Summary
여기에서는 생체 내에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑을 가능하게하는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S - selected Hysbrids (SL)의 S equencing 방법을 자세히 설명합니다. SPLASH는 효모, 박테리아 및 인간을 포함한 유기체의 RNA 상호 작용을 연구하는 데 적용 할 수 있습니다.
Abstract
RNA가 어떻게 상호 작용 하는지를 아는 것은 세포에서 RNA 기반의 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. microRNA-mRNA 상호 작용과 같은 RNA-RNA 상호 작용의 예가 유전자 발현을 조절하는 것으로 나타 났지만 RNA 상호 작용이 세포에서 일어나는 전체 범위는 아직 알려지지 않았습니다. RNA 상호 작용을 연구하기위한 이전의 방법은 주로 특정 단백질 또는 RNA 종과 상호 작용하는 RNA의 부분 집합에 초점을 맞추었다. 여기에서는 P soralen crosslinked, Ligated 및 S elected H ybrids (SPLASH)라는 이름의 방법을 상세히 설명합니다.이 방법을 사용하면 생체 내 에서 RNA 상호 작용 을 편파적으로 캡처 할 수 있습니다. SPLASH는 생체 내 교차 결합, 근접 결합 및 높은 처리량 시퀀싱을 사용하여 분자 내 및 분자간 RNA 염기쌍 파트너를 세계적으로 확인합니다. SPLASH는 박테리아, 효모 및 인간 세포를 포함한 다른 유기체에 적용 할 수 있습니다.다양한 세포 환경에서 RNA 조직의 역 동성을 이해하는 데 도움이되는 다양한 세포 조건을 제공합니다. 전체 실험 SPLASH 프로토콜은 완료하는 데 약 5 일이 걸리고 계산 워크 플로는 완료하는 데 약 7 일이 걸립니다.
Introduction
거대 분자들이 서로 어떻게 접히고 상호 작용하는지 연구하는 것은 세포에서의 유전자 조절을 이해하는 열쇠입니다. 지난 수십 년간 DNA와 단백질이 유전자 조절에 어떻게 기여하는지에 대한 많은 노력이 집중되어 왔지만, 유전자 발현의 전사 후 조절에 관해서는 알려진 바가 상대적으로 적다. RNA는 선형 서열과 2 차 및 3 차 구조 모두에서 정보를 전달한다. 생체 내에서 자신과 다른 사람과 쌍을 이루는 능력이 중요합니다. 고 처리량 RNA 2 차 구조 탐색에서의 최근의 진보는 트랜스 크립 풋 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howe에서 이중 및 단일 가닥 영역의 위치에 대한 가치있는 통찰을 제공했다페어링 상호 작용 파트너에 대한 ver 정보가 아직 많이 누락되었습니다. transcriptome에서 어떤 RNA 서열이 다른 RNA 영역과 상호 작용 하는지를 결정하기 위해, 우리는 전구 쌍방향 정보가 필요합니다.
쌍방향의 RNA 상호 작용을 전지구하고 공평하지 않은 방식으로 매핑하는 것은 전통적으로 중요한 과제였습니다. CLASH 9 , hiCLIP 10 및 RAP 11 과 같은 이전의 접근법은 대규모 방식으로 RNA 상호 작용을 확인하는 데 사용되지만 이러한 기술은 일반적으로 특정 단백질 또는 RNA 종과 상호 작용하는 RNA의 하위 집합에 대해 RNA 염기쌍을 매핑합니다. 세계적 RNA 상호 작용을 연구하는 최근의 연구에는 생체 내에서 RNA 상호 작용 을 안정화시키지 않는 생체 내 상호 작용의 부분 집합 만 포착 할 수있는 RPL 12 방법이 포함된다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 우리와 다른 사람들은 게놈 전반에 걸친 공평한 전략을 개발하여p RNA interactomes 를 in vivo 에서 사용하여 crosslinker psoralen 13 , 14 , 15 의 변형 된 버전을 사용했습니다. 이 프로토콜에서는 생체 내에서 염기쌍 결합 RNA를 가교 결합시킨 비 오티 닐화 된 소 랄렌을 사용하여 근접 결합 및 높은 처리량 시퀀싱을 수행 한 P soralen crosslinked, Ligated 및 Sided H ybrids (SPLASH)의 S equencing을 수행하기위한 세부 사항을 설명합니다. 게놈 전체 RNA base-pairing 파트너를 확인하십시오 ( 그림 1 ).
이 원고에서 배양 된 접착 세포,이 경우에는 HeLa 세포를 사용하여 SPLASH를 수행하는 단계를 설명합니다. 동일한 프로토콜은 포유 동물 현탁액 및 효모 및 박테리아 세포에 쉽게 적용될 수 있습니다. 간략하게, HeLa 세포를 바이오 티 닐화 된 소 랄렌으로 처리하고 생체 내에서 상호 작용하는 RNA 염기 쌍을 가교 결합시키기 위해 365 nm에서 조사 하였다. 그런 다음 RNA를 세포에서 추출하고 스트렙 트 아비딘 (streptavidin) 구슬을 사용하여 가교 결합 영역을 강화하고 단편화합니다. 인터랙 팅 RNA 단편은 근접 결합을 사용하여 함께 결찰되고 심층 시퀀싱을위한 cDNA 라이브러리로 만들어진다. 시퀀싱시 키메라 RNA는 transcriptome / genome에 매핑되어 서로 쌍을 이루는 RNA 상호 작용 영역을 식별합니다. 우리는 SPLASH를 이용하여 snoRNA, lncRNA 및 mRNA와 같은 RNA의 다양한 부류에서 분자 내 및 분자간 RNA 염기 쌍 형성을 비롯하여 구조 조직 및 상호 작용 패턴을 엿볼 수있는 효모 및 다른 인간 세포 에서 생체 내 에서 수천 건의 RNA 상호 작용을 확인했습니다 세포에서 RNA의.
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Protocol
1. Biotinylated Psoralen과 RNA 추출을 이용한 HeLa 세포의 치료
- 10cm 플레이트에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 (PS)을 보충 한 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM)에 배양 한 HeLa 세포.
- HeLa 세포를 1x PBS 5 mL로 두 번 씻으십시오. 1 분 동안 접시를 수직으로 배치하여 접시에서 과잉 PBS를 완전히 배출하십시오.
- Biotinylated psoralen과 0.01 % w / v digitonin을 200 μM 함유 한 PBS 1 mL를 세포에 균일하게 가하고 37 ° C에서 5 분간 품다. biotinylated 소 랄렌은 세포에 들어갈 수 있지만, 세포가 5 분 동안 낮은 수치의 digitonin (0.01 %)에 노출 될 때 그 투과성은 훨씬 더 높습니다
- 처리 HeLa 세포가 들어있는 10cm 플레이트의 뚜껑을 제거하고 얼음 접시를 놓습니다. 자외선 crosslinker를 사용하여 자외선 전구에서 3cm의 거리에 얼음에 20 분 동안 365nm의 자외선과 세포를 포함하는 요리를 조사.
- 격리제조 업체의 프로토콜에 따라 guanidinium thiocyanate - 페놀 - 클로로포름 추출하여 HeLa 세포에서 otal RNA. 실온에서 30 분 동안 RNA를 침전시키기 위해 1 : 1 부피의 이소프로판올을 첨가한다.
정지 지점 : RNA는 이소프로판올에서 무한정 -20 ° C에 보관할 수 있습니다. 도트 블랏은이 단계에서 수행되어 biotinylated psoralen이 성공적으로 세포에 들어 왔고 in vivo에서 가교 된 RNA를 확인합니다 ( 그림 2 ). - RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA를 씻어 RNA 펠렛에 70 % 찬 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오. 상등액을 제거하고 실온에서 5 분 동안 펠렛을 공기 건조시킨다.
- RNA pellet에 nuclease free water를 넣고 UV 분광계를 사용하여 RNA 농도를 정량하십시오.
일시 정지 점 : RNA는 f 후에 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.액체 질소에서 래싱 동결.
2. RNA 단편화
- 95 ° C에서 1 분간 0.2 mL PCR 튜브에서 2 x RNA fragmentation buffer 15 μL와 RNA 샘플 10 μL (1 μg / μL)을 개별적으로 예열하십시오. 아래로 pipetting하여 10 μL RNA 샘플과 가열 2X RNA 조각 버퍼의 10 μL를 섞는다. 샘플을 95 ℃에서 5 분 동안 배양한다. 얼음 위에서 반응물을 신속하게 냉각시켜 반응을 멈추십시오.
- 1.5 ML microfuge 튜브에 2 조각 반응을 전송하고 풀. 반응에 Nuclease 무료 물 40 μL, 3 M 나트륨 아세테이트 10 μL, 글리코겐 1 μL 및 조각 반응에 100 % 에탄올 300 μL를 추가합니다. RNA를 침전시키기 위해 적어도 1 시간 동안 -20 ° C에서 RNA를 배양하십시오.
- 침전 된 RNA를 30 분 동안 20,000 xg에서 원심 분리하고, 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올 1 mL를 사용하여 RNA를 씻는다.
- RNA를 20,000 xg에서 15 분간 원심 분리하십시오.뜨는를 제거하고 20 μl의 nuclease 무료 물에 RNA를 분해.
3. RNA 크기 선택 및 용리
- microfuge 튜브에서 회수 RNA에 RNA 로딩 염료 20 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 RNA 로딩 염료로 RNA를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
- Microfuge 튜브에 10nt DNA 사다리 0.25 μL에 RNA 로딩 염료 3 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 사다리를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
- 변성 사다리와 샘플을 180V에서 40 분 동안 전기 영동에 의한 8.6cm x 6.8cm 6 % TBE 우레아 겔 및 크기 분획에 놓습니다. 5 분 동안 핵산 겔 얼룩의 1 : 10,000을 함유하는 TBE 완충액 10mL에서 겔을 염색합니다 어두운 밤.
- 24 G 바늘을 사용하여 바닥에 깨끗한 0.6 ML microfuge 튜브를 찔러 2 ML microfuge 튜브에 넣으십시오.
- transilluminator를 사용하여 포스트 얼룩이 진 젤의 밴드를 시각화하고 90-11에 해당하는 젤 슬라이스를 자르십시오.0 nt. 2 ML microfuge 튜브에 뚫린 0.6 ML microfuge 튜브에 젤 슬라이스를 전송합니다. 이 크기 선택은 키메라 단편이 트랜스 크립 to에 매핑하기위한 최소 길이를 가지도록하며, 하류 크기 선택 단계에서 근접 연결 제품 대 라이 게이션되지 않은 제품을 구별하기 위해 수행됩니다.
- 젤 조각을 파쇄하고 2 ML microfuge 튜브에서 수집하기 위해 2 분 동안 실온에서 12,000 XG에서 젤 조각을 원심 분리하십시오. 빈 0.6 ML microfuge 튜브를 폐기하십시오. 버퍼로 샘플의 확산을 허용하기 위해 상수 회전 4 ° C 하룻밤 4에서 2 ML microfuge 튜브 및 부화에났습니다 젤 조각에 용리 버퍼 700 μL를 추가합니다.
- 겔 조각과 용출 버퍼를 원심 튜브 필터에 옮기고 20,000 xg에서 2 분간 원심 분리합니다. 젤 슬라이스는 필터의 상단 구획에 갇히게됩니다. 젤 조각과 상단 구획을 버립니다.
- 글리코겐 1 μL와 7microfuge tube의 여액에 100 μL의 이소프로판올을 넣고 최소 1 시간 또는 밤새 -20 ° C에서 RNA를 침전시킵니다.
정지 지점 : RNA는 -20 ℃에서 무한정 이소프로판올에서 침전 될 수 있습니다. - RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 세척 한 펠릿을 원심 분리하십시오.
- 세척 버퍼를 제거하고 RNA를 resuspend하는 nuclease 무료 물 20 μL를 추가합니다. 자외선 분광계를 사용하여 RNA의 농도를 정량하십시오.
정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.
4. RNA 가교 영역의 강화
- 소용돌이 streptavidin 코팅 된 자기 구슬을 격렬히 튜브에 균질하게 resuspend. 100 μL의 구슬을 1.5 mL 미세 튜브에 옮기고 자석 위에 놓습니다.ic은 구슬이 튜브의 자기면에 달라 붙도록 1 분 동안 서 있습니다. 구슬에서 저장 버퍼를 조심스럽게 제거하고 튜브를 자석 받침대에서 꺼냅니다.
- microfuge 튜브와 피펫의 구슬에 1 ML의 용해 버퍼를 위아래로 추가합니다. 자석 버퍼에 구슬을 분리 1 분 자석 스탠드에 구슬을 포함 microfuge를 놓습니다. 이것을 3 회 반복하십시오.
- 자성 스탠드에 구슬을 포함 microfuge를 1 분 동안 놓아서 구슬에서 세척 버퍼를 제거합니다. 용해 버퍼에 RNase 억제제 (1 : 200)를 추가하고 microfuge 튜브에 씻어 구슬에 용해 버퍼 100 μL를 추가합니다.
- 갓 준비한 하이브 리다이 제이션 완충액 2 mL, 보충 용 용해 완충액 1 mL, 분획 화 된 RNA 1.5 μg 및 resuspended beads 100 μL를 15 mL 원추형 원심 튜브에 넣으십시오. 튜브를 부드럽게 보텍스하십시오.
- 37 ° C에서 15 ML 원추형 원심 분리기 튜브를 품어 30 분 동안 회전을 끝내십시오.미리 37 ℃에서 워싱 완충액을 덥혀 라.
- 버퍼에서 구슬을 분리 2 분 15 ML 튜브에 자기 스탠드에 15 ML 원추형 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 완충액을 조심스럽게 튜브에서 빼내 버립니다.
- 구슬에 사전 예열 세척 버퍼 1 ML을 추가하고 1.5 ML microfuge 튜브에 구슬을 위아래로 전송. 37 ° C에서 5 분 동안 비즈에서 인큐베이션하십시오.
- microfuge tube의 내용물을 간단히 원심 분리하십시오. 세척 버퍼에서 구슬을 분리 1 분 2 ML 튜브에 자석 스탠드에 microfuge 튜브에 1.5 ML 씻어 구슬을 놓으십시오. 부드럽게 microfuge 튜브에서 버퍼를 pipetting하여 구슬에서 버퍼를 제거합니다.
- 비드에 예열 된 세척 완충액 1 mL를 넣고 피펫을 위아래로 반복하여 세척하십시오. 총 5 번 세탁하십시오. 5 번째 세척이 끝나면, 자석 스탠드에 비즈가 들어있는 미세 지형을 놓아 세척 버퍼를 제거합니다.1 분.
5. 근접 연결
- 세척 한 구슬에 차가운 T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNK) 버퍼 1 ML을 추가하고 4 분 5 분 비즈를 품어 ° C, 끝 회전으로. 자성 스트립에 비즈가 들어있는 미세 튜브를 1 분 동안 넣고 부드럽게 T4 PNK 완충액을 제거합니다. 이 단계를 반복하여 총 2 회 세척하고 마지막 세척 후 T4 PNK 완충액을 제거합니다.
- 표 1 에 따라 구슬에 완충액을 첨가하십시오. RNA 조각의 3 '말단을 아래의 3'아답터에 연결할 수 있도록하려면 RNA의 말단에있는 3 '사이 클릭 포스페이트 그룹을 37 ℃에서 4 시간 동안 일정한 교반으로 버퍼에서 배양하여 3'OH.
- 표 2 에 따라 이전 반응에 완충액을 첨가한다. RNA 단편의 5 '말단이 연결 가능한 유도체가되도록하려면 ATP의 존재하에 일정한 교반하에 37 ° C에서 1 시간 반응을 항온 처리한다RNA상의 5 'OH를 5'포스페이트로 전환시킨다.
- 표 3에 따라 근접 반응을 수행하기 위해 이전 반응에 버퍼를 추가합니다. 16 ° C에서 16 시간 동안 반응을 항온 배양하고,
- 1 분 동안 자석 스탠드에 연결 RNA가 들어있는 microfuge를 놓습니다. 뜨는 부분을 조심스럽게 제거하고 실온 세척 완충액 1 mL를 비즈에 첨가한다. 위아래로 pipetting하여 Resuspend.
- 1 분 동안 자석 스탠드에 microfuge 튜브를 놓고 신중하게 세척 버퍼를 제거하십시오. 총 2 번의 세척을 수행하고 두 번째 세척이 끝나면 세척 버퍼를 비드에서 제거합니다.
- 구슬에 RNA PK 버퍼 100 μL를 추가하고 위아래로 pipetting하여 resuspend. 히트 블록에서 95 ° C에서 10 분 동안 시료를 가열합니다.
- 얼음에서 1 분 동안 시료를 차게하고 시료에 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 500 μL를 첨가합니다. 10 초 동안 격렬하게 섞어서 섞는다. mixtureu를 품어 라.실온에서 10 분간 반응시킨다.
Pause Point : RNA는 -80 ℃에서 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform에 2 ~ 3 개월 동안 보관할 수 있습니다. - 구아니딘 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출 샘플에 클로로포름 100 μL를 첨가한다. 10 초 동안 활발하게 소용돌이 치다. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 샘플을 원심 분리하십시오.
- 수용액 층 400 μL를 새로운 1.5 mL 미세 튜브에 옮기십시오. 800 μL (2 부피)의 100 % 에탄올을 넣고 위아래로 pipetting하여 혼합합니다.
- RNA 용액을 RNA cleanup column에 옮기고 제조자의 지시에 따라 RNA를 회수하여 작은 RNA가 유지되도록하십시오. nuclease없는 물 100 μL에서 RNA를 elute.
정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.
6. Biotinylated Psoralen의 가교 가교
- 용리 된 시료 100 μL를 24 well pl의 우물로 옮긴다.먹었다. 커버를 열고 UV 254 nm에서 샘플을 얼음 위에서 5 분간 조사합니다.
- 반대 crosslinked 샘플을 깨끗한 microfuge 튜브로 전송하십시오. 아세트산 나트륨 10 μL, 글리코겐 1 μL 및 100 % 에탄올 300 μL를 첨가하고 -20 ° C에서 RNA를 침전 시키십시오.
정지 지점 : RNA는 -20 ° C에서 무한정 에탄올에서 침전 될 수 있습니다. - RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 세척 한 펠릿을 원심 분리하십시오. 세척 버퍼를 제거하고 RNA를 resuspend에 Nuclease 무료 물의 4.25 μL를 추가합니다. 0.2 ML PCR 튜브에 RNA를 전송하십시오.
정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다.
7. 역전사 및 cDNA 원형 화
- 0.75 μL 추가RNA 링커 (0.5 μg / μL)를 PCR 튜브에 재현 탁한 시료와 80 ℃에서 90 초 동안 가열합니다. 샘플을 얼음에 2 분 동안 두십시오.
- 표 4 에 따라 3 '어댑터 연결에 대한 변성 샘플에 버퍼를 추가합니다. 반응물을 25 ° C에서 2.5 시간 동안 품어 낸다.
- 1.5 ML microfuge 튜브에 반응을 전송하십시오. 반응에 nuclease 무료 물 90 μL, 나트륨 아세테이트, 글리코겐 1 μL 100 % 에탄올 300 μL 10 μL 다음에 추가하십시오. 최소한 1 시간 또는 밤새 -20 ° C에서 RNA를 침전시킵니다.
정지 지점 : RNA는 -20 ° C에서 무한정 에탄올에서 침전 될 수 있습니다. - RNA를 회수하기 위해 4 ℃에서 30 분 동안 20,000 xg에서 침전 된 RNA를 원심 분리한다. 뜨는를 제거하고 RNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다.
- 4 ℃에서 15 분 동안 20,000 g에서 세척 된 펠릿을 원심 분리한다. 씻어 버퍼를 제거 nuclease 무료 5 μL의 펠렛을 resuspendater.
- microfuge 튜브에서 회수 RNA에 RNA 로딩 염료 5 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 RNA 로딩 염료로 RNA를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
- Microfuge 튜브에 10nt DNA 사다리 0.25 μL에 RNA 로딩 염료 3 μL를 추가합니다. 95 ° C에서 3 분 동안 사다리를 가열하고 2 분 동안 얼음 위에 놓습니다.
- 단계 3.3 및 3.4에서와 같이 8.6cm x 6.8cm 6 % TBE 우레아 겔을 사용하여 크기 분별을 수행하십시오.
- transilluminator를 사용하여 핵산 얼룩으로 염색 젤을 시각화하고 사다리에 110-140 NT에 해당하는 젤 슬라이스를 자르십시오. 2 ML microfuge 튜브에 구멍이 난 0.6 ML microfuge 튜브에 젤 슬라이스를 전송하고 3.6- 3.9 단계에서 프로토콜을 따르십시오.
- RNA 펠렛을 resuspend에 nuclease 무료 물 5 μL를 추가합니다. 0.2 ML PCR 튜브에 RNA를 전송하십시오.
정지 지점 : RNA는 액체 질소에서 플래시 동결 후 -80 ° C에서 보관할 수 있습니다. - RT 프라이머 1 μL를 1.25에 첨가81, M을 PCR tube의 RNA에 첨가하고 80 ℃에서 2 분간 가열 하였다. 샘플을 얼음에 2 분 동안 두십시오.
- 역전사를위한 버퍼를 표 5 에 따라 추가한다. 50 ° C에서 30 분 동안 반응을 품는다.
- 1 N NaOH 1.1 μL를 반응물에 넣고 98 ° C에서 20 분간 가열한다. 반응물을 얼음에 담그십시오.
- 1.5 ML microfuge 튜브에 반응을 전송하십시오. 반응에 nuclease 무료 물 90 μL, 나트륨 아세테이트, 글리코겐 1 μL 100 % 에탄올 300 μL 10 μL 다음에 추가하십시오. 적어도 1 시간 또는 밤새 -20 ° C에서 DNA를 침전시킵니다.
정지 지점 : DNA는 -20 ° C에서 무기한 에탄올에서 침전 될 수 있습니다. - 침전 된 DNA를 4 ℃에서 30 분간 20,000 g으로 원심 분리하여 DNA를 회수한다. 뜨는를 제거하고 DNA 펠렛을 씻어 70 % 차가운 에탄올 1 ML을 추가합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 20,000 xg에서 세척 한 펠릿을 원심 분리하십시오. 세척 버퍼를 제거하고 pel를 재현합니다.nuclease 무료 물 5 μL에 보자.
- 단계 3.3 및 3.4에서와 같이 8.6cm x 6.8cm 6 % TBE 우레아 겔을 사용하여 크기 분별을 수행하십시오.
- transilluminator를 사용하여 포스트 얼룩이 진 젤을 시각화하고 사다리에 200-240 NT에 해당하는 젤 슬라이스를 자르십시오. 역전사 된 cDNA는 이제 96 염기의 RT 프라이머를 첨가함으로써 RNA 단편보다 96 염기 더 길다. 2 ML microfuge 튜브에 뚫린 0.6 ML microfuge 튜브에 젤 슬라이스를 전송합니다.
- 젤 조각을 파쇄하고 2 ML microfuge 튜브에서 수집하기 위해 2 분 동안 실온에서 12,000 XG에서 젤 조각을 원심 분리하십시오. 빈 0.6 ML microfuge 튜브를 폐기하십시오.
- 2 ML microfuge 튜브에났습니다 젤 조각에 용리 버퍼 700 μL를 추가하고 37 ° C에서 일정한 회전과 2 시간 동안 품어. 단계 3.7 ~ 3.8에 설명 된대로 프로토콜을 따르십시오.
- DNA 펠렛을 resuspend에 nuclease 무료 물 6 μL를 추가합니다. 0.2 ML PCR 튜브에 DNA를 전송합니다.
- 표 6 에 따라 cDNA circularization에 대한 반응에 버퍼를 추가합니다. 반응을 60 ℃에서 1 시간 동안 항온 배양하고 80 ℃에서 10 분 동안 가열하여 반응을 비활성화시킨다.
- 1.5 ML microfuge 튜브에 반응을 전송하십시오. 제조 업체의 지침에 따라 DNA 클린업 컬럼을 사용하여 circularized cDNA를 정화. 정제 cDNA를 elution하기 위해 칼럼에 nuclease free water 20 μL를 첨가한다.
Pause Point : DNA는 -20 ° C에서 2 ~ 3 개월 동안 보관할 수 있습니다.
8. PCR 증폭 (Small Scale PCR)
- PCR 증폭을 위해 표 7 에 따라 반응 완충액을 첨가하여 라이브러리 증폭에 필요한 최소 사이클 수를 테스트합니다.
- 표 8에 따라 PCR 사이클링 조건을 설정하십시오. 반응을 멈추고 5 μL별도의 1.5 mL microfuge 튜브에 10, 15 및 20 사이클에서 PCR 반응.
- 다른 사이클에서 5 μL PCR 반응 각각에 6x DNA 겔로드 염료 1 μL를 추가합니다. PCR 제품을 시각화하기 위해 1 시간 120V에서 3 % 아가로 오스 겔에서 겔 전기 영동을 수행하십시오.
- 약 250 염기에서 증폭을 보이는 최저 PCR 사이클 수 (Y)를 사용하십시오 ( 그림 3 에서, 10 사이클에서 15 사이클의 증폭 및 약한 밴드에서 강한 밴드가 있음). 12 사이클의 대규모 PCR 증폭은 사용 된 cDNA의 양은 소규모 PCR 증폭의 10 배입니다.
9. PCR 증폭 (Large Scale PCR) 및 정제
- 대규모 PCR의 PCR 증폭을 위해 표 9 에 따라 반응 완충액을 첨가한다.
- 에 따라 PCR 순환 조건을 설정하십시오.표 10 .
- PCR 반응 25 μL에 6X DNA 겔로드 염료 5 μL를 넣고 3 % 아가 로스 겔의 웰에 넣으십시오. 별도의 우물에 1 kb + DNA 사다리를 넣으십시오. 1.5 시간 동안 100V에서 겔 전기 영동을 수행하십시오.
- UV Transilluminator를 사용하여 완성 된 젤을 시각화하십시오.
- 크기는 200-300 기지에서 PCR 제품을 포함하는 젤 조각을 추출하고 깨끗한 2 ML microfuge 튜브에 젤을 전송하십시오.
- 겔 슬라이스에 DNA 겔 추출 키트에서 겔 용해성 버퍼 1 ML을 추가하고 상온에서 30 분 동안 품어, 또는 지속적인 교반과 함께 젤이 녹을 때까지 품어 라.
- 용해 된 겔에 이소프로판올 200 μL를 넣고 pipetting으로 잘 섞는다. 시료 700 μL를 DNA 겔 추출 정화 컬럼으로 옮기고 30 초 동안 13,000 xg에서 원심 분리하십시오. 모든 시료가 컬럼에로드 될 때까지 용해 된 시료를 컬럼으로 옮기십시오.
- 500 μL 젤 용해도 버퍼를 추가,제조사의 프로토콜에 따라 컬럼 세척 버퍼 700 μL를 컬럼에 넣었다. nuclease-free 물 12 μL를 컬럼 중앙에 첨가하여 DNA를 제거하십시오. 정지 지점 : DNA는 -20 ° C에서 보관할 수 있습니다.
- fluorometric quantification을 사용하여 DNA의 농도를 정량하십시오. 시퀀싱을 위해 여러 라이브러리를 구성하고 함께 풀링하는 경우 높은 처리량 시퀀싱을 위해 동일한 양의 각 샘플을 풀에 추가합니다.
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Representative Results
그림 1 은 SPLASH 워크 플로우의 개략도입니다. 0.01 % digitonin 존재 하에서 biotinylated psoralen을 첨가하고 UV 가교 결합시 total RNA를 세포에서 추출하고 dot blot을 수행하여 RNA에 대한 biotinylated crosslinking이 효율적으로 일어 났는지 확인합니다 ( 그림 2 ). 우리는 biotinylated 20 base oligos를 양성 대조군으로 사용하여 biotinylated psoralen의 양을 세포에 첨가하여 150 개의 염기가 약 1 개가 가교되도록합니다.
더 많은 PCR 복제 이벤트가 증가 된 PCR 증폭 사이클에서 발생하는 경향이 있으므로, 우리는 깊은 시퀀싱을위한 충분한 재료를 제공 할 수있는 증폭 사이클의 최저 수를 결정하기 위해 다른 PCR 사이클을 사용하여 소규모 PCR 증폭을 수행합니다. 효율적인 도서관 준비 과정에서 우리는15 사이클 미만의 PCR 증폭에서 1.5μg 크기의 선택된 RNA 입력으로부터 cDNA 시퀀싱 라이브러리를 증폭 할 수 있습니다 ( 그림 3 ). 라이브러리는 high throughput sequencing machine에서 2x 150 base pair read를 사용하여 시퀀싱되고 sequencing read는 그림 4 의 계산 파이프 라인에 따라 처리됩니다. 최종 결과는 전 사체에서 분자 내 및 분자간 RNA-RNA 상호 작용을 모두 포함하는 필터링 된 키메라 상호 작용의 목록입니다 ( 표 11 ).
그림 1 : SPLASH 15 의 실험 작업 흐름도 365 nm의 자외선 하에서 biotinylated psoralen을 사용하여 세포 내부의 쌍방향 RNA 상호 작용을 가교시킨다. 가교 결합 된 RNA는 th이다.추출 및 약 100 기지로 조각난. 비 오티 닐화 된 소 랄렌 가교 결합체를 함유하는 상호 작용 영역은 스트렙 트 아비딘 비드에 결합함으로써 농축되고 함께 결찰된다. 265nm의 자외선 하에서 역 가교 결합시, 키메라 RNA는 심층 시퀀싱을위한 cDNA 라이브러리에 클로닝된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : dot blotting으로 biotinylated crosslinking 효율 테스트 15 . 1 % digitonin 존재 하에서 in vivo 에서 biotinylated psoralen crosslinked RNA의 dot blot. 상이한 농도의 가교 결합 된 RNA (20-2,000 ng)가 막 상에 얼룩지게된다. biotinylated 20 염기의 다른 농도올리고를 양성 대조군으로 검출한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : SPLASH를위한 소규모 라이브러리 증폭. RT 반응의 cDNA 1 μL를 소규모 PCR에 사용합니다. 반응은 10, 15 및 20 사이클에서 꺼내어 3 % 아가 로스 겔에서 실행하여 라이브러리 생성에 필요한 최소 증폭 사이클 수를 결정합니다. 이 특정 예에서는 대규모 PCR 반응에서 10 μL의 cDNA를 사용하는 10 사이클의 증폭이 깊은 시퀀싱을위한 충분한 앰플 리콘을 생성합니다.
| 시약 | 부피 (μL) | 결정적인 |
| Nuclease free water | 64 개 | |
| 10x T4 PNK 완충액 | 8 | 1 배 |
| Rnase 억제제20 U / μL) | 4 | 1 U / μL |
| T4 PNK (10 U / μL) | 4 | 0.5 U / μL |
| 합계 | 80 |
표 1 : 3 '말단 수리 용 시약.
| 시약 | 부피 (μL) | 결정적인 |
| PNK 반 응 | 80 | |
| Nuclease free water | 삼 | |
| 10x T4 PNK 완충액 | 2 | 1 배 |
| 10 mM ATP | 10 | 1 mM |
| T4 PNK (10 U / μL) | 5 | 0.5 U / μL |
| 합계 | 100 |
표 2 : 5 '말단 수리 시약.
| 시약 | 부피 (μL) | 결정적인 |
| PNK 반 응 | 100 | |
| 10x T4 RNA 리가 제 완충액 | 6 | 1 배 |
| 10 mM ATP | 6 | 1 mM |
| Rnase 억제제 (20 U / μL) | 4 | 0.5 U / μL |
| T4 Rnl1 (10 U / μL) | 40 | 2.5 U / μL |
| 뉴 클리에이 프리전자 물 | 4 | |
| 합계 | 160 |
표 3 : 근접 연결 용 시약.
| 구성 요소 | 반응 1 회당의 양 (μL) | 결정적인 |
| RNA 및 링커 | 5 | |
| T4 Rn12 버퍼 (10x) | 1 | 1 배 |
| PEG 8000 (50 %, 중량 / 부피) | 삼 | 15 % (중량 / 부피) |
| Rnase 억제제 (20 U / μL) | 0.5 | 1 U / μL |
| T4 Rn12 (tr) (200U / μL) | 0.5 | 10 U / μ;엘 |
| 합계 | 10 |
표 4 : 어댑터 결합 용 시약.
| 구성 요소 | 반응 1 회당의 양 (μL) | 결정적인 |
| 라이 게이션 및 프라이머 | 6 | |
| 첫 번째 가닥 완충액 (5x) | 2 | 1 배 |
| dNTP (10 mM) | 0.5 | 0.5 mM |
| DTT (0.1 M) | 0.5 | 5 mM |
| Rnase 억제제 (20 U / μL) | 0.5 | 1 U / μL |
| 역전사 효소 (200 U / μL) | 0.5 | 10 U / μL |
| 합계 | 10 |
표 5 : 역전사를위한 시약.
| 구성 요소 | 반응 1 회당의 양 (μL) | 결정적인 |
| 첫번째 가닥 cDNA | 6 | |
| 단일 가닥 DNA 리가 아제 완충액 (10x) | 1 | 1 배 |
| 베타 인 (5 M) | 2 | 1 M |
| MnCl2 (50 mM) | 0.5 | 2.5 mM |
| 단일 가닥 DNA 리가 제 (100U / μL) | 0.5 | 5U / μL |
| 합계 | 10 |
표 6 : cDNA의 원형 화용 시약.
| 구성 요소 | 반응 1 회당의 양 (μL) | 결정적인 |
| 연결 DNA 제품 | 1 | |
| Nuclease free Water | 10.5 | |
| High-Fidelity DNA 중합 효소 2x 마스터 믹스 | 12.5 | 1 배 |
| 유니버설 PCR 프라이머 (10 μM) | 0.5 | 0.02 μM |
| 색인 (X) 프라이머 (10 μM) | 0.5 | 0.02 μM |
| 합계 | 25 세 |
표 7 : 소규모 PCR에 사용되는 시약.
| 단계 | 온도 | 시각 | 주기 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 초 | 1 |
| 변성 | 98 ° C | 10 초 | |
| 가열 냉각 | 65 ° C | 30 초 | 25 세 |
| 신장 | 72 ° C | 30 초 | |
| 최종 확장 프로그램 | 72 ° C | 5 분 | |
| 보류 | 4 ° C | ∞ |
표 8 : 소규모 PCR에 사용되는 조건.
| 구성 요소 | 반응 1 회당의 양 (μL) | 결정적인 |
| 연결 DNA 제품 | 5 | |
| Nuclease free Water | 6.5 | |
| High-Fidelity DNA 중합 효소 2x 마스터 믹스 | 12.5 | 1 배 |
| 유니버설 PCR 프라이머 (10 μM) | 0.5 | 0.02 μM |
| 색인 (X) 프라이머 (10 μM) | 0.5 | 0.02 μM |
| 합계 | 25 세 |
표 9 : 대규모 PCR에 사용되는 시약.
| 단계 | 온도 | 시각 | 주기 |
| 초기 변성 | 98 ° C | 30 초 | 1 |
| 변성 | 98 ° C | 10 초 | |
| 가열 냉각 | 65 ° C | 30 초 | 와이 |
| 신장 | 72 ° C | 30 초 | |
| 최종 확장 프로그램 | 72 ° C | 5 분 | |
| 보류 | 4 ° C | ∞ |
표 10 : 대규모 PCR에 사용되는 조건.
표 11 : 계산 파이프 라인의 분석 출력. "SAM flag split read 1"= 0은 판독 값이 transcriptome의 양성 가닥에 매핑됨을 나타냅니다. "RNA 1 동일성"은 키메라 왼쪽의 RNA의 동일성을 의미합니다. "RNA 1 시작 위치"는 읽기가 RNA 1을 따라 매핑되는 시작 위치를 나타냅니다. "RNA 1 끝 위치"는 읽기가 RNA 1을 따라 매핑되는 끝 위치를 나타냅니다. "매핑 점수 분할 읽기 1"은 RNA 1에 매핑 된 판독 값의 매핑 스코어에 "Cigar split read 1"판독 "S"로부터 클리핑 된 염기의 수 및 판독 "M"으로 맵핑 된 염기의 수를 나타낸다. "Split read 1"은 RNA 1에 매핑 된 서열을 나타냅니다. 키메라의 오른쪽에는 RNA 2와 동일한 명명법이 사용되었습니다 .이 표의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 게놈 전체에서 pair-wise RNA 상호 작용을 확인하는 방법 인 SPLASH의 실험 및 계산 워크 플로우에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 박테리아, 효모 및 인간 문화에서 SPLASH를 성공적으로 활용했으며 전략이 다양한 세포 상태에서 다양한 유기체에 광범위하게 적용될 수있을 것으로 기대합니다. 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 하류 공정에 적합한 물질을 가지기 위해 적어도 20 μg의 가교 결합 된 RNA로 시작하는 것입니다. 그런 다음 RNA를 100 염기로 단편화하고 PAGE 크기로 선택합니다. 이러한 단계는 라이브러리 생성 과정에서 단량체가 아닌 결찰 된 키메라를 우선적으로 풍부하게하는 데 중요합니다. 우리는 일반적으로 조각과 첫 번째 크기 선택 후 RNA 약 1.5 μg을 복구하고 RNA는 SPLASH 워크 플로우에 따라 cDNA 라이브러리로 변환됩니다. 우리는 시작 RNA 의이 금액은 우리가 h에 대한 충분한 자료를 생성 할 수 있습니다PCR 증폭의 15주기 미만을 사용하여 처리량 시퀀싱. 증가 된 PCR 사이클에 따라 PCR 복제 사건의 수가 급격히 증가함에 따라 증폭 사이클의 횟수를 낮게 유지하는 것이 다운 스트림 분석에서 유용하고 독특한 키메라를 추출 할 수있는 중요한 요소입니다.
다른 게놈 차원의 소 랄렌 (ssoralen) 기반 전략과 달리 SPLASH는 비오틴 화 된 소 랄렌 (psoralen) 버전을 이용하여 염기쌍의 RNA 단편을 서로 가교 결합시킨다. 100 및 50 염기 당 약 하나의 가교 결합으로 가교 결합 량을 적정 할 때, RNA 단편화 후에 스트렙 트 아비딘 비드를 사용하여 가교 결합 된 RNA 영역을 풍부하게 할 수있다. 또한, RNA가 구슬에 바인딩되는 동안 효소 반응을 수행하면 버퍼 교환과 세척을 편리하게 수행 할 수 있습니다. 그러나 전략의 한계 중 하나는 비 오티 닐화 된 소 랄렌이 소 랄렌 또는 4'- 아미노 메틸 트라이보다 세포 내로 침투하는 것이 덜 효율적이라는 것이다oxsalen (AMT). 따라서, 비 오티 닐화 된 소 랄렌이 세포로 들어가서 RNA를 효율적으로 가교 결합시키는 것이 중요합니다. 우리는 일상적으로 교차 결합 된 추출 된 RNA에서 dotot blots를 양성 대조군으로 biotinylated oligos와 함께 수행하여 RNA가 제대로 가교되도록합니다. 가교 결합이 약한 경우 5 분 동안 낮은 농도의 digitonin (0.01 %까지)을 첨가하는 것과 같은 세포막 투과 전략을 사용하여 바이오틴이 첨가 된 소 랄렌을 효율적으로 세포에 도입 할 수 있습니다. 소 랄렌은 핵산 (UV 260 nm)과 동일한 파장으로 흡수되기 때문에 가교 RNA의 정량화를 위해 자외선 흡수보다는 형광 측정 시스템을 사용합니다.
소 랄렌 계 가교 전략의 한 가지 한계는 소 랄렌이 우리 딘 (U)에서 우선적으로 가교 결합한다는 것이다. 이와 같이, 가난한 염기쌍 부위는 가교 결합 중에 놓칠 수있다. 따라서, 가교 결합 b두 가닥 사이에 상호 작용이 일어나고 있다는 증거가 제공되며, 가교 결합의 결여는 상호 작용의 부족과 동일하지 않습니다. 우리의 SPLASH 프로토콜에서 우리는 아주 적은 양의 microRNA-mRNA 상호 작용과 적은 양의 lncRNA 상호 작용을 포착합니다. 마이크로 RNA 결합 mRNA는 유전자 발현에서 하향 조절되기 쉽고 lncRNA는 전형적으로 저 발현되기 때문에, 우리의 데이터에서 빈약 한 표현은 주로 불충분 한 서열화 깊이 때문이다. 우리는 일반적으로 각 복제물에 대해 인간 transcriptome 라이브러리 당 적어도 2 억 쌍의 최종 읽기를 서열화합니다. 이 깊이에서 대부분의 서열 검색은 상당히 풍부한 RNA에 속합니다. 우리는 특정 RNA 집단에 대한 농축 전략의 사용이 이러한 상대적으로 낮은 농도의 RNA에 대한 신호를 크게 향상시킬 것으로 기대한다. 우리가 키메라 데이터를 분석 할 때 관찰 한 다른 하나의 도전은 실제의 상호 작용 키메라 이벤트 대 스 플라이 싱으로부터 생성 된 키메라를 구별하는 것입니다. 오염 방지를 위해우리의 chimeric list에서 f splicing을 읽는다면, transcriptome에서 알려진 annotated splicing site와 가까운 모든 읽기를 걸러 낸다. 더 완벽한 스 플라이 싱 주석을 사용하면 키메라의 최종 목록이 더욱 정확해질 것으로 예상됩니다.
단일 RNA 종 또는 단일 RNA 결합 단백질에 특유의 RNA 상호 작용에 초점을 둔 이전 전략과는 달리, 모든 RNA에 대해 게놈 차원에서 RNA-RNA 상호 작용을 매핑하는 SPLASH의 능력은 우리가 대규모 RNA 상호 작용 네트워크를 개발하고 처음으로 새로운 분자 내 및 분자간 RNA 상호 작용을 확인합니다. SPLASH를 사용하여 우리는 인간 및 효모 전 사체에서 수천 개의 분자 내 및 분자간 상호 작용을 얻었 으며 생체 내 에서 RNA 상호 작용의 구성과 역 동성을 엿볼 수있었습니다. 이 장거리 RNA 상호 작용 데이터를 RNA 구조 모델링 알고리즘에 통합하는 것이RNA 조직의 현재 모델을 생체 내에서 정제 할 수 있습니다. SnoRNA 예측 프로그램과 같은 분자간 RNA 예측 알고리즘에 SPLASH를 통합하면 이러한 예측의 정확도를 높일 수 있습니다. 우리는 다른 복잡한 생물체와 동적 인 시스템에서의 SPLASH의 미래 사용은 생물학에서 RNA 기반 유전자 조절의 복잡성에 대해 계속 밝혀 줄 것으로 기대한다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
Wan 연구원과 Nagarajan 연구원에게 유익한 토론에 감사드립니다. N.Nagarajan은 A * STAR의 자금 지원을받습니다. Y.Wan은 A * STAR 및 Society in Science-Branco Weiss Fellowship의 지원을받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
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