Summary
Her spesifiserer vi metoden for S- ekventering av P- sor-nen, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), som muliggjør genomfattende kartlegging av intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaksjoner in vivo . SPLASH kan brukes til å studere RNA-interaktomer av organismer, inkludert gjær, bakterier og mennesker.
Abstract
Å vite hvordan RNAer interagerer med seg selv og med andre er nøkkelen til å forstå RNA-basert genregulering i cellen. Mens eksempler på RNA-RNA-interaksjoner, så som mikroRNA-mRNA-interaksjoner, har vist seg å regulere genuttrykk, er den totale utstrekningen av RNA-interaksjoner i cellen fortsatt ukjent. Tidligere metoder for å studere RNA-interaksjoner har primært fokusert på delsett av RNA som interagerer med et bestemt protein eller RNA-art. Her beskriver vi en metode som heter S- ekventering av P soralen, som er kryssbundet, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH) som tillater genomsøking av RNA-interaksjoner in vivo på en upartisk måte. SPLASH benytter in vivo tverrbinding, nærliggende ligering og høy gjennomstrømningssekvensering for å identifisere intramolekylære og intermolekylære RNA-baseparingspartnere globalt. SPLASH kan brukes på forskjellige organismer, inkludert bakterier, gjær og humane celler, samt aS mangfoldige cellulære forhold for å lette forståelsen av dynamikken til RNA-organisasjonen under ulike cellulære sammenhenger. Hele eksperimentelle SPLASH-protokollen tar omtrent 5 dager å fullføre, og beregningsarbeidet tar omtrent 7 dager å fullføre.
Introduction
Å studere hvordan makromolekyler brettes og samhandler med hverandre er nøkkelen til å forstå genregulering i cellen. Mens mye innsats har vært fokusert i det siste tiåret på å forstå hvordan DNA og proteiner bidrar til genregulering, er relativt mindre kjent om post-transkripsjonell regulering av genuttrykk. RNA bærer informasjon i både sin lineære sekvens og i sin sekundære og tertiære struktur 1 . Dens evne til å basere par med seg selv og med andre er viktig for sin funksjon in vivo . Nylige fremskritt i RNA sekundære strukturundersøkelser med høy gjennomstrømning har gitt verdifull innsikt i plasseringene av dobbelt- og enkeltstrengede regioner i transkriptom 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer informasjon om parringssamarbeidspartnerne mangler fortsatt stort sett. For å avgjøre hvilken RNA-sekvens som interagerer med en annen RNA-region i transkriptomet, trenger vi global parvis informasjon.
Kartlegging av parvise RNA-interaksjoner på global, upartisk måte har tradisjonelt vært en stor utfordring. Mens tidligere tilnærminger, som for eksempel CLASH 9 , hiCLIP 10 og RAP 11 , brukes til å identifisere RNA-interaksjoner i stor skala, kartlegger disse teknikkene vanligvis RNA-baseparing for en delmengde av RNA som enten interagerer med et bestemt protein eller RNA-art. Nylige utviklinger i å studere globale RNA-interaksjoner inkluderer metoden RPL 12 , som ikke stabiliserer RNA-interaksjoner in vivo, og kan derfor bare fange en delmengde av in vivo- interaksjoner. For å overvinne disse utfordringene utviklet vi og andre genoom-brede, upartiske strategier til maP RNA-interaktomer in vivo ved bruk av modifiserte versjoner av tverrbindingspsoralen 13 , 14 , 15 . I denne protokollen beskriver vi detaljene for utførelse av S- ekventering av P- sor-nen, L igated, og S valgte H ybrids (SPLASH), som benytter biotinylert psoralen til tverrbindingsbaseparasjons-RNAer in vivo , etterfulgt av nærliggende ligering og høy gjennomstrømningssekvensering til Identifisere RNA-baseparingspartnere genomgående ( figur 1 ) 15 .
I dette manuskriptet beskriver vi trinnene for å utføre SPLASH ved hjelp av dyrkede adherente celler, i dette tilfellet HeLa-celler. Den samme protokollen kan lett tilpasses til suspensjonspattedyrceller og til gjær- og bakterieceller. Kort fortalt behandles HeLa-celler med biotinylert psoralen og bestråles ved 365 nm for å krysse sammenvirkende RNA basepar in vivo.. RNAene ekstraheres deretter fra cellene, fragmentert og anriket for tverrbundende regioner ved bruk av streptavidinperler. Interaktive RNA-fragmenter blir deretter ligert sammen ved bruk av nærliggende ligering og gjort til et cDNA-bibliotek for dyp sekvensering. Ved sekvensering er de kimære RNAene kartlagt på transkriptomet / genomet for å identifisere RNA-interaksjonsregioner som er parret til hverandre. Vi har vellykket utnyttet SPLASH for å identifisere tusenvis av RNA-interaksjoner in vivo i gjær og forskjellige humane celler, inkludert intramolekylær og intermolekylær RNA-baseparing i forskjellige klasser av RNA, som snoRNA, lncRNA og mRNA, for å glimt inn i strukturorganisasjonen og samspillsmønstre Av RNA i cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Behandling av HeLa-celler med biotinylert psoralen og RNA-ekstraksjon
- Kultur HeLa-celler i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin (PS) i en 10 cm plate.
- Vask HeLa-cellene to ganger med 5 ml 1x PBS. Drenk overflødig PBS helt fra parabolen ved å plassere fatet vertikalt i 1 min.
- Tilsett 1 ml PBS som inneholder 200 μM biotinylert psoralen og 0,01% vekt / volum digitonin, til cellene jevnt og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter. Mens biotinylert psoralen kan komme inn i cellen, er dens permeabilitet mye høyere når cellene blir utsatt for lave mengder digitonin (0,01%) i 5 minutter
- Ta av lokket på 10 cm-platen som inneholder de behandlede HeLa-cellene, og legg fatet flatt på isen. Bestrål oppvasken som inneholder cellene med 365 nm UV i 20 minutter på is, i en avstand på 3 cm fra UV-pærene, ved hjelp av UV-tverrbinderen.
- Isoler tOtal RNA fra HeLa-celler ved hjelp av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformutvinning etter produsentens protokoll. Tilsett 1: 1 volum isopropanol for å utfelle RNA ved romtemperatur i 30 minutter.
Pause Point: RNA kan lagres ved -20 ° C i isopropanol på ubestemt tid. En dot blot kan utføres ved dette trinn for å kontrollere at biotinylert psoralen har lykkes inn i cellene og har tverrbundne RNAer in vivo ( Figur 2 ). - Sentrifuger det utfelte RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for å gjenvinne RNA. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml 70% kald etanol til RNA-pellet for å vaske RNA.
- Sentrifuger prøvene ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og lufttørk pelleten i 5 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett nukleasfritt vann til RNA-pellet og kvantifiser konsentrasjonen av RNA ved bruk av UV-spektrometer.
Pause Point: RNA kan lagres ved -80 ° C etter fLash fryser i flytende nitrogen.
2. RNA-fragmentering
- Forvarm 15 μl 2x RNA-fragmenteringsbuffer og 10 μl av RNA-prøven (1 μg / μl) individuelt i 0,2 ml PCR-rør, ved 95 ° C i 1 min. Bland 10 μl av den oppvarmede 2x RNA-fragmenteringsbufferen med 10 μl RNA-prøve ved pipettering opp og ned. Inkuber prøven ved 95 ° C i 5 minutter. Stopp reaksjonen ved å snap kjøle reaksjonen på is.
- Overfør og saml de 2 fragmenteringsreaksjonene til et 1,5 ml mikrofugerør. Tilsett 40 μL nukleasefritt vann til reaksjonen, 10 μl 3 M natriumacetat, 1 μl glykogen og 300 μl 100% etanol til fragmenteringsreaksjonen. Inkubér RNA ved -20 ° C i minst 1 time for å utfelle RNA.
- Sentrifuger det utfelte RNA ved 20.000 xg i 30 minutter, fjern supernatanten og vask RNA ved bruk av 1 ml 70% etanol.
- Sentrifuger RNA ved 20.000 xg i 15 minutter, remOver supernatanten og oppløs RNA i 20 μl nukleasefritt vann.
3. RNA-størrelsesvalg og eluering
- Tilsett 20 μL RNA-fargestoff til det gjenvunnede RNA i mikrofugerøret. Varm RNA med RNA-fargestoffet ved 95 ° C i 3 minutter og legg det på is i 2 minutter.
- Tilsett 3 μL RNA-fargestoff til 0,25 μL 10 nt DNA-stige i et mikrofugerør. Varm stigen ved 95 ° C i 3 minutter og legg den på is i 2 minutter.
- Last den denaturerte stigen og prøvene på en 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel og størrelsesfraksjonering ved elektroforese i 40 minutter ved 180 V. Sper gelen i 10 ml TBE buffer inneholdende 1: 10 000 nukleinsyre gel flekk for 5 Min i mørket.
- Punkter et rent 0,6 ml mikrofugerør på bunnen ved hjelp av en 24 G nål og legg den i et 2 ml mikrofugerør.
- Visualiser båndene på den etterfargede gelen ved hjelp av en transilluminator og kutt en gelskive tilsvarende 90-110 nt. Overfør gelskiven i det punkterte 0,6 ml mikrofugerøret i 2 ml mikrofugerøret. Dette størrelsesutvalget utføres for å tillate at de kimære fragmentene har en minimumslengde for å kartlegge til transkriptomet og for å skille mellom nærliggende ligerte produkter versus ubundne produkter i nedstrøms størrelsesvalgstrinn.
- Sentrifuger gelskivene ved 12 000 xg ved romtemperatur i 2 minutter for å rive gelskiven og samle den i 2 ml mikrofugerøret. Kast det tomme 0,6 ml mikrofugerøret. Tilsett 700 μL elueringsbuffer til den ristede gelskiven i 2 ml mikrofugerøret og inkuber ved 4 ° C over natten med konstant rotasjon for å tillate diffusjon av prøvene i bufferen.
- Overfør gelskivene og elueringsbufferen til et sentrifugerørfilter og sentrifuger ved 20 000 xg i 2 min. Gelskivene blir fanget i det øverste rommet på filteret. Kast gelskivene og toppkammeret.
- Tilsett 1 μl glykogen og 700 μl 100% isopropanol til filtratet i mikrofiberrøret og utfell RNA ved -20 ° C i minst 1 time eller over natten.
Pause Point: RNA kan utfelles i isopropanol på ubestemt tid ved -20 ° C. - Sentrifuger det utfelte RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for å gjenvinne RNA. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml 70% kald etanol for å vaske RNA-pellet. Sentrifuger den vasket pellet ved 20 000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Fjern vaskebufferen og tilsett 20 μL nukleasefritt vann for å resuspendere RNA. Kvantifiser konsentrasjonen av RNA ved bruk av et UV-spektrometer.
Pause Point: RNA kan lagres ved -80 ° C etter flash-frysing i flytende nitrogen.
4. Berikning av RNA-tverrbindingsregioner
- Vortex streptavidinbelagte magnetiske perler kraftig å resuspenge perlene homogent i røret. Overfør 100 μl perler til et 1,5 ml mikrofugerør og legg det på en magnetIc stå i 1 min for å la perlene holde seg til den magnetiske siden av røret. Fjern lagringsbufferen fra perlene forsiktig og ta røret ut av magnetstativet.
- Tilsett 1 ml Lysis Buffer til perlene i mikrofukterøret og pipetter opp og ned. Plasser mikrofugen som inneholder perler på magnetisk stativ i 1 min for å skille perlene fra vaskebufferen. Gjenta dette for totalt 3 vasker.
- Fjern vaskebufferen fra perlene ved å plassere mikrofugen som inneholder perler på magnetisk stativ i 1 min. Tilsett RNase-inhibitoren (1: 200) til lyseringsbufferen og tilsett 100 μl lysisbuffer til de vasket perlene i mikrofukterøret.
- Tilsett 2 ml nyfremstillet hybridiseringsbuffer, 1 ml supplerende lyserbuffer, 1,5 ug storfraksjonert RNA og 100 ul resuspenderte perler til et 15 ml konisk sentrifugerør. Vortexrøret forsiktig.
- Inkuber det 15 ml koniske sentrifugeringsrøret ved 37 ° C i 30 minutter med rotasjon fra ende til ende.Varm oppvaskbeholderen ved 37 ° C.
- Plasser de 15 ml koniske sentrifugerørene på et magnetisk stativ for 15 ml rør i 2 minutter for å skille perlene fra bufferen. Pipett bufferen forsiktig ut av røret og kast den.
- Tilsett 1 ml forvarmet vaskebuffer til perlene, pipetten opp og ned og overfør perlene til et 1,5 ml mikrofugerør. Inkuber ved perlene ved 37 ° C i 5 minutter, med ende til ende-rotasjon.
- Sentrifuger raskt innholdet i mikrofugerøret. Plasser de 1,5 ml vasket perlene i mikrofuge rør på en magnetisk stativ for 2 ml rør i 1 min, for å skille perlene fra vaskebufferen. Fjern bufferen fra perlene ved forsiktig pipettering av bufferen ut av mikrofiberrøret.
- Tilsett 1 ml forvarmet vaskebuffer til perlene og pipetter opp og ned for å gjenta vasken. Utfør totalt 5 vasker. På slutten av den femte vasken fjerner du vaskebufferen ved å plassere mikrofugen som inneholder perler på magnetstativet1 minutt.
5. Nærhetsligering
- Tilsett 1 ml kald T4 polynukleotid kinase (PNK) buffer til de vasket perler og inkuber perlene i 5 minutter ved 4 ° C, med ende til ende rotasjon. Plasser mikrofugerøret som inneholder perlene på magnetbåndet i 1 min og fjern forsiktig T4 PNK-bufferen. Gjenta dette trinnet for totalt 2 vasker og fjern T4 PNK-bufferen etter den siste vasken.
- Legg buffere til perlene, i henhold til tabell 1 . For å aktivere 3'-enden av RNA-fragmentet til å ligeres til 3'-adaptere under, inkuberer perlene i bufferen ved 37 ° C i 4 timer med konstant omrøring for å omdanne den 3'-cykliske fosfatgruppen ved enden av RNA til 3 'OH.
- Legg buffere til den forrige reaksjonen, i henhold til tabell 2 . For å muliggjøre 5'-enden av RNA-fragmentene for å være ligering kompetent, inkuber reaksjonen ved 37 ° C i 1 time med konstant omrøring i nærvær av ATP, For å konvertere 5'OH på RNA til 5'-fosfat.
- Legg buffer i forrige reaksjon for å utføre nærliggende ligering, i henhold til tabell 3 . Inkuber reaksjonen ved 16 ° C i 16 timer, med konstant omrøring,
- Plasser mikrofugen som inneholder det ligerte RNA på en magnetstand i 1 min. Fjern supernatanten forsiktig og tilsett 1 ml romtemperaturvaskbuffer til perlene. Resuspenderes ved pipettering opp og ned.
- Plasser mikrofiberrøret på magnetstativet i 1 min og fjern vaskebufferen forsiktig. Utfør totalt 2 vasker og fjern vaskebufferen fra perlene ved slutten av den andre vasken.
- Tilsett 100 μL RNA PK Buffer til perlene og resuspender ved pipettering opp og ned. Varm prøvene ved 95 ° C i 10 minutter på en varmeblokk.
- Avkjøl prøven på is i 1 min og tilsett 500 μl guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform til prøven. Bland ved vortexing kraftig i 10 s. Inkubér mixtueneRe ved romtemperatur i 10 min.
Pause Point: RNA kan lagres i guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform ved -80 ° C i et par måneder. - Tilsett 100 μl kloroform til guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroformekstraherte prøver. Vortex kraftig i 10 s. Sentrifuger prøvene ved 20.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Overfør 400 μl av det vandige laget til et nytt 1,5 ml mikrofugerør. Tilsett 800 μL (2 volum) 100% etanol og bland ved pipettering opp og ned.
- Overfør RNA-løsningen til RNA-oppryddingskolonner og gjenopprett RNA-prosedyren som følger produsentens instruksjoner, slik at selv små RNAer beholdes. Eliminer RNA i 100 μl nukleasefritt vann.
Pause Point: RNA kan lagres ved -80 ° C etter flash-frysing i flytende nitrogen.
6. Omvendt tverrbinding av biotinylert psoralen
- Overfør 100 μL av de eluerte prøvene i en brønn med en 24 brønn plspiste. Fjern dekselet og bestrål prøven under UV 254 nm, i 5 min på is.
- Overfør den omvendte, tverrbundne prøven til et rent mikrofugerør. Tilsett 10 μl natriumacetat, 1 μl glykogen og 300 μl 100% etanol og utfell RNA ved -20 ° C i minst 1 time eller over natten.
Pause Point: RNA kan utfelles i etanol på ubestemt tid ved -20 ° C. - Sentrifuger det utfelte RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for å gjenvinne RNA. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml 70% kald etanol for å vaske RNA-pellet.
- Sentrifuger den vasket pellet ved 20 000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern vaskebufferen og legg til 4,25 μL nukleasefritt vann for å resuspendere RNA. Overfør RNA til et 0,2 mL PCR-rør.
Pause Point: RNA kan lagres ved -80 ° C etter flash-frysing i flytende nitrogen.
7. Omvendt transkripsjon og cDNA-sirkulasjon
- Tilsett 0,75 μLAv RNA linker (0,5 μg / μl) til resuspendert prøve i PCR-rør og varme ved 80 ° C i 90 s. Legg prøven på is i 2 minutter.
- Tilsett bufferne til den denaturerte prøven for 3'-adapterligering, i henhold til tabell 4 . Inkuber reaksjonen ved 25 ° C i 2,5 timer.
- Overfør reaksjonen til et 1,5 ml mikrofugerør. Tilsett 90 μl nukleasefritt vann til reaksjonen, etterfulgt av 10 μl natriumacetat, 1 μl glykogen og 300 μl 100% etanol. Nedfell RNA ved -20 ° C i minst 1 time eller over natten.
Pause Point: RNA kan utfelles i etanol på ubestemt tid ved -20 ° C. - Sentrifuger det utfelte RNA ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C for å gjenvinne RNA. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml 70% kald etanol for å vaske RNA-pellet.
- Sentrifuger den vasket pellet ved 20 000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern vaskebufferen resuspender pelleten i 5 μl nukleasefri water.
- Tilsett 5 μL RNA-fargestoff til det gjenvunnede RNA i mikrofugerøret. Varm RNA med RNA-fargestoffet ved 95 ° C i 3 minutter og legg det på is i 2 minutter.
- Tilsett 3 μL RNA-fargestoff til 0,25 μL 10 nt DNA-stige i et mikrofugerør. Varm stigen ved 95 ° C i 3 minutter og legg den på is i 2 minutter.
- Utfør størrelsesfraksjonering ved å bruke 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel som i trinn 3.3 og 3.4.
- Visualiser gelen som er farget med nukleinsyreflekk ved å bruke transilluminator og kutt en gelskive tilsvarende 110-140 nt på stigen. Overfør gelskiven i det punkterte 0,6 ml mikrofugerøret i 2 ml mikrofugerøret og følg protokollen fra trinn 3.6 - 3.9.
- Tilsett 5 μL nukleasefritt vann for å resuspendere RNA-pellet. Overfør RNA til et 0,2 mL PCR-rør.
Pause Point: RNA kan lagres ved -80 ° C etter flash-frysing i flytende nitrogen. - Tilsett 1 μL RT primer ved 1,2581; M til RNA i PCR-rør og varme ved 80 ° C i 2 minutter. Legg prøven på is i 2 minutter.
- Legg bufferne til revers transkripsjon i henhold til tabell 5 . Inkuber reaksjonen ved 50 ° C i 30 minutter.
- Tilsett 1,1 μL 1 N NaOH til reaksjonen og oppvarm ved 98 ° C i 20 minutter. Plasser reaksjonen på is.
- Overfør reaksjonen til et 1,5 ml mikrofugerør. Tilsett 90 μl nukleasefritt vann til reaksjonen, etterfulgt av 10 μl natriumacetat, 1 μl glykogen og 300 μl 100% etanol. Nedfell DNA'et ved -20 ° C i minst 1 time eller over natten.
Pause Point: DNA kan utfelles i etanol på ubestemt tid ved -20 ° C. - Sentrifuger det utfelte DNA ved 20 000 g i 30 minutter ved 4 ° C for å gjenvinne DNA. Fjern supernatanten og tilsett 1 ml 70% kald etanol for å vaske DNA-pellet. Sentrifuger den vasket pellet ved 20 000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Fjern vaskebufferen resuspenge pelenLa inn 5 μl nukleasefritt vann.
- Utfør størrelsesfraksjonering ved å bruke 8,6 cm x 6,8 cm 6% TBE urea gel som i trinn 3.3 og 3.4.
- Visualiser den etterfargede gelen ved hjelp av transilluminator og kutt en gelskive tilsvarende 200-240 nt på stigen. Det omvendte transkriberte cDNA er nå 96 baser lengre enn RNA-fragmentet på grunn av tilsetningen av den 96 baserte RT-primeren. Overfør gelskiven i det punkterte 0,6 ml mikrofugerøret i 2 ml mikrofugerøret.
- Sentrifuger gelskivene ved 12 000 xg ved romtemperatur i 2 minutter for å rive gelskiven og samle den i 2 ml mikrofugerøret. Kast det tomme 0,6 ml mikrofugerøret.
- Tilsett 700 μl elueringsbuffer til den strimlede gelskiven i 2 ml mikrofugerøret og inkuber ved 37 ° C i 2 timer med konstant rotasjon. Følg protokollen som beskrevet i trinnene 3.7-3.8.
- Tilsett 6 μL nukleasefritt vann for å resuspendere DNA-pellet. Overfør DNA til et 0,2 mL PCR-rør.
- Legg bufferne til reaksjonen for cDNA-sirkulasjon, i henhold til tabell 6 . Inkuber reaksjonen ved 60 ° C i 1 time og varme ved 80 ° C i 10 minutter for å inaktivere reaksjonen.
- Overfør reaksjonen til et 1,5 ml mikrofugerør. Rens det sirkulære cDNA ved hjelp av en DNA-oppryddingskolonne etter produsentens instruksjoner. Tilsett 20 μL nukleasefritt vann til kolonnen for å eluere det rensede cDNA.
Pause Point: DNA kan lagres ved -20 ° C i et par måneder.
8. PCR Amplification (Small Scale PCR)
- Tilsett bufferne til reaksjonen i henhold til tabell 7 for PCR-amplifisering for å teste det minste antall sykluser som er nødvendige for bibliotekets amplifikasjon.
- Sett opp PCR-syklusforholdene i henhold til tabell 8 . Pause reaksjonen og overfør 5 μL avPCR-reaksjonen ved 10, 15 og 20 sykluser i separate 1,5 ml mikrofugerør.
- Tilsett 1 μl 6x DNA gelpåføringsfargestoff til hver av 5 μl PCR-reaksjonen ved de forskjellige syklusene. Utfør gelelektroforese på en 3% agarosegel, ved 120 V, i 1 time for å visualisere PCR-produktene.
- Bruk det laveste antallet PCR-sykluser (Y) som viser amplifikasjon ved rundt 250 baser. (I Figur 3 er det et sterkt bånd ved 15 sykluser av amplifikasjon og et svakt bånd ved 10 sykluser. 12 sykluser med storskala PCR-forsterkning er sannsynlig at Generere nok materiale til dyp sekvensering da mengden av cDNA som brukes er 10 ganger det for småskala PCR-amplifikasjon).
9. PCR Amplification (Large Scale PCR) og rensing
- Tilsett bufferne til reaksjonen i henhold til tabell 9 for PCR-amplifisering for PCR med stor skala.
- Konfigurer PCR-syklusforholdene i henhold tilTabell 10 .
- Tilsett 5 μL 6x DNA gelpåføringsfargestoff til 25 μl PCR-reaksjon og last inn i en brønn i en 3% agarosegel. Legg 1 kb pluss DNA-stige i en separat brønn. Utfør gelelektroforese ved 100 V, i 1,5 timer.
- Visualiser den fullførte gelen med en UV Transilluminator.
- Størrelsen trekker ut en gelskive som inneholder PCR-produkter fra 200 til 300 baser og overfører gelen til et rent 2 ml mikrofugerør.
- Tilsett 1 ml geloppløselighetsbuffer, fra et DNA-gelekstraksjonssett, til gelskiven og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter, eller til gelen oppløses, med konstant omrøring.
- Tilsett 200 μl isopropanol til oppløst gel og bland godt ved pipettering. Overfør 700 μL av prøven til en DNA-gelekstraksjonsoppryddingskolonne og sentrifuge ved 13 000 xg i 30 s. Fortsett å overføre den oppløste prøven til kolonnen til hele prøven er lastet inn på kolonnen.
- Tilsett 500 μl geloppløselighetsbuffer,Etterfulgt av 700 ul kolonnevaskbuffer, til kolonnen, i henhold til produsentens protokoll. Tilsett 12 μL nukleasefritt vann til sentrum av kolonnen for å eliminere DNA. Pause Point: DNA kan lagres ved -20 ° C.
- Kvantifisere konsentrasjonen av DNA ved bruk av fluorometrisk kvantifisering. Hvis flere biblioteker er konstruert og samlet sammen for sekvensering, må du legge til samme mengde av hver prøve til bassenget, for sekvensering med høy gjennomstrømning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser skjematisk av SPLASH-arbeidsflyten. Ved tilsetning av biotinylert psoralen i nærvær av 0,01% digitonin og UV-tverrbinding ekstraheres totalt RNA fra cellene og en dot blot utføres for å sikre at tverrbinding av biotinylert til RNA har skjedd effektivt ( figur 2 ). Vi bruker biotinylerte 20 basoligoser som positive kontroller for å titrere mengden av biotinylert psoralen som skal tilsettes til cellene, slik at ca. 1 av hver 150 baser er tverrbundet.
Siden flere PCR-dupliseringshendelser har en tendens til å forekomme med økte PCR-amplifikasjons-sykluser, utfører vi en liten skala PCR-amplifikasjon ved hjelp av forskjellige PCR-sykluser for å bestemme det laveste antall amplifikasjons-sykluser som vil gi nok materiale til dyp sekvensering. I en effektiv biblioteksprosessprosess er viKunne amplifisere et cDNA-sekvenseringsbibliotek fra en 1,5 μg størrelse valgt RNA-inngang på mindre enn 15 sykluser med PCR-amplifikasjon ( figur 3 ). Biblioteket sekvenseres deretter ved bruk av 2x 150 basepar leser på en høy gjennomstrømnings-sekvenseringsmaskin og sekvenseringslesene behandles deretter i henhold til beregningsrørledningen i figur 4 . Sluttresultatet er en liste over filtrerte kimære interaksjoner som inkluderer både intramolekylære og intermolekylære RNA-RNA-interaksjoner i transkriptomet ( Tabell 11 ).
Figur 1 : Skjematisk av eksperimentell arbeidsflyt av SPLASH 15 . Parvis RNA-interaksjoner inne i cellen kryssbundes ved bruk av biotinylert psoralen under UV-lys ved 365 nm. Tverrbundet RNA er thEn ekstrahert og fragmentert til rundt 100 baser. Interaksjonsregioner som inneholder de biotinylerte psoralen-kryssbinderne er beriket ved binding til streptavidinperler og ligert sammen. Ved revers kryssbinding under UV-lys ved 265 nm, klones de kimære RNA deretter i et cDNA-bibliotek for dyp sekvensering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : Testing av biotinylert tverrbindingseffektivitet ved dot-blotting 15 . Dotflekk av biotinylert psoralintverbundet RNA in vivo i nærvær av 1% digitonin. Ulike konsentrasjoner av tverrbundet RNA (20-2000 ng) er oppdaget på membranen. Ulike konsentrasjoner av biotinylert 20 baseOligo er oppdaget som positive kontroller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Liten skala bibliotek forsterkning for SPLASH. 1 μl cDNA fra RT-reaksjonen brukes til PCR med liten skala. Reaksjoner tas ut ved 10, 15 og 20 sykluser og kjøres på en 3% agarosegel for å bestemme minimums antall amplifikasjons-sykluser som kreves for generering av bibliotek. I dette spesifikke eksempel vil 10 sikluser av amplifikasjon ved bruk av 10 ul cDNA i en stor skala PCR-reaksjon generere nok amplikoner for dyp sekvensering.
| reagenser | Volum (μL) | Endelig |
| Nukleasefritt vann | 64 | |
| 10x T4 PNK buffer | 8 | 1x |
| Rnase Inhibitor (20 U / μl) | 4 | 1 U / μl |
| T4 PNK (10 U / μl) | 4 | 0,5 U / μl |
| Total | 80 |
Tabell 1: Reagenser for 3 'ende reparasjon.
| reagenser | Volum (μL) | Endelig |
| PNK-reaksjon | 80 | |
| Nukleasefritt vann | 3 | |
| 10x T4 PNK buffer | 2 | 1x |
| 10 mM ATP | 10 | 1 mM |
| T4 PNK (10 U / μl) | 5 | 0,5 U / μl |
| Total | 100 |
Tabell 2: Reagenser for 5-ende reparasjon.
| reagenser | Volum (μL) | Endelig |
| PNK-reaksjon | 100 | |
| 10x T4 RNA ligase buffer | 6 | 1x |
| 10 mM ATP | 6 | 1 mM |
| Rnase-inhibitor (20 U / μl) | 4 | 0,5 U / μl |
| T4 Rnl1 (10 U / μl) | 40 | 2,5 U / μl |
| Nuclease freE vann | 4 | |
| Total | 160 |
Tabell 3: Reagenser for nærliggende ligering.
| Komponent | Mengde pr reaksjon (μL) | Endelig |
| RNA og linker | 5 | |
| T4 Rnl2 buffer (10x) | 1 | 1x |
| PEG 8000 (50%, vekt / volum) | 3 | 15% (vekt / volum) |
| Rnase-inhibitor (20 U / μl) | 0.5 | 1 U / μl |
| T4Rnl2 (tr) (200U / μl) | 0.5 | 10 U / μL |
| Total | 10 |
Tabell 4: Reagenser for adapterligasjon.
| Komponent | Mengde pr reaksjon (μL) | Endelig |
| Ligation og primer | 6 | |
| Førstegangsbuffer (5x) | 2 | 1x |
| DNTPs (10 mM) | 0.5 | 0,5 mM |
| DTT (0,1 M) | 0.5 | 5 mM |
| Rnase-inhibitor (20 U / μl) | 0.5 | 1 U / μl |
| Omvendt transkriptase (200 U / μl) | 0.5 | 10 U / μl |
| Total | 10 |
Tabell 5: Reagenser for revers transkripsjon.
| Komponent | Mengde pr reaksjon (μL) | Endelig |
| Første streng cDNA | 6 | |
| Enkelstreng DNA ligase buffer (10x) | 1 | 1x |
| Betaine (5 M) | 2 | 1 M |
| MnCl2 (50 mM) | 0.5 | 2,5 mM |
| Enkeltstreng DNA ligase (100U / μl) | 0.5 | 5U / ul |
| Total | 10 |
Tabell 6: Reagenser for sirkulasjon av cDNA.
| Komponent | Mengde pr reaksjon (μL) | Endelig |
| Ligated DNA Product | 1 | |
| Nukleasefri Vann | 10.5 | |
| High-Fidelity DNA polymerase 2x master blanding | 12,5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Indeks (X) Primer (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Total | 25 |
Tabell 7: Reagenser brukt til småskala PCR.
| Skritt | Temperatur | Tid | Cycles |
| Innledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| denaturering | 98 ° C | 10 s | |
| annealing | 65 ° C | 30 s | 25 |
| Extension | 72 ° C | 30 s | |
| Endelig forlengelse | 72 ° C | 5 min | |
| Holde | 4 ° C | ∞ |
Tabell 8: Betingelser brukt for småskala PCR.
| Komponent | Mengde pr reaksjon (μL) | Endelig |
| Ligated DNA Product | 5 | |
| Nukleasefri Vann | 6.5 | |
| High-Fidelity DNA polymerase 2x master blanding | 12,5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Indeks (X) Primer (10 μM) | 0.5 | 0,02 μM |
| Total | 25 |
Tabell 9: Reagenser brukt til PCR i stor skala.
| Skritt | Temperatur | Tid | Cycles |
| Innledende denaturering | 98 ° C | 30 s | 1 |
| denaturering | 98 ° C | 10 s | |
| annealing | 65 ° C | 30 s | Y |
| Extension | 72 ° C | 30 s | |
| Endelig forlengelse | 72 ° C | 5 min | |
| Holde | 4 ° C | ∞ |
Tabell 10: Betingelser brukt for PCR med stor skala.
Tabell 11: Analyseutgang av beregningsrørledningen. "SAM flagg splitt lest 1" = 0 indikerer at lesingen er kartlagt til transkriptoms positive streng. "RNA 1-identitet" refererer til identiteten til RNA til venstre for kimæren. "RNA 1 startposisjon" refererer til startposisjonen som lesingen er kartlagt langs RNA 1. "RNA 1 endeposisjon" refererer til sluttposisjonen som lesingen er kartlagt langs RNA 1. "Mapping score split read 1" refererer til Til kartleggingspoeng av lesen som ble kartlagt til RNA 1. "Sigarplisselese 1"Indikerer antall baser som ble klippet fra leset "S" og antall baser som ble kartlagt til lese "M". "Split read 1" indikerer sekvensen som ble kartlagt til RNA 1. Den samme nomenklaturen ble brukt til høyre side av kimæren, som heter RNA 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi i detalj den eksperimentelle og beregningsfulle arbeidsflyten for SPLASH, en metode som gjør at vi kan identifisere parvise RNA-interaksjoner på en genom-bred måte. Vi har vellykket utnyttet SPLASH i bakterielle, gjær og menneskelige kulturer og forventer at strategien kan brukes allment til ulike organismer under forskjellige celletilstander. En av de kritiske trinnene i protokollen er å starte med minst 20 μg tverrbundet RNA for å ha tilstrekkelig materiale til nedstrøms prosesser. RNAet blir så fragmentert til 100 baser og PAGE-størrelse valgt. Disse trinnene er viktige for at vi fortrinnsvis beriker for ligerte kimærer, i stedet for monomerer under bibliotekets generasjonsprosess. Vi gjenoppretter typisk rundt 1,5 μg RNA etter fragmentering og det første størrelsesutvalget, og RNA konverteres deretter til et cDNA-bibliotek i henhold til SPLASH-arbeidsflyten. Vi finner at denne mengden start RNA tillater oss å generere nok materiale til hIgh-gjennomstrømnings-sekvensering ved bruk av mindre enn 15 sykluser av PCR-amplifikasjon. Ettersom antallet PCR-dupliseringshendelser øker dramatisk med økte PCR-sykluser, er det viktig å holde antall amplifikasjonssykluser lave for å kunne trekke ut nyttige og unike kimærer i nedstrømsanalysen.
I motsetning til de andre genom-brede psoralenbaserte strategiene, utnytter SPLASH en biotinylert versjon av psoralen for å krysse bundbaserte RNA-fragmenter til hverandre. Da vi titrerte mengden av tverrbinding til omtrent en krysslink per hundre og femti baser, kan vi berike for tverrbundne RNA-regioner ved å bruke streptavidinperler etter RNA-fragmentering. Videre tillater utførelse av enzymatiske reaksjoner mens RNAene er bundet på perler også oss å utføre bufferutvekslinger og vasker hensiktsmessig. En av begrensningene i strategien er imidlertid at biotinylert psoralen er mindre effektivt ved å trenge inn i celler enn psoralen eller 4'-aminometyl triOxsalen (AMT). Som sådan er det kritisk å sikre at biotinylert psoralen har gått inn i cellene og kryssbundet RNAene effektivt. Vi utfører rutinemessig prikkblott på tverrbundne, ekstraherte RNAer, sammen med biotinylerte oligos som positive kontroller, for å sikre at våre RNAer er riktig tverrbundet. I tilfelle at kryssbinding er svak, kan strategier for permeering av den cellulære membranen, slik som å legge til lave konsentrasjoner av digitonin (til 0,01%) i 5 minutter, brukes til å tillate biotinylert psoralen å komme inn i cellene effektivt. Som psoralen absorberer i samme bølgelengde som nukleinsyrer (UV 260 nm) bruker vi vanligvis fluorometriske kvantifiseringssystemer, snarere enn UV-absorpsjon for kvantifisering av tverrbundne RNAer.
En begrensning av psoralenbaserte tverrbindingsstrategier er at psoralen fortrinnsvis tverrbindes på uridiner (U). Som sådan kan baseparringsområder som er U fattige, bli savnet under kryssbinding. Derfor, mens det oppdages en tverrbindingshendelse bMellom to tråder gir bevis på at en interaksjon forekommer, er mangel på tverrbinding ikke likeverdig som mangel på interaksjon. I vår SPLASH-protokoll fanger vi svært lite mikroRNA-mRNA-interaksjoner og lave mengder lncRNA-interaksjoner. Som mikroRNA-bundet mRNAs vil sannsynligvis bli nedregulert i genuttrykk, og lncRNAs er vanligvis lite uttrykt, deres dårlige representasjon i dataene skyldes hovedsakelig utilstrekkelig sekvensdyping. Vi vanligvis sekvenser minst 200 millioner parrede ender leser per human transcriptome bibliotek for hver replikat. På denne dybden, leser det meste av sekvenseringen på ganske store RNAer. Vi forventer at bruken av anrikningsstrategier for bestemte populasjoner av RNA vil øke signalet for disse relativt lave riklige RNA. En annen utfordring som vi observert ved å analysere kimære data, er å skille mellom ekte interaksjonære kimære hendelser versus kimærer som genereres fra spleising. For å forhindre forurensing oF splicing leser i vår kimæriske liste, filtrerer vi bort alle leser som ligger nær kjente merkede spleiser i transkripsjonen. Vi forventer at med en mer komplett splitsingsannotasjon blir den endelige listen over kimærene enda mer nøyaktige.
Forskjellig fra tidligere strategier som fokuserte på RNA-interaksjoner som er spesifikke for en enkelt RNA-art eller et enkelt RNA-bindende protein, gjør at SPLASHs evne til å kartlegge RNA-RNA-interaksjoner på en genom-bred måte for alle RNAer gjør det mulig for oss å studere storskala RNA Interaksjonsnett og identifisere nye intramolekylære og intermolekylære RNA-interaksjoner for første gang. Ved hjelp av SPLASH oppnådde vi tusenvis av intramolekylære og intermolekylære interaksjoner i humane og gjære transkriptomer, slik at vi kunne se på organisasjonen og dynamikken til RNA interactome in vivo . Fremskritt i å integrere dette langdistanse-RNA-interaksjonsdata i RNA-strukturmodelleringsalgoritmer er sannsynligForfine våre nåværende modeller av RNA-organisasjon in vivo . Inkludering av SPLASH i intermolekylære RNA-prediksjonsalgoritmer, som for eksempel snoRNA-prediksjonsprogrammer, kan også forbedre nøyaktigheten av disse spådommene. Vi forventer at fremtidig bruk av SPLASH på andre komplekse organismer og dynamiske systemer vil fortsette å kaste lys over de intrikatene av RNA-basert genregulering i biologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av Wan lab og Nagarajan lab for informative diskusjoner. N.Nagarajan støttes av finansiering fra A * STAR. Y.Wan støttes av finansiering fra A * STAR og Society i Science-Branco Weiss Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
