Sublimering av DAN Matrix for søking og visualisering av gangliosider i Rat hjernevev for MALDI Imaging massespektrometri

Abstract

Prøvepreparering er nøkkelen for optimal deteksjon og visualisering av analytter i Matrix-assistert Laser desorpsjon / ionisering (MALDI) Imaging massespektrometri (IMS) eksperimenter. Bestemmelse av den aktuelle protokoll til å følge gjennom hele prøvefremstillingsprosessen kan være vanskelig som hvert trinn må optimaliseres i samsvar med de unike egenskapene til de analytter av interesse. Denne prosessen innebærer ikke bare å finne en kompatibel matrise som kan desorbere og ionisere molekyler av interesse effektivt, men også å velge riktig matrise deponering teknikk. For eksempel, en våt matrise deponeringsteknikk, noe som innebærer oppløsning av en matrise i oppløsningsmiddel, er overlegen for desorpsjon av de fleste proteiner og peptider, mens det tørre matriksen avsetningsteknikker er spesielt effektive for ionisering av lipider. Sublimering har blitt rapportert som en svært effektiv metode for å tørke matrise avsetning for påvisning av lipider i vev ved MALDI IMS på grunn av homogeneity til matrise krystall avsetning og minimal analytten delokalisering sammenlignet med mange våte deponering metoder ^{1, 2.} I store trekk innebærer den plassere en prøve og pulverformig matrise i et vakuumforseglet kammer med prøvene presset mot en kald flate. Apparatet blir så senket ned i et oppvarmet bad (sand eller olje), som resulterer i sublimering av det pulverformige matrise på den avkjølte vevsprøve overflate. Her beskriver vi en sublime protokollen med 1,5-diamonaphtalene (DAN) matrise for påvisning og visualisering av gangliosider i rottehjerne bruker MALDI IMS.

Introduction

Matriks-assistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) Imaging massespektrometri (IMS) er blitt en svært ettertraktet teknikk for visualisering av den romlige fordelingen av lipider, peptider og proteiner på tvers av intakte prøvenes overflater. MALDI IMS var tidligere kjent som en analytisk teknikk for pre-renset analytter, men i de senere år, har det vært å trekke oppmerksomhet i mange andre disipliner på grunn av evnen til å kombinere nøyaktigheten av massespektroskopi med høy oppløsning visuelle / anatomiske referansepunkter uten trenger for eksterne merking. Som den vitenskapelige pool av forskere som benytter denne teknikken fortsetter å vokse, er det økt behov for standardiserte, lett-å-følge protokoller for å bistå i utvikling og optimalisering av IMS eksperimenter. Gangliosider, en gruppe av membranlipider svært tallrike i sentralnervesystemet, er ideelle for MALDI IMS eksperimenter som sin beliggenhet, integrert i membranen, gjør enkelte spesies umulig å oppdage ved hjelp av konvensjonelle Immuno-merking. I tillegg har vi vist, ved hjelp av MALDI IMS, at disse lipider, som virker som modulatorer av cellesignalisering, blant annet har unike anatomisk fordelingsmønstre i det friske gnager hjernen som er endret etter hjerneskade ^{3, 4, 5.} Gangliosider er plassert på et høyere masseområde sammenlignet med de fleste arter lipid, og er derfor mest egnet for den MALDI bildeplattformen.

Figur 1: Workflow av MALDI IMS Experiment. Diagram av den generelle arbeidsflyten av en MALDI IMS eksperiment ved hjelp sublimering. Vev frosset ved -80 ° C er delt i en cryostat og 10 um delene er tine montert på ledende ITO lysbilder. Raset er deretter plassert i et tørke til sublimering. Slides er satt inn i sublimeringsapparatet og et jevnt lag av matrise påføres på vevsprøve overflate. Prøver blir frosset over natten i en -20 ° C fryser deretter plassert i en eksikator i 10 min. Når standarder har blitt påført, blir prøvene satt inn i MALDI instrument hvor en laser er rettet på tvers av vev forårsaker desorberte molekyler i grunnmassen for å ionisere. Ionene reise ned et fly rør og separat basert på deres masse (time-of-flight / TOF) til de når detektoren. Informasjonen om den ioniske overflod av analytter innenfor en forutbestemt masse-til-ladning (m / z) område er vist som både en molekyl bilde og massespektrum. Denne informasjonen kan brukes til både å visualisere og kvantifisere den ioniske overflod av analytten av interesse innenfor det avbildede vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

prøveopparbeidelsefor MALDI IMS er svært variabel som hvert trinn i prosessen må tilpasses til de analyttene av interesse. Den definerende trekk ved MALDI-baserte forsøk er bruken av en matrise belegg avsatt på prøvens overflate før analyse. I tillegg til rollen til å absorbere og overføre strålingsenergi fra laseren under avsmeltingsprosessen, matrisen tjener også til å isolere forskjellige analytter fra prøven, for derved å lette analysen av forbindelser av interesse ^{6, 7.} Homogen påføring av matriksen til prøveoverflaten er den mest avgjørende trinn i prøveprepareringsprosessen. Feilaktig matrise deponering kan føre til store heterogene matrise krystallformasjoner og utvikling av gjenstander, lav ion-signal, og dårlig reproduserbarhet ^7.

På grunn av affiniteten av enkelte matriser for å isolere bestemte analytter, typen av matriks er valgt for et eksperiment muligvesentlig endre utfallet. Matrisene som benyttes for avbildning av proteiner og peptider ofte avviker fra de som brukes for avbildning lipider og prosessen blir ytterligere komplisert ved behovet for ytterligere prosedyrer slik som vasking og rehydrering trinnene i for å kunne detektere signaler fra vev. Selv om vasketrinnene finnes for forbedring av lipid-signaler ^{til 8,} er de ikke en forutsetning for påvisning av de lipid-arter. Ved valg av en matrise for en lipid avbildning eksperiment, er det viktig å ta hensyn til polariteten av lipid av interesse, da dette vil begrense omfanget av egnede matriser. For eksempel gangliosidene inneholde sialinsyrerester som gir dem en samlet negativ polaritet. Det finnes en rekke matriser som effektivt kan desorbere og ioniserer gangliosider fra vev; må imidlertid faktorer som matrise-avledet topper i spekteret og stabiliteten av matrisen under vakuum tas under overveielse. 1,5-diaminonapthalene (DAN) matrise er tilstrekkelig stabil under instrument vakuumbetingelser for de fleste av bildebehandlingsapplikasjoner og har vist en høy grad av følsomhet for lipid desorpsjon og kan anvendes for analyse av lipider i både positive og negative ion-modus ^2. DAN matriks, sammenlignet med andre negative lipid affinitetsmatrikser som dihydroksybenzosyre (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), og 5-klor-2-merkaptobenzotiazol (CMBT), var i stand til å mest effektivt desorbere gangliosider fra rottehjerne vev i negativ ion-modus (manuskript under forberedelse).

Velge den riktige metoden for matrise deponering er like viktig å velge selve matrisen. Våte matrise avsetningsmetoder, karakterisert ved at den faste matriks er oppløst i et organisk oppløsningsmiddel, og er satt inn av pneumatisk eller automatiserte spredere eller spotters, er spesielt effektive for desorpsjon av proteiner og peptider som væsken syrer prøven for å gi ekstraDette skjer av forbindelser og ko-krystallisering med matrisen. Selv om disse teknikker kan også brukes til lipid applikasjoner, analytt delokalisering og ujevn matrisekrystallformasjoner er vanlige forekomster på grunn av den høye overflod og oppløselighet av lipider i oppløsningsmidler, spesielt i vev ^{2, 9.} Fordi lipider blir lett ioniseres fra vev, tørre matriseavsetningsteknikker, slik som destillasjon, gir en enkel, kostnadseffektivt alternativ til spredere mens omgå mange av ulempen med disse teknikkene. Suksessen til sublimering i MALDI IMS eksperimenter er knyttet til funksjoner som for eksempel mikrokrystallinsk grunnmasse morfologi som øker overflatearealet for matrise-analytt binding, økt matrise renhet, og homogen matrise avsetning fører til økt reproduserbarhet sammenlignet med våte matrise teknikker ^{1, 10.}

sublime~~POS=TRUNC involves oppvarming av en pulverformig matrise under vakuum, umiddelbart under en avkjølt prøve overflate som resulterer i faststoff til gass-fase overgang av det pulverformige matrise fulgt av avsetning på den vevsprøve overflate. Under sublimering, kan matriseavsetning kontrolleres ved å variere faktorer som tid, temperatur og trykk for å tilveiebringe svært reproduserbare resultater. En enkelt sublime eksperiment kan ta alt fra 5 til 20 min avhengig av typen av matriks er valgt, som kan brukes om igjen flere ganger før de kastes. Apparatet kan kjøpes kommersielt til en brøkdel av prisen av automatiserte sprøyter og er lett tas fra hverandre for rengjøring og vedlikehold. De lave kostnadene og relativ enkelhet i denne matrisen deponering teknikken gjør det ideelt for forskere som begynner eller utvide på lipid bildebehandlingsprogrammer i MALDI IMS. Selv informasjon detaljering protokoller for sublimering av vev for IMS har blitt rapportert ^11, noen få standardiserte protokoller finnes wjør fokusere på den grunnleggende arbeidsflyten som er involvert med å gjennomføre en sublimeringseksperiment for å avbilde høye masse lipider i negativ ion-modus, noe som gjør det vanskelig å etablere teknikken uten utstrakt prøving og feiling. Følgende er en eksperimentell protokoll som mål å fylle dette gapet for sublimering av DAN matrise på rottehjerne seksjoner for høy oppløsning og påvisning av gangliosider.

Figur 2: Sublime Apparatus. Bilde (A) og koblingsskjema (B) av sublimering anordningen. Vakuumpumpen er forbundet med gummislangen til en kald felle fylt med 300 ml etanol. Den kalde felle blir deretter forbundet ved hjelp av gummislangen til sublime anordningen. Anordningen består av to separate stykker av glass som er forseglet sammen med et metall universalledd. Den øverste halvdelen av sublimatorinneholder kondensatoren som er fylt med is slaps. Prøven platen er tapet på bunnen av kondensatoren inne i forseglet glassapparaturen. Den nederste halvdelen av sublime apparatet inneholder DAN matrise, spredt jevnt mot prøven plate. Under sublimering blir glassapparaturen plassert på et sandbad oppvarmet til 140 ° C med en varm plate direkte under den. Temperatursonden bidrar til å opprettholde en stabil temperatur gjennom hele forsøket sublime gjennom tilbakemelding av sandbadet temperatur sammenlignet med den forhåndsinnstilte temperaturen for forsøket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

Alle dyr håndteringsprosedyrer beskrevet nedenfor holder seg til University of Western Ontario dyr omsorg komité (2016-014).

1. Tissue Forberedelse og Seksjonering

1. Utdrag hjernevev fra rotte gjennom en prosess som kalles "Fresh Frozen Extraction" (FFE).
   1. Avlive rotta med en overdose av pentobarbital natrium og overvåke reflekser i beina. Når alle reflekser har opphørt, kutte hodet av rotte ved hjelp av en giljotin.
   2. Løsne forsiktig muskler og annet vev fra hodeskallen ved hjelp av en skalpell. Bruker ben-skjærende tang for å bryte skallen for å eksponere hjernen, med start fra bunnen av hodeskallen (foramen magnum) til den fremre del.
   3. Når hjernen er utsatt, øses forsiktig ut med en kirurgisk slikkepott og umiddelbart plassere på knust tørris for flash frysing.
      MERK: Hjernen vil være svært formbare. Derfor ta ekstrem forsiktighet når du plasserer hjernen påtørris. Dersom hjernen er knust eller presset mot en flate, vil den forandre sin form, og fryses i den posisjonen.
2. Fjern Dypfryst vev (ikke dynket med formaldehyd eller innebygd i OCT) fra - 80 ° C fryser og plass på tørris.
3. Plasser noen dråper vann på en cryostat holder og plass på enten tørris eller cryostat fryse bar. Trykk vev lett på cryostat holderen som det begynner å fryse og hold til vannet fryser rundt bunnen av vevet og forankrer det på plass. Legg ytterligere vann for ytterligere å sikre vev på holderen om nødvendig.
   MERK: Vann brukes istedenfor oktober media for montering vev for å unngå forurensning av vevet med forbindelser som kan påvirke deteksjonen av det ønskede signalet.
4. Posisjon vev i cryostat. Seksjon vev opp til den ønskede anatomisk lokalisering. Kontroller at skjæretykkelsen er mellom 8-12 mikrometer.
   MERK: Når seksjonering vev i felles cryostatenheter, er det viktig at separate materialer som kniver, børster, stabilisatorstag, og holdere kan brukes for å unngå forurensning med innstøping forbindelser. Innsiden av kryostaten bør også rengjøres grundig med etanol før bruk.
5. Bruk av cryostat anti-roll bar, sakte delen flatet vevssnitt. Hull eller tegninger på vev kan oppstå hvis veltebøylen plassering er feil eller bladet er kjedelig. Flytt vev til sentrum av slicing plattformer ved hjelp av rene pensler.
6. monterings~~POS=TRUNC
   1. Fryse ledende lysbilder eller metallplater ved å plassere dem i kryostaten mens slicing. Når dekselet er helt frosset, flytte forsiktig seksjonert vev på ledende overflate av lysbildet bruker rene pensler. Når alle vevssnitt er riktig plassert på lysbildet, plassere en finger under raset, på motsatt side av vev, og trykk til seksjonen tiner.
      MERK: Seksjoner kan brette eller krølle under tineprosessen nårved hjelp av denne monteringsmetode. Dette kan reduseres ved å holde sleiden i kryostaten ved tining av vevet. Hvis disse problemene bli problematisk, et alternativ er varm-mount metode oppført nedenfor.
   2. Alternativt kan du ta en romtemperatur Indium-tinn oksid (ITO) lysbilde (eller metallplate) og trykker forsiktig ned på frossen vev seksjonen på slicing plattformen overflaten, ledende siden ned. Dette vil føre til vevet seksjon tining jevnt på overflaten av objektglasset med lite krølling eller folding av vev.
      MERK: Kondensering kan forekomme under den delen ved montering ved hjelp av denne fremgangsmåten, som kan føre til tap av visse proteiner og lipider.
7. Plassere objektglass med vev i en eksikator i 5 - 10 min.

2. sublimator Apparater Set-up

MERK: Utfør disse trinnene i en avtrekkshette.

1. Plassere et sandbad i en aluminium-beholder på en varm plate, med kokeplaten på en metallsakseheisav egnet overflateareal (dvs. større enn varm plate). Slå på kokeplate og sette temperaturen til 140 ° C.
   MERK: Smeltepunktet for DAN matrise er mellom 187-190 ° C. Ikke overskrid denne temperaturen på kokeplaten.
   1. Dersom varmeplaten er utstyrt med en temperatur tilbakemelding probe, bruke den til å overvåke sand temperatur gjennom hele eksperimentet og sikre temperatur konsistens. Denne funksjonen kan hjelpe til med forsøket reproduserbarhet på tvers av ulike sublime eksperimenter.
      MERK: sandbad skal være inneholdt i en aluminiumbeholder som en glassbeholder kan knuses ved høye temperaturer.
2. Plasser 300 mg DAN matrise på den nedre overflate av sublimeringsapparat. Plassere matrisen i midten av anordningen og spredt ut i et jevnt lag i den omtrentlige bredde og lengde av lysbildet blir sublimert.
   FORSIKTIG: DAN matrise er giftig. Derfor er det viktig slitasje hansker, masker og sikkerhetbriller til alle tider ved håndtering av pulverisert matrise. DAN bør oppbevares i mørket som det er lysfølsom.
3. Tape en metallplate på den indre overflate av anordningen med platen i direkte kontakt med bunnen av kondensatoren for å sikre en jevn fordeling av temperaturen avkjøling over hele overflaten av objektglasset under sublimering. Alternativt kan sand i bunnen av kondensatoren for å sikre en flat overflate.
   1. Plasser tape langs ytterkantene av platen og holder seg til sidene av den indre glass. Hvis kassetten er plassert under platen, og fester seg til bunnen av den indre glassoverflaten, kan temperaturfordelingen ikke være jevn og kan føre til en ujevn fordeling matrisen over overflaten av objektglasset.
   2. Tape en blank (test) gli diagonalt over overflaten av den metallplate med båndet igjen plassert på den ytre kanten av sleiden.
4. Koble sammen de øvre og nedre deler av apparatet, wed en gummi O-ring i midten for å sikre en fullstendig forsegling.
5. Plassere et metall universalledd rundt midten av anordningen og stramme laster inntil øvre og nedre halvdel av anordningen er forseglet tett sammen. Plasser i metall O-ringen over sandbadet.
6. Ta en håndfull knust is og legg den i kondensatoren. Fyll kondensator ¼ til ½ full med kaldt vann for å lage is slaps. Isen slaps vil kjøle metallplaten på innsiden av apparatet og deretter lysbildet overholdt den. Vent i minst 5 min for temperaturen å nå en stabil tilstand.
7. Hell 300 ml etanol i en kaldfelle beholderen og plassere glass inn i beholderen. Drop 2 - 3 små stykker av tørris ned i etanol i bunnen av kuldefelle beholderen. Den kalde felle inngang har et glassrør som går til bunnen av sylinderen, mens utgangen ikke.
8. Koble vakuumpumpen til den kalde felle tilkobling ved å bruke gummi slangen. Bruk en annen del av gummirøret for å koble den kalde felle input til sublimeringsapparatet. Pass på at slangen er godt sikret ved hjelp av metall klemmer hvis tilgjengelig.
9. Bruk vakuumpumpe for å levere et vakuum på 30 - 50 tonn. La pumpen gå i minst 5 min for trykkutligning. Lastene på U-ring av sublimeringsapparatet kan ha til å strammes igjen når vakuumpumpen slås på grunn av redusert trykk i anordningen.
   MERK: Det anbefales at en vakuummåler være festet til pumpen for å overvåke trykket av vakuum i løpet av eksperimentet og for å teste for lekkasje i trykk for å oppnå den høyest mulige reproduserbarhet mellom eksperimenter. Imidlertid er de fleste pumper konstruert for å opprettholde et konstant trykk, således at måleren ikke kan være essensiell for erfarne brukere. I tillegg kan vakuum segl fett brukes til å opprettholde vakuum press.

3. Sublime

1. Kontroller at sandbad temperaturen har stabilsert ved 140 ° C, og at anordningen er festet i metall O-ringen over sandbadet med alle slange tilkoblet og vakuumet slått på.
2. Sett timeren for 7 min, men ikke start tidtakeren. Sakte heve sakseheis og sandbad opp til sublimeringsapparatet til den U-felles av sublimator er godt over metall O-ringen. Denne ekstra plass gir mulighet for justering av anordningen på sanden.
   1. Trykk raskt på sublimator forsiktig på sand overflaten for å sikre at apparatet sitter jevnt på sand, og deretter umiddelbart starte timeren.
3. Når tiden går, slå av vakuumpumpen og senk sakselift til sublimator ikke lenger berører sandbad og sitter sikkert i metall O-ring.
   1. Sakte løsne mikro-lufteventil for å frigjøre trykket i apparatet. Løsne metallbøylen rundt gummi slangen av sublimering apparater og sakte begynne å løsne røret. Når rubber rør har blitt løsnet litt, bøye røret til den ene siden slik at resterende trykk til å unnslippe.
   2. Når lokalt trykk avkastning, forsiktig fjerne gummislangen fra sublimeapparatet.
4. Løsne lastene på U-joint av apparatet og fjern. Nøye skille de to halvdelene av sublimering apparater og trekke av lysbildet fra toppen av den indre glass. Undersøk lysbilde for å bekrefte enda matrise distribusjon.
   MERK: Hvis matrise er ujevn, kan pulverisert matrise i bunnen av sublimator flyttes eller sublimator apparatet kan flyttes i sanden for neste lysbilde. Sublimering prosessen kan gjentas flere ganger ved hjelp av den samme matrise, men matrisen vil etterhvert bli mørkere ved gjentatt eksponering varme og mengden av pulver vil avta, slik at sublimering tiden vil måtte justeres svakt for å kompensere. Av denne grunn er det viktig å overvåke mengden av matrisen being sublimert etter hvert eksperiment for å sikre konsistens i matrise deponering mellom lysbilder
5. Hvis fordelingen og mengden av matrix sublimert er tilstrekkelig, tape et nytt lysbilde med vev på innsiden av sublimator og gjenta punkt 3.
   NB: For kvalitetskontroll (QC) formål, kan mengden av matrisen sublimert måles etter hvert forsøk ved å veie sleiden før og etter sublimering og dividere vekten av sublimert matrise med overflatearealet av sleiden ^2, bør det bemerkes at på grunn av manglende presisjon i de fleste vekter utover 4 desimaler og variabilitet mellom skalaer, disse målingene bør bare brukes en guide for optimal matrise avsetning i motsetning til et fullstendig kvantifiserbare hjelp av QC, med mindre en høy presisjon balanse er brukt (se figur 3).

4. Tissue Lagring / Utvanning

1. Etter sublimering, glir butikk i en lukket beholder eller liten cassette i forseglet plastpose.
2. Inkuber lysbilder i -20 ° C fryser i 2 timer eller over natten.
   MERK: Målet med fryseprosessen er å fungere som en rehydrering skritt for desorpsjon av vev stoffer i matrisen. Fryseprosessen har også vist seg å forhindre nedbrytning av lipid signaler for opptil en uke når de lagres ved -80 ° C ^12. Av denne grunn kan mengden av tid prøvene er lagret i fryseren varieres til en viss grad for å dekke behovene til experimenter uten vesentlig å endre signaldeteksjon (som observert i vårt laboratorium). Vi har imidlertid lagt merke til noen misfarging av matrix når prøvene er frosset i mer enn 24 timer ved -20 ° C. Derfor anbefaler vi å avbilde sublimert vev før den tid eller lagring av vev ved -80 ° C i lengre ruge perioder.
3. Fjern lysbilder fra fryseren (og beholder) og plasser i en eksikator i 5-10 min.

5. Imaging og Analysis

1. Fjern lysbilder fra tørkeapparat og bruke instrument standarder for å sikre masse nøyaktigheten av MALDI instrument under bildebehandling. Den type av standarder vil variere avhengig av instrumentering. Standarder er vanligvis brukes jevnt over hele lysbildet, omkringliggende vev som skal avbildes (figur 3D).
2. Sett gli inn MALDI instrument og følg produsentens anvisninger for bildebehandling eksperimenter (instrument metoder skal være optimalisert for en 1000 - 2000 masse range). Representant resultat (figur 4) ble kjøpt i reflectron negativ modus med 70 mikrometer raster og 20 bilder / spektrum (oppkjøp tid ~ 2 timer).

Representative Results

Ved fullføring av forsøket sublimering, blir de to halvdelene av glassapparatur separert i avtrekksskap og sleiden, tapet til kondensatoren, kan bli fjernet (figur 3A). På dette punkt bør sleiden bli kontrollert for ujevn fordeling matrise og den tid, temperatur, eller plassering av anordningen i sandbadet kan måtte justeres for neste side. En vellykket DAN sublime eksperiment vil resultere i en enda belegg av grått / brunt matrise langs overflaten av objektglasset, hvor de anatomiske trekk ved vev klart kan visualiseres og mengden av matrise på glass-slide er lik mengden av vev (Figur 3B). For eksempel, hvis for mye matrise er blitt foredlet på vevet, vil tykkelsen av matrisen dekke funksjonene i vev og bare den generelle formen vil være merkbar. Imidlertid, hvis for lite matrisen er sublimert, vil vevet HÅhar en mørkere utseende enn resten av lysbildet (Figur 3C). Både for stor og for liten matrise vil resultere i dårlig signal i MALDI instrument. For kvalitetskontroll, Thomas et al. veid mengden matrise avsatt på objektglasset, og dividert vekten av overflatearealet av lysbildet. De rapporterte en optimal mengde av matrise avsetning i flere matriser inkludert DAN (110 ug / cm) ^2. Selv om de fleste balanserer mangler presisjonen som trengs for å gjenskape slike resultater, har vi forsøkt denne metoden for QC; imidlertid, på grunn av en høy grad av variabilitet, vi kan bare gi råd et passende område av matrisen avsetning syntes å være forbundet vellykket versus mislykkede forsøk med sublimering DAN matrise som bestemt ved signaldeteksjon i instrumentet. En matrise måling av under 100 ug / cm ble forbundet med "for lite" matriseforhold, mens en måling av over 140 ug / cm varassosiert med "for mye". Matrise avsetning mellom 100 og 140 ug / cm ble funnet å være en optimal mengde for avbildning med DAN matrise. Kalibrering standarder skal brukes på glass-slide rundt vevsprøver for å sikre massen nøyaktigheten av de detekterte IMS signaler (figur 3D)

I et MALDI IMS eksperiment, tillater den molekylære bilde for visualisering av den romlige fordelingen av analytten av interesse sammen med noen ukjente arter som kan være til stede i et gitt masseområde. De molekylære bilder av gangliosider i dette forsøk ble belagt ved hjelp av ImageJ programvare for å vise den anatomiske fordeling av flere gangliosid-arter på tvers av kortikale og subkortikale regioner av rotte-hjerne (figur 4A). De mest tallrike gangliosider i hjernen er A-serien arter GD1a og GM1, men også inneholder gangliosider GM2 og GM3 som kan alle bli funnet mellom1000-2000 m / z masseområde, en høyere masseområde enn de fleste vanlige hjerne lipider, slik at disse gangliosidene lett å identifisere langs spekteret (figur 4B). Den ioniske overflod av hvert gangliosid-arter kan benyttes for å kvantifisere semi-forskjeller eller endringer i gangliosid-arter innen det samme bildet. Fordi en viss variasjon i prøven prep ikke kan unngås i IMS, mellom skanne sammenligninger er ansett for å være semi-kvantitativt.

Figur 3. DAN Sublime. Representative resultatene av sublimering av DAN matrise på rottehjernevevet. (A) Ved fullføring av sublimering, blir de to halvdelene av anordningen separert og sleiden fjernes fra kondensatoren. (B) DAN matrise sprer seg jevnt over flere rottehjerne vevssnitt på overflaten av objektglasset, slik at for høyt karsoducible resultater (mellom 100-150 mikrogram / cm). (C) Eksempler på mislykkede sublime forsøk der for lite matrise (venstre - <90 mikrogram / cm²) eller for mye matrise (høyre -> 150 mikrogram / cm²) ble avsatt. For lite matrise vil resultere i utilstrekkelig desorpsjon av analytter, mens for mye matrise ikke tillater laseren å trenge inn i vevet under innhenting, noe som resulterer i lav ion deteksjon. (D) Slide inneholder rottehjerne vevsdelene sublimated med DAN matrise og kalibreringsstandarder som anvendes er klar for innsetting i MALDI instrument for bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. MALDI IMS av gangliosider i rottehjerne. representative MALDI IMS molekyl bilde og massespektrum av gangliosider i rottehjerne etter sublime med DAN matrise. Molekyl bilde er sammensatt av flere gangliosid-arter i spekteret overlappet og pseudocolored bruk av Image J programvare for å vise den unike anatomiske fordelingen av gangliosid-arter i hele hjernen. Arter GM1d18: 1 (rød, masse ~ 1547 Da), GM1d20: 1 (grønn, masse ~ 1573 Da), GM3d18: 1 (blå, masse ~ 1178 Da), og GM3d20: 1 (blågrønn, masse ~ 1207 Da) er representert. Massen spektrum viser ionisk overflod av analytter i en 1000 - 2000 masse utvalg. De store A-serien gangliosider er merket langs spekteret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette arbeidet detaljer en standardisert protokoll matrise sublimering på vev for påvisning av negativt ladede lipider, slik som gangliosider, i MALDI IMS eksperimenter. Prøvepreparering for MALDI IMS er svært variabelt og må tilpasses de unike egenskapene til analytten av interesse. Anvendelsen av matrise på vevsprøve overflate er en viktig del av prøveopparbeidelse prosessen med hensyn til kvaliteten på resultatene i IMS. Spesiell forsiktighet bør utvises ved valg av matriser, slik at matrisen er kompatibel med analytten av interesse og er fri for matrix-avledet artefakter i spekteret. Sublime er en tørr matrise deponering teknikk som gir en høy grad av matrise krystall homogenitet med lite delokalisering av lipider på vev. DAN matrise spesielt viser en høy grad av følsomhet for desorpsjon av en gruppe av negativt ladede membranlipider kalt gangliosider, som vist i rottehjerneseksjoner, og er stabilt under vakuum i lengre perioder av gangen, slik at for kompatibilitet med de fleste bildebehandlingsprogrammer. DAN matrise har den ekstra fordelen av å også å ha en høy affinitet for positivt ladete lipid art, og dermed øker allsidigheten til denne matrise for MALDI IMS applikasjoner ^2. Det bør også bemerkes at multiple lipid-arter, inkludert fosfolipider, kan påvises samtidig ved bruk av denne protokollen IMS.

En grundig undersøkelse av egenskapene til DAN matrise i forhold til 9 andre brukte matriser har tidligere utgitt ^to. I denne artikkelen, forfatterne markere den økte følsomheten DAN matrise negative ion modus i forhold til de andre matriser undersøkt samt mulighet for høy oppløsning ved hjelp av DAN. DAN matrise ble funnet å ha den høyeste samlede ytelsen for negativ polaritet ioner. Interessant, det utført EQUAlly godt for positiv polaritet ioner. Andre vanlige matriser som har vist høy affinitet for negativ polaritet ioner inkluderer DHA, DHB, og 9-AA. Effektiviteten av DHA som en grunnmasse er begrenset av den lave stabilitet under vakuum, noe som gjør det upraktisk for de fleste bildebehandlingsapplikasjoner ^2. 9-AA har fordelen av å produsere lav bakgrunnsstøy og demonstrerte anrikning av sulfatidantistoffer signaler i 750-950 massespekter i negativ modus sammenlignet med DHB matrise ^13. Selv om DHB har vist seg å være meget effektiv i positiv modus, gir det lavere negativ polaritet ion signal i forhold til DAN massen ^2. DAN matrise også vist økt følsomhet i negativ ion-modus i det nedre masseområde (650-950) sammenlignet med DHB ^2. I tillegg har det blitt rapportert at DHB kan danne betydelige matrise klynger i negativ ion-modus inntil 750 Da ^to.

et al. , I hvilken første matrise blir ført gjennom en fin sil, og avsatt på prøveoverflaten. Forfatterne sammenlignet denne tørre metode for deponering matrise til en våt matrise manuell sprøyteteknikk, og fant at de ga sammenlignbare signal for fosfolipider i 450 - 1200 masseområde ^14. En studie brukes både sublimering og tørr belegg med en sil for å undersøke fosfolipid uttrykk, derimot, gjorde forfatterne ikke kommentere hvordan de to teknikkene forhold når det gjelder bildeoppløsning eller ion signal utbytte ^15.

For å sikre en størst mulig rekkevidde for eksempel anvendelse av protokollen presentert var en grunnleggende arbeidsflyt som vil tillate både nye og mer spesialiserte brukere av MALDI IMS for å oppnå svært reproduserbare resultater for en rekke lipid bildebehandlingsapplikasjoner. Imidlertid kan sublimering protokoller endres for å møte unique omstendigheter i forsøket. For eksempel, den fine matrise krystallavsetning tilgjengelig ved sublimering gjør det mulig for muligheten til å snu rekkefølgen av prøvepreparering av pre-belegg lysbilder / plater med matrise før montering av vev. Matrisen kan sublimeres på den ledende overflaten på forhånd og oppbevares i et mørkt miljø for senere bruk og dermed redusere prøvepreparering tidspunkt etter snitting samtidig opprettholde høy sensitivitet for påvisning lipid ^{16, 17.} En annen modifikasjon som kan bli gjort til denne protokollen for å forbedre signal for påvisning av lipider er en 2 minutters vask med ammoniumformiat ^8.

Selv om sublime kan omgå mange av ulempene ved de fleste våte avsetningsteknikker, slik som mindre, mer homogen matrise krystallavsetning ^1, redusert delokalisering av analytter, og lav pris i forhold til automatiserte spredere, såmeg variabilitet i prøveprepareringsprosessen er uunngåelig. I tilfelle av sublimering, er det flere faktorer som kan forårsake ørsmå forskjeller fra ett eksperiment til en annen, og kan omfatte følgende som har blitt observert i vårt laboratorium. Det kan være forskjeller i posisjonen til sublimeringsapparatet på sand. Når kjøre flere sublime eksperimenter rygg mot rygg, kan sanden i sandbadet begynner å forskyve sin stilling som kan påvirke dispersjonen av varme gjennom sandbadet. Flate ut sand før hver runde av sublimering kan også endre spredningen av varmen som sand som er blitt forskjøvet kan ta tid å vende tilbake til en jevn temperatur. Sublimeringstiden kan måtte justeres litt mellom hver runde for å kompensere for forskyvning av sand i sandbadet. Alternativt kan anvendelse av et oljebad som fører til mer homogen varmefordeling.

For det andre, kan mengden av matrisen ved bunnen av sublimator variere. DAN Matrix har en klumpete grått utseende og har en tendens til å danne store klynger. Disse grupper kan være manuelt brutt opp og anordnet i bunnen av sublimator men kan ikke være fullstendig eliminert. Store klynger av matrisen vil ta lengre tid å varme og sublimere enn mindre biter som kan påvirke sluttproduktet av sublimering.

Vakuumet utgangen på sublimeringsapparatet er en annen viktig faktor. De fleste sublimators er laget med et enkelt vakuum utgang på hvilken slange er festet for å koble den til vakuumpumpen under sublimering. På grunn av at trykket blir regulert på den siden av anordningen, kan det være en liten ujevnhet på matrisen avsetning, og det blir avsatt på siden med vakuum utgang. Dette kan være noe kompenseres for ved å forskyve enten posisjonen av apparatet i sanden, posisjonen av matrisen i bunnen av sublimator, eller ved å endre posisjonen av sleiden / plate på kondensatoren. disse faktumors er de viktigste ulempene ved sublimering teknikk og av denne grunn er det viktig å kjøre en testbrettet gjennom sublimeringsprosessen før kjøring av forsøksprøven, slik at tiden kan justeres for å kompensere for disse variablene.

En annen rapportert ulempe ved sublimering er at påvisning av høyere masse analytter er begrenset av utilstrekkelig analytt ekstraksjon og / eller blanding med grunnmassen. En rehydrering steg etter sublime kan hjelpe trekke ut disse høyere masse analyttene å omgå dette problemet. Dette oppnås typisk ved hjelp av et fuktighetskammer ^18. Men i denne protokollen, er en frysetrinnet tilsettes etter sublimering, som oppnår den samme hensikt. Frysing og påfølgende opptining (i en eksikator) av prøvene før innsetting i MALDI instrument bevirker at det dannes kondens på overflaten av prøven som midlertidig rehydrerer prøven for å tillate utvinning av høyere masse lipider og samtidig bevare tissue for analyse ^{12, 17.}

Samlet er sublime en svært følsom og kostnadseffektiv metode for å matrise anvendelse for påvisning av lipider i MALDI IMS eksperimenter. Faktisk har vår gruppe lagt merke til betydelige forbedringer i IMS resultater når vi skiftet fra å bruke en luftspray metode ³ til en sublime metode ⁴ for matrise deponering. Denne protokoll er passende for en rekke lipid bildebehandlingsprogrammer, men kan endres for å dekke behovene til eksperimentator.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sublimator	Chemglass Life Sciences	CG3038-01
1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix	Sigma-Aldrich	D21200	100 G
Cryostat	Thermo-Fisher Scientific		CryoStar NX50
Hot plate with temperature feedback	Thermo-Fisher Scientific	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Stainless Steel Jack	Thermo-Fisher Scientific	2216479	10x10
Cold Trap			Custom built on site
Vacuum Pump	Franklin Electric	1102180403	Savant VP100 Two Stage
Indium-tin-oxide (ITO) Slides	Hudson Surface Technology	PSI 1111000	type II, 1.1 mm/25 each
MALDI TOF/TOF 5800 Instrument	AB Sciex
Desiccator	Sigma-Aldrich	D2797	tabletop desiccator