Abstract
La preparazione del campione è la chiave per la rilevazione ottimale e la visualizzazione di analiti a laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) esperimenti di Matrix-assistita. Determinare il protocollo appropriato per seguire tutto il processo di preparazione del campione può essere difficile in quanto ogni passo deve essere ottimizzato per rispettare le caratteristiche uniche di analiti di interesse. Questo processo implica non solo trovare una matrice compatibile che può desorbire e ionizza le molecole di interesse in modo efficiente, ma anche selezionando la tecnica di deposizione matrice appropriata. Ad esempio, una tecnica di deposizione di matrice bagnata, che comporta sciogliendo una matrice in solvente, è superiore per desorbimento maggior parte delle proteine e peptidi, che secchi tecniche di deposizione di matrice sono particolarmente efficaci per la ionizzazione di lipidi. Sublimazione stato segnalato come un metodo altamente efficiente di deposizione di matrice secca per la rilevazione di lipidi nei tessuti di MALDI IMS causa della homogeneity di deposizione di cristalli di matrice e minimale delocalizzazione analita rispetto a molti metodi di deposizione bagnata 1, 2. In generale, si prevede che il campione e la matrice in polvere in una camera sottovuoto con i campioni pressati contro una superficie fredda. L'apparecchiatura viene quindi abbassata in un bagno riscaldato (sabbia o olio), risultando in sublimazione della matrice polvere sulla superficie del campione di tessuto raffreddata. Qui si descrive un protocollo sublimazione usando matrice 1,5-diamminonaftalene (DAN) per il rilevamento e la visualizzazione dei gangliosidi nel cervello di ratto utilizzando MALDI IMS.
Introduction
Matrix-Assisted Laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) sta diventando una tecnica molto ricercato per la visualizzazione della distribuzione spaziale dei lipidi, peptidi e proteine su superfici campione intatte. MALDI IMS era precedentemente conosciuto come una tecnica analitica per analiti pre-purificato, ma negli ultimi anni, ha attirato l'attenzione in molte altre discipline causa della capacità di combinare la precisione della spettrometria di massa ad alta risoluzione punti di riferimento anatomici / visivi senza bisogno di alcuna etichettatura esterna. Come la piscina scientifica dei ricercatori che utilizzano questa tecnica continua a crescere, vi è una maggiore necessità di standardizzati, protocolli facili da seguire per assistere nello sviluppo e ottimizzazione di esperimenti IMS. I gangliosidi, un gruppo di lipidi di membrana altamente abbondanti nel sistema nervoso centrale, sono ideali per esperimenti MALDI IMS come loro ubicazione, incorporato all'interno della membrana, rende certi species impossibile da rilevare con i convenzionali Immuno-etichettatura. Inoltre, abbiamo dimostrato, utilizzando MALDI IMS, che questi lipidi, che funzionano come modulatori di segnalazione cellulare, tra le altre cose, hanno modelli di distribuzione anatomica unici nel cervello dei roditori sani che vengono modificate dopo lesione cerebrale 3, 4, 5. I gangliosidi sono situati in un range di massa più elevata rispetto alla maggior parte delle specie di lipidi, e sono quindi più adatto alla piattaforma di imaging MALDI.
Figura 1: Flusso di lavoro di MALDI IMS Experiment. Diagramma dello schema generale di un esperimento MALDI IMS tramite sublimazione. Tessuti congelati a -80 ° C è sezionato in un criostato e 10 sezioni micron sono disgelo montato su vetrini ITO conduttivo. Il vetrino viene quindi posto in un essiccatore fino sublimazione. Slides sono inseriti nell'apparecchiatura sublimazione e uno strato uniforme di matrice viene applicata alla superficie del campione di tessuto. I campioni sono congelati durante la notte in un congelatore C -20 ° poi messo in essiccatore per 10 minuti. Una volta applicate norme, i campioni vengono inseriti nello strumento MALDI cui un laser è diretto attraverso il tessuto causando molecole desorbiti nella matrice a ionizzare. Gli ioni viaggiano lungo un tubo di volo e separati in base alla loro massa (tempo di volo / TOF) fino a raggiungere il rilevatore. Le informazioni sulla abbondanza ionica di analiti in un intervallo predeterminato di massa-carica (m / z) viene visualizzata come sia un'immagine molecolare e spettro di massa. Questi dati possono essere utilizzati sia per visualizzare e quantificare l'abbondanza ionica dell'analita di interesse all'interno del tessuto con immagini stampate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
preparazione del campioneper MALDI IMS è molto variabile in ogni fase del processo deve essere personalizzato per gli analiti di interesse. La caratteristica distintiva di esperimenti MALDI-base è l'uso di un rivestimento a matrice depositata sulla superficie del campione prima dell'analisi. Oltre al ruolo di assorbire e trasferire energia di radiazione dal laser durante il processo di ablazione, la matrice serve anche ad isolare vari analiti dal campione, facilitando così l'analisi di composti di interesse 6, 7. applicazione omogenea della matrice alla superficie del campione è il passo più importante nel processo di preparazione del campione. Deposizione di matrice non corretta può portare a grandi formazioni eterogenee cristallo matrice e lo sviluppo di artefatti, ionico segnale basso, e scarsa riproducibilità 7.
A causa della affinità di alcune matrici per isolare analiti specifici, il tipo di matrice selezionata per un esperimento puòalterare in modo significativo l'esito. Le matrici utilizzate per l'imaging di proteine e peptidi spesso differiscono da quelli utilizzati per i lipidi di imaging e il processo è ulteriormente complicata dalla necessità di procedure aggiuntive come lavaggio e reidratazione passaggi per rilevare correttamente i segnali dal tessuto. Sebbene esistano fasi di lavaggio per la valorizzazione dei segnali lipidi 8, non sono un prerequisito per la rilevazione della maggior parte delle specie di lipidi. Quando si seleziona una matrice per un esperimento di imaging lipidi, è importante considerare la polarità del lipide di interesse come questo restringere la gamma di matrici adatte. Ad esempio, gangliosidi contengono residui di acido sialico che conferiscono loro una polarità negativa complessiva. Ci sono una serie di matrici che possono efficacemente desorbire e ionizzare gangliosidi dal tessuto; Tuttavia, fattori come picchi matrice derivata nello spettro e stabilità della matrice sotto vuoto devono essere presi in considerazione. 1,5-diaminonapthalene (DAN matrice) è sufficientemente stabile in condizioni di vuoto strumento per la maggior parte delle applicazioni di imaging e ha dimostrato un alto grado di sensibilità per lipidi desorbimento e può essere utilizzato per l'analisi dei lipidi in entrambe le modalità di ioni positivi e negativi 2. matrix DAN, rispetto ad altre matrici negative lipidico affinità come acido diidrossibenzoico (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), e 5-cloro-2-mercaptobenzotiazolo (CMBT), era in grado di desorbire più efficiente gangliosidi di cervello di ratto tessuto in modalità ioni negativi (manoscritto in preparazione).
Selezione del metodo appropriato di deposizione di matrice è di uguale importanza alla selezione matrice stessa. Wet metodi di deposizione di matrice in cui la matrice solida viene disciolto in un solvente organico, e depositato dal pneumatico o spruzzatori o spotters automatizzate, sono particolarmente efficaci per il desorbimento di proteine e peptidi come liquido permea il campione per consentire supplementarection di composti e co-cristallizzazione con la matrice. Sebbene queste tecniche possono essere usate anche per applicazioni lipidici, analita delocalizzazione e formazioni cristalline matrice irregolare sono fenomeni comuni a causa della grande abbondanza e la solubilità dei lipidi in solventi, particolarmente nel tessuto 2, 9. Poiché i lipidi sono facilmente ionizzati dal tessuto, secco tecniche di deposizione di matrice, come sublimazione, offrono una semplice, economica alternativa alla irroratrici che aggirano molti lo svantaggio di queste tecniche. Il successo di sublimazione in esperimenti MALDI IMS è attribuita a caratteristiche quali la morfologia matrice microcristallina che aumenta la superficie di matrice analita vincolante, maggiore purezza della matrice, e la deposizione di matrice omogenea che aumentano la riproducibilità rispetto alle tecniche matrice umido 1, 10.
sublimazione involves riscaldamento di una matrice di polvere sotto vuoto immediatamente sotto una superficie del campione raffreddato con conseguente solida transizione in fase gas della matrice polvere seguita dalla deposizione sulla superficie del campione di tessuto. Durante sublimazione, deposizione di matrice può essere controllata da diversi fattori quali tempo, temperatura e pressione per fornire risultati altamente riproducibili. Un singolo esperimento sublimazione può richiedere da 5 a 20 min a seconda del tipo di matrice selezionata, che può essere riutilizzato più volte prima dello smaltimento. L'apparecchio può essere acquistato commercialmente ad una frazione del prezzo delle irroratrici automatizzate ed è facilmente smontato per pulizia e manutenzione. Il basso costo e la relativa semplicità di questa tecnica di deposizione di matrice rendono ideale per i ricercatori che iniziano o in espansione su applicazioni di imaging di lipidi in MALDI IMS. Anche se le informazioni in dettaglio i protocolli per sublimazione dei tessuti per IMS sono stati riportati 11, alcuni protocolli standardizzati esistono which concentrarsi sul flusso di lavoro di base coinvolto con la realizzazione di un esperimento di sublimazione per l'imaging lipidi alta massa in modalità di ioni negativi, il che rende difficile stabilire la tecnica senza vasta tentativi ed errori. Il seguente è un protocollo sperimentale che mira a colmare questa lacuna per la sublimazione della matrice di DAN su sezioni di cervello di ratto per imaging ad alta risoluzione e la rilevazione dei gangliosidi.
Figura 2: sublimazione Apparatus. Fotografico (A) e schema (B) dell'apparecchiatura sublimazione. La pompa per vuoto è collegata con un tubo in gomma per una trappola a freddo riempito con 300 mL di etanolo. La trappola fredda è poi collegata con un tubo in gomma per l'apparato sublimazione. L'apparecchiatura è costituita da due pezzi separati di vetro che sono sigillati insieme con un metallo giunto cardanico. La metà superiore della sublimatorecontiene il condensatore che è riempito di fanghiglia di ghiaccio. La piastra campione viene registrato sul fondo del condensatore, all'interno dell'apparato di vetro sigillato. La metà inferiore del dispositivo sublimazione contiene la matrice DAN, distribuite in modo uniforme di fronte al piatto del campione. Durante sublimazione, l'apparecchio di vetro è posto su un bagno di sabbia riscaldata a 140 ° C da una piastra calda direttamente sotto di esso. La sonda di temperatura aiuta a mantenere una temperatura stabile durante l'esperimento sublimazione attraverso il feedback della temperatura del bagno di sabbia rispetto alla temperatura preimpostata per l'esperimento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Protocol
Tutte le procedure di gestione degli animali descritti di seguito aderire alla University of comitato cura degli animali del Western Ontario (2016-014).
1. Preparazione del tessuto e sezionamento
- Estratto tessuto cerebrale di ratto attraverso un processo noto come "Fresh congelati estrazione" (FFE).
- Euthanize il topo con una dose eccessiva di sodio pentobarbital e monitorare riflessi negli arti. Una volta che tutti i riflessi hanno cessato, recidere il capo del ratto usando una ghigliottina.
- Attenzione separare i muscoli e altri tessuti dal cranio con un bisturi. Utilizzare pinze osso-taglio per rompere il cranio per esporre il cervello, partendo dalla base del cranio (occipitale) alla porzione anteriore.
- Una volta che il cervello è esposto, scoop accuratamente fuori con una spatola chirurgica e collocare immediatamente in ghiaccio secco schiacciato per congelamento flash.
NOTA: Il cervello sarà molto malleabile. Pertanto, prestare la massima attenzione quando si posiziona il cervello sughiaccio secco. Se il cervello è schiacciato o premuto contro una superficie, altera la sua forma e congelare in quella posizione.
- Rimuovere il tessuto fresco congelato (non perfusi con formaldeide o incorporato in OCT) da - 80 ° C freezer e luogo in ghiaccio secco.
- Mettere alcune gocce di acqua su un supporto criostato e posto su entrambi ghiaccio secco o la barra di congelamento criostato. Premere il tessuto leggermente sul supporto criostato come si comincia a congelare e tenere premuto fino a quando l'acqua gela intorno alla base del tessuto ed ancora in posizione. Aggiungere acqua supplementare per fissare ulteriormente il tessuto sul supporto se necessario.
NOTA: dell'acqua invece dell'OCT mezzi per il tessuto di montaggio al fine di evitare la contaminazione del tessuto con composti che possono influenzare il rilevamento del segnale desiderato. - tessuti posizione nel criostato. tessuto Sezione fino alla posizione anatomica desiderata. Assicurarsi che lo spessore di taglio è compresa tra 8-12 micron.
NOTA: quando sezionare il tessuto in criostato comunaledispositivi, è imperativo che i materiali separati come lame, spazzole, barre antirollio, e titolari essere utilizzati al fine di evitare la contaminazione con l'incorporamento composti. L'interno del criostato deve essere pulito anche accuratamente con etanolo prima dell'uso. - Utilizzando la barra antirollio criostato, lentamente sezione appiattita sezioni di tessuto. Fori o segni sul tessuto può verificarsi se il posizionamento roll bar non è corretto o lama è ottuso. Spostare il tessuto verso il centro di affettare piattaforma usando pennelli puliti.
- Montaggio
- Congelare diapositive conduttive o piastre di metallo inserendoli nel criostato mentre affettare. Quando la slitta è completamente congelato, spostare accuratamente il tessuto sezionato sulla superficie conduttiva del vetrino utilizzando pennelli puliti. Una volta che tutte le sezioni di tessuto sono posizionati correttamente sul vetrino, mettere un dito sotto il vetrino, di fronte al tessuto, e premere fino a quando la sezione si scioglie.
NOTA: Le sezioni possono piegare o arricciare durante il processo di scongelamento quandoUtilizzando questo metodo di montaggio. Questo può essere ridotto mantenendo la slitta nella criostato quando scongelamento del tessuto. Se questi problemi diventano problematici, in alternativa, warm-mount metodo è elencato di seguito. - In alternativa, prendere una temperatura ambiente di indio-stagno Oxide (ITO) slitta (o piastra di metallo) e premere leggermente verso il basso sezione di tessuto congelato sulla superficie della piattaforma affettare, lato conduttivo verso il basso. Questo porterà alla scongelamento sezione di tessuto in modo uniforme sulla superficie del vetrino con poco arricciatura o ripiegamento del tessuto.
NOTA: La condensa può apparire sotto la sezione per il montaggio si utilizza questo metodo, che possono portare alla perdita di alcune proteine e lipidi.
- Congelare diapositive conduttive o piastre di metallo inserendoli nel criostato mentre affettare. Quando la slitta è completamente congelato, spostare accuratamente il tessuto sezionato sulla superficie conduttiva del vetrino utilizzando pennelli puliti. Una volta che tutte le sezioni di tessuto sono posizionati correttamente sul vetrino, mettere un dito sotto il vetrino, di fronte al tessuto, e premere fino a quando la sezione si scioglie.
- Collocare i vetrini con il tessuto in un essiccatore per 5 - 10 minuti.
2. sublimatore Apparato Set-up
NOTA: Effettuare queste operazioni in una cappa aspirante.
- Inserire un bagno di sabbia in un contenitore di alluminio su una piastra calda, con la piastra su un elevatore di metallo forbicedi un'adeguata superficie (cioè maggiore della piastra). Accendere la piastra calda e impostare la temperatura a 140 ° C.
NOTA: Il punto di fusione per matrice DAN è compresa tra 187-190 ° C. Non superare questa temperatura sulla piastra.- Se la piastra è dotata di una sonda di retroazione di temperatura, utilizzarlo per monitorare la temperatura della sabbia tutto l'esperimento e garantire la coerenza della temperatura. Questa caratteristica può aiutare con l'esperimento riproducibilità attraverso vari esperimenti di sublimazione.
NOTA: Il bagno di sabbia deve essere contenuta all'interno di un contenitore di alluminio come un contenitore di vetro possono rompersi a temperature elevate.
- Se la piastra è dotata di una sonda di retroazione di temperatura, utilizzarlo per monitorare la temperatura della sabbia tutto l'esperimento e garantire la coerenza della temperatura. Questa caratteristica può aiutare con l'esperimento riproducibilità attraverso vari esperimenti di sublimazione.
- Mettere 300 mg di matrice DAN sulla superficie inferiore dell'apparecchio sublimazione. Posizionare la matrice al centro dell'apparato e sparsi in uno strato uniforme nella larghezza approssimativa e la lunghezza della slitta essendo sublimata.
ATTENZIONE: matrix DAN è tossico. Pertanto, è importante indossare guanti, maschere, e sicurezzaocchiali di protezione in ogni momento durante la manipolazione della matrice in polvere. DAN deve essere conservato al buio in quanto è sensibile alla luce. - Nastro una piastra di metallo sulla superficie interna dell'apparecchio con la piastra di entrare in contatto diretto con la parte inferiore del condensatore al fine di garantire una distribuzione uniforme di raffreddare tutta la superficie del vetrino durante sublimazione temperatura. In alternativa, la sabbia sul fondo del condensatore al fine di garantire una superficie piana.
- Posizionare il nastro lungo i bordi esterni della piastra e aderire ai lati del vetro interno. Se il nastro viene posizionato sotto la piastra e aderisce al fondo della superficie di vetro interna, la distribuzione della temperatura non può essere uniforme e può causare distribuzione matrice uniforme su tutta la superficie del vetrino.
- Nastro uno spazio (test) scivolare diagonalmente attraverso la superficie della piastra metallica con il nastro nuovo posto sui bordi esterni della slitta.
- Collegare le porzioni superiore e inferiore dell'apparecchiatura, with un O-ring in gomma nel mezzo per garantire una tenuta completa.
- Inserire un metallo giunto cardanico attorno al centro dell'apparato e serrare vizi fino alla metà superiore e inferiore dell'apparecchiatura sono sigillati ermeticamente insieme. Mettere in O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia.
- Prendete una manciata di ghiaccio tritato e metterlo nel condensatore. Riempire condensatore ¼ a ½ con acqua fredda per creare granita di ghiaccio. La fanghiglia ghiaccio raffreddare la piastra metallica all'interno dell'apparecchio e successivamente il vetrino aderito ad esso. Attendere almeno 5 minuti per la temperatura di raggiungere uno stato stazionario.
- Versare 300 mL di etanolo nel contenitore trappola fredda e posizionare il vetro nel contenitore. Goccia 2 - 3 piccoli pezzi di ghiaccio secco in etanolo nel fondo del contenitore trappola fredda. L'ingresso trappola fredda ha un tubo di vetro in esecuzione al fondo del cilindro, mentre l'uscita no.
- Collegare la pompa del vuoto al freddo uscita trappola utilizzando tubi in gomma. Utilizzare un altro pezzo di gommatubo per collegare l'ingresso trappola fredda all'apparato sublimazione. Assicurarsi che il tubo sia ben fissato con fascette metalliche, se disponibile.
- Utilizzare la pompa a vuoto per fornire un vuoto di 30 - 50 mt. Lasciare che la pompa di funzionare per almeno 5 minuti per il raggiungimento dell'equilibrio di pressione. Morse su U-ring di apparecchi sublimazione possono essere serrati nuovamente dopo la pompa da vuoto viene attivato a causa della riduzione della pressione nell'apparecchiatura.
NOTA: Si raccomanda che un vacuometro essere collegato alla pompa per monitorare la pressione di vuoto durante l'esperimento e testare perdite in pressione al fine di ottenere la massima riproducibilità possibile tra esperimenti. Tuttavia, la maggior parte delle pompe sono progettati per mantenere una pressione costante, quindi l'indicatore non sia essenziale per gli utenti esperti. Inoltre, il grasso guarnizione di vuoto può essere utilizzato per aiutare a mantenere la pressione di vuoto.
3. sublimazione
- Assicurarsi che la temperatura del bagno di sabbia ha stabilzata a 140 ° C e che l'apparecchio sia fissato nella O-ring di metallo sopra il bagno di sabbia con tutti i tubi collegati e il vuoto acceso.
- Impostare il timer per 7 minuti ma non avviare il timer. Lentamente sollevare la forbice e sabbia vasca fino all'apparato sublimazione finché il giunto a U del sublimatore è ben sopra l'O-ring di metallo. Questo spazio permette di regolare l'apparecchio sulla sabbia.
- Premere rapidamente il sublimatore delicatamente sulla superficie di sabbia per assicurare che l'apparecchio è seduto uniformemente sulla sabbia, e quindi iniziare immediatamente il timer.
- Quando il timer suona, spegnere la pompa del vuoto e con attenzione abbassare il sollevatore a forbice fino alla sublimatore non è a contatto con il bagno di sabbia ed è seduto saldamente l'O-ring in metallo.
- Lentamente allentare la valvola di micro-sfogo per scaricare la pressione nell'apparato. Allentare la fascetta metallica attorno al tubo di gomma dell'apparato sublimazione e lentamente cominciano ad allentare il tubo. Una volta che il rutubo bBER è stato allentato un po ', piegare il tubo da un lato per consentire pressione residua di fuoriuscire.
- Quando ritorna a pressione ambiente, rimuovere con attenzione il tubo di gomma dall'apparato sublimazione.
- Allentare i vizi sul giunto cardanico dell'apparecchiatura e rimuovere. separare con cautela le due metà dell'apparato sublimazione ed estrarre il vetrino dalla parte superiore del vetro interno. Esaminare scivolo per confermare una distribuzione uniforme della matrice.
NOTA: Se matrice è irregolare, la matrice in polvere in fondo alla sublimatore può essere riposizionato o dell'apparato sublimatore può essere riposizionata nella sabbia per la diapositiva successiva. Il processo di sublimazione può essere ripetuto più volte usando la stessa matrice, tuttavia, la matrice finirà per diventare più scura da calore ripetuta e la quantità di polvere diminuirà tale che il tempo sublimazione dovrà essere lievemente modificate per compensare. Per questa ragione, è importante controllare la quantità di matrice being sublimato dopo ogni esperimento per garantire la coerenza nella deposizione di matrice tra le diapositive - Se la distribuzione e la quantità di matrice sublimato è sufficiente, il nastro una nuova diapositiva con il tessuto sulla parte interna del sublimatore e ripetere Sezione 3.
NOTA: Per controllo di qualità (QC) scopi, la quantità di matrice sublimato può essere misurata dopo ogni esperimento pesando il vetrino prima e dopo sublimazione e dividendo il peso di matrice sublimato con la superficie del vetrino 2, va notato che a causa della mancanza di precisione della maggior parte delle scale oltre 4 punti decimali e la variabilità tra le scale, queste misure dovrebbero essere essere utilizzato solo una guida per la deposizione ottimale della matrice piuttosto che un mezzo completamente quantificabili di controllo di qualità a meno che non si utilizzi un equilibrio di alta precisione (si veda la Figura 3).
4. tessuto di stoccaggio / reidratazione
- Dopo sublimazione, negozio scivola in un contenitore sigillato o piccola cassette in sacchetto di plastica sigillato.
- Incubare i vetrini a -20 ° C freezer per 2 ore o durante la notte.
NOTA: L'obiettivo del processo di congelamento è di agire come una fase di reidratazione per il desorbimento di materiali tessuti nella matrice. Il processo di congelamento è stato anche dimostrato di prevenire il degrado dei segnali di lipidi per fino a 1 settimana, se conservato a -80 ° C 12. Per questo motivo, la quantità di tempo i campioni vengono conservati nel congelatore può essere variato in una certa misura per soddisfare le esigenze dello sperimentatore senza alterare significativamente rilevazione del segnale (come osservato nel nostro laboratorio). Tuttavia, abbiamo notato un po 'di scolorimento della matrice quando i campioni sono congelati per più di 24 ore a -20 ° C. Così, si consiglia l'imaging del tessuto sublimato prima di quel momento o conservare il tessuto a -80 ° C per periodi di incubazione più lunghi. - Estrarre i vetrini dal congelatore (e contenitore) e posto in un essiccatore per 5 - 10 minuti.
5. Imaging e AANALISI
- Estrarre i vetrini da essiccatore e applicare standard strumento per garantire l'accuratezza di massa dello strumento MALDI durante l'imaging. Il tipo di standard varierà secondo strumentazione. Gli standard sono generalmente applicati in modo uniforme su tutta scorrevole, tessuto circostante per essere ripreso (Figura 3D).
- Inserisci diapositiva in strumento MALDI e seguire le istruzioni del produttore per esperimenti di imaging (metodi strumento dovrebbe essere ottimizzati per una 1.000 - 2.000 range di massa). Risultato rappresentativo (figura 4) è stata acquisita in modalità negativa reflectron con un raster 70 micron e 20 colpi / spettro (acquisizione in tempo ~ 2 h).
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Representative Results
Al termine dell'esperimento sublimazione, le due metà del apparecchio di vetro vengono separati nella cappa e la slitta, registrato al condensatore, può essere rimosso (Figura 3A). A questo punto, il vetrino deve essere esaminato per la distribuzione uniforme della matrice e il tempo, la temperatura, o il posizionamento dell'apparecchio in bagno di sabbia può essere adeguato per la diapositiva successiva. Un esperimento sublimazione successo DAN comporterà uno strato uniforme di matrice grigio / marrone lungo la superficie del vetrino in cui le caratteristiche anatomiche del tessuto possono essere chiaramente visualizzati e la quantità di matrice sul vetrino è analogo a quello sul tessuto (Figura 3B). Ad esempio, se troppo matrice è stata sublimata sul tessuto, lo spessore della matrice riguarderà le caratteristiche del tessuto e solo la forma generale sarà distinguibile. Tuttavia, se troppo poco matrice è sublimata, il tessuto sarà HAve un aspetto più scuro del resto della diapositiva (Figura 3C). Sia troppo e troppo poco matrice si provocherebbe un calo del segnale nello strumento MALDI. Ai fini del controllo di qualità, Thomas et al. pesato la quantità di matrice depositata sul vetrino e diviso il peso per la superficie del vetrino. Hanno riferito una quantità ottimale di deposizione di matrice per diverse matrici tra cui DAN (110 mg / cm²) 2. Anche se la maggior parte dei saldi non hanno la precisione necessaria per replicare tali risultati, abbiamo cercato questo metodo di controllo di qualità; tuttavia, a causa di un alto grado di variabilità, possiamo consigliare solo una gamma appropriata di deposizione di matrice trovato per essere associato successo contro esperimenti sublimazione infruttuosi con matrice DAN come determinato mediante il rilevamento del segnale nello strumento. Una misurazione a matrice di sotto di 100 mg / cm² è stato associato a condizioni di "troppo poco" matrice mentre una misura di superiore a 140 mg / cm² eraassociata a "troppo". deposizione di matrice tra 100 e 140 mg / cm è risultato essere una quantità ottimale per l'imaging a matrice DAN. Norme Calibrazione dovrebbero essere applicati sul vetrino attorno ai campioni di tessuto per assicurare l'accuratezza di massa dei segnali rilevati IMS (Figura 3D)
In un esperimento MALDI IMS, l'immagine molecolare permette la visualizzazione della distribuzione spaziale dell'analita di interesse lungo con qualsiasi specie sconosciute che possono essere presenti in un dato intervallo di massa. Le immagini molecolari di gangliosidi in questo esperimento sono stati sovrapposti utilizzando il software ImageJ per mostrare la distribuzione anatomica di diverse specie gangliosidi attraverso le regioni corticali e subcorticali del cervello di ratto (Figura 4A). I gangliosidi più abbondanti nel cervello sono le specie di serie A e GD1a GM1 ma contengono anche gangliosidi GM2 e GM3, che si possono trovare tra il1000-2000 m / z gamma di massa, un range di massa superiore alla maggior parte dei lipidi cerebrali comuni, rendendo questi gangliosidi semplici per identificare lungo lo spettro (Figura 4B). L'abbondanza ionica di ciascuna specie gangliosidi può essere usato per quantificare i semi-differenze o variazioni specie gangliosidici all'interno della stessa immagine. Poiché una certa variabilità in prep campione non può essere evitato in IMS, tra i confronti di scansione sono considerati semi-quantitativa.
Figura 3. DAN sublimazione. Risultati rappresentativi di sublimazione di matrice DAN sul tessuto del cervello di ratto. (A) Al completamento della sublimazione, le due metà dell'apparato sono separati e la slitta viene rimosso dal condensatore. Matrice (B) DAN distribuisce uniformemente su più sezioni di tessuto cerebrale di ratto sulla superficie del vetrino per permettere altamente reprrisultati oducible (tra 100 - 150 g / cm²). (C) Esempi di esperimenti falliti di sublimazione in cui troppo poco matrice (sinistra - <90 mg / cm²) (a destra o troppo a matrice -> è stato depositato 150 g / cm²). Troppo poco matrice comporterà insufficiente desorbimento di analiti, mentre troppo matrice non permetterà il laser di penetrare al tessuto durante l'acquisizione, con conseguente rilevazione bassa ione. (D) diapositiva contenente sezioni di tessuto di cervello di ratto sublimati con Matrix e di taratura standard DAN applicate è pronto per l'inserimento in strumento MALDI per l'imaging. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. MALDI IMS dei gangliosidi nel cervello di ratto. Representative immagine molecolare e spettro di massa dei gangliosidi nel cervello di ratto dopo sublimazione con matrice DAN MALDI IMS. L'immagine molecolare è un composto di specie multiple gangliosidi nello spettro sovrapposto e pseudocolored utilizzando software Immagine J per mostrare la distribuzione anatomica unica di specie gangliosidi tutto il cervello. Specie GM1d18: 1 (colore rosso, la massa ~ 1.547 Da), GM1d20: 1 (verde, massa ~ 1.573 Da), GM3d18: 1 (blu, massa ~ 1.178 Da), e GM3d20: 1 (verde acqua, massa ~ 1.207 Da) sono rappresentato. Lo spettro di massa mostra abbondanza ionica di analiti all'interno di un 1.000 - 2.000 range di massa. I principali gangliosidi A-serie sono etichettati lungo lo spettro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Dettagli Questo lavoro un protocollo standardizzato di matrice sublimazione sul tessuto per la rilevazione di lipidi carichi negativamente, come gangliosidi, in esperimenti MALDI IMS. Preparazione del campione per MALDI IMS è altamente variabile e deve essere personalizzato per soddisfare le proprietà uniche del analita di interesse. L'applicazione della matrice sulla superficie del campione di tessuto è un aspetto cruciale del processo di preparazione del campione per quanto riguarda la qualità dei risultati in IMS. Particolare attenzione dovrebbe essere presa quando si seleziona matrici, assicurando che la matrice è compatibile con l'analita di interesse e sia privo di artefatti matrice di derivazione dello spettro. Sublimazione è una tecnica di deposizione di matrice secca che fornisce un alto grado di cristallo matrice omogeneità con poco delocalizzazione dei lipidi sul tessuto. matrix DAN in particolare mostra un alto grado di sensibilità per il desorbimento di un gruppo di lipidi di membrana carica negativa chiamato gangliosidi, come dimostrato nel cervello di rattosezioni, ed è stabile sotto vuoto per lunghi periodi di tempo, permettendo per la compatibilità con la maggior parte delle applicazioni di imaging. Matrix DAN ha l'ulteriore vantaggio di avere anche una elevata affinità per specie lipidi caricati positivamente, aumentando così la versatilità di questa matrice per applicazioni MALDI IMS 2. Va inoltre osservato che specie multiple lipidi, tra fosfolipidi, possono essere rilevati contemporaneamente quando si utilizza questo protocollo IMS.
Un esame approfondito delle proprietà di matrice DAN rispetto ad altre matrici 9 comunemente usati è stato precedentemente pubblicato 2. In questo articolo, gli autori evidenziano l'accresciuta sensibilità della matrice DAN in modalità ioni negativi rispetto alle altre matrici esaminate nonché la capacità di imaging ad alta risoluzione usando DAN. matrice DAN è stato trovato per avere la più alta performance complessiva per gli ioni di polarità negativa. È interessante notare, ha eseguito Equally bene per gli ioni di polarità positiva. Altre matrici comuni che hanno dimostrato elevata affinità per gli ioni di polarità negativi includono DHA, DHB, e 9-AA. L'efficienza di DHA come matrice è limitata dalla scarsa stabilità sotto vuoto che rende impraticabile per molte applicazioni di imaging 2. 9-AA ha il vantaggio di produrre a basso rumore di fondo e l'arricchimento dimostrato di segnali sulfatide nel 750 - 950 range di massa in modalità negativo rispetto alla matrice DHB 13. Sebbene DHB ha dimostrato di essere molto efficace in modalità positiva, produce minore segnale ioni polarità negativa rispetto al DAN matrice 2. Matrice DAN ha anche dimostrato una maggiore sensibilità in modalità ioni negativi nel range di massa inferiore (650-950) rispetto al DHB 2. Inoltre, è stato riportato che DHB può formare significativi cluster matrice in ioni negativi modalità fino a 750 Da 2.
et al. , In cui matrice terra viene fatto passare attraverso un setaccio fine e depositato sulla superficie del campione. Gli autori hanno confrontato questo metodo a secco di deposizione di matrice ad una tecnica a spruzzo manuale di matrice bagnato e ha scoperto che hanno dato il segnale paragonabile per fosfolipidi nel 450 - intervallo di massa 1.200 14. Uno studio ha utilizzato sia sublimazione e secco rivestimento con un setaccio per esaminare l'espressione fosfolipidi, tuttavia, gli autori non hanno commentato su come le due tecniche a confronto in termini di risoluzione o segnale di ioni resa 15.
Al fine di assicurare la più ampia gamma possibile di applicabilità, il protocollo presentato è il flusso di base che permetterà nuovi e più specializzati utenti di MALDI IMS per ottenere risultati altamente riproducibili per un'ampia varietà di applicazioni di imaging lipidi. Tuttavia, i protocolli di sublimazione possono essere modificati per soddisfare le unique le circostanze di questo esperimento. Ad esempio, la deposizione di cristalli di matrice multa prevista per sublimazione consente la possibilità di invertire l'ordine di preparazione del campione da slitte pre-rivestimento / piastre con matrice prima di montare il tessuto. La matrice può essere sublimata sulla superficie conduttiva in anticipo e conservato in un ambiente buio per un uso successivo riducendo così il tempo di preparazione del campione post-sezionamento pur mantenendo elevata sensibilità per il rilevamento lipidi 16, 17. Un'altra modifica che può essere fatto a questo protocollo per migliorare il segnale per il rilevamento dei lipidi è un 2 min lavata con ammonio formiato 8.
Sebbene sublimazione può aggirare molti degli inconvenienti della maggior tecniche di deposizione di acqua, alla più piccola, più omogenea deposizione di cristalli di matrice 1, diminuita delocalizzazione di analiti, e basso costo rispetto a spruzzatori automatizzati, cosìme variabilità nel processo di preparazione del campione è inevitabile. Nel caso di sublimazione, ci sono diversi fattori che possono causare differenze minute da un esperimento all'altro e può includere le seguenti, che sono stati osservati nel nostro laboratorio. Ci possono essere differenze nella posizione dell'apparecchio sublimazione sulla sabbia. Quando si esegue diversi esperimenti sublimazione back-to-back, la sabbia nel bagno di sabbia può iniziare a spostare la sua posizione che può influenzare la dispersione del calore in tutto il bagno di sabbia. Appiattendo la sabbia prima di ogni turno di sublimazione può anche cambiare la dispersione del calore, come la sabbia che è stato spostato può prendere tempo per tornare a una temperatura uniforme. tempo sublimazione potrebbe dover essere regolato leggermente tra ogni round per compensare lo spostamento della sabbia nella vasca di sabbia. In alternativa, l'uso di un bagno d'olio può causare dispersione di calore più omogeneo.
In secondo luogo, la quantità di matrice nella parte inferiore della sublimatore può variare. DAN matrix ha un aspetto grigio clumpy e ha la tendenza a formare grandi cluster. Questi gruppi possono essere suddivisi manualmente e disposti nella parte inferiore del sublimatore ma non possono essere completamente eliminati. Grandi gruppi di matrice ci vorrà più tempo per riscaldare e sublimare di pezzi più piccoli che possono influenzare il prodotto finale della sublimazione.
L'uscita del vuoto sull'apparato sublimazione è un altro fattore critico. La maggior parte sublimatori sono realizzati con una sola uscita vuoto sulla quale tubo è collegato a collegarlo alla pompa a vuoto durante la sublimazione. Poiché la pressione viene regolata su quel lato dell'apparecchio, ci può essere una leggera irregolarità della deposizione di matrice, con più che viene depositata sul lato con l'uscita del vuoto. Questo può essere in qualche modo compensata spostando o la posizione dell'apparecchio nella sabbia, la posizione della matrice in fondo alla sublimatore, o cambiando la posizione della slitta / piastra sul condensatore. questi infattiors sono i principali inconvenienti della tecnica sublimazione e per questo motivo è fondamentale per eseguire una diapositiva di prova attraverso il processo di sublimazione prima dell'esecuzione campione sperimentale in modo che il tempo può essere regolato per compensare queste variabili.
Un altro inconveniente segnalato di sublimazione è che la rilevazione di maggiori analiti massa è limitato mediante estrazione analita insufficiente e / o miscelazione con matrice. Un passo reidratazione dopo sublimazione può aiutare a tirare fuori questi analiti di massa più elevati per aggirare questo problema. Ciò si ottiene in genere utilizzando una camera umida 18. Tuttavia, in questo protocollo, viene aggiunta una fase di congelamento dopo sublimazione che realizza lo stesso scopo. Il congelamento e successivo scongelamento (in essiccatore) dei campioni prima dell'inserimento nello strumento MALDI provoca la formazione di condensa sulla superficie del campione, che reidrata temporaneamente il campione per consentire l'estrazione dei lipidi elevati massa preservando il tiSSUE per l'analisi 12, 17.
Nel complesso, la sublimazione è un metodo efficace altamente sensibile e costi delle applicazioni matrice per la rilevazione di lipidi negli esperimenti MALDI IMS. In effetti, il nostro gruppo ha notato miglioramenti significativi risultati IMS quando abbiamo spostato di utilizzare un metodo di aria spruzzo 3 ad un metodo di sublimazione 4 per la deposizione di matrice. Il presente Protocollo è appropriata per un numero di applicazioni di imaging lipidico, ma può essere modificata per adattarsi alle esigenze dello sperimentatore.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
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