisão da maioria das escalas além de 4 pontos decimais e variabilidade entre escalas, estas medidas devem ser ser usado apenas um guia para a deposição de matriz ideal em oposição a um meio totalmente quantificáveis de QC a menos que uma balança de alta precisão é usado (veja a Figura 3).

4. Tissue Armazenamento / Reidratação

  1. Depois de sublimação, loja desliza em um recipiente fechado ou pequena cassette em saco plástico selado.
  2. Incubar as lâminas em freezer -20 ° C durante 2 h ou durante a noite.
    NOTA: O objectivo do processo de congelação é de actuar como um passo de re-hidratação para a dessorção de materiais de tecido no interior da matriz. O processo de congelamento também tem sido demonstrado para prevenir a degradação de sinais de lípidos durante até 1 semana, quando armazenados a -80 ° C 12. Por esta razão, a quantidade de tempo que as amostras são armazenadas em congelador pode ser variado em certa medida de acordo com as necessidades do experimentador, sem alterar de forma significativa a detecção de sinal (como observado no nosso laboratório). No entanto, temos notado alguma descoloração da matriz quando as amostras são congeladas por mais de 24 h a -20 ° C. Assim, recomendamos a imagiologia do tecido sublimado antes que o tempo ou o armazenamento de tecido a -80 ° C durante períodos de incubação mais longos.
  3. Retirar as lâminas do congelador (e recipiente) e coloque em um secador durante 5 - 10 min.

5. Imaging and Análise

  1. Remover as lâminas da exsicador e aplicar normas de instrumentos para garantir a precisão massa de instrumento MALDI durante o exame. O tipo de padrões irá variar em função da instrumentação. Os padrões são geralmente aplicadas uniformemente ao longo de toda corrediça, em torno de tecido a ser visualizado (Figura 3D).
  2. Inserir slide em instrumento MALDI e siga as instruções do fabricante para experimentos com imagens (métodos instrumento deve ser otimizado para um 1000 - faixa de massa 2,000). Resultado representativo (Figura 4) foi obtido em modo de reflectrão negativo com uma quadrícula de 70 uM e 20 disparos / espectro (aquisição em tempo ~ 2 h).

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Representative Results

Após a conclusão da experiência sublimação, as duas metades do aparelho de vidro estão separadas no exaustor de fumos e a corrediça, gravado para o condensador, pode ser removida (Figura 3A). Neste ponto, a lâmina deve ser examinada para a distribuição desigual de matriz e o tempo, a temperatura, ou a colocação do aparelho em banho de areia pode ter que ser ajustada para o slide seguinte. Um experimento sublimação DAN bem sucedido resultará num revestimento uniforme da matriz de cinza / castanha ao longo da superfície da lâmina onde as características anatómicas do tecido pode ser claramente visualizadas e a quantidade de matriz sobre a lâmina de vidro é semelhante à quantidade no tecido (Figura 3B). Por exemplo, se demasiado matriz foi sublimada sobre o tecido, a espessura da matriz irá cobrir as características do tecido e apenas a forma geral será discernível. No entanto, muito pouco se matriz é sublimado, o tecido vai have uma aparência mais escura do que o resto da lâmina (Figura 3C). Ambos muito e muito pouco matriz irá resultar em mau sinal no instrumento MALDI. Para efeitos de controlo de qualidade, Thomas et al. pesava a quantidade de matriz depositado na corrediça e dividido o peso por área da superfície da lâmina. Eles relataram uma quantidade ideal de deposição de matriz para várias matrizes incluindo DAN (110 ug / cm) 2. Embora a maioria dos saldos não têm a precisão necessária para replicar esses resultados, temos tentado este método de QC; No entanto, devido a um elevado grau de variabilidade, que só pode aconselhar uma gama adequada de deposição de matriz verificou-se estar associada bem sucedida contra sublimação experiências mal sucedidas com matriz DAN tal como determinado através de detecção de sinal no instrumento. A medição da matriz de abaixo de 100 mg / cm² foi associado com "muito pouco" condições de matriz, enquanto uma medida de acima de 140 mg / cm² foiassociado com "muito". deposição de matriz entre 100 e 140 ug / cm verificou-se ser uma quantidade óptima para a imagiologia com matriz DAN. Padrões de calibração deve ser aplicado sobre a lâmina de vidro em torno das amostras de tecido para assegurar a precisão de massa dos sinais detectados de IMS (Figura 3D)

Numa experiência MALDI IMS, a imagem molecular permite a visualização da distribuição espacial do analito de interesse, juntamente com quaisquer espécies desconhecidas que podem estar presentes em um determinado intervalo de massa. As imagens moleculares de gangliósidos nesta experiência foram sobrepostas utilizando o software ImageJ para mostrar a distribuição anatómica de várias espécies de gangliósidos em todas as regiões corticais e subcorticais do cérebro do rato (Figura 4A). Os gangliosídeos mais abundantes no cérebro são as espécies A-série GD1a e GM1, mas também contêm gangliosídeos GM2 e GM3, que podem ser encontrados entre o1.000-2.000 m / z gama de massa, uma gama de massa mais elevada do que a maioria dos lípidos do cérebro comuns, tornando estes gangliosidos fácil de identificar no espectro (Figura 4B). A abundância iónica de cada espécie de gangliósidos podem ser usados ​​para semi-quantificar as diferenças ou alterações nas espécies de gangliósidos no seio da mesma imagem. Uma vez que uma determinada quantidade de variabilidade de preparação da amostra não pode ser evitada em IMS, entre comparações de análise são considerados para ser semi-quantitativa.

Figura 3
Figura 3. DAN sublimação. Os resultados representativos de sublimação da matriz DAN no tecido cerebral de ratos. (A) Após a conclusão da sublimação, as duas metades do aparelho são separadas e a lâmina é removido a partir do condensador. Matriz (B) a DAN se espalha uniformemente através de múltiplas secções de tecido de cérebro de rato sobre a superfície da lâmina para permitir altamente reproducible resultados (entre 100-150 ng / cm). (C) Os exemplos de experiências de sublimação falharam, onde muito pouco matriz (esquerda - <90 mg / cm²) ou demasiado matriz (à direita -> 150 mg / cm²) foi depositado. Muito pouco matriz irá resultar em dessorção dos analitos insuficiente, enquanto muito matriz não vai permitir que o laser para penetrar no tecido durante a aquisição, o que resulta na detecção de baixa de iões. (D) Lâmina contendo secções de tecido de cérebro de rato sublimados com os padrões da matriz e calibração DAN aplicadas está pronto para inserção instrumento MALDI para a imagem latente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. IMS MALDI de gangliosídeos no cérebro de um rato. representantee MALDI IMS imagem molecular e espectro de massa de gangliosídeos no cérebro de ratos, após sublimação com a matriz DAN. A imagem molecular é um compósito de várias espécies de gangliósidos no espectro sobrepostas e pseudocolored usando o software Image J. mostrar a distribuição anatómica original de espécies de gangliósidos por todo o cérebro. Espécies GM1d18: 1 (vermelho, massa ~ 1.547 Da), GM1d20: 1 (verde, massa ~ 1.573 Da), GM3d18: 1 (azul, massa ~ 1.178 Da), e GM3d20: 1 (cerc, massa ~ 1.207 Da) são representados. O espectro de massa exibe abundância iónica de analitos dentro de um 1000 - faixa de massa de 2.000. Os principais gangliósidos Uma série são marcados ao longo do espectro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este trabalho detalha um protocolo padronizado de sublimação matriz em tecidos para a detecção de lípidos carregados negativamente, tais como gangliósidos, em experimentos MALDI IMS. A preparação da amostra para MALDI IMS é altamente variável e deve ser personalizado para atender as propriedades únicas do analito de interesse. A aplicação da matriz sobre a superfície da amostra de tecido é um aspecto essencial do processo de preparação da amostra que diz respeito à qualidade dos resultados em IMS. Um cuidado especial deve ser tomado ao selecionar matrizes, garantindo que a matriz é compatível com o analito de interesse e é livre de artefatos derivados de matriz no espectro. A sublimação é uma técnica de deposição de matriz seca que fornece um alto grau de homogeneidade da matriz de cristal com pouco deslocalização de lípidos no tecido. DAN matriz, em particular, mostra um elevado grau de sensibilidade para a dessorção de um grupo de lípidos da membrana carregados negativamente chamados gangliósidos, como demonstrado no cérebro de ratosecções, e é estável sob vácuo durante longos períodos de tempo, permitindo a compatibilidade com a maioria das aplicações de imagiologia. DAN matriz tem o benefício adicional de também ter uma elevada afinidade para as espécies de lípidos carregados positivamente, aumentando assim a versatilidade desta matriz para aplicações MALDI IMS 2. Deve também notar-se que várias espécies de lípidos, incluindo fosfolípidos, podem ser detectadas simultaneamente quando se usa este protocolo IMS.

Um exame completo das propriedades da matriz de DAN, em comparação com 9 outras matrizes comumente usados foi publicado anteriormente 2. Neste artigo, os autores destacam o aumento da sensibilidade da matriz DAN no modo de iões negativos, em comparação com as outras matrizes examinados, bem como a capacidade de imagens de alta resolução usando DAN. matriz DAN foi encontrado para ter o melhor desempenho global de íons de polaridade negativa. Curiosamente, realizada equally bem para os iões de polaridade positiva. Outras matrizes comuns que têm demonstrado uma elevada afinidade para os iões de polaridade negativa incluem DHA, DHB, e 9-AA. A eficiência de DHA como uma matriz é limitada pela sua baixa estabilidade sob vácuo o que o torna impraticável para a maioria das aplicações de imagem 2. 9-AA tem a vantagem de produzir baixo ruído de fundo e enriquecimento demonstrado de sinais sulfatide no 750 - gama de massas 950 no modo negativo em relação a matriz DHB 13. Embora DHB demonstrou ser muito eficaz no modo positivo, rendimentos mais baixos do sinal de iões de polaridade negativa em comparação com a matriz 2 DAN. Matriz DAN também demonstraram maior sensibilidade no modo de iões negativos na faixa de massa inferior (650-950) em comparação com DHB 2. Além disso, tem sido relatado que DHB podem formar aglomerados de matriz significativas no modo de ião negativo 750 Da até 2.

et ai. , Em que a matriz de solo é passado através de uma peneira fina e depositados sobre a superfície da amostra. Os autores compararam este método seco da deposição de matriz a uma técnica de pulverização manual de matriz molhado e descobriram que eles deram sinal comparável para fosfolipídios no 450 - faixa de massa de 1.200 14. Um estudo utilizada tanto sublimação e de revestimento seco, com uma peneira para examinar expressão fosfolipídios, no entanto, os autores não comentar sobre como as duas técnicas comparadas em termos de resolução de imagem ou o rendimento sinal ion 15.

A fim de assegurar a mais ampla gama possível de aplicabilidade, o protocolo apresentado foi um fluxo de trabalho de base que permitirá que novos e mais especializados usuários de MALDI IMS para alcançar resultados altamente reprodutíveis para uma ampla variedade de aplicações de imagem lipídico. No entanto, os protocolos de sublimação pode ser modificado para satisfazer o unique circunstâncias do experimento. Por exemplo, a deposição de cristais de matriz fina fornecida por sublimação permite a opção para inverter a ordem de preparação da amostra por lâminas pré-revestimento / placas com matriz antes da montagem do tecido. A matriz pode ser sublimado sobre a superfície condutora de antecedência e armazenado em um ambiente escuro para utilização posterior, reduzindo assim o tempo de preparação da amostra de pós-seccionamento, enquanto ainda mantendo uma elevada sensibilidade para a detecção de lípidos 16, 17. Outra modificação que pode ser feito para este protocolo para melhorar o sinal para a detecção de lipídios é uma lavagem de 2 min com formato de amónio 8.

Embora sublimação pode contornar muitas das desvantagens da maior parte das técnicas de deposição húmida, tais como a mais pequena, a deposição de cristais de matriz mais homogénea 1, diminuição da deslocalização de analitos, e de baixo custo, em comparação com pulverizadores automáticos, entãome variabilidade no processo de preparação da amostra é inevitável. No caso de sublimação, existem vários fatores que podem causar diferenças hora de uma experiência para outra e podem incluir os seguintes que foram observados em nosso laboratório. Não pode haver diferenças na posição do aparelho de sublimação na areia. Ao executar várias experiências de sublimação back-to-back, a areia no banho de areia pode começar a mudar a sua posição, que pode afetar a dispersão de calor em todo o banho de areia. Achatando a areia antes de cada rodada de sublimação também pode alterar a dispersão de calor como a areia que foi deslocada pode levar algum tempo para voltar a uma temperatura uniforme. tempo de sublimação pode ter de ser ajustada ligeiramente entre cada rodada para compensar a areia movediça no banho de areia. Em alternativa, o uso de um banho de óleo pode levar a dispersão de calor mais homogénea.

Em segundo lugar, a quantidade de matriz na parte inferior do sublimador pode variar. DAN Matrix tem uma aparência cinzenta agrupado e tem uma tendência para formar grandes aglomerados. Estes agregados podem ser quebrada manualmente para cima e disposta no fundo do sublimador, mas não pode ser completamente eliminado. Grandes aglomerados de matriz vai demorar mais tempo para aquecer e sublimar do que pedaços menores que podem afetar o produto final da sublimação.

A saída de vácuo no aparelho de sublimação é um outro factor crítico. A maioria dos sublimators são feitos com uma única saída de vácuo na tubagem, que está ligado ao ligá-la à bomba de vácuo durante a sublimação. Uma vez que a pressão está a ser regulado em que o lado do aparelho, pode haver uma ligeira irregularidade da deposição da matriz, com mais sendo depositada sobre o lado com a saída de vácuo. Isto pode ser um pouco compensada por deslocamento quer a posição do aparelho na areia, a posição da matriz na parte inferior da sublimador, ou alterando a posição da corrediça / placa no condensador. estes fatoRUP são as principais desvantagens da técnica de sublimação e por esta razão, é crucial para executar um teste de corrediça através do processo de sublimação antes de executar amostra experimental de modo que o tempo pode ser ajustado para compensar essas variáveis.

Outra desvantagem relatada de sublimação é que a detecção de analitos de massa mais elevadas é limitada pela extracção do analito insuficiente e / ou da mistura com a matriz. A etapa de reidratação após sublimação pode ajudar a retirar esses analitos de massa mais elevadas para contornar este problema. Isto é tipicamente alcançado usando uma câmara de humidade 18. No entanto, neste protocolo, um passo de congelação é adicionado depois da sublimação que atinge a mesma finalidade. A congelação e subsequente descongelação (em um exsicador) das amostras antes da inserção no instrumento MALDI provoca a formação de condensação na superfície da amostra, que hidrata temporariamente a amostra para permitir a extracção de lípidos de massa mais elevadas, embora preservando a TIssue para análise 12, 17.

Em geral, a sublimação é um método altamente sensível e eficaz custo de aplicação de matriz para a detecção de lípidos em experimentos MALDI IMS. Com efeito, o nosso grupo notou melhoras significativas para resultados IMS quando deslocado de utilizar um método de pulverização de ar 3 para um método de sublimação 4 para deposição de matriz. O presente protocolo é apropriado para um número de aplicações de imagem lipídico, mas pode ser modificado para atender as necessidades do experimentador.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sublimator Chemglass Life Sciences CG3038-01
1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix Sigma-Aldrich D21200  100 G
Cryostat Thermo-Fisher Scientific CryoStar NX50
Hot plate with temperature feedback Thermo-Fisher Scientific HP88857290 Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Stainless Steel Jack Thermo-Fisher Scientific 2216479 10x10
Cold Trap Custom built on site
Vacuum Pump Franklin Electric 1102180403 Savant VP100 Two Stage
Indium-tin-oxide (ITO) Slides Hudson Surface Technology PSI 1111000 type II, 1.1 mm/25 each
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument AB Sciex
Desiccator Sigma-Aldrich D2797 tabletop desiccator

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References

  1. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
  2. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
  3. Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
  4. Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
  5. Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
  6. Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
  7. Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
  8. Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
  9. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
  10. Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
  11. O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
  12. Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
  13. Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
  14. Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
  15. Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
  16. Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
  17. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
  18. Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).

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Neurociência Edição 121 sublimação MALDI imagem espectrometria de massa gangliosídeos matriz DAN cérebro lípidos da membrana
Sublimação da DAN Matrix para a Detecção e Visualização de gangliosídeos no cérebro de um rato do tecido por MALDI imagem Espectrometria de Massa
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Caughlin, S., Park, D. H., Yeung, K. More

Caughlin, S., Park, D. H., Yeung, K. K. C., Cechetto, D. F., Whitehead, S. N. Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (121), e55254, doi:10.3791/55254 (2017).

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