Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Sublimering av DAN Matrix för detektion och visualisering av gangliosider i råtthjärnvävnad för MALDI Imaging Mass Spectrometry

Published: March 23, 2017 doi: 10.3791/55254

Abstract

Provberedning är nyckeln för optimal detektion och visualisering av analyter i Matrix-assisted laser desorption / jonisering (MALDI) Imaging masspektrometri (IMS) experiment. Fastställande av lämpligt protokoll för att följa hela provberedningsprocessen kan vara svårt eftersom varje steg måste optimeras för att uppfylla de unika egenskaperna hos de analyter av intresse. Denna process innebär inte bara att hitta en kompatibel matris som kan desorbera och jonisera molekylerna av intresse effektivt, men också välja lämplig matris nedfall teknik. Till exempel, en våt matris avsättningsteknik, som innebär upplösning av en matris i lösningsmedel, är överlägsen för desorption av de flesta proteiner och peptider, medan torra matrisavsättningstekniker är särskilt effektiva för jonisering av lipider. Sublimering har rapporterats som en mycket effektiv metod för torr matrixdeposition för detektion av lipider i vävnad genom MALDI IMS grund av homogeneity matriskristallavsättning och minimal analyt omlokalisering jämfört med många våta deponeringsmetoder 1, 2. I stora drag innebär det att placera ett prov och pulvriserat matris i en vakuumförseglad kammare med proverna pressade mot en kall yta. Anordningen sänkes därefter in i ett uppvärmt bad (sand eller olja), vilket resulterar i sublimering av den pulverformiga matrisen på den kylda vävnadsprovytan. Här beskriver vi en sublime protokoll med 1,5-diaminonaftalen (DAN) matris för detektion och visualisering av gangliosider i råtthjärna med hjälp av MALDI IMS.

Introduction

Matrix-assisterad laserdesorption / jonisering (MALDI) Imaging masspektrometri (IMS) har blivit en eftertraktad teknik för visualisering av den geografiska fördelningen av lipider, peptider och proteiner över intakta provytorna. MALDI IMS var tidigare känd som en analytisk teknik för pre-renade analyter, men under de senaste åren har det varit uppmärksamma på många andra discipliner på grund av möjligheten att kombinera riktigheten i masspektrometri med hög upplösning visuella / anatomiska referenspunkter utan behov av någon extern märkning. Som den vetenskapliga pool av forskare som använder denna teknik fortsätter att växa, är det ökade behovet av standardiserade, enkla att följa protokoll för att underlätta utveckling och optimering av IMS experiment. Gangliosider, en grupp av membranlipider mycket rikligt i det centrala nervsystemet, är idealiska för MALDI IMS experiment som de befinner sig, inbäddade i membranet, gör vissa species omöjligt att detektera med användning av konventionell Immuno-märkning. Dessutom har vi visat, med hjälp av MALDI IMS att dessa lipider, som fungerar som modulatorer av cellsignalering, bland annat, har unika anatomiska fördelningsmönster i friska gnagare hjärnan som förändras efter hjärnskada 3, 4, 5. Gangliosider är belägna på ett högre massområde jämfört med de flesta fettarter, och är därför mest lämpade för MALDI imaging plattform.

Figur 1
Figur 1: Workflow av MALDI IMS experiment. Diagram över det generella arbetsflödet av en MALDI IMS experiment med sublimering. Vävnaden frystes vid -80 ° C är sektionerad i en kryostat och 10 | j, m sektioner är tö monterade på ledande ITO diabilder. Objektglaset placeras därefter i en exsickator tills sublimering. Slides är införda i sublimeringsapparat och ett jämnt lager av matris appliceras på vävnadsprovytan. Proverna fryses över natt i en -20 ° C frys placerades sedan i en torkapparat under 10 min. När standarder har tillämpats, är proverna insattes i MALDI instrumentet där en laser riktas tvärs vävnaden orsakar desorberade molekylerna i matrisen för att jonisera. Jonerna resa ned en flygning rör och separat baserat på deras massa (time-of-flight / TOF) tills de når detektorn. Informationen på den joniska överflöd av analyter inom ett förutbestämt massa-till-laddning (m / z) området visas som både en molekyl bilden och masspektrum. Dessa data kan användas för att både visualisera och kvantifiera den joniska överflöd av analyten av intresse i den avbildade vävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

provberedningför MALDI IMS är mycket varierande eftersom varje steg i processen måste anpassas till analyter av intresse. Det utmärkande drag för MALDI-baserade experiment är användningen av ett matrisbeläggning avsattes på provytan före analys. Utöver rollen att absorbera och överföra strålningsenergi från lasern under ablationsprocessen, matrisen tjänar också till att isolera olika analyter från provet och därigenom underlätta analysen av föreningar av intresse 6, 7. Enhetlig tillämpning av matrisen till provytan är det mest avgörande steget i provberedningsprocessen. Felaktig matrisavsättning kan leda till stora heterogena matris kristall formationer och utvecklingen av artefakter, låg jon-signal, och dålig reproducerbarhet 7.

På grund av affiniteten av vissa matriser för att isolera specifika analyter, typen av matris ut för ett experiment kansignifikant förändra resultatet. Matriserna som används för avbildning av proteiner och peptider skiljer sig ofta från dem som används för avbildning lipider och processen kompliceras ytterligare av behovet av ytterligare förfaranden såsom tvätt- och rehydrering åtgärder för att framgångsrikt detektera signaler från vävnad. Även tvättsteg finns för att höja lipid signaler 8, är de inte en förutsättning för att upptäcka de flesta lipid arter. Vid val av en matris för en lipid avbildningsexperiment, är det viktigt att beakta polariteten hos lipiden av intresse eftersom detta kommer att begränsa området av lämpliga matriser. Till exempel, gangliosider innehåller sialinsyrarester som ger dem en total negativ polaritet. Det finns ett antal matriser som effektivt kan desorbera och joniserar gangliosider från vävnad; måste emellertid faktorer såsom matrishärledda toppar i spektrum och stabilitet hos matrisen under vakuum tas under övervägande. 1,5-diaminonaftalen (DAN) matrisen är tillräckligt stabil under instrumentvakuumförhållanden för de flesta av bildprogram och har visat en hög grad av känslighet för lipid desorption och kan användas för analys av lipider i både positiva och negativa joner lägen 2. DAN matris, jämfört med andra negativa lipid affinitetsmatriser såsom dihydroxibensoesyra (DHB), 9-aminoakridin (9-AA), och 5-kloro-2-merkaptobensotiazol (CMBT), kunde mest effektivt desorbera gangliosider från råtthjärna vävnad i negativ jon-läge (manuskript under utarbetande).

Välja lämplig metod för matrixdeposition är lika viktigt att välja själva matrisen. Våta matrisdeponeringsmetoder varvid den fasta matrisen är lösta i ett organiskt lösningsmedel, och som deponeras av pneumatisk eller automatiserade sprutor eller spotters, är särskilt effektiva för desorption av proteiner och peptider när vätskan tränger provet för att möjliggöra för extraInsatser av föreningar och sam-kristallisation med matrisen. Även om dessa tekniker kan också användas för lipid-applikationer, analytdelokalise och ojämn matriskristallformationer är vanligt förekommande på grund av den höga förekomst och lösligheten av lipider i lösningsmedel, särskilt i vävnad 2, 9. Eftersom lipider lätt joniseras från vävnad, torra matrisavsättningstekniker, såsom sublimering, erbjuder en enkel, kostnadseffektiv alternativ till sprutor samtidigt som den kringgår många av nackdelen av dessa tekniker. Framgången för sublimering i MALDI IMS experiment tillskrivs funktioner såsom mikromatris morfologi, vilket ökar ytan för matrisanalytbindande, ökad matris renhet och homogen matris nedfall leder till ökad reproducerbarhet jämfört med våta matristeknik 1, 10.

sublime involves uppvärmning av en pulveriserad matris under vakuum omedelbart under en kyld provytan vilket resulterar i fast till gas-fas övergång av den pulveriserade matrisen följt av avsättning på vävnadsprov ytan. Under sublimering, kan matrixdeposition styras genom varierande faktorer såsom tid, temperatur och tryck för att ge mycket reproducerbara resultat. En enda sublime experiment kan ta allt från 5 till 20 minuter, beroende på vilken typ av matris vald, som kan återanvändas flera gånger innan den kasseras. Apparaten kan köpas i handeln till en bråkdel av priset för automatiserade sprutor och lätt tas isär för rengöring och underhåll. Den låga kostnaden och den relativa enkelheten i denna matris nedfall teknik gör den idealisk för forskare börjar eller expandera på lipid bildprogram i MALDI IMS. Även uppgifter med uppgifter protokoll för sublimering av vävnader för IMS har rapporterats 11, några standardiserade protokoll finns which fokusera på den grundläggande arbetsflöde som arbetar med att genomföra en sublimeringsexperiment för avbildning med hög mass lipider i negativ jon-läge, vilket gör det svårt att fastställa tekniken utan omfattande försök och misstag. Följande är ett experimentellt protokoll som syftar till att fylla denna lucka för sublimering av DAN matris på råtthjärnsektioner för högupplösande avbildning och detektering av gangliosider.

figur 2
Figur 2: Sublimerings Apparatus. Fotografi (A) och schematiskt diagram (B) i sublimeringsapparaten. Vakuumpumpen är ansluten med gummislangen till en köldfälla fylld med 300 ml etanol. Köldfällan ansluts sedan genom gummislangen till sublimeringsapparaten. Anordningen består av två separata delar av glasvaror som har förseglats tillsammans med en metall U-fog. Den övre halvan av den sublimatorinnehåller kondensorn som är fylld med issörja. Provplattan är tejpade på botten av kondensorn, inuti den förslutna glasapparaturen. Den nedre halvan av den sublimeapparaten innehåller den DAN matrisen, utspridda jämnt vänd mot provplattan. Under sublimering, är glasapparaturen placeras på ett sandbad upphettades till 140 ° C med en värmeplatta direkt under den. Temperatursonden hjälper till att bibehålla en stabil temperatur under sublimeringsexperiment genom återkoppling av sandbadet temperatur jämfört med den förinställda temperaturen för experimentet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden djurhantering som beskrivs nedan ansluter sig till University of Western Ontario djurvård kommitté (2016-014).

1. Vävnadsberedning och Sektione

  1. Utdrag hjärnvävnad från råtta genom en process som kallas "Fresh Frozen Extraction" (FFE).
    1. Euthanize råttan med en överdos av pentobarbitalnatrium och övervaka reflexer i armar och ben. När alla reflexer har upphört, kapa huvudet av råttan med hjälp av en giljotin.
    2. Separera försiktigt muskler och andra vävnader från skallen med en skalpell. Använda ben-skärande pincett för att bryta skallen att exponera hjärnan, med start från basen av skallen (foramen magnum) till den främre delen.
    3. När hjärnan utsätts, ös ut med en kirurgisk spatel och placera omedelbart på krossad torris för blixtfrysning.
      OBS: Hjärnan kommer att vara mycket formbar. Därför tar mycket försiktig när du placerar hjärnan påtorris. Om hjärnan krossas eller pressas mot en yta, kommer den att ändra sin form och frysa i den positionen.
  2. Ta fryst vävnad (inte perfusion med formaldehyd eller inbäddad i oktober) från - 80 ° C frys och plats på torr is.
  3. Placera några droppar vatten på en kryostat hållare och plats på antingen torris eller kryostat frysa bar. Tryck vävnad lätt på kryostat hållaren som det börjar frysa och hålla tills vattnet fryser runt basen av vävnaden och förankrar den på plats. Tillsätt ytterligare vatten för att ytterligare säkra vävnaden på hållaren om det behövs.
    OBS: Vatten används i stället för oktober media för montering vävnad för att undvika kontaminering av vävnaden med föreningar, som kan påverka detekteringen av den önskade signalen.
  4. Position vävnad i kryostat. Vävnadssektionen upp till den önskade anatomiska läget. Säkerställa att skärtjockleken är mellan 8-12 | im.
    OBS: När snitt vävnad i kommunala kryostatenheter, är det absolut nödvändigt att separata material såsom knivar, borstar, krängningshämmare, och hållare användas för att undvika kontaminering med inbäddning föreningar. bör också rengöras insidan av kryostaten grundligt med etanol före användning.
  5. Använda kryostaten krängningshämmaren, långsamt avsnitt tillplattad vävnadssnitt. Hål eller markeringar på vävnaden kan uppstå om störtbåge placering är felaktig eller bladet är tråkigt. Flytta vävnaden till mitten av skiv plattform med hjälp av rena penslar.
  6. Montering
    1. Frysa ledande diabilder eller metallplattor genom att placera dem i kryostaten medan skivning. När bilden är helt frusen, försiktigt flytta sektione vävnaden på den ledande ytan av bilden med hjälp av rena penslar. När alla vävnadssnitt är korrekt placerade på bilden, placera ett finger under bilden, mittemot vävnad, och tryck tills sektionen tinar.
      OBS: Sektioner kan vika eller krypa under upptiningsprocessen närmed hjälp av denna monteringsmetod. Detta kan minskas genom att hålla sliden i kryostaten när tina vävnaden. Om dessa frågor blir problematiskt, ett alternativ är varm-mount metod som anges nedan.
    2. Alternativt kan du ta en rumstemperatur Indium-tennoxid (ITO) slide (eller metallplatta) och lätt tryck nedåt på fryst vävnadssnitt på skiv plattformens yta, ledande nedåt. Detta kommer att leda till vävnadssektionen upptining jämnt på ytan av objektglaset med liten curling eller veckning av vävnaden.
      OBS: Kondensation kan visas under sektionen vid montering med hjälp av denna metod, som kan leda till förlust av vissa proteiner och lipider.
  7. Placera objektglasen med vävnad i en torkapparat under 5 - 10 min.

2. Sublimator Apparat Set-up

OBS: Utför dessa steg i ett dragskåp.

  1. Placera ett sandbad i en aluminiumbehållare på en värmeplatta, med värmeplatta på ett metall scissor liftlämplig yta (dvs större än den varma plattan). Slå på den varma plattan och ställa in temperaturen på 140 ° C.
    OBS: Smältpunkten för DAN matrisen är mellan 187 till 190 ° C. Inte överstiga denna temperatur på plattan.
    1. Om den varma plattan är försedd med en temperaturåterkopplingssond, använda den för att övervaka sand temperatur under hela experimentet och säkerställa temperatur konsekvens. Den här funktionen kan hjälpa till med experiment reproducerbarhet över olika sublime experiment.
      OBS: Den sandbad bör finnas inom en aluminiumbehållare som en glasbehållare kan splittras vid höga temperaturer.
  2. Placera 300 mg av DAN matris på bottenytan av sublimeapparat. Placera matrisen i mitten av apparaten och sprids ut i ett jämnt lager i det ungefärliga bredden och längden av glid som sublimeras.
    VARNING: DAN matrisen är giftig. Därför är det viktigt slitage handskar, masker och säkerhetglasögon hela tiden vid hantering av pulveriserad matrisen. DAN bör förvaras i mörker som det är ljuskänslig.
  3. Tejpa en metallplatta på den inre ytan av anordningen med plåtframställnings direkt kontakt med botten av kondensorn för att säkerställa jämn fördelning av temperaturen kylning över hela ytan av objektglaset under sublimering. Alternativt, sand i botten av kondensorn för att säkerställa en plan yta.
    1. Placera tejpen längs de yttre kanterna av plattan och vidhäfta till sidorna av den inre glasvaror. Om bandet är placerad under plattan och vidhäftar till botten av den inre glasytan, kan temperaturfördelningen inte är jämn och kan resultera i ojämn fördelningsmatris över ytan av objektglaset.
    2. Tejpa en blank (test) glida diagonalt över ytan av metallplattan med tejpen åter placeras på de yttre kanterna av objektglaset.
  4. Ansluta de övre och nedre delar av anordningen, wed en O-ring i mitten för att säkerställa en fullständig tätning.
  5. Placera en metall U-fog runt centrum av apparaten och dra åt skruvstycken tills den övre och nedre halvan av anordningen förseglas tätt tillsammans. Placera i metall O-ring ovanför sandbad.
  6. Ta en handfull av krossad is och placera den i kondensorn. Fyll kylare ¼ till ½ fullt med kallt vatten för att skapa issörja. Den issörja kyler metallplattan på insidan av anordningen och därefter sliden vidhäftat till det. Vänta minst 5 minuter för temperaturen att nå ett stabilt tillstånd.
  7. Häll 300 ml av etanol i köldfällan behållaren och placera glasvaror in i behållaren. Drop 2 - 3 små bitar av torr is i etanolen i botten av köldfällan behållaren. Köldfällan ingång har ett glasrör som kör till botten av cylindern, under det att utgången inte gör det.
  8. Anslut vakuumpumpen till köldfällan utgång med gummislang. Använd en annan bit av gummislangar för anslutning köldfällan insignalen till sublimeapparaten. Se till att slangen är ordentligt med hjälp av klämmor metall om det finns.
  9. Använd vakuumpumpen att leverera ett vakuum på 30 - 50 meter. Låt pumpen gå under minst fem minuter för tryckutjämning. Laster på U-ring av sublime anordning kan behöva dras åt igen när vakuumpumpen är påslagen på grund av minskat tryck i anordningen.
    OBS: Vi rekommenderar att en vakuummätaren fästas på pumpen för att övervaka trycket av vakuum under försöket och för att testa efter läckor i tryck för att uppnå högsta möjliga reproducerbarhet mellan experiment. Dock är de flesta pumpar utformade för att upprätthålla ett konstant tryck, därför mätaren kanske inte är väsentlig för erfarna användare. Dessutom kan vakuumtätning fett användas för att bidra till att upprätthålla vakuum.

3. Sublime

  1. Se till att sand badtemperaturen har stabilized vid 140 ° C och att anordningen är fäst i metall O-ring ovanför sandbad med alla slangar ansluten och vakuumet påslagen.
  2. Ställ timer för 7 minuter, men inte starta timern. Långsamt höja scissor lift och sandbad upp till sublimeringsapparaten tills det U-leden mellan sublimator är väl ovanför metall O-ringen. Denna extra utrymmet tillåter för justering av apparaten på sanden.
    1. Tryck snabbt på sublimator försiktigt på sand yta för att säkerställa att apparaten sitter jämnt på sanden, och sedan omedelbart starta timern.
  3. När timern låter, stänga av vakuumpumpen och sänk försiktigt scissor lift tills sublimator inte längre vidrör sandbadet och sitter säkert i metall O-ringen.
    1. Långsamt lossa mikro avluftningsventil för att minska trycket i apparaten. Lossa metallklämma runt gummislangen av sublimeringsapparat och börjar långsamt för att lossa röret. När rubber röret har lossats något, böja röret åt sidan för att låta resttrycket att fly.
    2. När omgivande trycket återgår försiktigt bort gummislangen från sublimeapparaten.
  4. Lossa laster på U-fog av anordningen och ta bort. Noggrant separera de två halvorna av sublimeringsapparat och dra av sliden från toppen av det inre glasvaror. Undersök bilden för att bekräfta även fördelningsmatris.
    OBS: Om matrisen är ojämn, kan den pulverformiga matrisen i botten av sublimator återpositioneras eller sublimator anordningen kan omplaceras i sanden för nästa bild. Sublimeringsprocessen kan upprepas flera gånger med samma matris, men matrisen kommer så småningom bli mörkare upprepad värmeexponering och mängden pulver kommer att minska så att sublime tiden måste justeras något för att kompensera. Av denna anledning är det viktigt att övervaka mängden matris being sublim efter varje experiment för att säkerställa konsekvens i matrixdeposition mellan diabilder
  5. Om fördelningen och mängden av matris sublimerad är tillräcklig, tejpa en ny bild med vävnad på insidan av sublimator och upprepa avsnitt 3.
    OBS: För kvalitetskontroll (QC) ändamål, kan mängden matris sublimerad mätas efter varje experiment genom vägning sliden före och efter sublimering och dividera vikten av sublimerad matris med ytarean av sliden 2, bör det noteras att på grund av bristande precision flesta skalor bortom 4 decimaler och variationen mellan skalor, dessa mätningar bör endast användas en guide för optimal matrixdeposition i motsats till en helt kvantifierbara hjälp av QC inte en hög precision balans används (se figur 3).

4. Tissue Förvaring / Rehydrering

  1. Efter sublimering, lagra glider i en sluten behållare eller små cassette i förseglad plastpåse.
  2. Inkubera objektglasen i -20 ° C frys under 2 timmar eller över natten.
    OBS: Målet med frysprocessen är att fungera som en rehydrering steg för desorption av vävnadsmaterial in i matrisen. Frysprocessen har också visat att förhindra nedbrytning av fettsignaler för upp till en vecka vid förvaring vid -80 ° C 12. Av denna anledning, kan den tid som proverna förvaras i frysen varieras till en viss grad för att passa behoven hos den som utför experimentet utan någon väsentlig ändring signaldetektering (såsom observerats i vårt lab). Däremot har vi märkt en viss missfärgning av matris när prover fryses längre än 24 timmar vid -20 ° C. Därför rekommenderar vi att avbilda sublime vävnaden innan dess eller lagra vävnaden vid -80 ° C under längre inkubationsperioder.
  3. Ta bort diabilder från frysen (och behållare) och placera i en torkapparat under 5 - 10 min.

5. Imaging och ANALYS

  1. Ta bort diabilder från exsickator och tillämpa instrument standarder för att säkerställa massa noggrannhet MALDI instrument under avbildning. Den typ av standarder kommer att variera beroende på instrumentering. Standarder är i allmänhet appliceras jämnt över hela bilden, omgivande vävnad som skall avbildas (Figur 3D).
  2. Sätt glida in MALDI instrument och följa tillverkarens instruktioner för imaging experiment (instrumentmetoder bör optimeras för 1000 - 2000 massområde). Representativt resultat (Figur 4) förvärvades i reflektronen negativ läge med en 70 pm raster och 20 skott / spektrum (förvärv tid ~ 2 h).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter slutförandet av sublime experimentet är de båda halvorna av glasapparaturen separeras i dragskåp och sliden, tejpade till kylaren, kan tas bort (figur 3A). Vid det här laget bör undersökas bilden vara för ojämn fördelningsmatris och tid, temperatur, eller placering av apparaten i sandbadet kan behöva justeras för nästa bild. En framgångsrik DAN sublime experiment kommer att resultera i en jämn beläggning av grå / brun matris längs ytan av objektglaset där anatomiska egenskaper hos vävnaden kan visualiseras tydligt och mängden matris på glaset bilden liknar det belopp på vävnaden (figur 3B). Till exempel, om för mycket matris har sublimeras på vävnaden kommer tjockleken hos matrisen täcka särdragen i vävnaden och enbart den allmänna formen kommer att vara urskiljbar. Om emellertid för lite matris sublimeras, kommer vävnaden utmärve en mörkare utseende än resten av bilden (Figur 3C). Både för mycket och för lite matris kommer att resultera i dålig signal i MALDI instrumentet. För kvalitetskontroll, Thomas et al. vägde mängden matris deponerad på objektglaset och dividerat vikten med ytarean av sliden. De rapporterade en optimal mängd matrisavsättning flera matriser inklusive DAN (110 mikrogram / cm) 2. Även om de flesta saldon saknar precision som behövs för att replikera dessa resultat har vi försökt denna metod för QC; men på grund av en hög grad av variation, vi kan bara råda ett lämpligt område av matrisavsättning befunnits vara associerade framgångsrik kontra misslyckade sublime experiment med DAN matris som bestäms genom signaldetektering i instrumentet. En matris mätning av under 100 mikrogram / cm var förknippad med "för lite" matris villkor samtidigt som ett mått på över 140 mikrogram / cm vari samband med "för mycket". Matrixdeposition mellan 100 och 140 | j, g / cm ^ befanns vara en optimal kvantitet för avbildning med DAN matris. Kalibreringsstandarder bör tillämpas på objektglaset runt vävnadsprover för att säkerställa mass noggrannheten hos de detekterade IMS signaler (Figur 3D)

I en MALDI IMS experiment tillåter molekylära bild för visualisering av den geografiska fördelningen av analyten av intresse tillsammans med okända arter som kan förekomma i ett givet massintervall. De molekylära bilder av gangliosider i detta experiment belades med ImageJ programvara för att visa den anatomiska fördelningen av flera gangliosid arter över de kortikala och subkortikala regioner av råtthjärna (Figur 4A). De vanligast förekommande gangliosider i hjärnan är A-serien arter GD1a och GM1 men innehåller också gangliosider GM2 och GM3 som alla kan hittas mellan1000-2000 m / z massområde, ett högre massområde än de flesta vanliga hjärnlipider, vilket gör dessa gangliosider lätt att identifiera längs spektrum (Figur 4B). Den joniska överflöd av varje gangliosid arter kan användas till semi-kvantifiera skillnader eller förändringar i gangliosid arter inom samma bild. Eftersom en viss mängd variabilitet i provet prep inte kan undvikas i IMS, mellan skannings jämförelser anses vara semikvantitativ.

Figur 3
Figur 3. DAN Sublime. Representativa resultat av sublimering av DAN matris på råtthjärnvävnad. (A) Efter avslutad sublimering, är de två halvorna av anordningen separeras och sliden avlägsnas från kondensorn. (B) DAN matris sprider jämnt över flera råtthjärna vävnadssnitt på ytan av bilden för att möjliggöra mycket reproducible resultat (mellan 100 till 150 | j, g / cm ^). (C) Exempel på misslyckade sublimerings experiment där för lite matrix (vänster - <90 mikrogram / cm) eller för mycket matris (höger -> 150 mikrogram / cm) deponerades. För lite matris kommer att resultera i otillräcklig desorption av analyter, medan alltför mycket matris inte kommer att tillåta laser för att tränga in i vävnaden under förvärv, vilket resulterar i låg jon upptäckt. (D) Skjut innehållande råtthjärna vävnadssnitt sublime med DAN matris och kalibreringsstandarder är redo för insättning i MALDI instrument för avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. MALDI IMS av gangliosider i råtthjärna. representative MALDI IMS molekyl bild och masspektrum av gangliosider i råtthjärna efter sublimering med DAN matris. Den molekylära bild är en komposit av flera gangliosid arter i det spektrum som överdras och pseudocolored med Image J programvara för att visa den unika anatomiska fördelningen av gangliosid arter i hela hjärnan. Arter GM1d18: en (röd, massa ~ 1547 Da), GM1d20: 1 (grön, massa ~ 1573 Da), GM3d18: 1 (blå, massa ~ 1178 Da), och GM3d20: 1 (kricka, massa ~ 1207 Da) är representerade. Den visar masspektrum joniska överflöd av analyter inom ett 1000 - 2000 massområde. De stora A-serien gangliosider är märkta längs spektrumet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta arbete detaljer ett standardiserat protokoll av matrissublime på vävnad för detektering av negativt laddade lipider, såsom gangliosider, i MALDI IMS experiment. Provberedning för MALDI IMS är mycket varierande och måste anpassas för att passa de unika egenskaperna hos målanalyten. Tillämpningen av matris på vävnadsprov ytan är en viktig aspekt av provberedningsprocessen med avseende på kvaliteten på resultaten i IMS. Särskild försiktighet bör iakttas vid val av matriser, se till att matrisen är förenlig med analyten av intresse och är fri från matris härledda artefakter i spektrumet. Sublimering är en torr matris avsättningsteknik som ger en hög grad av matriskristall homogenitet med liten delokalisering av lipider på vävnad. DAN matris i synnerhet uppvisar en hög grad av känslighet för desorption av en grupp av negativt laddade membranlipider kallade gangliosider, såsom demonstreras i råtthjärnasektioner, och är stabil under vakuum under förlängda tidsperioder, vilket möjliggör för kompatibilitet med en majoritet av bildtillämpningar. DAN matris har den ytterligare fördelen att också har en hög affinitet för positivt laddade lipidförening, vilket ökar mångsidigheten hos denna matris för MALDI IMS applikationer 2. Det bör också noteras att flera lipid-arter, inklusive fosfolipider, kan detekteras samtidigt vid användning av denna IMS-protokollet.

En grundlig undersökning av egenskaperna hos DAN matris jämfört med 9 andra vanliga matriser har tidigare publicerats två. I den här artikeln, författarna belysa den ökade känsligheten hos DAN matris i negativ jon-läge jämfört med andra matriser undersökts samt kapacitet för högupplösta bilder med hjälp av DAN. DAN matris befanns ha den högsta prestanda för negativa polaritet joner. Intressant, utförde det EQUAlly bra för positiv polaritet joner. Andra vanliga matriser som har visat hög affinitet för negativa polaritet joner innefattar DHA, DHB, och 9-AA. Effektiviteten av DHA som en matris är begränsat av dess låga stabilitet under vakuum, vilket gör det opraktiskt för de flesta avbildningstillämpningar 2. 9-AA har fördelen av att producera låg bakgrundsbrus och påvisade anrikning av sulfatid signaler i 750-950 massområdet i negativ-läge jämfört med DHB matrisen 13. Även DHB har visat sig vara mycket effektiv i positiv mod, ger det lägre negativ polaritet jon signal jämfört med DAN matris 2. DAN matris visade också ökad känslighet i negativ jon-läge i det nedre viktområdet (650-950) jämfört med DHB 2. Dessutom har det rapporterats att DHB kan bilda stora matris kluster i negativ jon-läge upp till 750 Da 2.

et al. , I vilken markmatrisen bringas att passera genom en fin sil och avsattes på provytan. Författarna jämförde denna torra metoden av matrixdeposition till våt matris manuell sprayteknik och fann att de gav jämförbar signal för fosfolipider i 450 - 1200 viktområdet 14. En studie använde både sublimering och torr beläggning med en sil för att undersöka fosfolipid uttryck, men gjorde författarna inte kommentera hur de två teknikerna jämfört med avseende på bildupplösning eller jon signal avkastning 15.

För att säkerställa bredast möjliga utbud av tillämplighet, protokollet som presenterades var en grundläggande arbetsflöde som gör att både nya och mer specialiserade användare av MALDI IMS att uppnå mycket reproducerbara resultat för ett stort antal av lipid bildprogram. Däremot kan sublimeringsprotokoll ändras för att möta unique omständigheter av försöket. Till exempel, den fina matris crystal nedfall från sublime medger möjligheten att kasta om ordningen för provberedning genom förbeläggning diabilder / plattor med matris före montering vävnaden. Matrisen kan sublimeras på den ledande ytan i förväg och lagras i en mörk miljö för senare användning på så sätt reducerande prov förberedelsetid eftersektione samtidigt bibehålla hög känslighet för lipid detektering 16, 17. En annan modifiering som kan göras till detta protokoll för att förbättra signal för detektion av lipider är en 2 min tvätt med ammoniumformiat 8.

Även om sublimering kan kringgå många av nackdelarna med de flesta våtdeposition tekniker, såsom mindre, mer homogen matris kristall nedfall en minskade utlokalisering av analyter, och låg kostnad jämfört med automatiska sprutor, såmig variation i provberedningsprocessen är oundviklig. I fallet med sublimering, finns det flera faktorer som kan orsaka små skillnader från ett experiment till ett annat och kan inkludera följande, som har observerats i vårt labb. Det kan finnas skillnader i läget för sublimeringsapparaten på sanden. När du kör flera sublime experiment back-to-back, kan sanden i sandbadet börjar skifta sin position som kan påverka spridningen av värme i hela sandbad. Plattas sanden före varje omgång av sublimering kan också ändra spridningen av värme som sand som har förskjutits kan ta tid att återgå till en jämn temperatur. Sublime tid kan behöva justeras något mellan varje omgång för att kompensera för skiftande sand i sandbadet. Alternativt kan användning av ett oljebad leda till mer homogen värmespridning.

För det andra kan den mängd matris vid botten av det sublimator variera. DAN MATRIx har ett klumpiga grått utseende och har en tendens att bilda stora kluster. Dessa kluster kan manuellt brytas upp och anordnade i botten av sublimator men kan inte helt elimineras. Stora kluster av matris kommer att ta längre tid att värma och sublimera än mindre bitar som kan påverka slutprodukten av sublimering.

Vakuum utgången på sublimeapparaten är en annan avgörande faktor. De flesta sublimators görs med en enda vakuum utgång på vilken slangen är fäst för att ansluta den till vakuumpumpen under sublimering. Eftersom trycket är reglerat på den sida av anordningen, kan det finnas en lätt ojämnhet av matrisavsättning, med mer som deponeras på sidan med vakuumutgången. Detta kan vara något kompenseras genom att skifta antingen positionen av anordningen i sanden, placeringen av matrisen i botten av sublimator, eller genom att ändra läget av sliden / platta på kondensorn. dessa faktumorer är de huvudsakliga nackdelarna med den sublimeringsteknik och av denna anledning är det mycket viktigt att köra en testglaset genom sublimeringsprocessen innan du kör experimentella provet så att tiden kan justeras för att kompensera för dessa variabler.

En annan rapporterade nackdel med sublime är att upptäcka högre mass analyter begränsas av otillräcklig analyt extraktion och / eller blandning med matrisen. En rehydrering steg efter sublimering kan hjälpa dra ut dessa högre mass analyter att kringgå detta problem. Detta uppnås typiskt med hjälp av en fuktkammare 18. Men i detta protokoll, är en frysningssteg läggas till efter sublimering som uppnår samma syfte. Frysning och efterföljande upptining (i en torkapparat) av proverna före insättning i MALDI instrumentet orsakar kondens bildas på ytan av provet som tillfälligt återfuktar provet för att möjliggöra utvinning av högre mass lipider samtidigt som tissue för analys 12, 17.

Totalt sett är sublime en mycket känslig och kostnadseffektiv metod för matris ansökan för detektion av lipider i MALDI IMS experiment. I själva verket har vår grupp märkt betydande förbättringar IMS resultat när vi skiftade från att använda en luftspraymetod 3 till en sublimeringsmetod 4 för matrixdeposition. Det nuvarande protokollet är lämpligt för ett antal lipid bildprogram men kan modifieras för att passa behoven hos försöks.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sublimator Chemglass Life Sciences CG3038-01
1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix Sigma-Aldrich D21200  100 G
Cryostat Thermo-Fisher Scientific CryoStar NX50
Hot plate with temperature feedback Thermo-Fisher Scientific HP88857290 Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Stainless Steel Jack Thermo-Fisher Scientific 2216479 10x10
Cold Trap Custom built on site
Vacuum Pump Franklin Electric 1102180403 Savant VP100 Two Stage
Indium-tin-oxide (ITO) Slides Hudson Surface Technology PSI 1111000 type II, 1.1 mm/25 each
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument AB Sciex
Desiccator Sigma-Aldrich D2797 tabletop desiccator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
  2. Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
  3. Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
  4. Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
  5. Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
  6. Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
  7. Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
  8. Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
  9. Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
  10. Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
  11. O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
  12. Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
  13. Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
  14. Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
  15. Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
  16. Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
  17. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
  18. Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).

Tags

Neuroscience sublimering MALDI Imaging Mass Spectrometry gangliosider DAN matris hjärna membranlipider
Sublimering av DAN Matrix för detektion och visualisering av gangliosider i råtthjärnvävnad för MALDI Imaging Mass Spectrometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Caughlin, S., Park, D. H., Yeung, K. More

Caughlin, S., Park, D. H., Yeung, K. K. C., Cechetto, D. F., Whitehead, S. N. Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (121), e55254, doi:10.3791/55254 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter