Summary
ここでは、 in vivoでの分子内および分子間のRNA-RNA相互作用のゲノムワイドなマッピングを可能にする、 P soralen架橋、 L鎖およびS選択H鎖のS equencingの方法を詳述します（SPLASH）。 SPLASHは、酵母、細菌およびヒトを含む生物のRNA相互作用を研究するために適用することができる。
Abstract
RNAがどのように相互作用するかを知ることは、細胞内のRNAベースの遺伝子調節を理解する上で重要です。マイクロRNA-mRNA相互作用のようなRNA-RNA相互作用の例は、遺伝子発現を調節することが示されているが、細胞内でRNA相互作用が起こる全範囲は未だ不明である。 RNA相互作用を研究する以前の方法は、主として、特定のタンパク質またはRNA種と相互作用するRNAのサブセットに焦点を当てていた。ここでは、 in vivoでのRNA相互作用のゲノムワイドな捕獲を可能にする、 P soralen架橋、 L鎖、およびS選択H鎖のS equencingと呼ばれる方法を詳述します（SPLASH）。 SPLASHは、インビボでの架橋、近接ライゲーション、ハイスループットシーケンシングを利用して、分子内および分子間のRNA塩基対形成パートナーを世界的に同定します。 SPLASHは、細菌、酵母およびヒト細胞を含む様々な生物に適用することができ、同様に多様な細胞の状況下でのRNA構成のダイナミクスの理解を促進するための多様な細胞条件を提供する。実験的SPLASHプロトコル全体は完了までに約5日間かかり、計算ワークフローは完了するまでに約7日間かかります。
Introduction
巨大分子が互いにどのように折り重なり相互作用するかを研究することは、細胞内の遺伝子調節を理解するための鍵である。 DNAおよびタンパク質がどのようにして遺伝子調節に寄与するかを理解することに多くの努力が集中してきたが、遺伝子発現の転写後調節については比較的少ない。 RNAは、その直鎖配列およびその二次および三次構造の両方で情報を運ぶ。 インビボでのその機能にとって、それ自体および他のものと塩基対形成するその能力は重要である。ハイスループットRNAの二次構造のプロービングにおける最近の進歩は、トランスクリプトーム2,3,4,5,6,7,8、howeにおける二本鎖および一本鎖領域の位置についての貴重な洞察を提供しているペアリング対話パートナーに関するver情報はまだほとんど失われています。どのRNA配列がトランスクリプトーム内の別のRNA領域と相互作用しているかを決定するために、我々は全体的なペアワイズ情報を必要とする。
グローバルで偏りのない方法でペアワイズRNA相互作用をマッピングすることは、伝統的に大きな課題でした。これらの技術は、CLASH9、hiCLIP10およびRAP11のような従来のアプローチが大規模な方法でRNA相互作用を同定するために使用されるが、典型的には、特定のタンパク質またはRNA種と相互作用するRNAのサブセットについてRNA塩基対をマッピングする。包括的なRNA相互作用を研究する最近の進展には、 インビボで RNA相互作用を安定化させず、したがってインビボ相互作用のサブセットのみを捕捉する方法RPL12が含まれる。これらの課題を克服するために、我々と他の研究者は、p RNAインターロイムをインビボで使用することにより、架橋ソラレン13,14,15の修飾バージョンを使用した。このプロトコールでは、 インビボで塩基対形成RNAを架橋するためにビオチン化ソラレンを使用し、続いて近接ライゲーションおよびハイスループット配列決定を行うP soralen架橋、ライゲート、およびS選択HYBRIDES（SLH）のS equencingを行うための詳細を記載する。ゲノムワイドのRNA塩基対形成パートナーを同定する（ 図1 ） 15 。
この原稿では、我々は培養接着細胞、この場合はHeLa細胞を使用してSPLASHを実行するための手順を説明します。同じプロトコールは、懸濁哺乳動物細胞および酵母および細菌細胞に容易に適合させることができる。簡単に述べると、HeLa細胞をビオチン化ソラレンで処理し、インビボで相互作用するRNA塩基対を架橋するために365nmで照射する。次いでRNAを細胞から抽出し、断片化し、ストレプトアビジンビーズを用いて架橋領域を豊富にする。次いで、相互作用するRNA断片を近接ライゲーションを用いて一緒にライゲーションし、深い配列決定のためのcDNAライブラリーに作製する。配列決定の際に、キメラRNAをトランスクリプトーム/ゲノムにマッピングして、互いに対形成するRNA相互作用領域を同定する。我々は、snoRNAs、lncRNAsおよびmRNAなどのRNAの多様なクラスにおける分子内および分子間RNA塩基対形成、構造の組織化および相互作用パターンを俯瞰するなど、酵母および異なるヒト細胞におけるインビボでの何千ものRNA相互作用を同定するためにSPLASHを首尾よく利用した細胞内のRNAの量。
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Protocol
ビオチン化ソラレンによるHeLa細胞の処理およびRNA抽出
- 10cmプレート中の10％ウシ胎仔血清（FBS）および1％ペニシリンストレプトマイシン（PS）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中の培養HeLa細胞。
- HeLa細胞を5mLの1×PBSで2回洗浄する。ディッシュを垂直に1分間置くことにより、ディッシュから過剰のPBSを完全に排出する。
- 200μMのビオチン化ソラレンと0.01％w / vジギトニンを含む1 mLのPBSを細胞に均一に加え、37°Cで5分間インキュベートする。ビオチン化ソラレンは細胞に入ることができるが、その透過性は、細胞をジギトニン（0.01％）の少量に5分間曝露した場合にはるかに高い
- 処理されたHeLa細胞を含む10cmプレートの蓋を取り外し、皿の上に皿を置きます。 UV架橋剤を使用して、UVバルブから3cmの距離で、氷上で365nm UVで20分間細胞を含むディッシュを照射する。
- アイソレートtチオ酢酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルム抽出によるHeLa細胞からのotal RNAの精製。 1：1容量のイソプロパノールを添加して室温で30分間RNAを沈殿させる。
停止点：イソプロパノール中で無限に-20℃でRNAを保存できます。ビオチン化ソラレンが細胞にうまく入って、 in vivoで RNA を架橋していることを確認するために、このステップでドットブロットを行うことができます（ 図2 ）。 - 沈殿したRNAを4℃で30分間20000×gで遠心分離してRNAを回収する。上清を取り除き、1mLの70％冷エタノールをRNAペレットに加えてRNAを洗浄する。
- 4℃で15分間20,000 xgでサンプルを遠心分離する。上清を除去し、ペレットを室温で5分間風乾します。
- ヌクレアーゼフリーの水をRNAペレットに加え、UV分光光度計を使用してRNAの濃度を定量する。
ポーズポイント：RNAはf後に-80℃で保存することができます液体窒素中で凍結する。
RNA断片化
- 2mLのRNA断片化バッファー15μLとRNAサンプル（1μg/μL）10μLを、0.2mLのPCRチューブに個別に95℃で1分間予熱する。加熱した2×RNA断片化バッファー10μLを10μLのRNAサンプルと上下にピペッティングすることにより混合する。サンプルを95℃で5分間インキュベートする。反応物を氷上で急冷することによって反応を停止する。
- 2つの断片化反応を1.5mLの微量遠心管に移してプールする。反応に40μLのヌクレアーゼフリー水、10μLの3M酢酸ナトリウム、1μLのグリコーゲン、および300μLの100％エタノールをフラグメンテーション反応に添加する。 -20℃で少なくとも1時間RNAをインキュベートしてRNAを沈殿させます。
- 沈殿したRNAを20,000 xgで30分間遠心分離し、上清を除去し、1mLの70％エタノールを用いてRNAを洗浄する。
- 20,000 xgで15分間RNAを遠心分離し、rem上清を除去し、20μLのヌクレアーゼフリー水にRNAを溶解する。
RNAサイズの選択と溶出
- 20μLのRNAローディング色素を微量遠心管内の回収RNAに加えます。 RNAローディング色素を用いて95℃で3分間RNAを加熱し、2分間氷上に置く。
- 微量遠心管内の0.25μlの10 nt DNAラダーにRNAローディング色素3μLを加えます。はしごを95℃で3分間加熱し、氷上に2分間置いてください。
- 変性ラダーおよびサンプルを、8.6cm×6.8cmの6％TBE尿素ゲルにロードし、180Vで40分間電気泳動することによりサイズ分画する。ゲルを、1：10,000の核酸ゲル染色液を含有する10mLのTBE緩衝液暗闇の中で、分。
- 24Gの針を使用して、底にきれいな0.6mLの微量遠心管を突き刺し、2mLの微量遠心チューブに入れます。
- トランスイルミネーターを用いてポスト染色されたゲル上のバンドを視覚化し、90-110 nt。ゲルスライスを、2mLの微量遠心チューブの穴あき0.6mLの微量遠心管に移す。このサイズ選択は、キメラ断片がトランスクリプトームにマッピングするための最小の長さを有し、下流のサイズ選択工程において近接連結産物対非連結産物を区別することができるように行われる。
- ゲルスライスを室温で12,000 xgで2分間遠心分離し、ゲルスライスを細断し、2 mLの微量遠心チューブに回収する。空の0.6mL微量遠心管を捨てる。溶出バッファー700μLを2mL微量遠心チューブの細断したゲルスライスに加え、バッファーにサンプルを拡散させるために、一定回転下で4℃で一晩インキュベートする。
- ゲルスライスと溶出バッファーを遠心チューブフィルターに移し、20,000 xgで2分間遠心します。ゲルスライスは、フィルターの上部コンパートメントに閉じ込められます。ゲルスライスと上部の区画を捨てる。
- 1μLのグリコーゲンおよび7μLのグリコーゲンを添加する。100μlの100％イソプロパノールを微量遠心チューブの濾液に加え、RNAを-20℃で少なくとも1時間または一晩沈殿させます。
停止点：-20℃で無期限にイソプロパノールにRNAを沈殿させることができます。 - 沈殿したRNAを4℃で30分間20000×gで遠心分離してRNAを回収する。上清を除去し、1mLの70％冷エタノールを加えてRNAペレットを洗浄する。洗浄したペレットを20,000 xgで15分間4℃で遠心分離する。
- 洗浄バッファーを取り除き、20μLのヌクレアーゼフリー水を加えてRNAを再懸濁する。 UV分光計を用いてRNAの濃度を定量する。
一時停止点：RNAは、液体窒素中で急速凍結後に-80℃で保存することができます。
RNA架橋領域の濃縮
- ボルテックスストレプトアビジン被覆磁気ビーズを激しく溶かしてビーズをチューブ内に均一に再懸濁する。 100μLのビーズを1.5mLの微量遠心チューブに移し、磁石上に置きますビーズをチューブの磁気面に付着させるために1分間静置する。ビーズからストレージバッファーを注意深く取り出し、チューブをマグネットスタンドから取り出します。
- マイクロチューブのビーズに1 mLのLysis Bufferを加え、ピペットで上下にピペットをかけます。ビーズを含有する微量遠心機を磁気スタンド上に1分間置いて、ビーズを洗浄緩衝液から分離する。これを3回繰り返す。
- 磁気スタンド上にビーズを含む微量遠心機を1分間置くことにより、ビーズから洗浄緩衝液を除去する。溶解緩衝液にRNase阻害剤（1：200）を添加し、微量遠心管内の洗浄ビーズに100μLの溶解緩衝液を加える。
- 新たに調製したハイブリダイゼーション緩衝液2mL、補充溶解緩衝液1mL、サイズ分画RNA1.5μgおよび再懸濁したビーズ100μLを15mLコニカル遠心チューブに加えます。チューブを静かにボルテックスします。
- 37℃で30分間、15mLコニカル遠心チューブをインキュベートし、回転を終了する。37℃で洗浄バッファーを予熱してください。
- 緩衝液からビーズを分離するために15mLのチューブ用の磁気スタンド上に15mLの円錐遠心分離チューブを2分間置く。緩衝液をチューブから注意深くピペットで取り出し、捨てる。
- あらかじめ加温した洗浄バッファー1 mLをビーズに加え、ピペットで上下に動かし、ビーズを1.5 mLの微量遠心チューブに移す。ビーズを37℃で5分間インキュベートし、回転を終了させます。
- 簡単に微量遠心管の内容物を遠心分離する。ビーズを洗浄バッファーから分離するために、1.5mLの洗浄済みビーズを2mLチューブ用磁気スタンド上の微量遠心管に1分間入れる。緩衝液を微量遠心管から静かにピペッティングすることにより、ビーズから緩衝液を除去する。
- あらかじめ加温した洗浄バッファー1 mLをビーズに加え、ピペットを上下に動かして洗浄を繰り返します。合計5回の洗浄を行います。 5 回目の洗浄の終わりに、ビーズを含む微量遠心管を1分。
5.近接性ライゲーション
- 洗浄したビーズに冷T4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）バッファー1 mLを加え、4℃で5分間ビーズをインキュベートする。ビーズを含む微量遠心管を磁気ストリップ上に1分間置き、静かにT4 PNK緩衝液を除去する。この手順を合計2回繰り返し、最後の洗浄後にT4 PNKバッファーを除去する。
- 表1に従ってビーズにバッファーを添加する。下の3 'アダプターにRNA断片の3'末端を連結させるには、バッファー中でビーズを37℃で4時間インキュベートし、RNAの末端の3 '環状リン酸基を3'OH。
- 表2に従って、前の反応にバッファーを添加する。 RNAフラグメントの5 '末端をライゲーションコンピテントにするために、ATPの存在下で絶え間なく攪拌しながら37℃で1時間インキュベートしますRNA上の5'OHを5 'リン酸に変換する。
- 表3に従って、近接反応を実施するために前の反応にバッファーを添加する。 16℃で16時間、一定の撹拌下で反応物をインキュベートし、
- 連結したRNAを含む微量遠心機を磁石スタンド上に1分間置く。上清を注意深く取り除き、1mLの室温洗浄バッファーをビーズに加えます。ピペット操作でResuspendします。
- マイクロチューブをマグネットスタンドに1分間置き、洗浄バッファーを注意深く取り除きます。合計2回の洗浄を行い、2回目の洗浄終了時にビーズから洗浄バッファーを除去します。
- 100μLのRNA PK Bufferをビーズに加え、上下にピペッティングすることにより再懸濁する。ヒートブロック上でサンプルを95℃で10分間加熱する。
- サンプルを氷上で1分間冷却し、チオシアン酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルム500μLをサンプルに添加する。 10秒間激しくボルテックスして混合する。混合物をインキュベートする室温で10分間放置する。
ポーズポイント：RNAはチオシアン酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルムに-80℃で2〜3ヶ月間保存できます。 - 100μLのクロロホルムをチオシアン酸グアニジニウム - フェノール - クロロホルム抽出試料に添加する。激しく10秒間ボルテックスします。 4℃で15分間20,000 xgでサンプルを遠心分離する。
- 水層400μLを新しい1.5mL微量遠心管に移す。 800μL（2倍量）の100％エタノールを添加し、上下にピペッティングすることにより混合する。
- RNA溶液をRNAクリーンアップカラムに移し、小さなRNAが残っていても製造者の指示に従ってRNAを回収する。 100μLのヌクレアーゼフリー水でRNAを溶出する。
一時停止点：RNAは、液体窒素中で急速凍結後に-80℃で保存することができます。
6.ビオチン化ソラレンの逆架橋
- 100μLの溶出したサンプルを24ウェルplのウェルに移す食べた。カバーを取り外し、氷上で5分間UV 254nm下でサンプルを照射する。
- 逆架橋したサンプルを清潔なマイクロチューブに移す。 10μLの酢酸ナトリウム、1μLのグリコーゲン、および300μLの100％エタノールを添加し、RNAを-20℃で少なくとも1時間または一晩沈殿させる。
停止点：-20℃で無期限にエタノール中でRNAを沈殿させることができます。 - 沈殿したRNAを4℃で30分間20000×gで遠心分離してRNAを回収する。上清を除去し、1mLの70％冷エタノールを加えてRNAペレットを洗浄する。
- 洗浄したペレットを20,000 xgで15分間4℃で遠心分離する。洗浄緩衝液を除去し、RNAを再懸濁するためにヌクレアーゼフリー水4.25μLを加える。 RNAを0.2 mL PCRチューブに移す。
一時停止点：RNAは、液体窒素中で急速凍結後に-80℃で保存することができます。
逆転写およびcDNA環状化
- 0.75μLを加えるRNAリンカー（0.5μg/μL）をPCRチューブに再懸濁したサンプルに加え、80℃で90秒間加熱します。サンプルを氷上に2分間置く。
- 表4に従って、3 'アダプターライゲーションのための変性サンプルにバッファーを添加する。反応液を25℃で2.5時間インキュベートする。
- 反応液を1.5mLの微量遠心管に移す。反応液に90μLのヌクレアーゼフリー水を添加し、続いて10μLの酢酸ナトリウム、1μLのグリコーゲンおよび300μLの100％エタノールを加える。 -20℃で少なくとも1時間または一晩RNAを沈殿させる。
停止点：-20℃で無期限にエタノール中でRNAを沈殿させることができます。 - 沈殿したRNAを4℃で30分間20000×gで遠心分離してRNAを回収する。上清を除去し、1mLの70％冷エタノールを加えてRNAペレットを洗浄する。
- 洗浄したペレットを20,000gで15分間4℃で遠心分離する。洗浄緩衝液を除去して、ヌクレアーゼフリーの5μL中のペレットを再懸濁する。ater。
- 5μLのRNAローディング色素を微量遠心管内の回収RNAに加えます。 RNAローディング色素を用いて95℃で3分間RNAを加熱し、2分間氷上に置く。
- 微量遠心管内の0.25μlの10 nt DNAラダーにRNAローディング色素3μLを加えます。はしごを95℃で3分間加熱し、氷上に2分間置いてください。
- ステップ3.3および3.4のように、8.6cm×6.8cm 6％TBE尿素ゲルを用いてサイズ分画を実施する。
- トランスイルミネーターを使用して核酸染色で染色したゲルを視覚化し、ラダー上の110-140ntに対応するゲルスライスを切断する。ゲルスライスを2mLの微量遠心チューブの穴あき0.6mLの微量遠心管に移し、手順3.6〜3.9のプロトコールに従います。
- 5μLのヌクレアーゼフリー水を加えてRNAペレットを再懸濁する。 RNAを0.2 mL PCRチューブに移す。
一時停止点：RNAは、液体窒素中で急速凍結後に-80℃で保存することができます。 - 1.25μLのRTプライマーを添加する。81; MをPCRチューブ中のRNAに加え、80℃で2分間加熱する。サンプルを氷上に2分間置く。
- 逆転写のための緩衝液を表5に従って添加する。反応液を50℃で30分間インキュベートする。
- 1.1 Nの1 N NaOHを反応物に添加し、98℃で20分間加熱する。反応物を氷上に置く。
- 反応液を1.5mLの微量遠心管に移す。反応液に90μLのヌクレアーゼフリー水を添加し、続いて10μLの酢酸ナトリウム、1μLのグリコーゲンおよび300μLの100％エタノールを加える。 -20℃で少なくとも1時間または一晩、DNAを沈殿させる。
停止点：-20℃でエタノールを無期限に沈殿させることができます。 - 沈殿したDNAを20000 gで30分間4℃で遠心分離してDNAを回収する。上清を除去し、1mLの70％冷エタノールを加えてDNAペレットを洗浄する。洗浄したペレットを20,000 xgで15分間4℃で遠心分離する。ペーストを再懸濁する洗浄バッファーを取り除く5μLのヌクレアーゼフリー水を入れます。
- ステップ3.3および3.4のように、8.6cm×6.8cm 6％TBE尿素ゲルを用いてサイズ分画を実施する。
- トランスイルミネーターを使用してポスト染色されたゲルを視覚化し、ラダー上の200〜240ntに対応するゲルスライスを切断する。逆転写されたcDNAは、96塩基のRTプライマーの添加のために、RNAフラグメントよりも96塩基長い。ゲルスライスを、2mLの微量遠心チューブの穴あき0.6mLの微量遠心管に移す。
- ゲルスライスを室温で12,000 xgで2分間遠心分離し、ゲルスライスを細断し、2 mLの微量遠心チューブに回収する。空の0.6mL微量遠心管を捨てる。
- 溶出バッファー700μLを2mL微量遠心チューブの細断したゲルスライスに加え、37℃で2時間一定回転させてインキュベートする。手順3.7〜3.8に記載されている手順に従ってください。
- 6μLのヌクレアーゼフリー水を加えてDNAペレットを再懸濁する。 DNAを0.2 mLのPCRチューブに移す。
- 表6に従って、cDNA環状化のための反応物に緩衝液を添加する。反応液を60℃で1時間インキュベートし、80℃で10分間加熱して反応を不活性化する。
- 反応液を1.5mLの微量遠心管に移す。製造元の指示に従ってDNAクリーンアップカラムを用いて環状化cDNAを精製する。 20μLのヌクレアーゼフリー水をカラムに加えて、精製したcDNAを溶出させます。
一時停止点：DNAは-20℃で2〜3ヶ月間保存することができます。
8. PCR増幅（小規模PCR）
- ライブラリー増幅に必要な最小限のサイクル数を試験するために、PCR増幅のために表7に従って反応物にバッファーを添加する。
- 表8に従ってPCRサイクル条件を設定する。反応を一時停止し、5μLのPCR反応を10,15および20サイクルで別々の1.5mL微量遠心チューブに移した。
- 異なるサイクルで5μLのPCR反応の各々に1μLの6×DNAゲルローディング色素を加える。 3％アガロースゲル（120V、1時間）でゲル電気泳動を行い、PCR産物を可視化します。
- 約250塩基での増幅を示す最も低いPCRサイクル数（Y）を使用する（ 図3では、10サイクルで増幅の15サイクルおよび弱いバンドで強いバンドが存在する）。大規模PCR増幅の12サイクルは、使用されるcDNAの量が小規模PCR増幅の10倍であるので、深い配列決定のための十分な物質を生成する）。
9. PCR増幅（大規模PCR）および精製
- 大規模PCRのためのPCR増幅のために表9に従って反応物に緩衝液を添加する。
- PCRサイクリング条件は、表10 。
- 5μLの6×DNAゲルローディング色素を25μLのPCR反応に加え、3％アガロースゲルのウェルにロードする。別のウェルに1 kb + DNAラダーをロードする。 1.5時間、100Vでゲル電気泳動を行う。
- 完成したゲルをUV Transilluminatorで可視化します。
- サイズは、200〜300塩基からのPCR産物を含むゲルスライスを抽出し、ゲルを清潔な2mL微量遠心管に移す。
- DNAゲル抽出キットから1mLのゲル溶解性バッファーをゲルスライスに加え、室温で30分間インキュベートするか、またはゲルが溶解するまで一定の攪拌をしてインキュベートする。
- 溶解したゲルに200μLのイソプロパノールを加え、ピペットでよく混合します。サンプル700μLをDNAゲル抽出クリーンアップカラムに移し、13,000 xgで30秒間遠心します。すべてのサンプルがカラムにロードされるまで、溶解したサンプルをカラムに移し続けます。
- 500μLのゲル溶解性緩衝液を加え、続いて700μLのカラム洗浄緩衝液を製造業者のプロトコールに従ってカラムに添加した。ヌクレアーゼを含まない水12μLをカラムの中心に加えてDNAを溶出する。ポーズポイント：DNAは-20℃で保存できます。
- 蛍光定量を用いてDNAの濃度を定量する。複数のライブラリーが構築され、シーケンシングのために一緒にプールされている場合は、ハイスループットシーケンシングのためにプールに各サンプルの同量を加えます。
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Representative Results
図1に、SPLASHワークフローの図を示します。 0.01％ジギトニンの存在下でビオチン化ソラレンを添加し、UV架橋すると、全RNAが細胞から抽出され、RNAにビオチン化された架橋が効率的に起こったことを確実にするためにドットブロットが行われる（ 図2 ）。本発明者らは、細胞に添加するビオチン化ソラレンの量を滴定するための陽性対照としてビオチン化20塩基オリゴを使用し、150塩基ごとに約1個が架橋されるようにする。
より多くのPCR複製事象がPCR増幅サイクルの増加に伴って生じる傾向があるので、我々は、深刻な配列決定に十分な物質を提供する増幅サイクルの最低数を決定するために、異なるPCRサイクルを用いて小規模PCR増幅を行う。効率的な図書館の準備プロセスでは、15サイクル未満のPCR増幅で1.5μgの選択されたRNA入力からcDNAシークエンシングライブラリーを増幅することができます（ 図3 ）。ハイスループットシーケンシングマシンで2x150塩基対読み取りを用いてライブラリーをシーケンシングし、シーケンシングリードを図4の計算パイプラインに従って処理します。最終結果は、トランスクリプトーム内の分子内および分子間RNA-RNA相互作用の両方を含む、ろ過されたキメラ相互作用のリストである（ 表11 ）。
図1 ：SPLASH 15の実験ワークフローの概要。 365nmのUV光下でビオチン化ソラレンを使用して、細胞内のペアワイズRNA相互作用を架橋する。架橋されたRNAはth抽出され、約100塩基に断片化される。ビオチン化ソラレン架橋を含有する相互作用領域は、ストレプトアビジンビーズへの結合によって富化され、一緒に結紮される。 265nmでのUV光下での逆架橋の際に、キメラRNAを深い配列決定のためにcDNAライブラリーにクローン化する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：ドットブロッティングによるビオチン化架橋効率の試験15 。 1％ジギトニンの存在下でのビオチン化ソラレン架橋RNA のインビボでのドットブロット。種々の濃度の架橋RNA（20〜2,000ng）が膜上にスポットされる。異なる濃度のビオチン化20塩基オリゴを陽性対照として検出する。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3： SPLASHの小規模ライブラリ増幅。 RT反応からの1μLのcDNAを小規模PCRに使用する。反応を10,15および20サイクルで取り出し、3％アガロースゲル上で実行して、ライブラリー生成に必要な最小増幅サイクル数を決定する。この特定の例において、大規模PCR反応において10μLのcDNAを使用する10サイクルの増幅は、深い配列決定のための十分なアンプリコンを生成するであろう。
| 試薬 | 容量（μL） | 最後の |
| ヌクレアーゼフリー水 | 64 | |
| 10×T4 PNK緩衝液 | 8 | 1倍 |
| Rnase阻害剤（20U /μL） | 4 | 1U /μL |
| T4 PNK（10U /μL） | 4 | 0.5U /μL |
| 合計 | 80 |
表1：3 '末端修復のための試薬。
| 試薬 | 容量（μL） | 最後の |
| PNK反応 | 80 | |
| ヌクレアーゼフリー水 | 3 | |
| 10×T4 PNK緩衝液 | 2 | 1倍 |
| 10mM ATP | 10 | 1mM |
| T4 PNK（10U /μL） | 5 | 0.5U /μL |
| 合計 | 100 |
表2：5 '末端修復のための試薬。
| 試薬 | 容量（μL） | 最後の |
| PNK反応 | 100 | |
| 10×T4 RNAリガーゼ緩衝液 | 6 | 1倍 |
| 10mM ATP | 6 | 1mM |
| Rnase阻害剤（20U /μL） | 4 | 0.5U /μL |
| T4 Rnl1（10U /μL） | 40 | 2.5U /μL |
| ヌクレアーゼフリー水 | 4 | |
| 合計 | 160 |
表3：近接ライゲーションのための試薬。
| 成分 | 1反応あたりの量（μL） | 最後の |
| RNAおよびリンカー | 5 | |
| T4 Rn12緩衝液（10x） | 1 | 1倍 |
| PEG8000（50％、wt / vol） | 3 | 15％（wt / vol） |
| Rnase阻害剤（20U /μL） | 0.5 | 1U /μL |
| T4 Rn12（tr）（200U /μL） | 0.5 | 10U /μ; L |
| 合計 | 10 |
表4：アダプターライゲーションのための試薬。
| 成分 | 1反応あたりの量（μL） | 最後の |
| ライゲーションおよびプライマー | 6 | |
| ファーストストランド緩衝液（5x） | 2 | 1倍 |
| dNTP（10mM） | 0.5 | 0.5mM |
| DTT（0.1M） | 0.5 | 5mM |
| Rnase阻害剤（20U /μL） | 0.5 | 1U /μL |
| 逆転写酵素（200U /μL） | 0.5 | 10U /μL |
| 合計 | 10 |
表5：逆転写のための試薬。
| 成分 | 1反応あたりの量（μL） | 最後の |
| 第一鎖cDNA | 6 | |
| 一本鎖DNAリガーゼ緩衝液（10倍） | 1 | 1倍 |
| ベタイン（5M） | 2 | 1 M |
| MnCl 2 （50mM） | 0.5 | 2.5mM |
| 一本鎖DNAリガーゼ（100U /μL） | 0.5 | 5U /μL |
| 合計 | 10 |
表6：cDNAの環状化のための試薬。
| 成分 | 1反応あたりの量（μL） | 最後の |
| 連結DNA産物 | 1 | |
| ヌクレアーゼフリー水 | 10.5 | |
| 高忠実度DNAポリメラーゼ2xマスターミックス | 12.5 | 1倍 |
| ユニバーサルPCRプライマー（10μM） | 0.5 | 0.02μM |
| インデックス（X）プライマー（10μM） | 0.5 | 0.02μM |
| 合計 | 25 |
表7：小規模PCRに使用される試薬。
| ステップ | 温度 | 時間 | サイクル |
| 初期変性 | 98℃ | 30秒 | 1 |
| 変性 | 98℃ | 10秒 | |
| アニーリング | 65℃ | 30秒 | 25 |
| 拡張 | 72℃ | 30秒 | |
| ファイナルエクステンション | 72℃ | 5分 | |
| ホールド | 4℃ | ∞ |
表8：小規模PCRに使用される条件。
| 成分 | 1反応あたりの量（μL） | 最後の |
| 連結DNA産物 | 5 | |
| ヌクレアーゼフリー水 | 6.5 | |
| 高忠実度DNAポリメラーゼ2xマスターミックス | 12.5 | 1倍 |
| ユニバーサルPCRプライマー（10μM） | 0.5 | 0.02μM |
| インデックス（X）プライマー（10μM） | 0.5 | 0.02μM |
| 合計 | 25 |
表9：大規模PCRに使用される試薬。
| ステップ | 温度 | 時間 | サイクル |
| 初期変性 | 98℃ | 30秒 | 1 |
| 変性 | 98℃ | 10秒 | |
| アニーリング | 65℃ | 30秒 | Y |
| 拡張 | 72℃ | 30秒 | |
| ファイナルエクステンション | 72℃ | 5分 | |
| ホールド | 4℃ | ∞ |
表10：大規模PCRに使用される条件。
表11：計算パイプラインの解析出力。 "SAMフラグスプリットリード1" = 0は、リードがトランスクリプトームの正のストランドにマッピングされていることを示します。 「RNA 1同一性」は、キメラの左側のRNAの同一性を指す。 「RNA1開始位置」とは、読み取りがRNA1に沿ってマッピングされる開始位置をいう。「RNA1末端位置」は、読み取りがRNA1に沿ってマッピングされる最終位置を指す。「マッピングスコアスプリットリード1」は、 RNA 1にマッピングされた読み取りのマッピングスコアに「シガースプリットリード1」読み取り「S」からクリッピングされた塩基の数および読み取り「M」にマッピングされた塩基の数を示す。 「スプリットリード1」はRNA1にマッピングされた配列を示す。キメラの右側には同じ命名法が用いられ、RNA2と命名された。 この表のより大きなバージョンを見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、我々は、ゲノムワイドの方法でペアワイズRNA相互作用を同定することを可能にする方法であるSPLASHの実験的および計算的ワークフローを詳細に記述する。我々は、細菌、酵母およびヒトの培養物においてSPLASHを首尾よく利用し、この戦略が異なる細胞状態下の多様な生物に広く適用され得ることを予測する。プロトコールの重要なステップの1つは、下流のプロセスに適した材料を得るために少なくとも20μgの架橋RNAで開始することです。次いで、RNAを100塩基に断片化し、PAGEサイズ選択する。これらの工程は、ライブラリー生成プロセス中のモノマーではなく、連結キメラを優先的に濃縮するために重要である。我々は、典型的には、断片化および最初のサイズ選択の後に、約1.5μgのRNAを回収し、次いでSPLASHワークフローに従ってRNAをcDNAライブラリーに変換する。我々は、RNAのこの量は、我々がh15サイクル未満のPCR増幅を用いたハイスループット配列決定。 PCRサイクルの増加に伴ってPCR複製事象の数が劇的に増加するにつれて、増幅サイクル数を低く保つことは、下流分析において有用でユニークなキメラを抽出することが不可欠である。
他のゲノム規模のソラレンベースの戦略とは対照的に、SPLASHは、ソラレンのビオチン化バージョンを利用して、塩基対のRNA断片を互いに架橋させる。我々は架橋の量を150塩基あたりおよそ1つの架橋に滴定するので、RNA断片化後にストレプトアビジンビーズを使用することにより、架橋RNA領域を濃縮することができる。さらに、RNAがビーズに結合している間に酵素反応を行うことにより、緩衝液の交換および洗浄を便利に行うことができた。しかし、ストラテジーの限界の1つは、ビオチン化ソラレンが、ソラレンまたは4'-アミノメチルトリoxsalen（AMT）。したがって、ビオチン化ソラレンが細胞に入り、RNAを効率的に架橋させることが重要である。私たちは、架橋し抽出したRNAにドットブロットを陽性対照としてビオチン化オリゴと一緒に行い、RNAが正しく架橋されるようにします。架橋が弱い場合、低濃度のジギトニン（0.01％まで）を5分間添加するなど、細胞膜を透過させる戦略を使用して、ビオチン化ソラレンが細胞に効率的に入ることを可能にすることができる。ソラレンは核酸（UV 260nm）と同じ波長で吸収するので、架橋RNAの定量のためにUV吸収ではなく蛍光定量システムを使用します。
ソラレンベースの架橋戦略の1つの制限は、ソラレンがウリジン（U）で優先的に架橋することである。このように、U貧弱な塩基対形成領域は、架橋中に見逃される可能性がある。したがって、架橋事象b2つの鎖の間には、相互作用が起こっているという証拠が示され、架橋の欠如は相互作用の欠如と同等ではない。我々のSPLASHプロトコールでは、マイクロRNA-mRNA相互作用をほとんど捕捉せず、低量のlncRNA相互作用を捕捉する。マイクロRNAに結合したmRNAは遺伝子発現においてダウンレギュレートされる可能性が高く、mRNAは一般に低発現しているので、我々のデータにおけるそれらの表現の不十分は、主に不十分な配列決定深度によるものである。我々は、典型的には、各複製物について、ヒトトランスクリプトームライブラリー当たり少なくとも2億対の末端読み取りを配列決定する。この深さでは、ほとんどのシークエンシングリードはかなり豊富なRNAに分類されます。我々は、特定の集団のRNAに対する濃縮戦略の使用が、これらの比較的少ない豊富なRNAのシグナルを大きく増強すると予想している。キメラデータの解析において観察されたもう1つの課題は、スプライシングから生成されたキメラ対キメラ事象の真の相互作用を区別することである。汚染を防ぐためにfスプライシングはキメラリストを読み込み、トランスクリプトーム内の既知の注釈付きスプライシング部位の近くにあるすべての読み取りを除きます。もっと完全なスプライシングアノテーションがあれば、キメラの最終的なリストはさらに正確になると予想しています。
単一RNA種または単一RNA結合タンパク質に特異的なRNA相互作用に焦点を当てた従来の戦略とは異なり、SPLASHがすべてのRNAに対してゲノムワイドな様式でRNA-RNA相互作用をマッピングする能力は、我々が大規模RNA新たな分子内および分子間のRNA相互作用を初めて同定することができます。 SPLASHを使用して、我々はヒトおよび酵母トランスクリプトームにおいて数千分子内および分子間相互作用を得て、 インビボでの RNAインタラクトームの構成および動力学を垣間見ることができた。この長距離RNA相互作用データをRNA構造モデリングアルゴリズムに統合することの進歩は、in vivoでのRNA組織の現在のモデルを改良する。 snoRNA予測プログラムなどの分子間RNA予測アルゴリズムにSPLASHを組み込むことで、これらの予測の精度を向上させることもできます。他の複雑な生物やダイナミックなシステムでのSPLASHの将来の利用は、生物学におけるRNAベースの遺伝子制御の複雑さを引き続き光栄に思うでしょう。
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Disclosures
著者は競合する金銭的利益を有していない。
Acknowledgments
私たちはWanラボとNagarajanラボのメンバーに有益な議論をしてくれたことに感謝します。 N.NagarajanはA * STARからの資金提供を受けています。 Y.WanはA * STARとSociety of Science-Branco Weiss Fellowshipからの資金援助を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
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