Abstract
Prøve forberedelse er nøglen til optimal detektion og visualisering af analytter i Matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) Imaging massespektrometri (IMS) eksperimenter. Fastsættelse af passende protokol til at følge hele prøven forberedelse proces kan være svært som hvert trin skal være optimeret til at opfylde de unikke kendetegn ved de analytter af interesse. Denne proces indebærer ikke kun at finde en kompatibel matrix, der kan desorbere og ionisere molekylerne af interesse effektivt, men også at vælge den rette matrix deposition teknik. For eksempel en våd matrix deposition teknik, som indebærer opløsning af en matrix i opløsningsmiddel, er overlegen til desorption af de fleste proteiner og peptider, hvorimod tørre matrix aflejringsteknikker er særligt effektive til ionisering af lipider. Sublimering er blevet rapporteret som en meget effektiv metode til tør matrix deposition til påvisning af lipider i væv ved MALDI IMS grundet homogeneity matrix krystal deposition og minimal analyt flytning sammenlignet med mange våddeposition metode 1, 2. I store træk det indebærer at placere en prøve og pulveriseret matrix i et vakuum-forseglet kammer med prøverne presset mod en kold overflade. Apparatet sænkes derefter ned i et opvarmet bad (sand eller olie), hvilket resulterer i sublimering af den pulverformige matrix på den afkølede vævsprøve overflade. Her beskriver vi en sublimering protokol ved at anvende 1,5-diaminonaphthalen (DAN) matrix til påvisning og visualisering af gangliosider i rottehjernen ved brug MALDI IMS.
Introduction
Matrix-assisteret laser desorption / ionisering (MALDI) Imaging massespektrometri (IMS) er ved at blive en meget efterspurgt teknik til visualisering af den rumlige fordeling af lipider, peptider og proteiner tværs intakte prøve overflader. MALDI IMS var tidligere kendt som analytisk teknik til præ-oprenset analytter, men i de senere år er det blevet opmærksom på mange andre discipliner grund af evnen til at kombinere nøjagtigheden af massespektrometri med høj opløsning visuelle / anatomiske referencepunkter uden brug for nogen ekstern mærkning. Da den videnskabelige pulje af forskere udnytter denne teknik fortsætter med at vokse, er der øget behov for standardiserede, let at følge protokoller til at bistå med udvikling og optimering af IMS eksperimenter. Gangliosider, en gruppe af membranlipider høj hyppighed i centralnervesystemet, er ideelle til MALDI IMS eksperimenter som deres placering, indlejret i membranen, gør visse species umuligt at opdage anvendelse af konventionel Immuno-mærkning. Derudover har vi vist, ved hjælp af MALDI IMS, at disse lipider, der fungerer som modulatorer af cellesignalering, bl.a. har unikke anatomiske fordeling mønstre i sunde gnaver hjernen, der er ændret efter hjerneskade 3, 4, 5. Gangliosider er placeret på et højere masseinterval sammenlignet med de fleste lipidarter, og er således mest egnet til MALDI billeddannelse platform.
Figur 1: Workflow af MALDI IMS Experiment. Diagram af den overordnede arbejdsgang af en MALDI IMS eksperiment ved hjælp sublimering. Væv frosset ved -80 ° C er opdelt i en kryostat og 10 um sektioner er tø monteret på ledende ITO objektglas. Objektglasset anbringes derefter i et tørreapparat indtil sublimering. Slides indsættes i sublimation apparat og et jævnt lag matrix påføres vævsprøven overflade. Prøver fryses natten over i en -20 ° C fryser derefter placeret i en ekssikkator i 10 minutter. Når standarder er blevet anvendt, er prøverne indsat i MALDI instrument, hvor en laser er rettet på tværs af vævet forårsager desorberede molekyler i matrixen til at ionisere. Ionerne rejse ned en flyvning rør og separat baseret på deres masse (time-of-flight / TOF) indtil de når detektoren. Oplysningerne om den ioniske overflod af analytter inden for et forudbestemt masse-til-ladningsforhold (m / z) område vises som både en molekylær billede og massespektrum. Disse data kan anvendes til både at visualisere og kvantificere den ioniske overflod af analytten af interesse i det afbildede væv. Klik her for at se en større version af dette tal.
Prøveforberedelsefor MALDI IMS varierer meget som hvert trin i processen skal tilpasses til de analytter af interesse. Det afgørende træk ved MALDI-baserede eksperimenter er anvendelsen af en matrix coating aflejret på prøveoverfladen inden analyse. Ud over den rolle absorbere og overføre stråling energi fra laseren under ablationsprocessen matrixen tjener også til at isolere forskellige analytter fra prøven, hvilket letter analysen af forbindelser af interesse 6, 7. Ensartet anvendelse af matricen til prøven overflade er det mest afgørende skridt i prøven forberedelsesprocessen. Forkert matrixdeponering kan føre til store heterogene matrix krystal formationer og udvikling af artefakter, lav ion-signal og dårlig reproducerbarhed 7.
På grund af affiniteten af visse matricer til isolering specifikke analytter, typen af matrix er valgt til et eksperiment kanvæsentlig grad ændre udfaldet. Matricerne anvendt til billeddannelse af proteiner og peptider afviger ofte fra dem, der anvendes til billeddannelse af lipider og processen kompliceres yderligere af behovet for yderligere procedurer såsom vaske- og rehydrering trin for at kunne detektere signaler fra væv. Selvom der findes vasketrin til forbedring af lipid-signaler 8, de er ikke en forudsætning for påvisning af de fleste lipid arter. Ved valg en matrix til et lipid afbildningseksperiment, er det vigtigt at overveje polariteten af lipidet af interesse, da dette vil begrænse antallet af egnede matrixer. For eksempel, gangliosider indeholder sialinsyrerester, som giver dem en samlet negativ polaritet. Der er en række af matricer, der effektivt kan desorbere og ionisere gangliosider fra væv; dog skal tages faktorer såsom matrix-afledte toppe i spektret og stabilitet af matrixen under vakuum under overvejelse. 1,5-diaminonapthalene (DAN) matrix er tilstrækkelig stabil under instrument vakuumbetingelser for størstedelen af billedbehandlingsprogrammer og har vist en høj grad af følsomhed til lipid desorption og kan anvendes til analyse af lipider i både positive og negative ion modes 2. DAN matrix, sammenlignet med andre negative lipid affinitetsmatricer såsom dihydroxybenzoesyre (DHB), 9-aminoacridin (9-AA), og 5-chlor-2-mercaptobenzothiazol (CMBT), var i stand til mest effektivt at desorbere gangliosider fra rottehjerne væv i negativ ion-mode (manuskript under udarbejdelse).
Valg af passende metode matrix deposition er lige så vigtig for valg af matricen selv. Våde matrix deposition fremgangsmåder, hvor den faste matrix er opløst i et organisk opløsningsmiddel, og deponeret af pneumatisk eller automatiserede sprøjter eller observatører, er særligt effektive til desorption af proteiner og peptider som væsken trænger prøven for at tillade ekstraktion af forbindelser og co-krystallisering med matrixen. Selv om disse teknikker også kan anvendes til lipid applikationer, analyt delokalisering og ujævn matrix krystal formationer er almindeligt forekommende på grund af den høje forekomst og opløseligheden af lipider i opløsningsmidler, især i væv 2, 9. Fordi lipider let ioniseres fra væv, tørre matrix deposition teknikker, såsom sublimation, tilbyder en enkel, omkostningseffektivt alternativ til sprøjter mens omgå mange af ulempen ved disse teknikker. Succesen for sublimering i MALDI IMS eksperimenter tilskrives funktioner såsom mikrokrystallinsk matrix morfologi hvilket øger areal for matrix-analyt binding, øget matrix renhed og homogen matrix deposition, der fører til øget reproducerbarhed i forhold til våde matrix teknikker 1, 10.
sublimation involves opvarmning af en pulveriseret matrix under vakuum umiddelbart under en afkølet prøve overflade resulterer i fast stof til gas-faseovergangen af den pulverformige matrix efterfulgt af aflejring på vævsprøven overflade. Under sublimering, kan matrixdeponering styres ved at variere faktorer såsom tid, temperatur og tryk for at tilvejebringe stærkt reproducerbare resultater. En enkelt sublimation eksperiment kan tage alt fra 5 til 20 minutter afhængigt af typen af matrix er valgt, som kan genanvendes flere gange før bortskaffelse. Apparatet kan købes kommercielt til en brøkdel af prisen af automatiserede sprøjter og let adskilles for rengøring og vedligeholdelse. De lave omkostninger og relative enkelhed af denne matrix deposition teknik gør det ideelt for forskere begynder eller ekspanderende på lipid billedbehandlingsprogrammer i MALDI IMS. Selvom information detaljering protokoller for sublimering af væv til IMS er blevet rapporteret 11, findes w par standardiserede protokollerhich fokusere på den grundlæggende arbejdsgang involveret med udførelse af en sublimering eksperiment til afbildning høj masse lipider i negativ ion-mode, hvilket gør det vanskeligt at fastslå den teknik uden omfattende forsøg-fejl. Følgende er en forsøgsprotokol til formål at afhjælpe denne mangel for sublimering af DAN matrix på rotte hjerne sektioner for høj opløsning billeddannelse og afsløring af gangliosiderne.
Figur 2: Sublimation Apparatur. Fotografi (A) og skematisk diagram (B) i sublimation apparatet. Vakuumpumpen er forbundet med gummirør til en kold fælde fyldt med 300 ml ethanol. Kuldefælden forbindes derefter ved gummislanger til sublimation apparat. Apparatet består af to separate stykker glasvarer, der er forseglet til hinanden med en metal U-joint. Den øverste halvdel af sublimatorindeholder kondensatoren, som er fyldt med is sjap. Prøven plade tapes på bunden af kondensatoren, inde i forseglede glas apparatet. Den nederste halvdel af sublimering apparatet indeholder DAN matrix, spredt jævnt ud overfor prøveplade. Under sublimation, er apparatet glas anbringes på et sandbad opvarmet til 140 ° C ved en varmeplade direkte under den. Temperaturføleren bidrager til at opretholde en stabil temperatur i hele sublimation eksperiment gennem tilbagemelding af sandet badtemperaturen forhold til den indstillede temperatur til eksperimentet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer dyr håndtering beskrevet nedenfor holde sig til University of Western Ontario dyr pleje udvalg (2016-014).
1. Tissue Forberedelse og Sektionsinddeling
- Uddrag hjernevæv fra rotter gennem en proces kaldet "Fresh Frozen Extraction" (FFE).
- Aflive rotten med en overdosis af pentobarbital natrium og overvåge reflekser i lemmerne. Når alle reflekser er ophørt, bryde lederen af rotten ved hjælp af en guillotine.
- Omhyggeligt adskille muskler og andre væv fra kraniet ved en skalpel. Brug bone-skæring pincet til at bryde kraniet for at blotlægge hjernen, startende fra bunden af kraniet (foramen magnum) til den forreste del.
- Når hjernen er udsat for, skrab omhyggeligt det ud med en kirurgisk spatel og straks placere på knust tøris til flash frysning.
BEMÆRK: Hjernen vil være meget formbart. Derfor tager ekstrem omhu, når du placerer hjernen påtøris. Hvis hjernen knuses eller presses mod en overflade, vil det ændre sin form og fryse i denne stilling.
- Fjern frisk frosset væv (ikke perfunderet med formaldehyd eller indlejret i OCT) fra - 80 ° C fryser og sted på tøris.
- Placer flere dråber vand på en kryostat holder og sted på enten tøris eller kryostat fryse bar. Tryk væv let på kryostat holder, da det begynder at fryse og hold, indtil vand fryser omkring bunden af væv og forankrer det på plads. Tilsæt yderligere vand til yderligere at fastgøre væv på holderen, hvis nødvendigt.
BEMÆRK: Vand anvendes i stedet OLT medier til montering væv med henblik på at undgå forurening af vævet med forbindelser, som kan påvirke påvisningen af det ønskede signal. - Position væv i kryostaten. Vævssnittet op til den ønskede anatomiske placering. Sørg for, at skære tykkelse er mellem 8-12 um.
BEMÆRK: Når sektionering væv i kommunale kryostatenheder, er det bydende nødvendigt, at særskilte materialer såsom knive, børster, krængningsstabilisatorer og indehaverne bruges for at undgå kontaminering med indlejring forbindelser. Indersiden af kryostaten skal også rengøres grundigt med ethanol før brug. - Brug af kryostat krængningsstabilisator, langsomt sektion fladtrykt vævssnit. Huller eller markeringer på vævet kan opstå, hvis styrtbøjlen placering er forkert eller klinge er kedeligt. Flyt vævet til centrum af udskæring platform ved hjælp af rene pensler.
- Montering
- Frys ledende dias eller metalplader ved at placere dem i kryostaten mens udskæring. Når slæden er helt frosset, forsigtigt flytte sektioneret væv på ledende overflade af dias ved hjælp rene pensler. Når alle vævssnit er placeret korrekt på diaset, placere en finger under dias, overfor vævet, og tryk, indtil sektionen tør op.
BEMÆRK: Sektioner kan folde eller krølle under optøningen, nårved hjælp af denne monteringsmetode. Dette kan reduceres ved at holde slæden i kryostaten når optøning af vævet. Hvis disse spørgsmål blive problematisk, et alternativ, er varm-mount metode nedenfor. - Alternativt kan du tage en rumtemperatur Indium-tin Oxide (ITO) dias (eller metalplade) og let tryk ned på frosne væv afsnit om udskæring platform overflade, ledende nedad. Dette vil føre til vævssnit optøning jævnt på overfladen af objektglasset med lille krølning eller foldning af vævet.
BEMÆRK: Kondensation kan vises under sektionen ved montering ved hjælp af denne metode, som kan føre til tab af visse proteiner og lipider.
- Frys ledende dias eller metalplader ved at placere dem i kryostaten mens udskæring. Når slæden er helt frosset, forsigtigt flytte sektioneret væv på ledende overflade af dias ved hjælp rene pensler. Når alle vævssnit er placeret korrekt på diaset, placere en finger under dias, overfor vævet, og tryk, indtil sektionen tør op.
- Placer dias med væv i en ekssikkator i 5 - 10 min.
2. Sublimator Apparater Opsætning
BEMÆRK: Udfør disse trin i et stinkskab.
- Placer et sandbad i en aluminium beholder på en varmeplade, med varmepladen på en metal scissor liftaf passende overfladeareal (dvs. større end den varme plade). Tænd varmepladen og indstille temperaturen til 140 ° C.
BEMÆRK: Smeltepunktet for DAN matrix er mellem 187-190 ° C. Må ikke overstige denne temperatur på varmepladen.- Hvis den varme plade er udstyret med en temperatur feedback-sonde, bruge det til at overvåge sand temperatur i hele eksperimentet og sikre temperatur konsistens. Denne funktion kan hjælpe med eksperiment reproducerbarhed på tværs af forskellige sublimation eksperimenter.
BEMÆRK: sandbad bør være indeholdt i en aluminium beholderen som en glasbeholder kan splintre ved høje temperaturer.
- Hvis den varme plade er udstyret med en temperatur feedback-sonde, bruge det til at overvåge sand temperatur i hele eksperimentet og sikre temperatur konsistens. Denne funktion kan hjælpe med eksperiment reproducerbarhed på tværs af forskellige sublimation eksperimenter.
- Placer 300 mg DAN matrix på den nederste overflade af sublimering apparat. Placer matrix i apparatets midte og spredt ud i et jævnt lag i den omtrentlige bredde og længde af objektglasset blive sublimeret.
ADVARSEL: DAN matrix er giftigt. Derfor er det vigtigt brug handsker, masker, og sikkerhedbeskyttelsesbriller på alle tidspunkter ved håndtering af pulveriserede matrix. DAN bør opbevares i mørke, da det er lysfølsomt. - Tape en metalplade på den indre overflade af apparatet med pladen direkte kontakt med bunden af kondensatoren for at sikre en jævn fordeling af temperaturen afkøling over hele overfladen af objektglasset under sublimering. Alternativt sand bunden af kondensatoren for at sikre en plan overflade.
- Placer tapen langs de ydre kanter af pladen og adhærere til siderne af den indvendige glas. Hvis båndet er anbragt under pladen og klæber til bunden af den indre glasoverflade, kan temperaturfordelingen ikke være jævn og kan medføre ujævn matrix fordeling på overfladen af objektglasset.
- Tape en blank (test) glide diagonalt hen over overfladen af metalpladen med tapen igen anbragt på de ydre kanter af objektglasset.
- Forbind den øverste og nederste dele af apparatet, wed en gummi O-ring i midten for at sikre en fuldstændig tætning.
- Placer en metal U-joint omkring midten af apparatet og stramme Laster indtil de øverste og nederste halvdel af apparatet er forseglet stramt sammen. Placer i metal O-ring over sandbad.
- Tag en håndfuld af knust is og læg den i kondensatoren. Fyld kondensatoren ¼ til ½ fuld med koldt vand for at skabe is sjap. Ice slush vil køle metalpladen på indersiden af apparatet og derefter objektglasset klæbet til den. Vent mindst 5 min for temperaturen at nå en stabil tilstand.
- Hæld 300 ml ethanol i kuldefælden beholder og placere glasvarer i beholderen. Drop 2 - 3 små stykker af tøris i ethanol i bunden af kuldefælde beholderen. Kuldefælden indgang har et glasrør kører til bunden af cylinderen, mens udgangen ikke gør.
- Tilslut vakuumpumpen til kold fælde udgang med gummislanger. Brug et andet stykke af gummislanger til at forbinde kold fælde input til sublimation apparat. Sørg for, at slangen stramt er sikret ved hjælp af metal klemmer hvis tilgængelig.
- Brug vakuumpumpen at levere et vakuum på 30 - 50 mt. Lad pumpen køre i mindst 5 min for trykudligning. Laster på U-ring af sublimering apparat kan have til at blive strammet igen, når vakuumpumpen tændes på grund af nedsat tryk i apparatet.
BEMÆRK: Det anbefales, at en vakuummåler fastgøres til pumpen for at overvåge trykket af vakuum under forsøget og til at teste for lækager i trykket for at opnå den højest mulige reproducerbarhed mellem eksperimenter. Men de fleste pumper designet til at opretholde et konstant tryk, således profilet kan ikke være afgørende for erfarne brugere. Derudover kan vakuum sæl fedt bruges til at hjælpe med at opretholde vakuum pres.
3. Sublimation
- Sørg for, at sand bad temperaturen stabilliseret ved 140 ° C, og at apparatet er fastgjort i metal O-ring over sandet bad med alle rør tilsluttet og vakuummet tændt.
- Indstil timeren til 7 min, men ikke starte timeren. Langsomt hæve den sakselift og sand bad op til sublimering apparatet, indtil U-fælles af sublimator er langt over metal O-ring. Denne ekstra plads giver mulighed for justering af apparatet på sandet.
- Tryk hurtigt på sublimator forsigtigt på sandet overflade for at sikre, at apparatet sidder jævnt på sandet, og derefter straks starte timeren.
- Når timeren lyder, skal du slukke vakuumpumpe og sænk forsigtigt sakselift indtil sublimator ikke længere rører sandet bad og sidder sikkert i metal O-ring.
- løsnes langsomt mikro-udluftningsventil for at mindske trykket i apparatet. Løsne metalbøjle omkring gummislanger af sublimering apparater og langsomt begynder at løsne røret. Når rubber rør er løsnet en smule, bøje røret til den ene side for at tillade resttryk at undslippe.
- Når omgivende afkast tryk, forsigtigt fjerne gummislanger fra sublimering apparatet.
- Løsn laster på U-joint af apparatet og fjern. adskille forsigtigt de to halvdele af sublimering apparatet og træk glide fra toppen af den indre glas. Undersøg slide for at bekræfte selv matrix fordeling.
BEMÆRK: Hvis matrix er ujævn, kan den pulveriserede matrix i bunden af sublimator omplaceres eller sublimator apparat kan omplaceres i sandet for det næste lysbillede. Sublimeringsprocessen kan gentages flere gange med samme matrix imidlertid matrixen vil i sidste ende blive mørkere fra gentagen opvarmning eksponering og mængden af pulver vil falde sådan, at sublimation tid vil skulle tilpasses let for at kompensere. Af denne grund er det vigtigt at overvåge mængden af matrix being sublimeret efter hvert forsøg for at sikre sammenhæng i matrix deposition mellem dias - Hvis fordelingen og mængden af matrix sublimeret er tilstrækkelig, tape et nyt dias med væv på indersiden af sublimator og gentag Afsnit 3.
BEMÆRK: kvalitetskontrol (QC) formål, kan mængden af matrix sublimeret måles efter hvert forsøg ved at veje objektglasset før og efter sublimering og dividere vægten af sublimeret matrix med overfladearealet af slæden 2, skal det bemærkes, at på grund af manglende nøjagtighed i de fleste skalaer ud over 4 decimaler og variabilitet mellem skalaer, disse målinger bør kun bruges en guide for optimal matrixaflejring i modsætning til en fuldt kvantificerbare midler til QC medmindre der anvendes en høj præcision balance (se figur 3).
4. Tissue Opbevaring / Rehydrering
- Efter sublimering, butik glider i en lukket beholder eller lille cassette i forseglet plastpose.
- Inkuber objektglassene i -20 ° C fryser i 2 timer eller natten over.
BEMÆRK: Målet med fryseprocessen er at fungere som en rehydrering skridt for desorption af væv materialer i matrixen. Fryseprocessen har også vist sig at forhindre nedbrydning af lipid signaler i op til 1 uge ved opbevaring ved -80 ° C 12. Af denne grund kan den tid de opbevares i fryseren varieres til en vis grad at passe til behovene hos eksperimentatoren uden væsentlig ændring signal detektion (som observeret i vores laboratorium). Imidlertid har vi bemærket nogle misfarvning af matrix, når prøverne er frosset i mere end 24 timer ved -20 ° C. Således anbefaler vi billeddannelse sublimeret væv før den tid eller opbevarer væv ved -80 ° C i længere inkubationsperioder. - Fjern slides fra fryser (og beholder) og anbringes i en ekssikkator i 5 - 10 min.
5. Billedbehandling og ANALYSE
- Fjern slides fra ekssikkator og anvende instrumenter standarder for at sikre masse nøjagtighed MALDI instrumentet under billedbehandling. Typen af standarder vil variere afhængigt af instrumentering. Standarder er generelt anvendes jævnt over hele dias, omgivende væv, der skal afbildes (figur 3D).
- Indsæt dias i MALDI instrument og følg producentens anvisninger for billeddannelse eksperimenter (instrument metoder bør være optimeret til en 1000 - 2000 masseinterval). Repræsentant resultat (figur 4) blev erhvervet i reflectron negativ tilstand med en 70 um raster og 20 skud / spektrum (erhvervelse tid ~ 2 timer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved afslutningen af sublimering eksperiment er de to halvdele af glasapparaturet separeret i stinkskab og objektglasset, tapede til kondensatoren, kan fjernes (figur 3A). På dette tidspunkt, bør den være undersøgt for ujævn matrix distribution og den tid, temperatur, eller placering af apparatet i sandet badet skal måske justeres til næste dias. En vellykket DAN sublimation eksperiment vil resultere i en jævn belægning af grå / brun matrix langs overfladen af objektglasset, hvor de anatomiske forhold ved væv kan tydeligt visualiseres og mængden af matrix på objektglasset svarer til det beløb på vævet (figur 3B). For eksempel, hvis for meget matrix er blevet sublimeret på vævet, vil tykkelsen af matrixen dække funktionerne i vævet og kun den generelle form bliver tydeligt. Men hvis for lidt matrix sublimeres, vil vævet have en mørkere fremtoning end resten af skyderen (figur 3C). Både for meget og for lidt matrix vil resultere i dårlig signal i MALDI instrument. For kvalitetskontrol, Thomas et al. afvejet mængden af matrix afsat på objektglasset og divideres med vægten af overfladearealet af objektglasset. De rapporterede en optimal mængde matrixdeponering i flere matricer herunder DAN (110 ug / cm) 2. Selv om de fleste saldi mangler præcision, til at skabe lignende resultater har vi forsøgt denne fremgangsmåde til QC; Men på grund af en høj grad af variabilitet, kan vi kun råde et passende område af matrixdeponering fundet at være associeret vellykket versus mislykkede sublimation eksperimenter med DAN matrix som bestemt ved signaldetektering i instrumentet. En matrix måling af under 100 mg / cm² var forbundet med "for lidt" matrix betingelser, mens en måling af over 140 mg / cm² varforbundet med "for meget". Matrixdeponering mellem 100 og 140 ug / cm viste sig at være et optimalt mængde for billeddannelse med DAN matrix. Bør anvendes Kalibrering standarder på objektglas omkring vævsprøverne at sikre massen nøjagtigheden af de detekterede IMS signaler (figur 3D)
I et MALDI IMS eksperiment, den molekylære billedet muliggør visualisering af den rumlige fordeling af analytten af interesse sammen med ukendte arter, der kan være til stede i en given masse interval. De molekylære billeder af gangliosider i dette forsøg blev overlejret under anvendelse ImageJ software til at vise den anatomiske fordeling af flere gangliosid arter på tværs af de subkortikale områder af rottehjernen (figur 4A). De mest udbredte gangliosider i hjernen er de A-serien arter GD1a og GM1 men også indeholder gangliosider GM2 og GM3 som kan alle findes mellem1000-2000 m / z masseinterval, en højere masseinterval end de fleste almindelige hjemelipider, hvilket gør disse gangliosider let at identificere langs spektret (figur 4B). Den ioniske overflod af hver gangliosid arter kan anvendes til semi-kvantificere forskelle eller ændringer i gangliosid arter inden for samme billede. Fordi en vis mængde af variation i prøve prep ikke kan undgås i IMS, mellem scanning sammenligninger betragtes som semi-kvantitativ.
Figur 3. DAN Sublimation. Repræsentative resultater af sublimering af DAN matrix på rotte hjernevæv. (A) Ved afslutning af sublimering, er de to halvdele af apparatet adskilles, og objektglasset fjernes fra kondensatoren. (B) DAN matrix spreder jævnt på tværs af flere rottehjerne vævssnit på overfladen af objektglasset for at tillade stærkt Reproducible resultater (mellem 100 - 150ug / cm). (C) Eksempler på mislykkede sublimation eksperimenter, hvor for lidt matrix (venstre - <90 pg / cm²) eller for meget matrix (højre -> 150 ug / cm²) blev deponeret. For lidt matrix vil resultere i utilstrækkelig desorption af analytter, mens for meget matrix ikke vil tillade laser til at trænge ind til væv under erhvervelse, hvilket resulterer i registrering af lavt ion. (D) Slide indeholder rotte hjerne vævssnit sublimerede med DAN matrix og kalibrering standarder, der anvendes er klar til indsættelse i MALDI instrument til billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. MALDI IMS gangliosider i rottehjernen. Representative MALDI IMS molekylær billede og massespektret af gangliosider i rottehjernen efter sublimering med DAN matrix. Den molekylære billede er en komposit af flere gangliosid arter i spektret belagte samt pseudocolored hjælp af Image J software til at vise den unikke anatomiske fordeling af gangliosid arter i hele hjernen. Arter GM1d18: 1 (rød, masse ~ 1547 Da), GM1d20: 1 (grøn, masse ~ 1573 Da), GM3d18: 1 (blå, masse ~ 1178 Da), og GM3d20: 1 (krikand, masse ~ 1207 Da) er repræsenteret. Massespektret viser ionisk overflod af analytter i en 1.000 - 2.000 masseområde. De store A-serien gangliosider er mærket langs spektret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbejde beskriver en standardiseret protokol af matrix sublimation på væv til påvisning af negativt ladede lipider, såsom gangliosider, i MALDI IMS eksperimenter. Prøve forberedelse til MALDI IMS er meget varierende, og skal tilpasses de unikke egenskaber af analyt. Anvendelsen af matrix på vævsprøven overflade er et afgørende aspekt af prøven fremstillingsprocessen med hensyn til kvaliteten af resultaterne i IMS. Særlig forsigtighed bør tages ved valg matricer, der sikrer, at matricen er kompatibel med analyt og er uden matrix-afledte artefakter i spektret. Sublimering er en tør matrix deposition teknik, der tilvejebringer en høj grad af matrix krystal homogenitet med lidt delokalisering af lipider på væv. DAN matrix især udviser en høj grad af følsomhed til desorption af en gruppe af negativt ladede membranlipider kaldet gangliosider, som demonstreret i rottehjernesektioner, og er stabilt under vakuum i længere perioder, hvilket muliggør kompatibilitet med de fleste af billedbehandling. DAN matrix har den yderligere fordel også at have en høj affinitet for positivt ladede lipid arter, hvilket øger alsidigheden af denne matrix for MALDI IMS programmer 2. Det skal også bemærkes, at flere lipid arter, herunder phospholipider, kan detekteres samtidigt ved brug af denne IMS protokol.
En grundig undersøgelse af egenskaberne af DAN-matrix i forhold til 9 andre almindeligt anvendte matrixer er tidligere blevet udgivet to. I denne artikel forfatterne fremhæver den øgede følsomhed DAN matrix i negativ ion-mode i forhold til de andre matrixer undersøgt samt evnen til høj opløsning billeddannelse ved hjælp DAN. DAN matrix viste sig at have den højeste samlede ydelse for negativ polaritet ioner. Interessant nok udførte ligningerlly godt for positive polaritet ioner. Andre almindelige matricer, der har vist høj affinitet for negative polaritet ioner omfatter DHA, DHB, og 9-AA. Effektiviteten af DHA som en matrix er begrænset af dens lave stabilitet under vakuum, som gør det upraktisk for de fleste billedbehandlingsprogrammer 2. 9-AA har den fordel at producere lav baggrundsstøj og demonstreret berigelse af sulfatid signaler i 750 - 950 masseinterval som negativ sammenlignet med DHB matrix 13. Selv DHB har vist sig at være meget effektiv i positiv mode, det giver lavere negativ polaritet ionsignal sammenlignet med DAN matrix 2. DAN matrix demonstrerede også øget følsomhed i negativ ion-mode i den nedre masseinterval (650 - 950) sammenlignet med DHB 2. Derudover er det blevet rapporteret, at DHB kan danne betydelige matrix klynger i negativ ion-mode op til 750 Da 2.
et al. , Hvori jorden matrix ledes gennem en fin sigte og aflejres på prøveoverfladen. Forfatterne sammenlignet denne tørre metode til matrixdeponering til våd matrix manuel sprøjteteknik og fundet, at de gav sammenlignelige signal for phospholipider i 450 - 1.200 masseinterval 14. En undersøgelse bruges både sublimering og tør-belægning med en sigte at undersøge phospholipid udtryk, dog har forfatterne ikke kommentere på, hvordan de to teknikker sammenlignes med hensyn til billedopløsning eller ion-signal udbytte 15.
For at sikre den bredest mulige vifte af anvendelighed, protokollen præsenteret var en grundlæggende arbejdsgang, der vil give både nye og mere specialiserede brugere af MALDI IMS at opnå meget reproducerbare resultater for en bred vifte af lipid billedbehandlingsprogrammer. Imidlertid kan sublimation protokoller ændres for at imødekomme den unique forhold i forsøget. For eksempel er den fine matrix krystal deposition fra sublimering giver mulighed for mulighed for at bytte om på rækkefølgen af prøve forberedelse ved præ-belægning slides / plader med matrix før montering vævet. Matrixen kan sublimeres på ledende overflade i forvejen og opbevares i et mørkt miljø til senere brug og dermed reducere prøveforberedelse tid efter sektionering samtidig bibeholde høj følsomhed til lipid detektering 16, 17. En anden ændring, der kan gøres for at denne protokol til at øge signal til påvisning af lipider er en 2 min vask med ammoniumformiat 8.
Selvom sublimering kan omgå mange af ulemperne ved de fleste Våddeposition teknikker, såsom mindre, mere homogen matrix krystal deposition 1, nedsat delokalisering af analytter, og lave omkostninger sammenlignet med automatiserede sprøjteudstyr, såmig variabilitet i prøvefremstillingen processen er uundgåelig. I tilfælde af sublimering, er der flere faktorer, som kan forårsage små forskelle fra et eksperiment til en anden og kan omfatte følgende, der er observeret i vores laboratorium. Der kan være forskelle i placeringen af sublimering apparat på sandet. Når du kører flere sublimering eksperimenter back-to-back, kan sandet i sandet bad begynder at flytte sin position som kan påvirke spredningen af varme i hele sandbad. Udfladning sandet før hver runde af sublimering kan også ændre varmeudledningen som sand, der er blevet forskudt kan tage tid til at vende tilbage til en ensartet temperatur. Sublimation tid skal måske justeres lidt mellem hver runde for at kompensere for flyvesand i sandbad. Alternativt kan anvendelse af et oliebad føre til mere homogen varme dispersion.
For det andet kan mængden af matrix på bunden af sublimator variere. DAN Matrix har en klumpet gråt udseende og har en tendens til at danne store klynger. Disse klynger kan manuelt brudt op og anbragt i bunden af sublimator men kan ikke helt udelukkes. Store klynger af matrix vil tage længere tid at opvarme og sublimere end mindre stykker, som kan påvirke slutproduktet af sublimering.
Vakuumet udgang på sublimation apparatet er en anden kritisk faktor. De fleste sublimators er lavet med en enkelt vakuum output hvorpå slangen er fastgjort til at forbinde den til vakuumpumpen under sublimering. Fordi trykket bliver reguleret på den side af apparatet, kan der være en lille ujævnhed af matricen deposition, med mere bliver anbragt på siden med vakuum output. Dette kan i nogen grad kompenseres for ved at flytte enten positionen af apparatet i sandet, placeringen af matricen i bunden af sublimator, eller ved at ændre placeringen af objektglasset / plade på kondensatoren. Disse forholdors er de vigtigste ulemper ved sublimering teknik og af denne grund er det afgørende at køre en test glide gennem sublimation proces, før der køres eksperimentel prøve så tiden kan justeres for at kompensere for disse variabler.
En anden rapporteret ulempe ved sublimering er, at detektion af en større masse analytter er begrænset af utilstrækkelig analyt udtræk og / eller blanding med matrix. Et rehydrering skridt efter sublimering kan hjælpe trække disse højere masse analytter at omgå dette problem. Dette opnås typisk ved anvendelse af et fugtighedskammer 18. Men i denne protokol, er en indefrysning skridt tilføjet efter sublimering, der opnår det samme formål. Det frysning og efterfølgende optøning (i en ekssikkator) af prøverne før indsættelse i MALDI instrument forårsager kondens på overfladen af prøven, som midlertidigt genfugter prøven for at tillade udvinding af højere masse lipider samtidig bevare tissue til analyse 12, 17.
Samlet set sublimering er en meget følsom og omkostningseffektiv metode til matrix ansøgning til påvisning af lipider i MALDI IMS eksperimenter. Faktisk har vores gruppe bemærket betydelige forbedringer til IMS resultater, når vi skiftede fra at bruge en luft-spray metode 3 til en sublimering metode 4 for matrix deposition. Den nuværende protokol er passende for en række lipid billedbehandlingsprogrammer, men kan ændres til at passe til behovene hos forsøgslederen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
