Abstract
Preparación de la muestra es la clave para la detección y visualización de analitos en experimentos de láser asistida por matriz de desorción / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) óptima. Determinar el protocolo apropiado para seguir todo el proceso de preparación de la muestra puede ser difícil, ya que cada paso debe ser optimizada para cumplir con las características únicas de los analitos de interés. Este proceso no sólo consiste en encontrar una matriz compatible que puede desorber e ionizar las moléculas de interés de manera eficiente, sino también la selección de la técnica de deposición de matriz apropiada. Por ejemplo, una técnica de deposición de matriz húmeda, lo que implica la disolución de una matriz en un disolvente, es superior para la desorción de la mayoría de proteínas y péptidos, mientras que las técnicas de deposición de matriz seca son particularmente eficaces para la ionización de los lípidos. Sublimación ha sido reportado como un método altamente eficaz de la deposición de matriz seca para la detección de lípidos en el tejido por MALDI IMS debido a la homogeneity de la deposición de cristales de la matriz y la deslocalización mínimo analito en comparación con muchos métodos de deposición húmeda 1, 2. En términos generales, se trata de la colocación de una muestra y de la matriz en polvo en una cámara sellada al vacío con las muestras prensadas contra una superficie fría. El aparato es bajado a continuación en un baño calentado (arena o aceite), lo que resulta en la sublimación de la matriz en polvo sobre la superficie de muestra de tejido enfriado. Aquí se describe un protocolo de sublimación usando 1,5-diamino-naftaleno matriz (DAN) para la detección y visualización de los gangliósidos en el cerebro de rata utilizando MALDI IMS.
Introduction
Asistida por matriz de desorción láser / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) se está convirtiendo en un codiciado técnica para la visualización de la distribución espacial de los lípidos, péptidos y proteínas a través de superficies de muestras intactas. MALDI IMS era conocido previamente como una técnica analítica para analitos pre-purificado, pero en los últimos años, se ha llamado la atención en muchas otras disciplinas debido a la capacidad de combinar la exactitud de la espectrometría de masas con puntos de referencia de alta resolución visuales / anatómicas sin la necesitará para cualquier etiquetado externo. Como la piscina científica de los investigadores que utilizan esta técnica sigue creciendo, hay una mayor necesidad de protocolos estandarizados y fáciles de seguir para ayudar en el desarrollo y optimización de experimentos IMS. Los gangliósidos, un grupo de lípidos de membrana muy abundantes en el sistema nervioso central, son ideales para experimentos de MALDI IMS como su ubicación, incrustado dentro de la membrana, hace cierta especificidadit imposible detectar el uso de Inmuno-etiquetado convencional. Además, hemos demostrado, usando MALDI IMS, que estos lípidos, que funcionan como moduladores de la señalización celular, entre otras cosas, tienen patrones de distribución anatómica únicas en el cerebro de roedores sanos que son alterados después de la lesión cerebral 3, 4, 5. Los gangliósidos se encuentran en un intervalo de masa superior en comparación con la mayoría de las especies de lípidos, y son por lo tanto más adaptado a la plataforma de imágenes MALDI.
Figura 1: Flujo de trabajo de MALDI IMS experimento. Diagrama del flujo de trabajo general de un experimento de MALDI IMS usando sublimación. El tejido congelado a -80 ° C se secciona en un criostato y 10 micras secciones son deshielo montado en portaobjetos de ITO conductores. El portaobjetos se coloca entonces en un desecador hasta la sublimación. SLIdes se inserta en el aparato de sublimación y se aplica una capa uniforme de la matriz a la superficie de la muestra de tejido. Las muestras se congelaron durante la noche en un congelador C -20 ° después se colocaron en un desecador durante 10 min. Una vez que se han aplicado las normas, las muestras se insertan en el instrumento MALDI donde un láser se dirige a través del tejido causando moléculas desorbidos en la matriz para ionizar. Los iones viajan por un tubo de vuelo y por separado en función de su masa (/ TOF tiempo-de-vuelo) hasta que alcanzan el detector. La información sobre la abundancia iónica de analitos dentro de un rango predeterminado de masa a carga (m / z) se muestra como tanto una imagen molecular y espectro de masas. Estos datos se pueden usar tanto para visualizar y cuantificar la abundancia iónica del analito de interés en el tejido de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
preparación de la muestrapor MALDI IMS es muy variable, ya que cada paso del proceso debe ser personalizado para los analitos de interés. La característica definitoria de experimentos basados en MALDI es el uso de un revestimiento de matriz depositada sobre la superficie de la muestra antes del análisis. Además de la función de absorber y transferir energía de radiación del láser durante el proceso de ablación, la matriz también sirve para aislar diversos analitos de la muestra, lo que facilita el análisis de los compuestos de interés 6, 7. una aplicación homogénea de la matriz a la superficie de la muestra es el paso más importante en el proceso de preparación de la muestra. La deposición de matriz incorrecta puede dar lugar a grandes formaciones heterogéneas cristal matriz y el desarrollo de artefactos, bajo la señal de iones, y la mala reproducibilidad 7.
Debido a la afinidad de ciertas matrices para aislar analitos específicos, el tipo de matriz seleccionado para un experimento puedealterar de manera significativa el resultado. Las matrices utilizadas para la obtención de imágenes de proteínas y péptidos a menudo difieren de las utilizadas para los lípidos de formación de imágenes y el proceso se complica aún más por la necesidad de procedimientos adicionales, tales como lavado y rehidratación pasos con el fin de detectar con éxito las señales a partir de tejido. Aunque existen etapas de lavado para la mejora de las señales de lípidos 8, no son un requisito previo para la detección de la mayoría de especies de lípidos. Al seleccionar una matriz para un experimento de formación de imágenes de lípidos, es importante tener en cuenta la polaridad de los lípidos de interés, ya que esto reducir la gama de matrices adecuadas. Por ejemplo, los gangliósidos contienen residuos de ácido siálico que les dan una polaridad negativa global. Hay una serie de matrices que pueden desorber e ionizar gangliósidos a partir de tejido de manera efectiva; Sin embargo, factores tales como picos derivadas de la matriz en el espectro y la estabilidad de la matriz al vacío deben ser tomados en consideración. 1,5-diaminonaftaleno (DAN) de la matriz es lo suficientemente estable en condiciones de vacío instrumento para la mayoría de aplicaciones de imágenes y ha demostrado un alto grado de sensibilidad para la desorción de los lípidos y se puede utilizar para el análisis de lípidos en ambos modos de iones positivos y negativos 2. matriz DAN, en comparación con otras matrices de afinidad de lípidos negativos tales como el ácido dihidroxibenzoico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), y 5-cloro-2-mercaptobenzotiazol (CMBT), fue capaz de desorber más eficiente gangliósidos de cerebro de rata tejido en el modo de ion negativo (manuscrito en preparación).
Al seleccionar el método adecuado para la deposición de matriz es de igual importancia para la selección de la propia matriz. métodos de deposición de matriz húmeda en el que la matriz sólida se disuelve en un disolvente orgánico, y se depositan por neumático o pulverizadores o observadores automatizado, son particularmente eficaces para la desorción de proteínas y péptidos como el líquido impregna la muestra para permitir adicionalcción de compuestos y co-cristalización con la matriz. Aunque estas técnicas también se pueden utilizar para aplicaciones de lípidos, la deslocalización analito y formaciones de cristal de matriz desigual son sucesos comunes, debido a la gran abundancia y la solubilidad de los lípidos en disolventes, en particular en el tejido 2, 9. Debido a que los lípidos se ionizan fácilmente a partir de tejidos, técnicas de deposición de matriz secos, como sublimación, ofrecen una alternativa sencilla y rentable para pulverizadores eludiendo las disposiciones que muchos de los inconvenientes de estas técnicas. El éxito de la sublimación en experimentos MALDI IMS se atribuye a características tales como la morfología de la matriz microcristalina lo que aumenta el área superficial para la matriz de unión a analito, el aumento de la pureza de la matriz, y la deposición de matriz homogénea que conducen a una mayor reproducibilidad en comparación con las técnicas de matriz húmeda 1, 10.
invo sublimaciónLves calentamiento de una matriz de polvo bajo vacío inmediatamente por debajo de una superficie de la muestra enfriada resultante en forma sólida a la transición de fase gaseosa de la matriz en polvo seguido de la deposición sobre la superficie de la muestra de tejido. Durante la sublimación, deposición de la matriz puede ser controlado por factores variables tales como el tiempo, la temperatura y la presión para proporcionar resultados altamente reproducibles. Un experimento de la sublimación solo puede tomar de 5 a 20 minutos, dependiendo del tipo de matriz seleccionada, que puede ser reutilizado varias veces antes de su eliminación. El aparato puede ser comprado comercialmente a una fracción del precio de los pulverizadores automáticos y es fácilmente desmontado para su limpieza y mantenimiento. El bajo costo y la simplicidad relativa de esta técnica de deposición de la matriz, lo hacen ideal para los investigadores que comienzan o en expansión en aplicaciones de imágenes de lípidos en MALDI IMS. Aunque la información que detalla los protocolos para la sublimación de los tejidos para IMS se han reportado 11, unos protocolos estandarizados existen which centrarse en el flujo de trabajo básico involucrado en la realización de un experimento de la sublimación para obtener imágenes de los lípidos de alto peso en el modo de iones negativos, por lo que es difícil establecer la técnica sin un amplio ensayo y error. El siguiente es un protocolo experimental con el objetivo de llenar ese hueco para la sublimación de la matriz de DAN en secciones de cerebro de rata para la formación de imágenes de alta resolución y detección de los gangliósidos.
Figura 2: Aparato de sublimación. La fotografía (A) y el diagrama esquemático (B) del aparato de sublimación. La bomba de vacío está conectada por un tubo de goma a una trampa fría llena con 300 ml de etanol. La trampa está entonces conectada por un tubo de goma al aparato de sublimación. El aparato se compone de dos piezas separadas de material de vidrio que están sellados juntos con un metal U-articulación. La mitad superior de la sublimadorcontiene el condensador que está lleno de aguanieve hielo. La placa de muestra se pega sobre la parte inferior del condensador, en el interior del aparato de vidrio sellado. La mitad inferior del aparato de sublimación contiene la matriz DAN, que se extiende de manera uniforme hacia la placa de muestra. Durante la sublimación, el aparato de vidrio se coloca en un baño de arena se calienta a 140 ° C por una placa caliente directamente debajo de ella. La sonda de temperatura ayuda a mantener una temperatura estable durante todo el experimento sublimación través de la retroalimentación de la temperatura del baño de arena en comparación con la temperatura predeterminada para el experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Todos los procedimientos de manejo de animales describen a continuación se adhieren a la Universidad de Cuidado de Animales de Ontario Occidental (2016-014).
1. Preparación del tejido y Seccionamiento
- Extraer el tejido cerebral de la rata a través de un proceso conocido como "fresco congelado Extraction" (FFE).
- La eutanasia a las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico y controlar los reflejos en las extremidades. Una vez que todos los reflejos han cesado, cortar la cabeza de la rata utilizando una guillotina.
- Con cuidado, separar los músculos y otros tejidos del cráneo utilizando un bisturí. El uso de fórceps de corte de hueso para romper el cráneo para exponer el cerebro, a partir de la base del cráneo (foramen magnum) a la porción anterior.
- Una vez que el cerebro está expuesto, saque con cuidado con una espátula quirúrgica y colocar inmediatamente en hielo seco triturado para la congelación de flash.
NOTA: El cerebro va a ser muy maleable. Por lo tanto, tenga mucho cuidado al colocar en el cerebrohielo seco. Si el cerebro es aplastado o prensado contra una superficie, se va a alterar su forma y congelar en esa posición.
- Eliminar el tejido fresco congelado (no perfundidos con formaldehído o embebido en OCT) de - 80 ° C congelador y colocar en hielo seco.
- Coloque varias gotas de agua sobre un soporte de criostato y el lugar en cualquiera de hielo seco o barra de inmovilidad criostato. Presione ligeramente sobre el tejido titular de criostato, ya que comienza a congelar y mantener hasta que el agua se congela alrededor de la base del tejido y lo ancla en su lugar. Añadir más agua para asegurar aún más el tejido en el soporte si es necesario.
NOTA: El agua se utiliza en lugar de los medios de octubre para el tejido de montaje con el fin de evitar la contaminación de los tejidos con compuestos que pueden afectar la detección de la señal deseada. - Posición en el tejido criostato. tejido sección hasta la localización anatómica deseada. Asegúrese de que el espesor de corte es de entre 8-12 micras.
NOTA: Cuando el corte de tejidos en criostato comunitariadispositivos, es imperativo que los materiales separados tales como palas, cepillos, barras estabilizadoras, y los titulares pueden utilizar con el fin de evitar la contaminación con la incorporación de compuestos. El interior del criostato también debe limpiarse a fondo con etanol antes de su uso. - Uso de la barra estabilizadora criostato, lentamente sección aplanada secciones de tejido. Los agujeros o marcas en el tejido puede ocurrir cuando la colocación barra antivuelco es incorrecta o lámina es opaca. Mueva el tejido para el centro de corte de plataforma usando brochas limpias.
- Montaje
- Congelar diapositivas conductoras o placas de metal, colocándolos en el criostato mientras rebanar. Cuando la tapa está completamente congelado, mueva con cuidado el tejido seccionado sobre la superficie conductora de la diapositiva utilizando pinceles limpios. Una vez que todas las secciones de tejido están colocadas correctamente en la diapositiva, coloque un dedo debajo de la diapositiva, frente al tejido, y presione hasta que la sección se descongela.
NOTA: Las secciones pueden plegarse o enrollarse durante el proceso de descongelación cuandoel uso de este método de montaje. Esto se puede reducir manteniendo la diapositiva en el criostato al descongelar el tejido. Si estos problemas se vuelven problemáticos, una alternativa, calentamiento montaje método se enumeran a continuación. - Otra opción es tomar una temperatura ambiente de óxido de indio y estaño (ITO) de deslizamiento (o placa de metal) y presione ligeramente hacia abajo en la sección de tejido congelado en la superficie de la plataforma de corte, lado conductor hacia abajo. Esto conducirá a la sección de tejido descongelación de manera uniforme sobre la superficie de la corredera con poco rizado o plegado del tejido.
NOTA: La condensación puede aparecer debajo de la sección de montaje cuando se utiliza este método que puede conducir a la pérdida de ciertas proteínas y lípidos.
- Congelar diapositivas conductoras o placas de metal, colocándolos en el criostato mientras rebanar. Cuando la tapa está completamente congelado, mueva con cuidado el tejido seccionado sobre la superficie conductora de la diapositiva utilizando pinceles limpios. Una vez que todas las secciones de tejido están colocadas correctamente en la diapositiva, coloque un dedo debajo de la diapositiva, frente al tejido, y presione hasta que la sección se descongela.
- Colocar los portaobjetos con el tejido en un desecador durante 5 - 10 minutos a.
2. Aparato Sublimador Set-up
NOTA: Realice estos pasos en una campana de humos.
- Coloque un baño de arena en un recipiente de aluminio sobre una placa caliente, con la placa caliente en un elevador de tijera de metalde un área superficial apropiada (es decir, más grande que el plato caliente). Encienda la placa caliente y ajustar la temperatura a 140 ° C.
NOTA: El punto de fusión de la matriz DAN está entre 187 - 190 ° C. No exceda esta temperatura en la placa calefactora.- Si la placa caliente está equipado con una sonda de realimentación de temperatura, lo utilizan para controlar la temperatura de arena durante todo el experimento y garantizar la consistencia de la temperatura. Esta característica puede ayudar con la reproducibilidad experimento a través de diversos experimentos de sublimación.
NOTA: El baño de arena debe estar contenido dentro de un recipiente de aluminio como un recipiente de vidrio pueden romperse a alta temperaturas.
- Si la placa caliente está equipado con una sonda de realimentación de temperatura, lo utilizan para controlar la temperatura de arena durante todo el experimento y garantizar la consistencia de la temperatura. Esta característica puede ayudar con la reproducibilidad experimento a través de diversos experimentos de sublimación.
- Colocar 300 mg de matriz de DAN sobre la superficie inferior del aparato de sublimación. Coloque la matriz en el centro del aparato y se extendió en una capa uniforme en la anchura aproximada y la longitud de la corredera está sublimado.
PRECAUCIÓN: matriz de DAN es tóxico. Por lo tanto, es importante llevar guantes, máscaras, y la seguridadgafas en todo momento al manipular la matriz de polvo. DAN se debe almacenar en la oscuridad, ya que es sensible a la luz. - Cinta de una placa de metal sobre la superficie interior del aparato con la placa de toma de contacto directo con el fondo del condensador con el fin de asegurar una distribución uniforme de la temperatura de refrigeración a través de toda la superficie de la corredera durante la sublimación. Alternativamente, la arena del fondo del condensador para asegurar una superficie plana.
- Coloque la cinta a lo largo de los bordes exteriores de la placa y adherirse a los lados de los artículos de vidrio interior. Si la cinta se coloca debajo de la placa y se adhiere a la parte inferior de la superficie de vidrio interior, la distribución de temperatura no puede ser aún y podría resultar en la distribución desigual de la matriz a través de la superficie del portaobjetos.
- Cinta de un espacio en blanco (test) deslice diagonalmente a través de la superficie de la placa de metal con la cinta de nuevo colocado en los bordes exteriores de la diapositiva.
- Conectar las porciones superior e inferior del aparato, won una junta tórica de caucho en el medio para asegurar un sellado completo.
- Coloque un metal junta en U alrededor del centro del aparato y apriete vicios hasta la mitad superior e inferior del aparato están sellados herméticamente juntos. Colocar en la junta tórica de metal por encima del baño de arena.
- Tome un puñado de hielo picado y colocarlo en el condensador. Llenar condensador de ¼ a ½ llena con agua fría para crear granizado de hielo. El granizado de hielo se enfría la placa de metal en el interior del aparato y, posteriormente, la corredera adherido a ella. Espere al menos 5 minutos para que la temperatura alcance un estado de equilibrio.
- Verter 300 ml de etanol en el recipiente de trampa fría y colocar el material de vidrio en el recipiente. Caída de 2 - 3 pequeños trozos de hielo seco en el etanol en la parte inferior del recipiente de absorción en frío. La entrada de absorción en frío tiene un tubo de vidrio corriendo a la parte inferior del cilindro, mientras que la salida no lo hace.
- Conectar la bomba de vacío a la salida de la trampa fría usando un tubo de goma. Utilice otro trozo de gomatubos para conectar la entrada de absorción en frío al aparato de sublimación. Asegúrese de que el tubo esté fijado firmemente mediante abrazaderas metálicas si está disponible.
- Utilice la bomba de vacío para proporcionar un vacío de 30 - 50 mT. Deje que la bomba funcione durante al menos 5 minutos para equilibrar la presión. Vicios en U-anillo de aparato de sublimación pueden tener que ser apretados de nuevo una vez que la bomba de vacío se activa debido a la disminución de la presión en el aparato.
NOTA: Se recomienda que un indicador de vacío puede unir a la bomba para controlar la presión de vacío durante el experimento y para detectar si existen fugas en la presión con el fin de lograr la más alta capacidad de reproducción posible entre los experimentos. Sin embargo, la mayoría de las bombas están diseñados para mantener una presión constante, por lo tanto, el indicador puede no ser esencial para los usuarios experimentados. Además, la grasa sello de vacío se puede utilizar para ayudar a mantener la presión de vacío.
3. La sublimación
- Asegúrese de que la temperatura del baño de arena tiene Stabilzado a 140 ° C y que el aparato se fija en la junta tórica de metal por encima del baño de arena con todos los tubos conectados y el vacío encendido.
- Ajuste del temporizador durante 7 minutos, pero no arranque el temporizador. Lentamente levante la plataforma elevadora de tijera y la arena del baño hasta el aparato de sublimación hasta que la junta universal del sublimador está muy por encima de la junta tórica de metal. Este espacio adicional permite el ajuste del aparato en la arena.
- pulse rápidamente el sublimador suavemente sobre la superficie de la arena para asegurar que el aparato está sentado de manera uniforme sobre la arena, y luego comenzar inmediatamente el temporizador.
- Cuando suene el temporizador, apague la bomba de vacío y cuidadosamente baje la plataforma elevadora de tijera hasta que el sublimador ya no está en contacto con el baño de arena y se encuentra segura en la junta tórica de metal.
- Soltar lentamente la válvula de micro-ventilación para liberar la presión en el aparato. Aflojar la abrazadera de metal alrededor del tubo de goma del aparato de sublimación y poco a poco comienzan a aflojar el tubo. Una vez que el rutubo bber se ha aflojado ligeramente, doblar el tubo a un lado para permitir que la presión residual.
- Cuando vuelve la presión ambiente, retirar con cuidado el tubo de goma del aparato de sublimación.
- Aflojar los vicios en la junta universal del aparato y quitar. separe con cuidado las dos mitades del aparato de sublimación y salga de la diapositiva de la parte superior del material de vidrio interior. Examine el portaobjetos para confirmar la distribución uniforme de la matriz.
NOTA: Si la matriz no es uniforme, la matriz en polvo en la parte inferior del sublimador puede cambiar de posición o el aparato sublimador puede colocar de nuevo en la arena para la siguiente diapositiva. El proceso de sublimación se puede repetir varias veces utilizando la misma matriz, sin embargo, la matriz con el tiempo se vuelven más oscuras de la exposición al calor repetida y la cantidad de polvo se reducirá de tal manera que el tiempo de sublimación tendrá que ser ajustada ligeramente para compensar. Por esta razón, es importante controlar la cantidad de bei matrizng sublima después de cada experimento para asegurar la consistencia en la deposición de matriz entre diapositivas - Si la distribución y cantidad de matriz sublimado es suficiente, la cinta de una nueva diapositiva con el tejido en el interior de la sublimador y repita la Sección 3.
NOTA: Para fines de control de calidad (QC), la cantidad de matriz sublimado se puede medir después de cada experimento mediante el pesaje de la diapositiva antes y después de la sublimación y dividiendo el peso de la matriz sublimado con el área de la superficie de la corredera 2, hay que señalar que debido a la falta de precisión de la mayoría de las escalas más allá de 4 puntos decimales y la variabilidad entre las escalas, estas mediciones deben sólo se pueden utilizar una guía para la deposición de matriz óptima en oposición a un medio totalmente cuantificables de QC menos que se utilice un equilibrio de alta precisión (véase la figura 3).
4. El tejido de almacenamiento / rehidratación
- Después de la sublimación, la tienda se desliza en un recipiente sellado o pequeño Cassette en una bolsa de plástico sellada.
- Incubar los portaobjetos en -20 ° C congelador durante 2 h o durante la noche.
NOTA: El objetivo del proceso de congelación es la de actuar como una etapa de rehidratación para la desorción de los materiales de tejido en la matriz. El proceso de congelación también se ha demostrado para prevenir la degradación de las señales de lípidos para un máximo de 1 semana cuando se almacenan a -80 ° C 12. Por esta razón, la cantidad de tiempo las muestras se almacenan en el congelador se puede variar a un cierto grado para adaptarse a las necesidades del experimentador sin alterar significativamente la detección de señales (como se observa en nuestro laboratorio). Sin embargo, hemos notado cierta decoloración de la matriz cuando las muestras se congelan durante más de 24 horas a -20 ° C. Por lo tanto, se recomienda obtener imágenes del tejido sublimado antes de ese momento o almacenamiento de tejidos a -80 ° C durante períodos de incubación más largos. - Retire los portaobjetos del congelador (y contenedor) y colocar en un desecador durante 5 - 10 minutos a.
5. Imaging y Análisis
- Retirar los portaobjetos de desecador y aplicar las normas de instrumentos para asegurar la exactitud de la masa MALDI instrumento durante la exploración. El tipo de normas puede variar dependiendo de la instrumentación. Las normas se aplican generalmente de forma homogénea en toda la diapositiva, el tejido circundante en ser fotografiado (Figura 3D).
- Insertar diapositiva en el instrumento MALDI y siga las instrucciones del fabricante para los experimentos de imagen (métodos de instrumentos deben ser optimizados para un 1,000 - 2,000 rango de masas). Resultado representativo (Figura 4) fue adquirido en el modo negativo reflectrón con una trama de 70 micras y 20 disparos / espectro (adquisición en tiempo ~ 2 h).
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Representative Results
Al finalizar el experimento sublimación, las dos mitades del aparato de vidrio se separan en la campana de humos y la corredera, pegado en el condensador, se pueden eliminar (Figura 3A). En este punto, la corredera debe ser examinado para la distribución desigual de la matriz y el tiempo, la temperatura o la colocación del aparato en el baño de arena puede tener que ser ajustado para la siguiente diapositiva. Un exitoso experimento sublimación DAN resultará en una capa uniforme de la matriz gris / marrón a lo largo de la superficie de la corredera, donde las características anatómicas del tejido pueden ser claramente visualizados y la cantidad de matriz en el portaobjetos de vidrio es similar a la cantidad en el tejido (Figura 3B). Por ejemplo, si demasiado matriz se ha sublimado sobre el tejido, el espesor de la matriz se cubre las características del tejido y sólo la forma general será discernible. Sin embargo, si se sublima muy poca matriz, el tejido se HÅve un aspecto más oscuro que el resto de la corredera (Figura 3C). A la vez demasiado y demasiado poco de matriz que puede reducirse el de la señal en el instrumento MALDI. A efectos de control de calidad, Thomas et al. pesó la cantidad de matriz depositada en la diapositiva y se divide el peso por el área superficial de la diapositiva. Se informó de una cantidad óptima de la deposición de matriz para varias matrices incluyendo DAN (110 g / cm²) 2. Aunque la mayoría de los saldos carecen de la precisión necesaria para replicar estos resultados, hemos intentado este método de control de calidad; Sin embargo, debido a un alto grado de variabilidad, sólo podemos aconsejar a una gama adecuada de deposición de la matriz que se encuentran asociados con éxito frente a la sublimación experimentos fracasados con matriz de DAN como se determina mediante la detección de la señal en el instrumento. Una medición de matriz por debajo de 100 g / cm² se asoció con "demasiado poco" condiciones de la matriz, mientras que una medición de por encima de 140 g / cm² eraasociado con "demasiado". deposición de la matriz entre 100 y 140 g / cm² se encontró que era una cantidad óptima para la formación de imágenes con la matriz DAN. Estándares de calibración deben aplicarse sobre el portaobjetos de vidrio alrededor de las muestras de tejido para asegurar la exactitud de la masa de las señales detectadas IMS (Figura 3D)
En un experimento de MALDI IMS, la imagen molecular permite la visualización de la distribución espacial del analito de interés junto con cualquier especie desconocidos que pueden estar presentes en un intervalo de masa dada. Las imágenes moleculares de gangliósidos en este experimento se recubrieron utilizando el software ImageJ para mostrar la distribución anatómica de varias especies de gangliósidos en las regiones corticales y subcorticales del cerebro de rata (Figura 4A). Los gangliósidos más abundantes en el cerebro son las especies de la serie A y GD1a GM1 pero también contienen gangliósidos GM2 y GM3, que se pueden encontrar entre la1.000-2.000 m / z gama de masa, un rango de masa más alta que la mayoría de los lípidos cerebrales comunes, haciendo estos gangliósidos fáciles de identificar a lo largo del espectro (Figura 4B). La abundancia de cada especie iónica de gangliósidos se puede utilizar para semi-cuantificar las diferencias o cambios en las especies de gangliósidos dentro de la misma imagen. Debido a que una cierta cantidad de variabilidad en la preparación de muestras no se puede evitar en IMS, entre comparaciones de análisis se consideran semi-cuantitativa.
Figura 3. DAN sublimación. Los resultados representativos de la sublimación de la matriz DAN en el tejido cerebral de rata. (A) Al término de la sublimación, las dos mitades del aparato se separan y la corredera se retira del condensador. Matriz (B) DAN extiende de manera uniforme a través de múltiples secciones de tejido de cerebro de rata en la superficie de la corredera para permitir altamente reprresultados oducible (entre 100 a 150 g / cm²). (C) Los ejemplos de los experimentos fallidos de sublimación, donde muy poca matriz (izquierda - <90 g / cm²) (derecha o el exceso de matriz -> se depositan 150 g / cm²). Demasiado poco matriz dará lugar a insuficiente desorción de analitos, mientras que demasiado matriz no permitirá que el láser penetre hasta el tejido durante la adquisición, lo que resulta en la detección de iones de baja. (D) de diapositivas que contiene secciones de tejido de cerebro de rata sublimados con las normas de la matriz y de calibración daN está listo para su inserción en instrumento MALDI para la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. MALDI IMS de gangliósidos en el cerebro de rata. representative imagen molecular y espectro de masas de los gangliósidos en el cerebro de rata después de la sublimación con la matriz DAN MALDI IMS. La imagen molecular es un compuesto de múltiples especies de gangliósidos en el espectro superpuesto y pseudocoloreada utilizando el software Image J mostrar la única distribución anatómica de las especies de gangliósidos en todo el cerebro. Especies GM1d18: 1 (rojo, masa ~ 1.547 Da), GM1d20: 1 (verde, masa ~ 1.573 Da), GM3d18: 1 (azul, masa ~ 1.178 Da), y GM3d20: 1 (verde azulado, masa ~ 1.207 Da) son representado. El espectro de masas muestra la abundancia iónica de analitos dentro de un 1,000 - 2,000 rango de masas. Los principales gangliósidos de la serie A se etiquetan a lo largo del espectro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este trabajo detalla un protocolo estandarizado de la sublimación de la matriz en el tejido para la detección de lípidos cargados negativamente, tales como gangliósidos, en los experimentos de MALDI IMS. Preparación de muestras para MALDI IMS es muy variable y debe ser personalizado para adaptarse a las propiedades únicas de analito de interés. La aplicación de la matriz sobre la superficie de la muestra de tejido es un aspecto crucial del proceso de preparación de la muestra con respecto a la calidad de los resultados en IMS. En particular debe tener cuidado al seleccionar las matrices, asegurando que la matriz es compatible con el analito de interés y está libre de artefactos derivadas de la matriz en el espectro. La sublimación es una técnica de deposición de matriz seca que proporciona un alto grado de homogeneidad de cristal matriz con poco deslocalización de los lípidos en el tejido. matriz DAN, en particular, muestra un alto grado de sensibilidad para la desorción de un grupo de lípidos de membrana cargados negativamente, llamado gangliósidos, como se demuestra en el cerebro de ratasecciones, y es estable bajo vacío durante períodos prolongados de tiempo, lo que permite la compatibilidad con la mayoría de las aplicaciones de imagen. Matriz DAN tiene el beneficio adicional de tener también una alta afinidad por especies de lípidos cargados positivamente, lo que aumenta la versatilidad de esta matriz para aplicaciones de MALDI IMS 2. También hay que señalar que múltiples especies de lípidos, incluyendo fosfolípidos, pueden detectarse simultáneamente cuando se utiliza este protocolo IMS.
Un examen detallado de las propiedades de la matriz DAN en comparación con otros 9 matrices utilizadas comúnmente ha sido publicado previamente 2. En este artículo, los autores destacan el aumento de la sensibilidad de la matriz DAN en el modo de iones negativos en comparación con las otras matrices examinadas, así como la capacidad para obtener imágenes de alta resolución usando DAN. Se encontró que la matriz DAN tener el rendimiento general más alto de iones de polaridad negativa. Curiosamente, se realizó ecuacionesLLY bien para los iones de polaridad positiva. Otras matrices comunes que han demostrado una alta afinidad por los iones de polaridad negativa incluyen DHA, DHB, y 9-AA. La eficacia de DHA como matriz está limitado por su baja estabilidad al vacío que hace que sea poco práctico para la mayoría de aplicaciones de imagen 2. 9-AA tiene la ventaja de producir bajo ruido de fondo y el enriquecimiento de las señales demostrado sulfatide en el 750 - rango de masa 950 en el modo negativo en comparación con matriz DHB 13. Aunque DHB ha demostrado ser muy eficaz en el modo positivo, se produce la señal de iones de polaridad negativa menor en comparación con la matriz DAN 2. DAN matriz también demostró una mayor sensibilidad en el modo de iones negativos en el rango de masa inferior (650 - 950) en comparación con DHB 2. Además, se ha informado de que DHB puede formar grupos de matriz significativas en modo de ion negativo de hasta 750 Da 2.
et al. , En la que la matriz del suelo se pasa a través de un tamiz fino y se deposita sobre la superficie de la muestra. Los autores compararon este método seco de la deposición de matriz a una técnica de pulverización manual de matriz húmeda y encontraron que dieron la señal comparable para los fosfolípidos en la 450 - rango de masas 1.200 14. Un estudio utilizó tanto la sublimación y aplicación de recubrimiento seco con un tamiz para examinar la expresión de fosfolípidos, sin embargo, los autores no comentan cómo las dos técnicas comparados en términos de resolución de imagen o el rendimiento de señal de iones 15.
A fin de garantizar la más amplia gama posible de aplicabilidad, el protocolo presentado era un flujo de trabajo básico que permitirá a los nuevos y más especializados usuarios de MALDI IMS para lograr resultados altamente reproducibles para una amplia variedad de aplicaciones de formación de imágenes de lípidos. Sin embargo, los protocolos de sublimación pueden ser modificados para satisfacer la unique circunstancias del experimento. Por ejemplo, el depósito de cristales matriz fina proporcionada por sublimación permite la opción de invertir el orden de preparación de la muestra por portaobjetos pre-recubrimiento / placas con matriz antes de montar el tejido. La matriz puede ser sublimado sobre la superficie conductora de antemano y se almacena en un ambiente oscuro para su uso posterior reduce el tiempo de preparación de la muestra post-seccionar mientras que todavía mantiene una alta sensibilidad para la detección de lípidos 16, 17. Otra modificación que puede hacerse a este protocolo para mejorar la señal para la detección de los lípidos es un lavado de 2 minutos con formato de amonio 8.
Aunque la sublimación puede eludir muchos de los inconvenientes de la mayoría de las técnicas de deposición húmeda, tales como pequeño, más homogénea deposición de cristales de la matriz 1, la disminución de la deslocalización de los analitos, y de bajo costo en comparación con los pulverizadores automáticos, por loMe variabilidad en el proceso de preparación de la muestra es inevitable. En el caso de la sublimación, hay varios factores que pueden causar diferencias hora de un experimento a otro y pueden incluir los siguientes elementos que se han observado en nuestro laboratorio. No puede haber diferencias en la posición del aparato de sublimación en la arena. Cuando se ejecuta varios experimentos de sublimación de back-to-back, la arena en el baño de arena puede empezar a cambiar su posición que puede afectar a la dispersión de calor a través del baño de arena. Aplanando la arena antes de cada ronda de la sublimación también puede cambiar la dispersión del calor como la arena que ha sido desplazada puede tomar tiempo para volver a una temperatura uniforme. tiempo de sublimación puede tener que ser ajustada ligeramente entre cada ronda para compensar el cambio de arena en el baño de arena. Como alternativa, el uso de un baño de aceite puede conducir a la dispersión del calor más homogénea.
En segundo lugar, la cantidad de matriz en la parte inferior de la sublimador puede variar. DAN matrix tiene un aspecto gris clumpy y tiene una tendencia a formar grandes grupos. Estos grupos se pueden romper manualmente y dispuestos en la parte inferior del sublimador pero no pueden ser eliminados completamente. Grandes grupos de la matriz se necesitará más tiempo para calentar y sublimar que las piezas pequeñas que pueden afectar el producto final de la sublimación.
La salida de vacío en el aparato de sublimación es otro factor crítico. La mayoría de sublimadores se hacen con una sola salida de vacío en la que la tubería está unida a conectarlo a la bomba de vacío durante la sublimación. Debido a que la presión está siendo regulado en ese lado del aparato, puede haber un ligero desnivel de la deposición de la matriz, siendo depositado más en el lado con la salida de vacío. Esto puede compensarse algo para desplazando ya sea la posición del aparato en la arena, la posición de la matriz en la parte inferior de la sublimador, o cambiando la posición de la corredera / placa en el condensador. estos hechoORS son los principales inconvenientes de la técnica de sublimación y por esta razón es crucial para ejecutar un portaobjetos de prueba a través del proceso de sublimación antes de ejecutar la muestra experimental para que el tiempo se puede ajustar para compensar estas variables.
Otro inconveniente informado de sublimación es que la detección de analitos de mayor masa está limitada por la extracción de analito insuficiente y / o por mezcla con matriz. Una etapa de rehidratación después de la sublimación puede ayudar a tirar a cabo estos analitos de mayor masa para eludir este problema. Esto se logra típicamente usando una cámara de humedad 18. Sin embargo, en este protocolo, se añade una etapa de congelación después de la sublimación, que cumpla la misma finalidad. La congelación y posterior descongelación (en un desecador) de las muestras antes de la inserción en el instrumento MALDI provoca condensación de humedad en la superficie de la muestra que rehidrata temporalmente la muestra para permitir la extracción de lípidos de mayor masa, preservando el tiN ú mero de análisis 12, 17.
En general, la sublimación es un método altamente sensible eficaz y el coste de la aplicación de la matriz para la detección de lípidos en experimentos MALDI IMS. De hecho, nuestro grupo ha notado mejoras significativas en los resultados de IMS cuando cambiamos el uso de un método de pulverización de aire-3 a un método de sublimación 4 para la deposición de matriz. El presente protocolo es apropiado para un número de aplicaciones de imagen de lípidos, pero puede ser modificado para adaptarse a las necesidades del experimentador.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10x10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1 mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
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