Abstract
Steekproef voorbereiding is essentieel voor een optimale detectie en visualisatie van analyten in matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experimenten. Het bepalen van de juiste protocol te volgen door het monster bereidingswerkwijze kan moeilijk zijn omdat elke stap moet worden geoptimaliseerd om te voldoen aan de unieke eigenschappen van de analyten. Dit proces omvat niet alleen het vinden van een compatibele matrix die kunnen desorberen en efficiënt ioniseren van de moleculen van belang, maar ook het selecteren van de geschikte matrix depositietechniek. Bijvoorbeeld, een natte matrixafzetting techniek, die inhoudt het oplossen van een matrix oplosmiddel superieur voor desorptie van de meeste eiwitten en peptiden, terwijl droge matrixafzetting technieken zijn bijzonder effectief voor ionisatie van lipiden. Sublimatie is gerapporteerd als een zeer efficiënte droge matrixafzetting voor de detectie van lipiden in weefsel door MALDI IMS vanwege de homogeneity van matrix kristallen afzetting en minimale analyseren delokalisatie in vergelijking met veel natte depositie methoden 1, 2. Algemeen gaat het om een monster en gepoederde matrix in een vacuüm afgedichte kamer met gedrukt tegen een koud oppervlak monsters. De inrichting wordt vervolgens neergelaten in een verwarmd bad (zand of olie), waardoor sublimatie poedervormig matrix op het gekoelde oppervlak weefselmonster. Hier beschrijven we een sublimatie protocol via 1,5-diaminonaftaleen (DAN) matrix voor de detectie en visualisatie van gangliosiden in de rattenhersenen middels MALDI IMS.
Introduction
Matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) is steeds een zeer gewilde techniek voor visualisatie van de ruimtelijke verdeling van lipiden, peptiden en eiwitten over intact monster oppervlakken. MALDI IMS werd voorheen een analytische techniek voor pre-gezuiverde analyten, maar de laatste jaren, is de aandacht in vele disciplines vanwege de mogelijkheid om de nauwkeurigheid van massaspectrometrie in combinatie met hoge resolutie visuele / anatomische referentiepunten zonder behoefte aan externe labeling. De wetenschappelijke onderzoekerswereld gebruik van deze techniek blijft groeien, is er meer behoefte aan gestandaardiseerde, gemakkelijk te volgen protocollen om te helpen bij de ontwikkeling en optimalisatie van IMS experimenten. Gangliosiden, een groep van membraanlipiden veel voorkomt in het centrale zenuwstelsel, zijn geschikt voor MALDI IMS experimenten hun locatie, ingebed in het membraan zorgt ervoor species onmogelijk op te sporen met behulp van conventionele Immuno-labeling. Bovendien hebben we aangetoond, middels MALDI IMS, dat deze lipiden, die functioneren als modulatoren van celsignalering, onder andere, hebben unieke anatomische verspreidingspatroon in de gezonde knaagdierhersenen die gewijzigd na hersenletsel 3, 4, 5. Gangliosiden worden bij een hogere massabereik vergelijking met de meeste soorten lipiden, en dus best overeenstemt met de MALDI imaging platform.
Figuur 1: Workflow van MALDI IMS Experiment. Diagram van de algemene workflow van een MALDI IMS experiment met behulp van sublimatie. Weefsel ingevroren bij -80 ° C is verdeeld in een cryostaat en 10 urn secties zijn ontdooien gemonteerd op geleidende ITO slides. Het objectglaasje wordt vervolgens in een exsiccator tot sublimatie. Slides worden in de sublimatie-inrichting en een gelijkmatige laag matrix wordt toegepast op het weefsel monsteroppervlak. De monsters worden gedurende de nacht ingevroren in een -20 ° C vriezer daarna in een exsiccator geplaatst gedurende 10 min. Zodra normen zijn toegepast, worden de monsters ingebracht in de MALDI instrument waarbij een laser is gericht aan de overkant van het weefsel veroorzaakt gedesorbeerde moleculen in de matrix te ioniseren. De ionen reizen naar beneden een vlucht buis en apart op basis van hun massa (time-of-flight / TOF) totdat ze de detector bereiken. De gegevens over de ionische overvloed van analyten binnen een vooraf bepaalde massa-tot-lading (m / z) bereik wordt als zowel een molecuulgewicht beeld en massaspectrum. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om zowel visualiseren en kwantificeren van de ionische overvloed van de analyt van belang in het afgebeelde weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
monstervoorbereidingvoor MALDI IMS is zeer variabel als elke stap van het proces moet worden aangepast aan de analyten. Het kenmerk van MALDI-gebaseerde experimenten is het gebruik van een matrix bekleding op het monsteroppervlak vóór de analyse afgezet. Naast de rol absorberen en overdragen stralingsenergie van de laser gedurende het ablatieproces, de matrix dient ook om diverse analyten te isoleren van het monster, waardoor de analyse van de van belang zijnde verbindingen 6, 7 vergemakkelijkt. Homogene toepassing van de matrix op het monsteroppervlak is de meest cruciale stap in het monster bereidingsproces. Onjuiste matrixafzetting kan leiden tot grote heterogene matrix kristalformaties en de ontwikkeling van artefacten, lage ion-signaal en slechte reproduceerbaarheid 7.
Door de affiniteit van bepaalde matrices specifieke analyten te isoleren, het type matrix gekozen voor een experiment kanaanzienlijke verandering van de uitkomst. De matrices voor beeldvorming van eiwitten en peptiden dikwijls verschillen van die welke voor de beeldvorming lipiden en het proces wordt verder bemoeilijkt door de behoefte aan aanvullende procedures zoals wassen en rehydratatie stappen om signalen uit weefsel succesvol detecteren. Hoewel wasstappen aanwezig voor de verhoging van lipide signalen 8, zij geen voorwaarde voor het detecteren van de meeste soorten lipiden. Bij het selecteren van een matrijs voor een lipide imagingexperiment, is het belangrijk om de polariteit van het lipide van belang, omdat dit gegeven moment het bereik van geschikte matrices beperken. Bijvoorbeeld gangliosiden bevatten siaalzuurresten waardoor ze een algemene negatieve polariteit geven. Er zijn een aantal matrices die effectief kan desorberen en ioniseren gangliosiden uit weefsel; evenwel moeten factoren als matrix afgeleide pieken in het spectrum en de stabiliteit van de matrix onder vacuüm behandeling genomen. 1,5-diaminonapthalene (DAN) matrix voldoende stabiel onder vacuüm instrument voor de meeste beeldvormende toepassingen en heeft een hoge mate van gevoeligheid voor lipide desorptie aangetoond en kan worden gebruikt voor de analyse van lipiden in zowel positieve als negatieve ion modus 2. DAN matrix, in vergelijking met andere negatieve lipide affiniteitsmatrices zoals dihydroxybenzoëzuur (DHB), 9-aminoacridine (9-AA) en 5-chloor-2-mercaptobenzothiazol (CMBT), kon gangliosiden uit rattenhersenen meest efficiënt desorberen weefsel in negatieve ionen-modus (manuscript in voorbereiding).
Het selecteren van de juiste methode van matrix afzetting is van even groot belang voor de keuze van de matrix zelf. Natte matrixafzetting methoden waarbij de vaste matrix wordt opgelost in een organisch oplosmiddel, en afgezet door pneumatische of geautomatiseerde sproeiers of spotters, zijn bijzonder effectief voor de desorptie van eiwitten en peptiden als de vloeistof doordringt het monster mogelijk te maken extractie van verbindingen en co-kristallisatie met de matrix. Hoewel deze technieken ook kunnen worden gebruikt voor lipide toepassingen analyt delocalisatie en onregelmatige matrix kristalformaties gemeenschappelijk gebeurtenissen vanwege de hoge dichtheid en oplosbaarheid van lipiden in oplosmiddelen, met name in weefsel 2, 9. Omdat lipiden gemakkelijk geïoniseerd uit weefsel, droge matrix depositietechnieken, zoals sublimatie, bieden een eenvoudige, kosteneffectief alternatief voor spuitmachines te omzeilen vele nadeel van deze technieken. Het succes van sublimatie in MALDI IMS experimenten wordt toegeschreven aan functies zoals microkristallijne matrix morfologie met een oppervlakte van matrix-bindende analyt verhoogt, verhoogde zuiverheid matrix en homogeen matrixafzetting leidt tot verhoogde reproduceerbaarheid in vergelijking met natte matrix technieken 1, 10.
sublimatie involves het verwarmen van een poedervormig matrix onder vacuüm onmiddellijk onder een gekoelde monster oppervlak resulteert in een vaste stof naar gas-fase-overgang van de gepoederde matrix gevolgd door afzetting op het weefselmonster oppervlak. Tijdens sublimatie kan matrixafzetting worden geregeld door factoren zoals tijd, temperatuur en druk zeer reproduceerbare resultaten opleveren. Eén sublimatie experiment kan variëren van 5 tot 20 minuten afhankelijk van het type matrix gekozen, die kan worden hergebruikt meerdere malen voor verwijdering. De inrichting kan commercieel worden gekocht bij een fractie van de prijs van automatische sproeiers en gemakkelijk uit elkaar gehaald voor reiniging en onderhoud. De lage kosten en relatieve eenvoud van deze matrix depositie techniek maakt het ideaal voor onderzoekers beginnen of uit te breiden op lipide imaging toepassingen in MALDI IMS. Hoewel de informatie detaillering protocollen voor sublimatie van weefsels voor IMS zijn gemeld 11, enkele gestandaardiseerde protocollen bestaan which focus op de basiswerkstroom betrokken bij het uitvoeren van een experiment voor het afbeelden sublimatie hoogmis lipiden in de negatieve ion modus, waardoor het moeilijk om de techniek te vestigen zonder uitgebreide trial and error. Het volgende is een experimentele protocol als doel om die kloof voor de sublimatie van DAN matrix op hersenen van de rat secties voor hoge resolutie beeldvorming en detectie van gangliosiden vullen.
Figuur 2: de sublimatie Apparatuur. Foto (A) en schema (B) van de sublimatie-inrichting. De vacuümpomp is verbonden met rubberen slang aan een koude val gevuld met 300 ml ethanol. De koude val wordt dan verbonden met rubberen slang aan op de sublimatie apparaat. De inrichting bestaat uit twee afzonderlijke stukken glaswerk die aan elkaar afgedicht met een metalen U-joint. De bovenste helft van het sublimatorbevat de condensator die is gevuld met ijs slush. De monsterplaat wordt geplakt op de bodem van de condensor, in het afgesloten glazen inrichting. De onderste helft van de sublimatie apparaat bevat de DAN matrix, verspreid gelijkmatig tegenover het monster plaat. Tijdens sublimatie, wordt het glaswerk geplaatst op een zandbad verwarmd tot 140 ° C door een hete plaat eronder. De temperatuursensor helpt om een stabiele temperatuur in de sublimatie experiment door middel van feedback van de zand badtemperatuur vergeleken met de ingestelde temperatuur voor het experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle handling dier procedures beschreven onder zich te houden aan de University of Western Ontario's dierverzorging comité (2016-014).
1. Tissue Voorbereiding en Sectioning
- Uittreksel hersenweefsel van de rat door middel van een proces dat bekend staat als "Fresh Frozen Extraction" (FFE).
- Euthanaseren de rat met een overdosis natriumpentobarbital en bewaken reflexen in de ledematen. Zodra alle reflexen hebben opgehouden, sever het hoofd van de rat met behulp van een guillotine.
- Zorgvuldig scheiden de spieren en andere weefsels van de schedel met behulp van een scalpel. Gebruik bot snijden tang om de schedel te breken naar de hersenen bloot vanaf de basis van de schedel (foramen magnum) aan het voorste gedeelte.
- Zodra de hersenen wordt blootgesteld, schep het uit met een chirurgische spatel en onmiddellijk te plaatsen op gemalen droog ijs voor Snelkoeling.
NB: De hersenen zal zeer kneedbaar zijn. Neem daarom uiterst voorzichtig bij het plaatsen van de hersenen opdroog ijs. Als de hersenen gebroken of tegen een oppervlak gedrukt, zal het zijn vorm veranderen en bevriezen die positie.
- Verwijder vers ingevroren weefsel (niet doorbloed met formaldehyde of ingesloten in oktober) van - 80 ° C vriezer en leg ze op droog ijs.
- Plaats enkele druppels water op een cryostaat houder en plaats op zowel droog ijs of cryostaat bevriezen bar. Druk weefsel lichtjes op cryostaat houder als het begint te bevriezen en vasthouden tot water bevriest rond de basis van het weefsel en verankert deze op zijn plaats. Voeg extra water aan het weefsel verder te verzekeren dat de houder indien nodig.
OPMERKING: Water wordt gebruikt in plaats van oktober media voor montage weefsel om verontreiniging van het weefsel met verbindingen die de detectie van het gewenste signaal kan beïnvloeden vermijden. - Positie weefsel in cryostaat. Sectie weefsel tot de gewenste anatomische locatie. Zorg ervoor dat de scherpe dikte tussen 8-12 urn.
LET OP: bij het snijden van weefsel in de gemeenschappelijke cryostaatapparaten, is het noodzakelijk dat afzonderlijke materialen zoals bladen, borstels, stabilisatorstangen en houders worden gebruikt om verontreiniging met inbedding verbindingen voorkomen. De binnenkant van de cryostaat moet worden gereinigd grondig met ethanol voor gebruik. - Met behulp van de cryostaat anti-roll bar, langzaam gedeelte afgevlakt weefselcoupes. Gaten of markeringen op het weefsel kan optreden als de roll bar plaatsing is onjuist of mes is saai. Verplaats het weefsel naar het centrum van het snijden platform met schoon penselen.
- Montage
- Freeze geleidend dia's of metalen platen door ze te plaatsen in de cryostaat, terwijl het snijden. Wanneer de schuif volledig bevroren is, zorgvuldig het doorgesneden weefsel verplaatsen naar het geleidende oppervlak van de schuif met schoon penselen. Zodra alle weefselcoupes correct geplaatst zijn op de dia, plaatst u een vinger onder de dia, tegenover het weefsel, en drukt u op totdat de sectie ontdooit.
LET OP: Secties kunnen vouwen of krullen tijdens het ontdooien proces bijmet behulp van deze montage methode. Dit kan worden verminderd door het houden van de schuif in de cryostaat bij ontdooien van het weefsel. Als deze problemen problematisch worden, een alternatief, warm-mount methode is hieronder vermeld. - U kunt ook een kamertemperatuur indium-tinoxide (ITO) slide (of metalen plaat) en licht aandrukken op bevroren weefsel hoofdstuk over het snijden platform oppervlak, geleidende kant naar beneden. Dit leidt tot de weefselsectie ontdooien gelijkmatig op het oppervlak van de dia met kleine krullen of vouwen van het weefsel.
LET OP: Condensatie kan verschijnen onder het gedeelte bij het monteren van het gebruik van deze methode, die kan leiden tot verlies van bepaalde eiwitten en lipiden.
- Freeze geleidend dia's of metalen platen door ze te plaatsen in de cryostaat, terwijl het snijden. Wanneer de schuif volledig bevroren is, zorgvuldig het doorgesneden weefsel verplaatsen naar het geleidende oppervlak van de schuif met schoon penselen. Zodra alle weefselcoupes correct geplaatst zijn op de dia, plaatst u een vinger onder de dia, tegenover het weefsel, en drukt u op totdat de sectie ontdooit.
- Plaats de glaasjes met weefsel in een exsiccator gedurende 5-10 min.
2. sublimator Apparatuur Set-up
OPMERKING: Voer deze stappen in een zuurkast.
- Plaats een zandbad in een aluminium container op een hete plaat, met de hete plaat op een metalen schaarliftvan geschikte oppervlak (dat wil zeggen groter dan de hete plaat). Zet op de hete plaat en de temperatuur tot 140 ° C.
Opmerking: Het smeltpunt van DAN matrix tussen 187-190 ° C. Neem niet meer dan deze temperatuur op de kookplaat.- Wanneer de verwarmingsplaat is uitgerust met een temperatuurfeedback sonde gebruiken om zand Temperatuursensor gedurende het experiment en zorgen temperatuurconstantheid. Deze functie kan helpen met het experiment reproduceerbaarheid over verschillende sublimatie experimenten.
OPMERKING: De zandbad moet worden opgenomen in een aluminium container als een glascontainer kan breken bij hoge temperaturen.
- Wanneer de verwarmingsplaat is uitgerust met een temperatuurfeedback sonde gebruiken om zand Temperatuursensor gedurende het experiment en zorgen temperatuurconstantheid. Deze functie kan helpen met het experiment reproduceerbaarheid over verschillende sublimatie experimenten.
- Plaats 300 mg DAN matrix op het bodemoppervlak van sublimatie inrichting. Plaats de matrix in het midden van de inrichting en verspreid in een gelijkmatige laag heeft van ongeveer breedte en lengte van de schuif wordt gesublimeerd.
LET OP: DAN matrix is giftig. Daarom is het belangrijk handschoenen dragen, maskers en veiligheidbril te allen tijde bij het hanteren van de gepoederde matrix. DAN moeten worden opgeslagen in het donker is lichtgevoelig. - Tape een metaalplaat op het binnenoppervlak van de inrichting met de plaat direct contact met de bodem van de condensor, om gelijkmatige temperatuurver- koeling over het gehele oppervlak van de slede tijdens sublimatie waarborgen. Alternatief zand de bodem van de condensor een plat oppervlak te verkrijgen.
- Plaats de band langs de buitenranden van de plaat en zich aan de zijkanten van de binnenste glaswerk. Als de band onder de plaat is geplaatst en zich aan de onderzijde van het binnenste glasoppervlak, kan de temperatuurverdeling niet eens zijn en kan resulteren in ongelijkmatige verdeling over de matrix van het glaasje.
- Tape een blanco (test) schuift diagonaal over het oppervlak van de metalen plaat met de band opnieuw op de buitenranden van de schuif geplaatst.
- Sluit de bovenste en onderste gedeelten van de inrichting, wet een rubberen O-ring in het midden om een volledige afdichting te garanderen.
- Plaats een metalen U-joint rond het centrum van de inrichting en draai sten tot de bovenste en onderste helft van de inrichting stevig tegen elkaar zijn afgedicht. Plaats de metalen O-ring boven het zandbad.
- Neem een handvol gemalen ijs en plaats het in de condensor. Vul condensor ¼ tot ½ vol met koud water om ijs slush creëren. Het ijs slush zal de metalen plaat afkoelen op de binnenkant van het apparaat en vervolgens de schuif gehecht aan. Wacht tenminste 5 minuten voor de temperatuur tot een steady state te bereiken.
- Giet 300 ml ethanol in de koude val houder en zet het glaswerk in de houder. Drop 2-3 kleine stukjes droog ijs in de ethanol in de bodem van de koude val container. De koude val ingang heeft een glazen buis die naar de bodem van de cilinder, terwijl de uitvoer niet.
- Sluit de vacuümpomp aan de koude val uitvoer via rubber slangen. Gebruik een ander stukje rubberslang aan de koude val-ingang aan de sublimatie inrichting. Zorg ervoor dat de slang stevig vast met behulp van metalen klemmen indien beschikbaar.
- Gebruik de vacuümpomp een vacuüm van 30 te leveren - 50 mT. Laat de pomp zijn voor ten minste 5 minuten voor drukevenwicht. Sten op U-ring van sublimatie inrichting mogelijk opnieuw worden aangedraaid nadat de vacuümpomp wordt aangezet door verlaagde druk in de inrichting.
Opmerking: Het is sterk aanbevolen dat een vacuümmeter worden bevestigd aan de pomp om de druk van het vacuüm moeten gedurende het experiment om te testen op lekken in de druk om de hoogst mogelijke reproduceerbaarheid tussen experimenten te bereiken. Echter, de meeste pompen ontworpen om een constante druk te handhaven, dan kan de meter niet essentieel is voor ervaren gebruikers. Bovendien kan vacuümverpakking vet worden gebruikt om te helpen handhaven onderdruk.
3. Sublimatie
- Zorg ervoor dat de zandbad temperatuur heeft stabilized bij 140 ° C en dat de inrichting is vastgezet in de metalen O-ring boven het zandbad met slangen verbonden en het vacuüm ingeschakeld.
- Stel timer voor 7 min, maar niet beginnen timer. Langzaam verhogen van de schaarlift en zandbad tot de sublimatie apparaat tot de U-gewricht van de sublimator is ruim boven de metalen O-ring. Deze extra ruimte maakt aanpassing van de inrichting op het zand.
- Snel op de sublimator zachtjes op het zand oppervlak zodat de inrichting gelijkmatig op het zand, en geeft de timer te starten.
- Als de timer afgaat, schakelt u de vacuümpomp en kantel de schaarlift totdat de sublimator niet meer aanraken van het zandbad en stevig zitten in de metalen O-ring.
- Draai langzaam de micro-ontluchtingsklep om de druk in de inrichting. Maak de metalen klem rond de rubber slang van de sublimatie apparatuur en langzaam beginnen aan de buis los te maken. Zodra de rubber buis is enigszins los, buig de buis naar één kant te laten aanwezige druk kan ontsnappen.
- Bij omgevingsdruk terugkeert, verwijder voorzichtig de rubber slang van de sublimatie apparaat.
- Draai de ondeugden van de U-gewricht van de apparatuur en te verwijderen. scheiden voorzichtig de twee helften van de sublimatie apparaat en trek de schuif van de bovenkant van de binnenste glaswerk. Onderzoek dia matrix distributie bevestigen zelfs.
Opmerking: Als matrix ongelijkmatig, kan de poedervormige matrix in de bodem van de sublimator worden verplaatst of sublimator inrichting kan worden verplaatst in het zand voor de volgende dia. De sublimatie kan enkele malen met dezelfde matrix worden herhaald, echter de matrix uiteindelijk donkerder herhaalde blootstelling aan hitte en de hoeveelheid poeder zal worden zodat de sublimatie tijd zal enigszins worden aangepast ter compensatie verlagen. Daarom is het belangrijk om de hoeveelheid matrix bei bewakenng gesublimeerd na elk experiment om de consistentie in de matrix afzetting tussen de dia's te verzekeren - Als de verspreiding hoeveelheid matrix gesublimeerde volstaat tape een nieuwe dia met weefsel aan de binnenkant van de sublimator en herhaal sectie 3.
Opmerking: Voor kwaliteitscontrole (QC) doeleinden kan de hoeveelheid matrix gesublimeerde na elk experiment gemeten door weging van de schuif voor en na sublimatie en het gewicht van gesublimeerde matrijs met het oppervlak van de schuif 2 verdelen, moet worden opgemerkt dat door de onnauwkeurigheid van de meeste schalen dan 4 decimalen en variabiliteit tussen schalen, deze metingen worden alleen gebruikt leidraad voor optimale matrixafzetting in tegenstelling tot een geheel worden berekend middels QC tenzij een precisiebalans wordt gebruikt (zie figuur 3).
4. Tissue Opslag / Rehydratatie
- Na de sublimatie, op te slaan dia's in een afgesloten container of een kleine cassette in verzegelde plastic zak.
- Incubeer dia's in -20 ° C vriezer gedurende 2 uur of 's nachts.
Opmerking: Het doel van het invriesproces is om als rehydratatie stap voor de desorptie van weefsel materialen in de matrix. Het vriesproces werd ook aangetoond dat de afbraak van lipide signalen voor maximaal 1 week voorkomen wanneer bewaard bij -80 ° C 12. Daarom kan de hoeveelheid tijd die de monsters in de vriezer opgeslagen worden gevarieerd om een zekere mate aan de behoeften van de onderzoeker te passen zonder noemenswaardige verandering signaaldetectie (zoals waargenomen in ons laboratorium). We hebben echter enige verkleuring matrix opgemerkt wanneer monsters worden ingevroren langer dan 24 uur bij -20 ° C. Zo adviseren we de beeldvorming van de gesublimeerde weefsel vóór die tijd of het opslaan van weefsel bij -80 ° C voor langere periodes incubatie. - Verwijder dia's uit diepvries (en container) en plaats in een exsiccator voor 5-10 min.
5. Imaging en ANALYSE
- Verwijder dia's uit exsiccator en instrument normen van toepassing zijn op de nauwkeurigheid van massa van MALDI instrument te garanderen tijdens de beeldvorming. Het type normen variabel instrumentatie. Normen zijn over het algemeen gelijkmatig over de gehele slide, omringende weefsel af te beelden (Figuur 3D).
- Plaats dia in MALDI instrument en volg de instructies van de fabrikant voor de beeldvorming experimenten (instrument methoden moeten worden geoptimaliseerd voor een 1000 - 2000 massabereik). Representatief resultaat (figuur 4) werd overgenomen in reflectron negatieve modus met een 70 micrometer raster en 20 shots / spectrum (acquisitie tijd ~ 2 uur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na voltooiing van de sublimatie experiment worden de twee helften van het glaswerk gescheiden in de zuurkast en de slede met plakband aan de condensor kan worden verwijderd (figuur 3A). Op dit punt moet de schuif worden onderzocht op ongelijke verdeling matrix en de tijd, temperatuur, of plaatsing van de inrichting in het zandbad kunnen moeten worden aangepast voor de volgende dia. Een succesvolle DAN sublimatie experiment resulteert in een gelijkmatige laag van grijze / bruine matrix langs het oppervlak van de schuif wanneer de anatomische kenmerken van het weefsel duidelijk worden gevisualiseerd en de hoeveelheid matrix op het glaasje is vergelijkbaar met de hoeveelheid op het weefsel (Figuur 3B). Bijvoorbeeld, als er teveel matrix gesublimeerd op het weefsel, de dikte van de matrix de eigenschappen van het weefsel en alleen de algemene vorm dekken waarneembaar zijn. Indien te weinig matrijs is gesublimeerd, wordt het weefsel have donkerder uiterlijk dan de rest van de schuif (figuur 3C). Zowel te veel en te weinig matrix zal resulteren in een slecht signaal in de MALDI instrument. Voor kwaliteitscontrole doeleinden, Thomas et al. woog de hoeveelheid matrix afgezet op de glijbaan en het gewicht gedeeld door de oppervlakte van de glijbaan. Zij rapporteerden een optimale hoeveelheid matrixafzetting meerdere matrices waaronder DAN (110 ug / cm²) 2. Hoewel de meeste saldi niet de nauwkeurigheid die nodig is om dergelijke resultaten te repliceren, hebben we deze werkwijze QC geprobeerd; echter, vanwege de hoge mate van variabiliteit, we kunnen alleen maar adviseren een bereik van matrixafzetting totaal succesvol versus sublimatie mislukte experimenten met DAN matrix worden gekoppeld, zoals bepaald door de signaaldetectie in het instrument. Een matrix meting van minder dan 100 ug / cm² werd geassocieerd met "te weinig" matrix omstandigheden, terwijl een meting van meer dan 140 ug / cm² wasgeassocieerd met "teveel". Matrixafzetting tussen 100 en 140 ug / cm² bleek een optimale hoeveelheid voor beeldvorming met DAN matrix. Kalibreren normen moeten op het glaasje rondom de weefselmonsters aan de massa juistheid van de gedetecteerde signalen IMS waarborgen (figuur 3D)
In een MALDI IMS experiment werd de moleculaire beeld maakt het visualiseren van de ruimtelijke verdeling van de analyt met een onbekende soort die aanwezig zijn in een bepaald massabereik kunnen zijn. De moleculaire beelden van gangliosiden in dit experiment werden bedekt behulp ImageJ software om de anatomische verdeling van verschillende ganglioside soorten over de corticale en subcorticale gebieden van de rattenhersenen (Figuur 4A) vertonen. De meest voorkomende gangliosiden in de hersenen zijn de A-serie soorten GD1a en GM1 maar bevatten ook gangliosiden GM2 en GM3 die zijn allemaal te vinden tussen de1000-2000 m / z massabereik, een grotere massa bereik dan de meeste voorkomende hersenen lipiden, waardoor deze gangliosiden gemakkelijk te identificeren langs het spectrum (Figuur 4B). De ionische overvloed van elk ganglioside soort kan worden gebruikt om semi-kwantificeren verschillen of wijzigingen in ganglioside soorten binnen hetzelfde beeld. Omdat een zekere variabiliteit in monster prep niet kan worden vermeden IMS tussen scan vergelijkingen als semi-kwantitatief worden.
Figuur 3. DAN sublimatie. Representatieve resultaten van sublimatie van DAN matrix op rat hersenweefsel. (A) Na voltooiing van sublimatie, de twee helften van de inrichting worden gescheiden en de schuif uit de condensor verwijderd. (B) DAN matrix verspreidt gelijkmatig over meerdere rattenhersenen weefselcoupes op het oppervlak van de schuif om voor zeer reproducible resultaten (tussen 100-150 ug / cm²). (C) Voorbeelden van mislukte sublimatie experimenten waarbij te weinig matrix (links - <90 ug / cm²) of te veel matrix (rechts -> 150 ug / cm²) werd afgezet. Te weinig matrix leidt tot onvoldoende desorptie van analyten, terwijl teveel matrix niet zal de laser te dringen tot het weefsel tijdens acquisitie leidt tot lage ion detectie. (D) Slide met rat hersenweefsel secties gesublimeerd met DAN toegepast matrix en kalibratienormen is klaar voor het inbrengen in MALDI instrument voor de beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. MALDI IMS van gangliosiden in de rattenhersenen. vertegenwoorde MALDI IMS moleculaire imago en massaspectrum van gangliosiden in de hersenen van de rat na sublimatie met DAN matrix. De moleculaire beeld is een samenstelling van meervoudige ganglioside soorten in het spectrum bedekt en pseudocolored middels Image J software om de unieke anatomische verdeling van ganglioside soorten op het hersenshow. Soort GM1d18: 1 (rood, massa ~ 1547 Da), GM1d20: 1 (groen, massa ~ 1573 Da), GM3d18: 1 (blauw, massa ~ 1178 Da), en GM3d20: 1 (wintertaling, massa ~ 1207 Da) zijn vertegenwoordigd. De massa spectrum displays ionische overvloed van analyten binnen een 1000 - 2000 massabereik. De belangrijkste A-serie gangliosiden beschermde langs het spectrum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk Gegevens een gestandaardiseerd protocol matrix sublimatie op weefsel voor het detecteren van negatief geladen lipiden, zoals gangliosiden, in MALDI IMS experimenten. Monstervoorbereiding voor MALDI IMS is zeer variabel en worden aangepast aan de unieke eigenschappen van het analyt te passen. De toepassing van de matrix op weefselmonster oppervlak een cruciaal aspect van de monstervoorbereiding proces met betrekking tot de kwaliteit van de resultaten in IMS. Bijzondere aandacht dient te worden genomen bij het selecteren van matrices, ervoor te zorgen dat de matrix compatibel is met de van belang zijnde analyt en is gratis-matrix afgeleide artefacten in het spectrum. Sublimatie droog matrixafzetting techniek die een hoge mate van homogeniteit matrix kristallen met weinig delokalisatie van lipiden op weefsel verschaft. DAN matrix toont in het bijzonder een hoge mate van gevoeligheid voor de desorptie van een groep negatief geladen membraan lipiden genoemd gangliosiden, zoals aangetoond in rattenhersenensecties, en is stabiel onder vacuüm gedurende langere tijd, waardoor de compatibiliteit met de meeste beeldvormende toepassingen. DAN matrix heeft als bijkomend voordeel ook met een hoge affiniteit voor het positief geladen lipide species, waardoor de veelzijdigheid van deze matrix MALDI IMS toepassingen 2. Ook moet worden opgemerkt dat verschillende soorten lipiden, zoals fosfolipiden, kunnen gelijktijdig worden gedetecteerd bij gebruik van dit protocol IMS.
Een grondig onderzoek van de eigenschappen van DAN matrix in vergelijking met 9 andere veelgebruikte matrices is eerder gepubliceerd 2. In dit artikel, de auteurs wijzen op de verhoogde gevoeligheid van DAN matrix in negatieve ionen-modus in vergelijking met de andere matrices onderzocht, evenals de mogelijkheid voor hoge resolutie beeldvorming met behulp van DAN. DAN matrix bleek de hoogste prestaties voor negatieve polariteit ionen. Interessant is uitgevoerd equally goed voor positieve polariteit ionen. Andere veel voorkomende matrices die een hoge affiniteit hebben aangetoond voor negatieve polariteit ionen bevatten DHA, DHB, en 9-AA. De efficiëntie van DHA als matrix wordt beperkt door de lage stabiliteit onder vacuüm dat het onpraktisch voor de meeste beeldvormende toepassingen 2 maakt. 9-AA heeft het voordeel van het produceren van lage achtergrondruis en demonstreerde verrijking van sulfatide signalen in de 750-950 massabereik als negatief vergeleken met DHB matrix 13. Hoewel DHB is gebleken zeer effectief in positieve modus, het bereikt lagere negatieve polariteit ionen signaal vergeleken met DAN 2 matrix. DAN matrix toonde ook verhoogde gevoeligheid in negatieve ionen-modus in de massa bereik (650-950) in vergelijking met DHB 2. Daarnaast is gerapporteerd dat DHB significante matrix clusters negatieve ion modus tot 750 Da 2 kunnen vormen.
et al. Waarin gemalen matrix wordt door een fijne zeef en afgezet op het monsteroppervlak. De auteurs vergeleken deze droge methode matrix depositie op een natte matrix handleiding spuittechniek en vond dat ze gaven vergelijkbaar signaal voor fosfolipiden in de 450 - 1200 massabereik 14. Een studie gebruikten zowel sublimatie en droog-coating met een zeef om fosfolipide expressie te onderzoeken, had echter de auteurs geen commentaar geven op hoe de twee technieken vergeleken in termen van beeldresolutie of ion signaal opbrengst 15.
Met het oog op een zo breed mogelijke waaier van toepasbaarheid te verzekeren, het protocol gepresenteerd was een eenvoudige workflow waarmee zowel nieuwe als meer gespecialiseerde gebruikers van MALDI IMS tot zeer reproduceerbare resultaten te bereiken voor een breed scala van lipide imaging-toepassingen. Kan echter sublimatie protocollen worden aangepast aan de uniqu voldoene omstandigheden van het experiment. Bijvoorbeeld, de fijne kristallen matrix afzetting door sublimatie maakt de mogelijkheid om de volgorde van monstervoorbereiding door voorbekleding slides achteruit / platen met matrix vóór montage het weefsel. De matrix kan sublimeren op het geleidende oppervlak van tevoren opgeslagen in een donkere omgeving om later aldus monstervoorbereiding tijd na snijden terwijl het hoge gevoeligheid voor detectie lipide 16, 17 handhaven verminderen. Andere modificatie die kan worden aangebracht in dit protocol om het signaal te versterken voor de detectie van lipiden is 2 minuten wassen met ammoniumformiaat 8.
Hoewel sublimatie veel van de nadelen van de meeste natte depositietechnieken, zoals kleinere kan omzeilen, homogener matrix kristal afzetting 1, verminderde delokalisatie van analyten en lage kosten vergeleken met geautomatiseerde sproeiers, zodatme variabiliteit in de steekproef voorbereidingsproces is onvermijdelijk. Bij sublimatie, zijn er verschillende factoren die kleine verschillen van het ene experiment naar het andere kunnen veroorzaken, kunnen de volgende die in ons laboratorium hebben waargenomen omvatten. Er kunnen verschillen in de positie van de sublimatie apparatuur op het zand. Bij het uitvoeren van verscheidene experimenten sublimatie back-to-back, kan het zand in het zandbad beginnen zijn gezet, waardoor de warmteafvoer kan beïnvloeden gehele zandbad verschuiven. Afvlakking van de zand vóór elke ronde van sublimatie kan ook de verspreiding van de warmte als zand, dat ontheemd is geraakt kan enige tijd duren om terug te keren om een gelijkmatige temperatuur te veranderen. Sublimatie tijd wellicht iets tussen elke ronde worden aangepast om te compenseren voor het verschuiven van zand in het zandbad. Alternatief kan het gebruik van een oliebad tot homogenere warmteafvoer.
Ten tweede kan de hoeveelheid matrix onderaan de sublimator variëren. DAN Matrix een clumpy grijs lijkt en heeft de neiging om grote clusters. Deze clusters kunnen handmatig worden gebroken en aangebracht in de bodem van de sublimator maar kan niet volledig worden geëlimineerd. Grote clusters van matrix duurt langer warmte en sublimeren dan kleinere stukken die het eindproduct van de sublimatie kan beïnvloeden.
Het vacuüm uitgang van de sublimatie-inrichting is een kritische factor. De meeste sublimators zijn gemaakt met een vacuüm uitgang waarop slang is bevestigd aan te sluiten op de vacuümpomp tijdens sublimatie. Omdat de druk wordt geregeld op die zijde van de inrichting, kan er een lichte oneffenheid van de matrixafzetting worden, met meer worden afgezet op de kant met het vacuüm uitgang. Dit kan enigszins worden gecompenseerd door verschuiving ofwel de positie van de inrichting in het zand, de positie van de matrix in de bodem van de sublimator of door de positie van de schuif / plaat aan de condensor. deze feitors zijn de belangrijkste nadelen van de sublimatietechniek en om deze reden is het cruciaal om een objectglaasje door sublimatie proces in werking voordat u experimentele monster dat kan worden ingesteld ter compensatie van deze variabelen.
Een ander nadeel van sublimatie gemeld is dat de detectie van analyten grotere massa wordt beperkt door onvoldoende extractie analyt en / of mengen met matrix. Een rehydratie stap na sublimatie kan helpen trekken uit deze hogere massa te analyseren om dit probleem te omzeilen. Dit wordt typisch bereikt door een bevochtigingskamer 18. In dit protocol, een invriesstap wordt na sublimatie die hetzelfde doel bereikt. Het invriezen en vervolgens ontdooien (in een exsiccator) van de monsters vóór het inbrengen in de MALDI instrument veroorzaakt condensatie op het oppervlak van het monster dat het monster tijdelijk hydrateert om voor de winning van lipiden grotere massa behoud van de tissue voor analyse 12, 17.
Overall, sublimatie is een zeer gevoelige en rendabele methode matrix aanvraag voor de detectie van lipiden in MALDI IMS experimenten. Inderdaad, heeft onze fractie aanzienlijke verbeteringen aan IMS resultaten opviel toen we verschoven van het gebruik van een lucht-nevel methode 3 om een sublimatie methode 4 voor matrix afzetting. Het huidige protocol is geschikt voor een aantal lipide imaging toepassingen, maar kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
