Abstract
להכנת דגימות הוא המפתח לגילוי אופטימלי וויזואליזציה של analytes ב Desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) ניסויים. קביעת הפרוטוקול המתאים לעקוב לאורך כל תהליך הכנת המדגם יכול להיות קשה כמו כל צעד חייב להיות מותאם על מנת לקיים את המאפיינים הייחודיים של analytes עניין. תהליך זה כרוך לא רק במציאת מטריצה תואמת שיכול desorb ו ליינן המולקולות של עניין ביעילות, אלא גם בחירת הטכניקה בתצהיר המטריצה המתאימה. לדוגמא, טכניקה בתצהיר מטריצה רטובה, שמשמעותה המסה מטריצה ממסה, היא מעולה עבור desorption של רוב החלבונים ופפטידים, ואילו טכניקות בתצהיר מטריצה יבשות יעילות במיוחד יינון של שומנים. סובלימציה דווחה כשיטה היעילה ביותר של בתצהיר מטריצה יבש לצורך זיהוי של שומנים ברקמות ידי MALDI IMS בשל homogeneity של בתצהיר קריסטל מטריקס delocalization אנליטי מזערי בהשוואה לשיטות בתצהיר רטוב רבות 1, 2. באופן כללי, זה מתבצע על ידי צבת מדגם מטריקס אבקה בתא אטום ואקום עם הדגימות נלחצו משטח קר. המנגנון הוא הוריד ואז לתוך אמבט מחומם (חול או שמן), וכתוצאה מכך סובלימציה של מטריקס אבק על שטח מדגם רקמות המקורר. כאן אנו מתארים פרוטוקול סובלימציה באמצעות 1,5-diaminonaphthalene (DAN) מטריקס לאיתור להדמיה של gangliosides במוח החולדה באמצעות MALDI IMS.
Introduction
מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) הופכת מאד מבוקש טכניקה להדמיה של הפריסה המרחבית של שומנים, פפטידים וחלבונים על פני משטחים מדגם שלמים. MALDI IMS היה ידוע בעבר בתור שיטה אנליטית עבור analytes מראש מטוהרים, אך בשנים האחרונות, זה כבר למשוך תשומת לב בתחומים רבים אחרים בגלל היכולת לשלב את הדיוק של ספקטרומטריית מסה עם נקודות התייחסות אנטומית / וידאו ברזולוציה גבוהה ללא צריך עבור כל תיוג חיצוני. כמו הברכה המדעית של חוקרי שימוש בטכניקה זו ממשיכה לגדול, שם הוא גדל צורך סטנדרטי, קלים לעקוב פרוטוקולים כדי לסייע בפיתוח ואופטימיזציה של ניסויי IMS. Gangliosides, קבוצה של ליפידים קרום בהיקף נרחב ביותר במערכת העצבים המרכזית, הם אידיאליים עבור ניסויים MALDI IMS כמו מיקומם, מוטבע בתוך הממברנה, גורם ספציפי מסויםes בלתי אפשרי לזהות באמצעות תיוג חיסוני קונבנציונלי. בנוסף, הראינו, באמצעות MALDI IMS, כי שומנים אלו, אשר מתפקדים מאפננים של איתות תאית, בין יתר, יש דפוסי תפוצה אנטומי ייחודיים במוח המכרסם הבריא כי הם שינו לאחר פגיעה מוחית 3, 4, 5. Gangliosides ממוקם מגוון מסה גבוה יותר בהשוואה למיני השומנים ביותר, ועל כן הם מתאימים ביותר פלטפורמת הדמית MALDI.
איור 1: Workflow של ניסוי MALDI IMS. תרשים של זרימת העבודה הכללית של ניסוי IMS MALDI באמצעות סובלימציה. רקמות קפואות ב -80 ° C מחולקות בתוך cryostat ו -10 מיקרומטר חלקים הם הפשרה רכובה על גבי שקופיות איטו מוליך. השקופית ממוקמת אז ייבוש עד סובלימציה. SLIdes מוכנס לתוך מנגנון סובלימציה וכן גם שכבה של מטריקס מוחלת על פני שטח מדגם רקמות. דוגמאות מוקפא לילה במקפיא -20 מעלות צלזיוס ממוקם אז ייבוש במשך 10 דקות. לאחר סטנדרטים יושמו, הדגימות מוכנסות לתוך מכשיר MALDI שבו ליזר מכוון על פני הרקמה גורמת מולקולות desorbed במטריצה כדי ליינן. היונים לנסוע במורד צינור טיסה ונפרד מבוסס על המסה שלהם (זמן של טיסה / TOF) עד שהם מגיעים אל הגלאי. המידע על השפע היוני של analytes בתוך מסה-אל-תשלום קבוע מראש (m / z) טווח מוצג גם תמונה מולקולרית ספקטרום המוני. נתונים אלה יכולים לשמש הם לחזות ולכמת את השפע היוני של אנליטי של עניין בתוך רקמת ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
להכנת דגימותעבור MALDI IMS הוא משתנה מאוד כמו כל שלב של התהליך חייב להיות מותאם אישית אל analytes עניין. התכונה המגדירה של ניסויים מבוססים MALDI היא השימוש ציפוי מטריקס מופקד על פני השטח המדגמים לפני הניתוח. בנוסף לתפקיד של קליטה והעברת אנרגית קרינה מהליזר במהלך תהליך אבלציה, המטריצה משמשת גם כדי לבודד analytes השונה מן המדגם, ובכך מקלות על הניתוח של תרכובות של עניין 6, 7. יישום אחיד של המטריצה אל פני שטח המדגם הוא הצעד החיוני ביותר בתהליך הכנת המדגם. בתצהיר מטריצה לא נכון יכול להוביל תצורות גביש מטריקס הטרוגניות גדולה בפיתוח של חפצים, אות-יון נמוך, ו -7 שחזור עניים.
בשל הזיקה של מטריצות מסוימות לבודד analytes הספציפי, הסוג של מטריקס נבחר לניסוי יכוללשנות את התוצאה באופן משמעותי. המטריצות המשמשות הדמיה של חלבונים ופפטידים לעתים קרובות שונות מאלה המשמשים שומני הדמיה והתהליך מסתבך עוד יותר על ידי הצורך בהליכים נוספים כגון צעדי כביסה להחזרת נוזלים כדי לזהות אותות בהצלחה מרקמות. למרות צעדי כביסה להתקיים להגברת אותות שומנים 8, הם לא תנאים הכרחיים לצורך זיהוי של רוב מיני שומנים. בעת בחירת מטריקס עבור ניסוי הדמית שומנים, חשוב לשקול את הקוטביות של השומנים של עניין כמו זה יהיה לצמצם את הטווח של מטריצות מתאימות. לדוגמא, gangliosides להכיל שאריות חומצת sialic המקנות להם קוטביות שלילית הכוללת. ישנם מספר של מטריצות שיכולים desorb ביעילות ליינן gangliosides מרקמות; עם זאת, גורמים כגון פסגות הנגזרות מטריקס בספקטרום והיציבות של מטריקס תחת ואקום חייבים יילקחו בחשבון. 1,5-diaminonapthalene (DAN) מטריקס היא יציבה מספיק בתנאי ואקום מכשיר עבור רוב יישומי הדמיה הוכיחה רמה גבוהה של רגישות desorption שומנים ויכולה לשמש לניתוח של שומנים הם מצבי יון חיוביים ושליליים 2. DAN מטריקס, בהשוואה מטריצות זיקה השומנים שליליות אחרות כגון חומצה dihydroxybenzoic (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), ו -5 כלורו-2-mercaptobenzothiazole (CMBT), הצליח desorb gangliosides ביעילות ביותר מהמוח חולדה רקמות במצב יונים שליליים (כתב יד בהכנה).
בחירת השיטה המתאימה של בתצהיר מטריצה היא בעלת חשיבות שווה בחירת המטריצה עצמה. שיטות בתצהיר מטריצה רטובות שבו המטריצה המוצקה מומסת ממס אורגני, ותופקדנה על פנאומטי או אוטומטית מתזים או תצפיתנים, יעילות במיוחד עבור desorption של חלבונים ופפטידים בעוד הנוזל מחלחל המדגם כדי לאפשר תוספתction של תרכובות ושיתוף התגבשות עם מטריקס. למרות ששיטות אלה יכולים לשמש גם עבור יישומי שומנים, delocalization אנליטי ותצורות קריסטל מטריקס אחידה היא תופעה נפוצה בשל שפע המסיסות הגבוה של שומנים ממסים, במיוחד ברקמה 2, 9. בגלל שומנים הופכים להיות מיוננים בקלות מרקמות, טכניקות בתצהיר מטריצה יבשות, כגון סובלימציה, להציע אלטרנטיבה יעילה פשוטה, עלות מתזים תוך עקיפת רבי החסרון של טכניקות אלה. ההצלחה של סובלימציה בניסויים MALDI IMS מיוחסת תכונות כגון מורפולוגיה מטריקס מיקרו דבר המגדיל את שטח הפנים החשוף-אנליטי מטריצה מחייב, טוהר מטריקס גדל, בתצהיר מטריצה הומוגנית המוביל שחזור מוגברת בהשוואה לטכניקות מטריקס רטוב 1, 10.
סובלימציה involves חימום מטריצת אבקה תחת ואקום מייד מתחת לפני שטח מדגם מקורר וכתוצאה מכך מוצק המעבר לשלב גז של מטריקס האבקה ואחריו בתצהיר על פני שטח מדגם רקמות. במהלך סובלימציה, בתצהיר מטריקס יכול להיות נשלט על ידי גורמים שונים כגון זמן, טמפרטורה ולחץ כדי לספק תוצאות מאוד לשחזור. ניסוי סובלימציה יחיד יכול לקחת בין 5 ל 20 דקות, תלוי בסוג של מטריקס נבחרה, אשר ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כמה פעמים לפני סילוק. המנגנון ניתן לרכוש מסחרי בכל חלק של המחיר של מתזים אוטומטיים נלקח בקלות בנפרד לניקוי ותחזוקה. עלות נמוכה הפשטות היחסית של טכניקה בתצהיר מטריצה זו להפוך אותו אידיאלי עבור חוקרים מתחילים או הרחבת על יישומי הדמיה ליפיד MALDI IMS. אף כי מידע המפרט פרוטוקולים סובלימציה של רקמות עבור IMS דווחו 11, כמה פרוטוקולים סטנדרטיים קיימים which להתמקד העבודה הבסיסית מעורבת עם ביצוע ניסוי סובלימציה הדמית שומני מסה גבוהים במצב יונים שלילי, ולכן קשה לקבוע את הטכניקה ללא ניסוי וטעייה נרחבים. להלן פרוטוקול הניסוי במטרה למלא את החלל עבור סובלימציה של מטריקס DAN על חלקים במוח החולדה הדמיה ברזולוציה גבוהה וזיהוי של gangliosides.
איור 2: מכשירי סובלימציה. תצלום (א) ו תרשים סכמטי (B) של מנגנון סובלימציה. משאבת הוואקום מחוברת באמצעות צינור גומי ל מלכודת קרה מלאה 300 מיליליטר של אתנול. המלכודת הקרה מחוברת אז על ידי צינורות גומי למנגנון סובלימציה. המנגנון הוא מורכב משני חלקים נפרדים של כלי זכוכית שאינם חתומים יחד עם מתכת U-משותף. המחצית העליונה של sublimatorמכיל הקבל אשר מתמלא רפש קרח. צלחת המדגם היא מודבקת על החלק התחתון של הקבל, בתוך התקן הזכוכית האטום. המחצית התחתונה של מנגנון סובלימציה מכילה מטריצת DAN, פרושים מול צלחת המדגם באופן שווה. במהלך סובלימציה, מנגנון הזכוכית מושם על אמבט חול מחומם ל -140 מעלות צלזיוס על ידי פלטה חשמלית ישירות מתחתיה. חללית הטמפרטורה עוזרת לשמור על טמפרטורה יציבה לאורך ניסוי סובלימציה באמצעות משוב של טמפרטורת חול האמבטיה לעומת הטמפרטורה מראש עבור הניסוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים טיפול בבעלי חיים כמתואר להלן לדבוק אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים של מערב אונטריו (2016-014).
רקמות 1. הכנת חתך
- חלץ רקמת מוח מן החולדה באמצעות תהליך המכונה "הפקה הקפואה" (FFE).
- להרדים את העכברוש עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital ולפקח רפלקסים בגפיים. לאחר כל הרפלקסים חדלו, לנתק את הראש של החולדה באמצעות הגיליוטינה.
- בזהירות להפריד את השרירים ורקמות אחרות מהגולגולת באמצעות אזמל. שימוש במלקחיים חיתוך העצם כדי לשבור את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, החל מבסיס של (מגנום foramen) הגולגולת על החלק הקדמי.
- ברגע שהמוח חשוף, בזהירות ולשלוף אותו עם מרית כירורגית ומיד מניחים על קרח יבש כתוש להקפאה פלאש.
הערה: המוח יהיה מאוד נזיל. לכן, לקחת בזהירות רבה בעת ביצוע המוח עלקרח יבש. אם המוח הוא כתוש או נלחץ משטח, זה ישנה את צורתו ולהקפיא במצב הזה.
- סרה של רקמה קפואה (לא perfused עם פורמלדהיד או מוטבע אוקטובר) מ - 80 ° C במקפיא ומניחים על קרח יבש.
- מניחים כמה טיפות של מים על בעל cryostat ומניחים על קרח או יבש או סרגל ההקפאה cryostat. רקמת לחץ קלה על בעל cryostat כפי שהוא מתחיל להקפיא וחזק עד קפיאת מים מסביב לבסיס של הרקמה ומעגן אותה במקום. מוסיף מים נוספים בהמשך לאבטח את הרקמה על הבעל במידת צורך.
הערה: מים משמשים במקום מדיה אוקטובר הרכבה רקמה על מנת למנוע זיהום של הרקמה עם תרכובות אשר יכול להשפיע על הגילוי של האות הרצויה. - רקמת תפקיד cryostat. קטע רקמה עד המיקום האנטומי הרצוי. ודא כי עובי החיתוך הוא בין 8 - 12 מיקרומטר.
הערה: כאשר חתך רקמות cryostat הקהילתיתהתקנים, קיים הכרח כי חומרים נפרדים כגון להבים, מברשות, ברים אנטי רול, ומחזיקי לשמש כדי למנוע זיהום עם הטבעה תרכובות. החלק הפנימי של cryostat צריך גם לנקות ביסודיות עם אתנול לפני השימוש. - שימוש בסרגל אנטי רול cryostat, לאט סעיף בברוטליות סעיפים רקמות. חורים או סימונים על הרקמה יכולים להתרחש אם המיקום בר רול שגוי או להב הוא משעמם. הזז את הרקמה למרכז חיתוך פלטפורמה בעזרת מכחולים נקיים.
- הַרכָּבָה
- להקפיא שקופיות מוליך או לוחות מתכת על ידי הצבתם cryostat בזמן שחתך. כאשר השקופית היא קפוא לחלוטין, בזהירות להעביר את הרקמה מחולקת על פני שטח המוליך של השקופית באמצעות מכחולים נקיים. לאחר כל קטעי הרקמה ממוקמים בצורה נכונה בשקופית, מניח אצבעות מתחת למגלשה, מול הרקמות, ולחץ עד הקטע מפשיר.
הערה: ייתכן שחלקים עשויים לקפל או להתכרבל במהלך תהליך ההפשרה כאשרבשיטת הרכבה זה. זה יכול להיות מופחת על ידי שמירה על שקופית cryostat כאשר מפשיר הרקמה. אם הבעיות אלה להיות בעייתיות, אלטרנטיבה, שיטה חמה-mount היא מפורטת להלן. - לחלופין, לקחת תחמוצת אינדיום-בדיל בטמפרטורת חדר (איטו) שקופיות (או צלחת מתכת) ואת לחץ בעדינות על קטע רקמה קפוא על פני שטח פלטפורמת החיתוך, בצד מוליך למטה. זה יוביל את הפשרת קטע הרקמה באופן אחיד על פני השטח של השקופית עם סלסול קטן או קיפול של הרקמה.
הערה: עיבוי עשוי להופיע שמתחת לקטע כאשר גוברים בשיטה זו אשר עלולה להוביל לאובדן של חלבונים ושומנים מסוימים.
- להקפיא שקופיות מוליך או לוחות מתכת על ידי הצבתם cryostat בזמן שחתך. כאשר השקופית היא קפוא לחלוטין, בזהירות להעביר את הרקמה מחולקת על פני שטח המוליך של השקופית באמצעות מכחולים נקיים. לאחר כל קטעי הרקמה ממוקמים בצורה נכונה בשקופית, מניח אצבעות מתחת למגלשה, מול הרקמות, ולחץ עד הקטע מפשיר.
- מניחים שקופיות עם רקמת ייבוש עבור 5 - 10 דקות.
2. Apparatus Sublimator הגדרה
הערה: בצע את השלבים הבאים במנדף.
- מניח באמבט חול במכל אלומיניום על פלטה חשמלית, עם הפלטה החשמלית על מעלית מספרי מתכתשל שטח פנים המתאים (כלומר גדול יותר הפלטה החשמלית). הפעל את הצלחת החמה להגדיר את הטמפרטורה ל -140 מעלות צלזיוס.
הערה: נקודת ההתכה עבור מטריקס DAN היא בין 187 - 190 ° C. אין לעבור טמפרטורה זו על הפלטה החשמלית.- אם הצלחת החמה מצוידת חללי משוב טמפרטורה, להשתמש בו כדי לעקוב אחר טמפרטורת חול לאורך הניסוי ולהבטיח עקביויות טמפרטורה. תכונה זו יכולה לסייע עם שחזור ניסוי על פני ניסויים סובלימציה שונים.
הערה: אמבט החול צריך להיות בתוך מיכל אלומיניום כמכל זכוכית עלולה לנפץ בטמפרטורות גבוהות.
- אם הצלחת החמה מצוידת חללי משוב טמפרטורה, להשתמש בו כדי לעקוב אחר טמפרטורת חול לאורך הניסוי ולהבטיח עקביויות טמפרטורה. תכונה זו יכולה לסייע עם שחזור ניסוי על פני ניסויים סובלימציה שונים.
- מניח 300 מ"ג של מטריקס DAN על המשטח התחתון של מנגנון סובלימציה. מניח את המטריצה במרכז המנגנון והתרווח שכבה אחידה של רוחב ואורך המשוער של השקופית להיות מעודן.
זהירות: מטריקס DAN הוא רעיל. לכן, כפפות ללבוש חשובה, מסכות, ובטיחותמשקפים בכל העת במהלך הטיפול בו מטריצת האבקה. DAN יש לאחסן בחושך כפי שהוא רגיש לאור. - קלטת לוחית מתכת על פני השטח הפנימיים של המנגנון עם הצלחת ליצור קשר ישיר עם החלק התחתון של הקבל כדי להבטיח חלוקה שווה של טמפרטורת קירור על פני כל השטח של השקופיות במהלך סובלימציה. לחלופין, חול התחתון של הקבל כדי להבטיח משטח שטוח.
- מניח את הקלטת לאורך השולים החיצוניים של הצלחת לדבוק צידי הזכוכית הפנימית. אם הסרט ממוקם מתחת הצלחת ואת שומר על החלק התחתון של משטח הזכוכית הפנימי, חלוקת הטמפרטורה לא יכולה להיות אפילו ועלולה להוביל הפצה מטריקס אחידה על פני השטח של השקופית.
- קלטת (מבחן) ריק להחליק באלכסון על פני השטח של צלחת מתכת עם הקלטת להציב שוב על השוליים החיצוניים של השקופית.
- חבר את החלקים העליונים ותחתונים של המנגנון, wה- i O-Ring גומי באמצע כדי להבטיח חותם שלם.
- מניח מתכת U-משותף סביב מרכז המנגנון ודק מידות רעות עד החצי העליון ותחתון של המנגנון נסגר בחוזקה. מניח את אטם המתכת מעל אמבט החול.
- לוקחים חופן קרח כתוש ולמקם אותו הקבל. מלאו קבל ¼ כדי ½ מלא עם מים קרים כדי ליצור רפש קרח. רפש הקרח יקרר את לוחית המתכת על החלק הפנימי של המנגנון ובהמשך השקופית דבק בו. חכו לפחות 5 דקות על הטמפרטורה להגיע למצב יציב.
- יוצקים 300 מ"ל של אתנול בתוך המיכל מלכודת קר ומניחים את כלי הזכוכית לתוך המיכל. זרוק 2 - 3 חתיכות קטנות של קרח יבש לתוך אתנול בתחתית המיכל מלכודת קר. קלט המלכודת הקר יש שפופרת זכוכית פועלת לתחתית של הגליל, ואילו התפוקה לא.
- חבר את משאבת הוואקום לפלט המלכודת הקר באמצעות צינור גומי. השתמש עוד פיסת גומיצינורות לחבר את הקלט מלכודת הקרה למנגנון סובלימציה. ודא כי הצינורות מהודקים היטב באמצעות מלחצי מתכת אם זמין.
- השתמש משאבת ואקום כדי לספק ואקום של 30 - 50 מטרים. אפשר המשאבה לפעול במשך לפחות 5 דקות על איזון לחץ. מידות רעות על U-טבעת של מנגנון סובלימציה ייתכן שתהיינה צורך להדק שוב פעם את משאבת הוואקום מופעלת בגלל לחץ ירד במנגנון.
הערה: מומלץ מאוד כי מד ואקום לצרף המשאבה לפקח על הלחץ של ואקום במהלך הניסוי וכדי לבדוק דליפות לחצו על מנת להשיג את השחזור הגבוה ביותר האפשרי בין ניסויים. עם זאת, רוב המשאבות נועדו לשמור על לחץ קבוע, ולכן המד לא יכול להיות חיוני עבור משתמשים מנוסים. בנוסף, גריז ואקום חותם יכול לשמש כדי לעזור לשמור על לחץ ואקום.
3. סובלימציה
- ודא כי הטמפרטורה באמבט חול יש stabilized ב 140 מעלות צלזיוס, כי המנגנון מאובטח ב O-Ring המתכת מעל אמבט החול עם כל הצינורות המחוברים ואת הוואקום מופעל.
- כוונו את הטיימר עבור 7 דקות אבל לא להתחיל טיימר. לאט להעלות את מי האמבט להרים וחול מספריים למנגנון סובלימציה עד U-משותף של sublimator הוא הרבה מעל טבעת O מתכת. שטח נוסף זה מאפשר התאמה של המנגנון על החול.
- במהירות ללחוץ על sublimator בעדינות על פני השטח בחול על מנת להבטיח כי המנגנון יושב באופן שווה על החול, ולאחר מכן מיד להפעיל את הטיימר.
- כאשר הטיימר נשמע, לכבות את משאבת ואקום ובזהירות להנמיך את המעלית מספריים עד sublimator כבר לא נוגע אמבטיה בחול יושב בבטחה המתכת O-Ring.
- לאט לשחרר את שסתום מיקרו-vent לשחרר לחץ במנגנון. שחרר את מהדק המתכת סביב צינור הגומי של מנגנון סובלימציה ולאט לאט מתחיל להתרופף הצינור. לאחר ruצינור bber כבר התיר מעט, לכופף את הצינור לצד אחד כדי לאפשר ללחץ שיורית לברוח.
- כאשר חוזר בלחץ הסביבה, להסיר בזהירות את צינורות גומי מן המנגנון סובלימציה.
- שחרר את המידות הרעות על U-משותף של המנגנון ולהסיר. בזהירות להפריד את שני החצאים של מנגנון סובלימציה לשלוף את השקופית מלמעלה של הזכוכית הפנימית. בדוק שקופיות כדי לאשר חלוקה שווה מטריקס.
הערה: אם המטריצה אינה אחידה, מטריצת האבקה התחתונה של sublimator ניתן למקמו מחדש או במנגנון sublimator ניתן למקמו מחדש בחול עבור לשקופית הבאה. תהליך סובלימציה ניתן לחזור מספר פעמים תוך שימוש באותו מטריקס, עם זאת, המטריצה בסופו של הדבר תהפוך כהה מחשיפה חומה חוזרת בכמות האבקה תקטן כך זמן סובלימציה יצטרך להיות מותאם מעט כדי לפצות על כך. מסיבה זו, חשוב לפקח על כמות מטריקס being סובלימציה לאחר כל ניסוי כדי להבטיח עקביות בתצהיר מטריצה בין שקופיות - אם החלוקה תהיה וכמות מטריקס סובלימציה מספיקה, קלטת שקופית חדשה עם רקמות על החלק הפנימי של סעיף sublimator וחזור 3.
הערה: עבור בקרת איכות (QC) למטרות, בסך של מטריקס סובלימציה ניתן למדוד לאחר כל ניסוי על ידי שקילת השקופיות לפני ואחרי סובלימציה חלוקת המשקל של מטריקס סובלימציה עם שטח הפנים של השקופית 2, יש לציין כי בשל חוסר הדיוק של רוב הכף מעבר ל -4 נקודות עשרוניות ולהבדלים בין סולמות, מדידות אלה צריכים להיות לשמש רק מדריך להפקדה מטריקס אופטימלית בניגוד אמצעי לכימות מלא של QC אלא איזון דיוק גבוה משמש (ראה איור 3).
4. רקמות חפצים / Rehydration
- לאחר סובלימציה, חנות שקופיות במיכל אטום או קאס קטןette בתיק ניילון אטום.
- דגירת שקופיות במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות או למשך הלילה.
הערה: המטרה של תהליך ההקפאה היא לפעול כצעד התייבשות עבור desorption של חומרים רקמה לתוך המטריצה. תהליך ההקפאה גם הוכח כדי למנוע שפלה של אותות שומנים עד 1 שבוע, כאשר הם מאוחסנים ב -80 ° C 12. מסיבה זו, את הכמות זמן הדגימות מאוחסנות במקפיא יכולה להיות מגוונת במידה מסוימת כדי להתאים לצרכימים של הנסיין מבלי לשנות זיהוי אותות משמעותי (כפי שנצפה במעבדה שלנו). עם זאת, יש לנו לב כמה דהוי של מטריקס כאשר דגימות קפואות למשך זמן ארוך יותר מ -24 שעות ב -20 מעלות צלזיוס. לפיכך, אנו ממליצים הדמית רקמת סובלימציה לפני הזמן או לאחסון רקמות ב -80 מעלות צלזיוס במשך תקופות דגירה כבר. - סר שקופית מהמקפיא (מיכל) ומניח ייבוש למשך 5 - 10 דקות.
הדמיה 5. ו- Analysis
- סר שקופיות ייבוש וליישם סטנדרטים מכשירים כדי להבטיח דיוק המוני של מכשיר MALDI במהלך הדמיה. הסוג של סטנדרטים ישתנה בהתאם מכשור. התקנים מיושמים בדרך כלל באופן שווה על פני השקופית כולה, לרקמות להיות צילמו (איור 3D).
- הוסף שקף לתוך מכשיר MALDI אחרי הוראות יצרן עבור ניסויי הדמיה (שיטות מכשיר צריכות להיות מותאמות עבור 1,000 - טווח המוני 2,000). תוצאה נציג (איור 4) נרכשה במצב שלילי reflectron עם רסטר 70 מיקרומטר ו 20 יריות / ספקטרום (רכישת זמן ~ 2 ח).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם השלמת ניסוי סובלימציה, שני החצאים של התקן הזכוכית מופרדים ב למכסת המנוע קטר ואת השקופיות, מודבקת הקבל, ניתן להסיר (איור 3 א). בשלב זה, את השקופית יש לבחון להפצה מטריקס אחידה ואת הזמן, טמפרטורה, או מיקום של המנגנון באמבטית החול עשוי להיות מותאם עבור לשקופית הבאה. ניסוי סובלימציה DAN מוצלח יגרום ציפוי אפילו של מטריקס אפור / חום על פני השטח של השקופית שבה התכונות אנטומיות של הרקמה ניתן דמיינו בבירור וכמות מטריקס בשקופית הזכוכית דומה לסכום על הרקמה (איור 3 ב). לדוגמא, אם מטריקס מדי לדרגה על הרקמה, העובי של מטריקס יכסה את התכונות של הרקמות רק את הצורה הכללית יהיה להבחין. עם זאת, אם מטריקס מעט מדי מזדכך, הרקמה תהיה חהve מראה כהה יותר משאר השקופית (איור 3 ג). שניהם יותר מדי מטריקס מעט מדי יגרום אות עניה מכשיר MALDI. לצורך בקרת איכות, ואח תומאס. מטריקס שוקל את המידה שהופקדה בשקופית וחלק את המשקל על ידי שטח הפנים של השקופית. הם דיווחו על כמות אופטימלית של בתצהיר מטריצה במשך כמה מטריצות כולל DAN (110 מיקרוגרם / cm²) 2. למרות שרוב יתרות חוסר דיוק צורך לחזור על תוצאות כאלה, ניסינו שיטה זו של QC; עם זאת, בשל רמה גבוהה של השתנות, אנחנו יכולים לייעץ רק מגוון מתאים של בתצהיר מטריצה נמצא קשר מוצלח לעומת ניסויי סובלימציה מוצלחים עם מטריקס DAN כפי שנקבעו באמצעות זיהוי אות במכשיר. מדידת מטריצה של מתחת ל -100 מיקרוגרם / cm² הייתה קשורה "מעט מדי" תנאים מטריקס תוך מדידה של מעל 140 מיקרוגרם / cm² הייתהקשור "יותר מדי". בתצהיר מטריקס בין 100 ל 140 מיקרוגרם / cm² נמצא כמות אופטימלית הדמיה עם מטריקס DAN. סטנדרטי כיול יש להחיל בשקופית זכוכית ברחבי דגימות הרקמה כדי להבטיח את דיוק המסה של אותות IMS זוהו (איור 3D)
בניסוי IMS MALDI, התמונה המולקולרית מאפשרת ההדמיה של הפריסה המרחבית של אנליטי של עניין יחד עם כל מין ידוע עלול להיות נוכחים מגוון המוני נתון. התמונות המולקולריות של gangliosides בניסוי הזה היו מעולפים באמצעות תוכנת ImageJ להראות חלוקת האנטומי של מיני ganglioside כמה על פני אזורי קורטיקליים קורטיקליים של מוח החולדה (איור 4 א). Gangliosides הנפוץ ביותר במוח הם הזנים A-series GD1a ו GM1 אלא גם מכילים gangliosides GM2 ו GM3 אשר כל ניתן למצוא בין1,000-2,000 מ '/ מגוון z המוני, מגוון מסה גבוה יותר מאשר רוב השומנים במוח משותפים, מה שהופך gangliosides אלה קלים לזהות לאורך הספקטרום (איור 4 ב). השפע היוני של כל מין ganglioside יכול לשמש כדי למחצה לכמת הבדלים או שינויי מיני ganglioside בתוך אותה התמונה. בגלל כמות של השתנות מסוימת הכנת מדגם לא ניתן להימנע IMS, בין השוואות סריקה נחשבות וכמותיות.
איור 3. DAN סובלימציה. נציג תוצאות של סובלימציה של מטריקס DAN על רקמת מוח עכברוש. (א) עם השלמת סובלימציה, שני חצאי המנגנון מופרדים השקופית יוסר הקבל. (ב) דן מטריקס מתפשט באופן שווה על פני חלקי רקמות במוח חולדה מרובים על פני השטח של השקופית כדי לאפשר מאוד reprתוצאות oducible (בין 100 - 150 מיקרוגרם / cm²). (ג) דוגמאות של ניסויים סובלימציה נכשל שבו מטריקס מעט מדי (משמאל - <90 מיקרוגרם / cm²) או מטריצה יותר מדי (מימין -> 150 מיקרוגרם / cm²) הופקד. מטריקס מעט מדי תגרום desorption מספקת של analytes, ואילו מטריקס יותר מדי לא תאפשר הלייזר לחדור אל הרקמה במהלך הרכישה, וכתוצאה מכך איתור יון נמוך. שקופיות (D) המכילות עכברוש מוח סעיפי רקמות סובלימציה עם דן מטריקס וסטנדרטי כיול להחיל מוכנות להכנסה לתוך מכשיר MALDI הדמיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. MALDI IMS של Gangliosides במוח החולדה. Representativדואר MALDI IMS תמונה מולקולרית ספקטרום המוני של gangliosides במוח החולדה לאחר סובלימציה עם מטריקס DAN. התמונה המולקולרית היא צירוף של מיני ganglioside מרובים בספקטרום המעולף ו pseudocolored באמצעות תוכנת J תמונה להראות חלוקת אנטומי הייחודית של מיני ganglioside בכל רחבי המוח. המינים GM1d18: 1 (אדום, המוני ~ 1,547 Da), GM1d20: 1 (ירוק, המוני ~ 1,573 Da), GM3d18: 1 (כחול, המוני ~ 1,178 Da), ו GM3d20: 1 (צהבהב, המוני ~ 1,207 Da) הם מיוצג. השפע היוני מציג ספקטרום ההמוני של analytes בתוך 1,000 - טווח המוני 2,000. Gangliosides A-הסדרות הגדולות מסומנים לאורך הספקטרום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו מפרטת פרוטוקול סטנדרטי של סובלימציה מטריקס על רקמות לצורך זיהוי של שומנים טעונים שלילית, כגון gangliosides, בניסויים MALDI IMS. לדוגמא כהכנה MALDI IMS הוא משתנה מאוד וחייב להיות מותאם אישית כדי להתאים את המאפיינים הייחודיים של אנליטי של עניין. היישום של מטריקס על גבי משטח דגימת רקמה היא היבט חיוני של תהליך הכנת המדגם לגבי איכות התוצאות IMS. זהירות מיוחדת יש לנקוט בעת בחירת מטריצות, על מנת להבטיח כי מטריקס תואם אנליטי של עניין והוא ללא ממצאים שמקורם מטריצה בספקטרום. סובלימציה היא טכניקה בתצהיר מטריצה יבשה המספקת רמה גבוהה של הומוגניות קריסטל מטריקס עם delocalization הקטן של שומנים על רקמות. DAN מטריקס בפרט מציג רמה גבוהה של רגישות desorption של קבוצת השומנים קרום מטען שלילי נקרא gangliosides, כפי שמודגם במוח חולדהסעיפים, והוא יציב תחת ואקום לפרקי זמן, המאפשר תאימות עם רוב יישומי הדמיה. יש DAN מטריקס יתרון הנוסף שיש גם זיקה גבוהה עבור מיני שומנים בעלי מטען חשמלי חיובי, ובכך להגדיל את הרבגוניות של מטריקס זה עבור יישומי MALDI IMS 2. ראוי גם לציין כי מיני שומנים מרובים, כוללים פוספוליפידים, ניתן לאתר בו זמנית בעת השימוש בפרוטוקול IMS זה.
בחינה יסודית של המאפיינים של מטריקס DAN לעומת 9 מטריצות אחרות נפוצות פורסמה 2 בעבר. במאמר זה, המחברים מדגישים את הרגישות המוגברת של מטריקס DAN במצב יונים שלילי לעומת המטריצות שנבדקו כמו גם יכולת הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות DAN. DAN מטריקס נמצא כדי לקבל את הביצועים הכוללים הגבוהים ביותר עבור יונים קוטביים שליליים. מעניין, זה ביצע equa lly גם עבור יונים קוטביים חיוביים. מטריצות נפוצות אחרות אשר הוכיחו זיקה גבוהה עבור יונים קוטביים שליליים כוללות DHA, DHB, ו -9-AA. היעילות של DHA כמטריצה מוגבלת על ידי היציבות הנמוכה שלה תחת ואקום מה שהופך את זה מעשי עבור יישומי ההדמיה ביותר 2. יש 9-AA לטובת הפקת רעש רקע נמוך והעשרה הפגינו אותות sulfatide ב 750 - טווח המוני 950 במצב שלילי לעומת מטריקס DHB 13. למרות הוכח DHB כיעיל מאוד במצב חיובי, זה מניב אות יון קוטביות שלילית נמוך לעומת DAN מטריקס 2. DAN מטריקס גם הפגין רגישות מוגברת במצב יונים שלילי בטווח ההמוני הנמוך (650 - 950) לעומת DHB 2. בנוסף, זה כבר דווח כי DHB יכול ליצור אשכולות מטריקס משמעותיים עד מצב יונים שלילי 750 Da 2.
> שיטה נוספת של בתצהיר מטריצה יבש תוארה על ידי Puolitaival et al. מטריקס קרקע, שבו הוא עבר דרך מסננת דקה ו מופקד על פני השטח המדגמים. המחברים לעומת שיטה יבשה זה של בתצהיר מטריצת טכניקת ספריי ידנית מטריקס רטובה ומצאו כי הם נתנו אות דומה עבור פוספוליפידים ב 450 - הטווח המוני 1,200 14. מחקר אחד לשמש הוא סובלימציה ציפוי יבש עם מסננת לבחון ביטוי פוספוליפידים, עם זאת, החוקרים לא להגיב על איך שתי הטכניקות לעומת מבחינת רזולוציית תמונה או יון אות תשואה 15.
על מנת להבטיח את המגוון הרחב ככל ההאפשר של ישימות, הפרוטוקול המובא הייתה עבודה בסיסית שתאפשר הן למשתמשים חדשים ועוד מקצועיים של MALDI IMS כדי להשיג תוצאות לשחזור ביותר עבור מגוון רחב של יישומי הדמית שומנים. עם זאת, פרוטוקולי סובלימציה יכולים להיות שונים כדי לענות על uniquבנסיבות דואר של הניסוי. לדוגמא, בתצהיר קריסטל מטריקס הקנס הקבוע ידי סובלימציה מאפשר את האפשרות להפוך את הסדר של הכנת מדגם ידי שקופיות מראש ציפוי / צלחות עם מטריקס לפני הרכבת הרקמה. המטריצה ניתן סובלימציה על משטח מוליך מראש ולאחסן להיערך לצילום בסביבה חשוכה לשימוש מאוחר יותר ובכך להקטין מדגם זמן הכנה שלאחר חתך תוך שמירה רגישות גבוהה לגילוי השומנים 16, 17. שינוי נוסף שניתן לעשות כדי בפרוטוקול זה כדי לשפר אות לצורך זיהוי של שומנים הוא לשטוף 2 דקות עם אמוניום formate 8.
למרות סובלימציה יכול לעקוף רבי החסרונות של רוב טכניקות בתצהיר רטובות, כגון קטן, קריסטל מטריצה הומוגנית יותר בתצהיר 1, ירד delocalization של analytes, ועלות נמוכה לעומת מתזים אוטומטיים, לכןהשתנות לי בתהליך הכנת המדגם היא בלתי נמנעות. במקרה של סובלימציה, ישנם מספר גורמים אשר עלולים לגרום הבדלים דקות מניסוי אחד למשנהו יכול לכלול את שבעקבותיה נצפו במעבדה שלנו. ייתכנו הבדלים במצב של המנגנון סובלימציה על החול. בעת הפעלת מספר ניסויי סובלימציה גב אל גב, בחול באמבטית החול עשוי להתחיל משמר את מעמדה אשר יכול להשפיע על פיזור החום ברחבי באמבטית החול. שיטוח החול לפני כל סיבוב של סובלימציה יכולים גם לשנות את פיזור חום כמו חול אשר נעקרו מבתיהם עלול לקחת זמן כדי לחזור טמפרטורה אחידה. זמן סובלימציה עשוי להיות מותאם מעט בין כל סיבוב כדי לפצות על חולות נודדים באמבטית החול. לחלופין, שימוש באמבט שמן עלול להוביל פיזור חום הומוגני יותר.
שנית, כמות מטריקס בתחתית של sublimator יכול להשתנות. DAN מטרייש x מראה אפור clumpy ויש לו נטייה ליצור אשכולות גדולים. אשכולות אלה יכולים להיות שבורים ידניים ומסודרים בתחתית sublimator אך לא ניתן למנוע לחלוטין. אשכולות גדולים של מטריקס ייקחו זמן רב יותר לחום לעדן מ חתיכות קטנות אשר יכול להשפיע על התוצר הסופי של סובלימציה.
תפוקת הוואקום על מנגנון סובלימציה היא גורם קריטי. רוב sublimators מבוצע עם תפוקת ואקום יחידה שעליו צינורות מצורפים לחבר אותו אל משאבת הוואקום במהלך סובלימציה. בגלל הלחץ להיות מוסדר בצד הזה של המנגנון, ייתכן שיש אחידות קלה של בתצהיר מטריקס, עם בכך שיופקד יותר בצד עם תפוקת הוואקום. זה יכול להיות מתוגמל במקצת על ידי הסטה או את המיקום של המכשירים בחול, את המיקום של מטריקס ב התחתון של sublimator, או על ידי שינוי המיקום של צלחת השקופיות / על הקבל. למעשה אלהORS הם החסרונות העיקריים של טכניקת סובלימציה ומסיבה זו חשוב להפעיל שקופית בדיקה באמצעות תהליך סובלימציה לפני הפעלת מדגם הניסיון כך זמן יכול להיות מותאם כדי לפצות על המשתנים הללו.
חסרון נוסף של סובלימציה המדווח כי זיהוי של analytes מסה הגבוה יותר מוגבל על ידי מיצוי אנליטי מספק ו / או ערבוב עם מטריקס. צעד התייבשות לאחר סובלימציה יכול לעזור לשלוף analytes המסה הגבוה יותר אלה כדי לעקוף את הבעיה. זו מושגת בדרך כלל באמצעות תא לחות 18. עם זאת, בפרוטוקול זה, צעד הקפאה מתווסף לאחר סובלימציה אשר משיגה את אותה מטרה. ההקפאה להפשרה עקב (ייבוש) של הדגימות לפני הכניסה במכשיר MALDI גורמת עיבוי להיוצר על פני השטח של המדגם אשר באופן זמני rehydrates המדגם כדי לאפשר את המיצוי של שומני מסה גבוהים יותר תוך שמירה על tissue לניתוח 12, 17.
בסך הכל, סובלימציה היא שיטה יעילה רגישה העלות ביותר של יישום מטריקס לצורך זיהוי של שומנים בניסויי MALDI IMS. ואכן, הקבוצה שלנו הבחינה שיפורים משמעותיים לתוצאות IMS כשאנחנו מוזזים משימוש בשיטת תרסיסים עם אוויר 3 עד שיטת סובלימציה 4 להפקדת מטריקס. הפרוטוקול הנוכחי הוא המתאים עבור מספר יישומי הדמיה השומנים אבל יכול להיות שונה כדי להתאים לצרכים של הנסיין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
