Abstract
La préparation des échantillons est la clé pour une détection optimale et la visualisation des analytes dans désorption / ionisation laser (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) expériences assistée Matrix. Déterminer le protocole approprié à suivre tout au long du processus de préparation de l'échantillon peut être difficile, car chaque étape doit être optimisée pour répondre aux caractéristiques uniques des analytes d'intérêt. Ce processus implique non seulement de trouver une matrice compatible qui peut désorber et ioniser les molécules d'intérêt de manière efficace, mais aussi la sélection de la technique de dépôt de matrice appropriée. Par exemple, une technique de dépôt par voie humide de la matrice, ce qui implique la dissolution d'une matrice dans un solvant, est supérieure à la désorption de la plupart des protéines et des peptides, alors que les techniques de dépôt de matrice sèche sont particulièrement efficaces pour l'ionisation des lipides. Sublimation a été rapporté comme un procédé très efficace de dépôt de matrice sèche pour la détection de lipides dans le tissu par MALDI IMS en raison de la homogeneity de dépôt matrice cristalline et minimale analyte délocalisation par rapport à de nombreuses méthodes de dépôt humide 1, 2. De manière générale, il consiste à placer un échantillon et de la matrice en poudre dans une chambre à vide scellée avec les échantillons pressés contre une surface froide. L'appareil est ensuite descendu dans un bain chauffé (sable ou de l'huile), ce qui entraîne la sublimation de la matrice en poudre sur la surface de l'échantillon de tissu refroidi. Nous décrivons ici un protocole de sublimation en utilisant le 1,5-diaminonaphtalène matrice (DAN) pour la détection et la visualisation de gangliosides dans le cerveau de rat en utilisant MALDI IMS.
Introduction
Laser Désorption assistée Matrice / ionisation (MALDI) d'imagerie Spectrométrie de masse (IMS) est devenue une technique très recherchée pour la visualisation de la distribution spatiale des lipides, des peptides et des protéines à travers les surfaces des échantillons intacts. MALDI IMS a été précédemment connu comme une technique d'analyse pour les analytes pré-purifiée, mais ces dernières années, il a attiré l'attention dans beaucoup d'autres disciplines en raison de la possibilité de combiner la précision de la spectrométrie de masse avec des points à haute résolution visuelle / de référence anatomiques sans besoin de tout étiquetage externe. Comme la piscine scientifique des chercheurs utilisant cette technique ne cesse de croître, il est un besoin accru pour des protocoles normalisés faciles à suivre pour aider dans le développement et l'optimisation des expériences IMS. Gangliosides, un groupe de lipides membranaires très abondantes dans le système nerveux central, sont idéales pour des expériences MALDI IMS comme leur emplacement, noyé dans la membrane, rend certaines spécies impossible à détecter en utilisant Immuno-marquage conventionnel. En outre, nous avons montré, en utilisant MALDI IMS, que ces lipides, qui fonctionnent comme des modulateurs de la signalisation cellulaire, entre autres, ont des modèles uniques de distribution anatomique dans le cerveau des rongeurs en bonne santé qui sont modifiés après une lésion cérébrale 3, 4, 5. Les gangliosides sont situés à une plage de masse plus élevée par rapport à la plupart des espèces de lipides, et sont donc plus adapté à la plate-forme d'imagerie MALDI.
Figure 1: Flux de MALDI IMS Experiment. Schéma du processus général d'une expérience MALDI IMS en utilisant la sublimation. Tissu congelé à -80 ° C est sectionnée dans un cryostat et 10 um sections sont montées sur des lames dégel ITO conductrices. La lame est ensuite placé dans un dessicateur jusqu'à ce que la sublimation. Slides sont insérés dans l'appareil de sublimation et une couche uniforme de matrice est appliquée sur la surface de l'échantillon de tissu. Les échantillons sont congelés pendant une nuit dans un congélateur C -20 ° C, puis placé dans un dessicateur pendant 10 minutes. Une fois que des normes ont été appliquées, les échantillons sont insérés dans l'instrument MALDI lorsqu'un laser est dirigé à travers le tissu provoquant des molécules désorbées dans la matrice pour ioniser. Les ions se déplacent dans un tube de vol et séparés en fonction de leur masse (/ TOF temps de vol) jusqu'à ce qu'ils atteignent le détecteur. Les informations sur l'abondance ionique d'analytes dans une masse à charge (m / z) plage prédéterminée apparaît à la fois comme une image moléculaire et le spectre de masse. Ces données peuvent être utilisées à la fois visualiser et de quantifier l'abondance ionique de l'analyte d'intérêt dans le tissu imagé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La préparation des échantillonspour MALDI IMS est très variable que chaque étape du processus doit être adapté aux analytes d'intérêt. La principale caractéristique des expériences basées MALDI est l'utilisation d'un revêtement de matrice déposée sur la surface de l'échantillon avant l'analyse. En plus du rôle d'absorber et de transférer de l' énergie de rayonnement provenant du laser pendant le processus d'ablation, la matrice sert également à isoler les divers analytes de l'échantillon, ce qui facilite l'analyse des composés d'intérêt 6, 7. une application homogène de la matrice à la surface de l'échantillon est l'étape la plus cruciale dans le processus de préparation des échantillons. Dépôt de matrice incorrecte peut conduire à de grandes formations hétérogènes matrice de cristal et le développement d'artefacts, de faible ion signal, et une faible reproductibilité 7.
En raison de l'affinité de certaines matrices pour isoler des analytes spécifiques, le type de matrice choisi pour une expérience peutmodifier considérablement le résultat. Les matrices utilisées pour l'imagerie des protéines et des peptides diffèrent souvent de ceux utilisés pour les lipides de l'imagerie et le processus est encore compliqué par la nécessité de procédures supplémentaires telles que lavage et réhydratation étapes afin de détecter avec succès les signaux à partir du tissu. Bien que des étapes de lavage existent pour l'amélioration des signaux lipidiques 8, ils ne sont pas une condition préalable pour la détection de la plupart des espèces lipidiques. Lors de la sélection d'une matrice pour une expérience d'imagerie de lipides, il est important de tenir compte de la polarité du lipide intéressant car cela restreindre la gamme de matrices appropriées. Par exemple, les gangliosides contiennent des résidus d'acide sialique qui leur confèrent une polarité négative globale. Il existe un certain nombre de matrices qui peuvent efficacement désorber et ioniser les gangliosides du tissu; Cependant, des facteurs tels que les pics de la matrice dérivée du spectre et de la stabilité de la matrice sous vide doivent être prises en considération. 1,5-diaminonapthalene (DUne matrice) est suffisamment stable dans des conditions de vide de l' instrument pour la majorité des applications d'imagerie et a démontré un haut degré de sensibilité pour les lipides désorption et peut être utilisé pour l'analyse des lipides dans les deux modes positifs et négatifs ions 2. Matrice DAN, par rapport à d'autres matrices lipidiques par affinité négative tels que l'acide dihydroxybenzoïque (DHB), 9-aminoacridine (9-AA) et 5-chloro-2-mercaptobenzothiazole (CMBT), a été capable de désorber le plus efficacement possible les gangliosides de cerveau de rat un tissu en mode ion négatif (manuscrit en préparation).
Sélection de la méthode appropriée de dépôt de la matrice est d'une importance égale à la sélection de la matrice elle-même. des procédés de dépôt par voie humide de matrice dans lequel la matrice solide est dissous dans un solvant organique et déposé par pneumatique ou pulvérisateurs ou les observateurs Automatisé, sont particulièrement efficaces pour la désorption des protéines et des peptides tels que le liquide imprègne l'échantillon pour permettre supplémentairection de composés et de co-cristallisation avec la matrice. Bien que ces techniques peuvent également être utilisées pour des applications lipidiques, l' analyte et la délocalisation des formations de cristaux de matrice inégale sont fréquentes en raison de la forte abondance et la solubilité dans les solvants des lipides, en particulier dans le tissu 2, 9. Parce que les lipides sont facilement ionisées à partir de tissus, les techniques sèches de dépôt de matrice, tels que la sublimation, offrent une solution de rechange simple et efficace pour les pulvérisateurs tout en évitant beaucoup de l'inconvénient de ces techniques. Le succès de la sublimation dans des expériences MALDI IMS est attribué à des fonctions telles que la matrice microcristalline morphologie qui augmente l'aire de surface pour la matrice de l' analyte de liaison, une pureté accrue de la matrice, et le dépôt de matrice homogène conduisant à une augmentation de la reproductibilité par rapport aux techniques de matrice humide 1, 10.
sublimation involves le chauffage d'une poudre de matrice sous vide immédiatement en dessous d'une surface d'échantillon refroidi résultant à l'état solide à la transition en phase gazeuse de la matrice en poudre suivie par le dépôt sur la surface de l'échantillon de tissu. Pendant la sublimation, le dépôt de la matrice peut être contrôlée par divers facteurs tels que le temps, la température et la pression pour obtenir des résultats hautement reproductibles. Une expérience de sublimation unique peut durer entre 5 et 20 min en fonction du type de matrice choisie, qui peut être réutilisé plusieurs fois avant d'être éliminés. L'appareil peut être acheté dans le commerce, à une fraction du prix des pulvérisateurs automatisés et est facilement démontable pour le nettoyage et l'entretien. Le faible coût et la simplicité relative de cette technique de dépôt de la matrice, il est idéal pour les chercheurs débutants ou en expansion sur les applications d'imagerie de lipides dans MALDI IMS. Bien que des informations détaillant les protocoles pour la sublimation des tissus pour IMS ont été rapportés 11, quelques protocoles normalisés existent wUEL se concentrer sur le flux de travail de base impliqués dans la réalisation d'une expérience de sublimation pour l'imagerie lipides élevés de masse en mode d'ions négatifs, ce qui rend difficile d'établir la technique sans vaste essai et erreur. Ce qui suit est un protocole expérimental visant à combler cette lacune pour la sublimation de la matrice DAN sur des coupes de cerveau de rat pour l'imagerie à haute résolution et la détection des gangliosides.
Figure 2: Sublimation Appareil. Photographie (A) et diagramme schématique (B) de l'appareil de sublimation. La pompe à vide est reliée par un tube en caoutchouc pour un piège à froid rempli avec 300 ml d'éthanol. Le piège froid est alors relié par un tube en caoutchouc à l'appareil de sublimation. L'appareil est composé de deux pièces séparées de verrerie qui sont scellés ensemble avec un joint en U métallique. La moitié supérieure de la sublimateurcontient le condenseur qui est rempli de glace pilée. La plaque d'échantillon est collé sur le fond du condenseur, à l'intérieur du récipient de verre scellé. La moitié inférieure de l'appareil de sublimation comprend la matrice DAN, répartis de façon uniforme en regard de la plaque d'échantillons. Pendant la sublimation, l'appareil de verre est placé dans un bain chauffé à 140 ° C, de sable par une plaque chauffante placée directement en dessous. La sonde de température permet de maintenir une température constante tout au long de l'expérience de sublimation par rétroaction de la température du bain de sable par rapport à la température de consigne pour l'expérience. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Protocol
Toutes les procédures de manipulation des animaux décrits ci-dessous adhérer à l'Université du comité de protection des animaux de Western Ontario (2016-014).
1. Préparation des tissus et Sectionnement
- Extraire le tissu cérébral du rat à travers un processus connu sous le nom "Extraction Frozen Fresh" (VPE).
- Euthanasier le rat avec une surdose de pentobarbital sodique et de surveiller les réflexes dans les membres. Une fois que tous les réflexes ont cessé, couper la tête du rat en utilisant une guillotine.
- Séparez soigneusement les muscles et autres tissus du crâne à l'aide d'un scalpel. Utilisez une pince à os-coupe pour briser le crâne pour exposer le cerveau, à partir de la base du crâne (foramen magnum) à la partie antérieure.
- Une fois que le cerveau est exposé, ramasser soigneusement avec une spatule chirurgicale et placer immédiatement sur la glace sèche écrasée pour la congélation instantanée.
NOTE: Le cerveau sera très malléable. Par conséquent, prendre soin extrême lorsque vous placez le cerveau surglace carbonique. Si le cerveau est écrasé ou pressé contre une surface, il va modifier sa forme et de geler dans cette position.
- Retirer le tissu frais congelé (non perfusé avec du formaldéhyde ou incorporé dans l'OCT) à partir de - 80 ° C congélateur et placer sur la glace sèche.
- Placez quelques gouttes d'eau sur un porte-cryostat et le lieu soit sur la glace sèche ou barre de gel cryostat. Appuyez légèrement sur le tissu porte-cryostat comme il commence à geler et maintenir jusqu'à ce que l'eau gèle autour de la base du tissu et de l'ancre en place. Ajouter de l'eau pour sécuriser davantage le tissu sur le support si nécessaire.
NOTE: L'eau est utilisée à la place de l'OCT médias pour le tissu de montage afin d'éviter la contamination des tissus avec des composés qui peuvent affecter la détection du signal désiré. - tissu Position dans cryostat. Section tissu jusqu'à la localisation anatomique désirée. Faire en sorte que l'épaisseur de coupe est compris entre 8 - 12 um.
NOTE: Lorsque le tissu dans cryostat communal sectionnantdispositifs, il est impératif que les matériaux séparés tels que des lames, des brosses, des barres anti-roulis, et les détenteurs être utilisés afin d'éviter la contamination par l'incorporation des composés. L'intérieur du cryostat doit également être nettoyé à fond avec de l'éthanol avant utilisation. - Utilisation de la barre anti-roulis cryostat, lentement section aplatie des coupes de tissus. Des trous ou des marques sur le tissu peuvent se produire si le placement de la barre de rouleau est incorrecte ou lame est émoussée. Déplacer le tissu au centre de tranchage en utilisant la plate-forme des pinceaux propres.
- Montage
- Congeler diapositives conductrices ou des plaques de métal en les plaçant dans le cryostat tout le tranchage. Lorsque la lame est complètement gelé, déplacer soigneusement le tissu sectionnée sur la surface conductrice de la diapositive à l'aide des pinceaux propres. Une fois que toutes les sections de tissus sont correctement positionnés sur la diapositive, placez un doigt sous la glissière, en face du tissu, et appuyez sur jusqu'à ce que la section dégèle.
NOTE: Les sections peuvent se plier ou se courber pendant le processus de décongélation lorsqueen utilisant cette méthode de montage. Ceci peut être réduit en maintenant la diapositive dans le cryostat lors de la décongélation du tissu. Si ces questions deviennent problématiques, une solution de rechange, warm-mount méthode est listé ci-dessous. - Sinon, prendre une température ambiante Indium-tin oxyde (ITO) coulissant (ou plaque métallique) et appuyez légèrement sur la section de tissu congelé sur la surface de la plate-forme de coupe, côté conducteur vers le bas. Cela conduira à la section de tissu décongélation uniformément sur la surface de la lame avec peu de curling ou le pliage du tissu.
NOTE: Condensation peut apparaître sous la section lors du montage en utilisant cette méthode qui peut conduire à la perte de certaines protéines et des lipides.
- Congeler diapositives conductrices ou des plaques de métal en les plaçant dans le cryostat tout le tranchage. Lorsque la lame est complètement gelé, déplacer soigneusement le tissu sectionnée sur la surface conductrice de la diapositive à l'aide des pinceaux propres. Une fois que toutes les sections de tissus sont correctement positionnés sur la diapositive, placez un doigt sous la glissière, en face du tissu, et appuyez sur jusqu'à ce que la section dégèle.
- Placer les lames avec le tissu dans un dessicateur pendant 5 - 10 min.
2. Sublimateur Appareil Set-up
REMARQUE: Effectuez ces étapes dans une hotte.
- Placez un bain de sable dans un récipient en aluminium sur une plaque chaude, avec la plaque chaude sur une table élévatrice à ciseaux en métalde surface appropriée ( par exemple plus grande que la plaque chauffante). Tournez sur la plaque chauffante et régler la température à 140 ° C.
NOTE: Le point de fusion pour la matrice DAN est comprise entre 187-190 ° C. Ne pas dépasser cette température sur la plaque chauffante.- Si la plaque chauffante est équipée d'une sonde de retour de température, de l'utiliser pour surveiller la température du sable tout au long de l'expérience et d'assurer l'uniformité de la température. Cette fonction peut aider à expérimenter la reproductibilité à travers diverses expériences de sublimation.
NOTE: Le bain de sable doit être contenu dans un récipient en aluminium comme un récipient en verre peut se briser à des températures élevées.
- Si la plaque chauffante est équipée d'une sonde de retour de température, de l'utiliser pour surveiller la température du sable tout au long de l'expérience et d'assurer l'uniformité de la température. Cette fonction peut aider à expérimenter la reproductibilité à travers diverses expériences de sublimation.
- Placer 300 mg de matrice DAN sur la surface inférieure de l'appareil de sublimation. Placer la matrice dans le centre de l'appareil et étalé en une couche régulière sur la largeur approximative et la longueur du coulisseau étant sublimée.
ATTENTION: matrice DAN est toxique. Par conséquent, il est important de porter des gants, des masques et de la sécuritélunettes en tout temps lors de la manipulation de la matrice en poudre. DAN doit être conservé dans l'obscurité car il est sensible à la lumière. - Ruban d'une plaque métallique sur la surface intérieure de l'appareil avec la plaque en contact direct avec le fond du condenseur afin d'assurer une distribution uniforme de la température de refroidissement sur toute la surface de la glissière pendant la sublimation. En variante, le sable le fond du condenseur pour assurer une surface plane.
- Placer le ruban le long des bords extérieurs de la plaque et à adhérer aux parois de la verrerie intérieure. Si la bande est placée sous la plaque et adhère au fond de la surface intérieure en verre, la distribution de la température peut ne pas être uniforme et pourrait entraîner une répartition inégale de la matrice à travers la surface de la lame.
- Ruban d'un flan (essai) glissent en diagonale à travers la surface de la plaque métallique avec la bande de nouveau placé sur les bords extérieurs de la lame.
- Relier les parties supérieure et inférieure de l'appareil, wvec un joint torique en caoutchouc au milieu pour assurer une étanchéité complète.
- Placer un joint en U métallique autour du centre de l'appareil et serrer les étaux jusqu'à ce que la moitié supérieure et inférieure de l'appareil sont scellées hermétiquement ensemble. Placer dans le joint torique métallique au-dessus du bain de sable.
- Prenez une poignée de glace pilée et placez-le dans le condenseur. Remplir un condenseur ¼ à ½ avec de l'eau froide pour créer la glace pilée. La glace pilée va refroidir la plaque métallique à l'intérieur de l'appareil, puis le coulisseau adhéré. Attendre au moins 5 minutes pour que la température atteigne un état stable.
- Verser 300 ml d'éthanol dans le récipient de piège à froid et de placer les objets en verre dans le récipient. Goutte 2 - 3 petits morceaux de carboglace dans l'éthanol, dans le fond du récipient de piège à froid. L'entrée du piège à froid comporte un tube de verre en cours d'exécution sur le fond du cylindre, tandis que la sortie ne fonctionne pas.
- Raccorder la pompe à vide à la sortie du piège à froid en utilisant un tube en caoutchouc. Utilisez un autre morceau de caoutchoucun tube pour connecter l'entrée du piège à froid à l'appareil de sublimation. Assurez-vous que le tuyau est bien fixé à l'aide des pinces métalliques si disponible.
- Utilisez la pompe à vide pour fournir un vide de 30 - 50 mT. Laisser la pompe fonctionner pendant au moins 5 minutes pour équilibration de pression. Vices sur U-anneau de l'appareil de sublimation peuvent avoir à serrer à nouveau une fois que la pompe à vide est activée en raison d'une diminution de la pression dans l'appareil.
NOTE: Il est fortement recommandé qu'une jauge de vide est fixé à la pompe pour contrôler la pression du vide pendant l'expérience et de tester les fuites de pression afin d'obtenir la reproductibilité la plus élevée possible entre les expériences. Cependant, la plupart des pompes sont conçues pour maintenir une pression constante, donc la jauge peut ne pas être essentiel pour les utilisateurs expérimentés. En outre, le vide de la graisse d'étanchéité peut être utilisé pour aider à maintenir la pression à vide.
3. sublimation
- Veiller à ce que la température du bain de sable a stabilized à 140 ° C et que l'appareil est fixé dans le joint torique métallique au-dessus du bain de sable avec tous les tubes connectés et le vide sous tension.
- Réglez la minuterie pendant 7 min mais ne pas démarrer la minuterie. Soulevez lentement la table élévatrice à ciseaux et de sable bain jusqu'à l'appareil de sublimation jusqu'à ce que le U-conjointe du sublimateur est bien au-dessus du joint torique métallique. Cet espace supplémentaire permet un réglage de l'appareil sur le sable.
- Appuyez rapidement sur le sublimateur doucement sur la surface du sable pour assurer que l'appareil est assis uniformément sur le sable, puis commencer immédiatement la minuterie.
- Lorsque la minuterie retentit, éteindre la pompe à vide et abaissez avec précaution l'ascenseur de ciseaux jusqu'à ce que le sublimateur ne touche plus le bain de sable et est fermement en place dans le joint torique métallique.
- Desserrer lentement la vanne micro-évent pour relâcher la pression dans l'appareil. Desserrer le collier métallique autour du tube de l'appareil de sublimation et de caoutchouc commencent lentement à se desserrer le tube. Une fois que le rule tube bber a été légèrement desserré, plier le tube d'un côté pour permettre à la pression résiduelle.
- Au retour de la pression ambiante, retirez soigneusement le tube de l'appareil de sublimation de caoutchouc.
- Desserrez les vices sur le U-joint de l'appareil et le retirer. Séparez soigneusement les deux moitiés de l'appareil de sublimation et retirer la lame du haut de la verrerie intérieure. Examiner diapositive pour confirmer une distribution uniforme de la matrice.
REMARQUE: si la matrice est inégale, la matrice en poudre dans la partie inférieure du sublimateur peut être repositionné ou l'appareil de sublimation peut être repositionné dans le sable pour la diapositive suivante. Le procédé de sublimation peut être répété plusieurs fois en utilisant la même matrice, cependant, la matrice sera finalement devenir plus foncée d'une exposition à la chaleur répétée et la quantité de poudre diminue de telle sorte que le temps de sublimation devra être légèrement ajustée pour compenser. Pour cette raison, il est important de contrôler la quantité de matrice being sublimées après chaque expérience pour assurer la cohérence dans le dépôt de la matrice entre les diapositives - Si la distribution et la quantité de matrice sublimés est suffisante, du ruban adhésif une nouvelle diapositive avec le tissu sur l'intérieur du sublimateur et répétez la section 3.
NOTE: Pour le contrôle de qualité (QC) application, la quantité de matrice sublimée peut être mesurée après chaque essai en pesant la lame avant et après sublimation et en divisant le poids de la matrice sublimés à la surface de la lame 2, il convient de noter que en raison du manque de précision de la plupart des échelles au - delà de 4 points de décimales et de la variabilité entre les échelles, ces mesures doivent être uniquement être utilisés un guide pour le dépôt de la matrice optimale , par opposition à un moyen entièrement quantifiables de QC , sauf une balance de précision élevée est utilisée (voir Figure 3).
4. Tissue Stockage / Réhydratation
- Après sublimation, magasin glisse dans un contenant hermétique ou un petit cassette dans un sac en plastique scellé.
- Incuber les lames à -20 ° C congélateur pendant 2 h ou toute la nuit.
NOTE: L'objectif du processus de congélation est d'agir comme une étape de réhydratation pour la désorption des matériaux de tissus dans la matrice. Le processus de congélation a également été démontré que pour éviter la dégradation des signaux lipidiques pendant 1 semaine lorsqu'elles sont conservées à -80 ° C 12. Pour cette raison, la quantité de temps, les échantillons sont stockés dans le congélateur peut faire varier dans une certaine mesure en fonction des besoins de l'expérimentateur, sans altérer de manière significative la détection du signal (comme observé dans notre laboratoire). Cependant, nous avons remarqué une certaine décoloration de la matrice lorsque les échantillons sont congelés pendant plus de 24 h à -20 ° C. Ainsi, nous vous recommandons de l'imagerie du tissu sublimés avant ce moment ou le stockage de tissus à -80 ° C pour des périodes d'incubation plus longues. - Retirer les lames du congélateur (et récipient) et placer dans un dessiccateur pendant 5 - 10 min.
5. Imagerie et Analyse
- Retirer les lames de dessiccateur et appliquer les normes d'instruments pour assurer la précision de masse de l'instrument MALDI lors de l'imagerie. Le type de normes variera en fonction de l'instrumentation. Les normes sont généralement appliquées de manière uniforme dans l' ensemble de diapositives, les tissus environnants à imager (Figure 3D).
- Insérez glisser dans l'instrument MALDI et suivez les instructions du fabricant pour des expériences d'imagerie (méthodes d'instruments doivent être optimisés pour une 1000 - plage de masse 2000). Résultat représentatif (figure 4) a été acquis en mode négatif reflectron avec une trame de 70 um et 20 coups / spectre (temps d' acquisition ~ 2 h).
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Representative Results
A l'issue de l'expérience de sublimation, les deux moitiés de l'appareil en verre sont séparés dans la hotte et de la glissière, collée sur le condensateur, peuvent être enlevés (figure 3A). À ce stade, la lame doit être examiné pour la distribution inégale de la matrice et le temps, la température, ou le placement de l'appareil dans le bain de sable peut être ajustée pour la diapositive suivante. Une expérience de sublimation DAN réussie se traduira par une couche uniforme de gris matrice / marron le long de la surface de la lame lorsque les caractéristiques anatomiques du tissu peuvent être clairement visualisé et la quantité de matrice sur la lame de verre est similaire à la quantité du tissu (figure 3B). Par exemple, si une trop grande matrice a été sublimé sur le tissu, l'épaisseur de la matrice couvre les caractéristiques du tissu et que la forme générale sera discernable. Cependant, si trop peu de matrice est sublimé, le tissu sera eussesve un aspect plus sombre que le reste de la lame (figure 3C). Les deux trop et trop peu la matrice se traduira par un signal faible dans l'instrument MALDI. À des fins de contrôle de qualité, Thomas et al. pesé la quantité de matrice déposée sur la lame et le poids divisé par la surface de la lame. Ils ont rapporté une quantité optimale de dépôt de matrice pour plusieurs matrices , y compris DAN (110 ug / cm²) 2. Bien que la plupart des soldes manquent de précision nécessaire pour reproduire ces résultats, nous avons essayé cette méthode de QC; cependant, en raison d'un haut degré de variabilité, nous ne pouvons que vous conseiller une gamme appropriée de dépôt de matrice trouvée à associer avec succès par rapport à des expériences de sublimation infructueuses avec la matrice DAN tel que déterminé par la détection du signal dans l'instrument. Une mesure de la matrice inférieure à 100 ug / cm² a été associée à «trop peu» les conditions de la matrice pendant une mesure supérieure à 140 ug / cm² étaitassociée à «trop». dépôt de matrice comprise entre 100 et 140 ug / cm a été trouvée pour être une quantité optimale pour l'imagerie à matrice DAN. Normes Calibrer doivent être appliqués sur la lame de verre autour des échantillons de tissus pour assurer la précision de la masse des signaux détectés IMS (Figure 3D)
Dans une expérience MALDI IMS, l'image moléculaire permet la visualisation de la distribution spatiale de l'analyte d'intérêt ainsi que toutes les espèces inconnues qui peuvent être présents dans une plage de masses donnée. Les images moléculaires de gangliosides dans cette expérience ont été superposées à l' aide du logiciel ImageJ pour afficher la répartition anatomique de plusieurs espèces de gangliosides dans les régions corticales et sous - corticales du cerveau du rat (Figure 4A). Les gangliosides les plus abondants dans le cerveau sont les espèces A-série GD1a et GM1 mais contiennent également des gangliosides GM2 et GM3 qui peuvent tous être trouvés entre le1000-2000 m / z gamme de masse, une gamme de masse plus élevée que la plupart des lipides du cerveau communs, ce qui rend ces gangliosides faciles à identifier le long du spectre (figure 4B). L'abondance ionique de chaque espèce de ganglioside peut être utilisée pour quantifier les différences semi- ou des changements dans les espèces de gangliosides au sein de la même image. Étant donné qu'un certain degré de variabilité dans la préparation d'échantillons ne peut pas être évitée dans l'IMS, la comparaison entre d'analyse sont considérés comme semi-quantitative.
Figure 3. DAN Sublimation. Les résultats représentatifs de la sublimation de la matrice DAN sur le tissu du cerveau de rat. (A) A la fin de la sublimation, les deux moitiés de l'appareil sont séparées et la lame est retirée du condenseur. La matrice (B) DAN se propage de manière uniforme sur des coupes de tissu de cerveau de rat multiples sur la surface de la lame pour permettre un très reprRésultats oducible (entre 100 - 150 g / cm²). (C) Exemples d'expériences de sublimation échoué là où trop peu la matrice (gauche - <90 g / cm²) ou trop de matrice ( à droite -> 150 pg / cm²) a été déposé. Trop peu de matrice se traduira par désorption d'analytes insuffisante, tandis que trop de la matrice ne permet pas au laser de pénétrer dans le tissu lors de l'acquisition, ce qui entraîne la détection d'ions faible. (D) Diapositive contenant des coupes de tissus de cerveau de rat sublimés avec DAN matrice et d' étalonnage des normes appliquées est prêt pour l' insertion dans l' instrument MALDI pour l' imagerie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. MALDI IMS de gangliosides dans le cerveau de rat. Representative l'image moléculaire et le spectre de masse de gangliosides dans le cerveau de rat après sublimation avec la matrice DAN MALDI IMS. L'image est un composite moléculaire de multiples espèces de gangliosides dans le spectre superposé et pseudocolored en utilisant le logiciel Image J pour montrer la distribution anatomique unique d'espèces de gangliosides dans le cerveau. Espèces GM1d18: 1 (rouge, masse ~ 1547 Da), GM1d20: 1 (vert, masse ~ 1573 Da), GM3d18: 1 (bleu, masse ~ 1178 Da), et GM3d20: 1 (sarcelle d'hiver, la masse ~ 1207 Da) sont représenté. L'affichage du spectre de masse ionique abondance des analytes dans un 1000 - gamme de masse de 2000. Les principaux gangliosides A-série sont marqués le long du spectre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce travail détaille un protocole standardisé de la matrice par sublimation sur du tissu pour la détection des lipides chargés négativement, tels que les gangliosides, dans les expériences MALDI IMS. Préparation de l'échantillon pour MALDI IMS est très variable et doit être personnalisé en fonction des propriétés uniques de l'analyte d'intérêt. L'application de la matrice sur la surface de l'échantillon de tissu est un aspect crucial du processus de préparation des échantillons en ce qui concerne la qualité des résultats dans IMS. Une attention particulière doit être prise lors de la sélection des matrices, en veillant à ce que la matrice est compatible avec l'analyte d'intérêt et est exempt d'artefacts de la matrice dérivée du spectre. Sublimation est une technique de dépôt de matrice sèche qui fournit un degré élevé de la matrice cristalline homogénéité avec peu de délocalisation des lipides sur les tissus. DAN matrice, en particulier présente un degré élevé de sensibilité pour la désorption d'un groupe de lipides membranaires chargés négativement appelés gangliosides, comme démontré dans le cerveau de ratles sections, et est stable sous vide pendant des périodes de temps prolongées, ce qui permet la compatibilité avec la plupart des applications d'imagerie. DAN matrice a l'avantage supplémentaire d'avoir également une affinité élevée pour les espèces lipidiques chargés positivement, ce qui augmente la souplesse de cette matrice pour des applications IMS MALDI 2. Il convient également de noter que de multiples espèces de lipides, y compris les phospholipides, peuvent être détectés simultanément lors de l'utilisation de ce protocole IMS.
Un examen approfondi des propriétés de la matrice DAN, comparativement à 9 autres matrices couramment utilisés a été précédemment publié 2. Dans cet article, les auteurs mettent en évidence la sensibilité accrue de la matrice DAN en mode d'ions négatifs par rapport aux autres matrices examinées, ainsi que la capacité d'imagerie à haute résolution en utilisant DAN. DAN matrice a été constaté que le rendement global le plus élevé pour les ions de polarité négative. Fait intéressant, il a exécuté equally bien pour les ions de polarité positive. D'autres matrices communes qui ont démontré une forte affinité pour les ions de polarité négative comprennent DHA, DHB, et 9-AA. L'efficacité de la DHA en tant que matrice est limitée par sa faible stabilité sous vide , ce qui le rend peu pratique pour la plupart des applications d'imagerie 2. 9-AA a l'avantage de produire un faible bruit de fond et d' enrichissement démontré des signaux sulfatide dans le 750 - gamme 950 de masse en mode négatif par rapport à la matrice DHB 13. Bien que DHB a été montré très efficace en mode positif, il donne le signal d'ions de polarité négative plus faible par rapport à la matrice 2 DAN. Matrice DAN a également démontré une sensibilité accrue en mode d'ions négatifs dans la gamme de masse inférieure (650-950) par rapport à DHB 2. En outre, il a été rapporté que DHB peut former des amas de matrice significatifs dans le mode ions négatifs jusqu'à 750 Da 2.
et al. , Dans lequel la matrice de masse est passé à travers une passoire fine et déposée sur la surface de l'échantillon. Les auteurs ont comparé cette méthode sèche de dépôt de matrice à une matrice technique de pulvérisation manuelle humide et a constaté qu'ils ont donné le signal comparable pour les phospholipides dans le 450 - gamme de masse 1200 14. Une étude a utilisé à la fois la sublimation et revêtement à sec avec un tamis pour examiner l' expression de phospholipides, cependant, les auteurs ne commentent sur la façon dont les deux techniques comparées en termes de résolution de l' image ou de l' ion rendement de signal 15.
Afin d'assurer la plus large gamme possible d'application, le protocole présenté était un flux de travail de base qui permettra à la fois nouveaux et plus spécialisés utilisateurs de MALDI IMS pour obtenir des résultats hautement reproductibles pour une grande variété d'applications d'imagerie lipidique. Cependant, les protocoles de sublimation peuvent être modifiés pour répondre à la unique circonstances de l'expérience. Par exemple, le dépôt matrice cristalline amende prévue par sublimation permet la possibilité d'inverser l'ordre de préparation d'échantillons par diapositives pré-revêtement / plaques à matrice avant le montage du tissu. La matrice peut être sublimé sur la surface conductrice à l' avance et stocké dans un environnement sombre pour une utilisation ultérieure échantillon réduisant ainsi le temps de préparation de post-sectionnant tout en conservant une sensibilité élevée pour la détection des lipides 16, 17. Une autre modification qui peut être faite à ce protocole pour améliorer le signal pour la détection des lipides est un lavage de 2 min avec le formiate d' ammonium 8.
Bien que la sublimation peut éviter un grand nombre des inconvénients de la plupart des techniques de dépôt par voie humide, tels que les plus petits, plus homogène le dépôt matrice cristalline 1, une diminution de la délocalisation des analytes et un faible coût par rapport aux pulvérisateurs automatiques, de sorte queme variabilité dans le processus de préparation de l'échantillon est inévitable. Dans le cas de la sublimation, il y a plusieurs facteurs qui peuvent causer des différences d'une expérience minute à l'autre et peuvent inclure les éléments suivants qui ont été observées dans notre laboratoire. Il peut y avoir des différences dans la position de l'appareil de sublimation sur le sable. Lors de l'exécution de plusieurs expériences de sublimation back-to-back, le sable dans le bain de sable peut commencer à changer sa position qui peut affecter la dispersion de la chaleur dans le bain de sable. Aplatir le sable avant chaque tour de sublimation peut également modifier la dispersion de la chaleur que du sable qui a été déplacée peut prendre le temps de revenir à une température uniforme. temps de Sublimation peut être ajusté légèrement entre chaque tour pour compenser des sables mouvants dans le bain de sable. Alternativement, l'utilisation d'un bain d'huile peut conduire à une dispersion de chaleur plus homogène.
D'autre part, la quantité de matrice au fond du sublimateur peut varier. DAN matrix a un aspect gris clumpy et a tendance à former de grands groupes. Ces amas peuvent être brisés manuellement et disposés dans le fond du sublimateur mais ne peuvent pas être complètement éliminés. Les grands groupes de matrice prendront plus de temps pour chauffer et sublimer que les petites pièces qui peuvent affecter le produit de la sublimation de fin.
La sortie de vide sur l'appareil de sublimation est un autre facteur critique. La plupart sublimateur sont réalisés avec une sortie à vide sur lequel est fixé un tube pour le relier à la pompe à vide pendant la sublimation. Étant donné que la pression est régulée sur le côté de l'appareil, il peut y avoir une légère irrégularité du dépôt de matrice, avec plus d'être déposé sur le côté de la sortie de vide. Ceci peut être quelque peu compensé en décalant soit la position de l'appareil dans le sable, la position de la matrice dans le fond du sublimateur, ou en changeant la position du tiroir / plaque sur le condenseur. Ce faiteurs sont les principaux inconvénients de la technique de la sublimation et pour cette raison, il est crucial de lancer une diapositive d'essai à travers le processus de sublimation avant d'exécuter échantillon expérimental pour que le temps peut être ajustée pour compenser ces variables.
Un autre inconvénient signalé de sublimation est que la détection d'analytes de masse supérieur est limitée par extraction de substance à analyser insuffisante et / ou de mélange avec la matrice. Une étape de réhydratation après sublimation peut aider à sortir ces analytes de masse plus élevés pour contourner ce problème. Ceci est typiquement réalisé en utilisant une chambre d'humidité 18. Cependant, dans ce protocole, une étape de congélation est ajouté après la sublimation qui permet d'obtenir le même but. La congélation et la décongélation subséquente (dans un dessicateur) des échantillons avant l'insertion dans l'instrument MALDI provoque la formation de condensation sur la surface de l'échantillon qui réhydrate temporairement l'échantillon pour permettre l'extraction des lipides massiques plus élevés tout en préservant la tissu pour l' analyse 12, 17.
Dans l'ensemble, la sublimation est une méthode très sensible et le coût de l'application de la matrice pour la détection de lipides dans les expériences MALDI IMS. En effet, notre groupe a remarqué des améliorations significatives aux résultats IMS lorsque nous sommes passés d'utiliser une méthode air-spray 3 à une méthode de sublimation 4 pour le dépôt de la matrice. Le présent protocole est approprié pour un certain nombre d'applications d'imagerie de lipides, mais peut être modifié pour répondre aux besoins de l'expérimentateur.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
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