Summary
Здесь мы подробно остановимся на способе S- выравнивания P soralen, сшитого, Ligated, и S, выбранного H ybrids (SPLASH), который позволяет проводить генома внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия РНК-РНК in vivo . SPLASH может применяться для изучения РНК-взаимодействий организмов, включая дрожжи, бактерии и людей.
Abstract
Зная, как РНК взаимодействуют с собой и с другими, является ключом к пониманию регуляции генов на основе РНК в клетке. Несмотря на то, что примеры взаимодействия РНК-РНК, такие как взаимодействия микроРНК-мРНК, как было показано, регулируют экспрессию генов, полная степень взаимодействия РНК в клетке остается неизвестной. Предыдущие методы изучения взаимодействий РНК были в основном сосредоточены на подмножествах РНК, которые взаимодействуют с конкретным видом белка или РНК. Здесь мы подробно описываем метод, названный S, состоящий из P soralen, сшитого, Ligated, и S, избранных H ybrids (SPLASH), который позволяет геномному захвату взаимодействий РНК in vivo беспристрастно. SPLASH использует in vivo сшивание, лигирование близости и высокую пропускную последовательность для идентификации внутримолекулярных и межмолекулярных партнеров по связыванию оснований РНК в глобальном масштабе. SPLASH может применяться для различных организмов, включая бактерии, дрожжи и клетки человека, а такжеС тем чтобы облегчить понимание динамики организации РНК в различных клеточных контекстах. Весь экспериментальный протокол SPLASH занимает около 5 дней, а процесс вычисления занимает около 7 дней.
Introduction
Изучение того, как макромолекулы складываются и взаимодействуют друг с другом, является ключом к пониманию регуляции генов в клетке. Несмотря на то, что в последнее десятилетие были предприняты значительные усилия для понимания того, как ДНК и белки способствуют регуляции генов, относительно меньше посттранскрипционной регуляции экспрессии генов известно относительно меньше. РНК несет информацию как в своей линейной последовательности, так и в ее вторичной и третичной структуре 1 . Его способность основывать пар с собой и с другими имеет важное значение для его функции in vivo . Недавние успехи в зондировании вторичной структуры с высокой пропускной способностью РНК дали ценную информацию о расположении двойных и одноцепочечных областей в транскриптоме 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeВерная информация о партнерах по парному взаимодействию все еще в значительной степени отсутствует. Чтобы определить, какая последовательность РНК взаимодействует с другой областью РНК в транскриптоме, нам нужна глобальная парная информация.
Традиционно картографирование парных взаимодействий РНК глобальным, беспристрастным образом является серьезной проблемой. В то время как предыдущие подходы, такие как CLASH 9 , hiCLIP 10 и RAP 11 , используются для идентификации взаимодействий РНК широкомасштабным образом, эти методы обычно отображают спаривание оснований РНК для подмножества РНК, которые либо взаимодействуют с конкретным видом белка, либо РНК. Недавние разработки в изучении взаимодействий в глобальной РНК включают метод RPL 12 , который не стабилизирует взаимодействия РНК in vivo и, следовательно, может захватывать только часть взаимодействий in vivo . Чтобы преодолеть эти трудности, мы и другие разработали универсальные, беспристрастные стратегии для маР-РНК взаимодействует in vivo с использованием модифицированных вариантов сшивающего агента psoralen 13 , 14 , 15 . В этом протоколе мы описываем детали для выполнения S- согласования P сoralen сшитого, Ligated и S выбранных H ybrids (SPLASH), который использует биотинилированный псорален для сшивания базовых спаривающих РНК in vivo с последующим лигированием близости и высокой пропускной последовательностью, чтобы Идентифицировать партнеров по связыванию с основанием РНК по всему геному ( Рисунок 1 ) 15 .
В этой рукописи мы описываем шаги для выполнения SPLASH с использованием культивируемых клеток-приверженцев, в данном случае клеток HeLa. Тот же протокол может быть легко адаптирован к суспензионным клеткам млекопитающих и дрожжевым и бактериальным клеткам. Вкратце, клетки HeLa обрабатывают биотинилированным псораленом и облучают при 365 нм для сшивания взаимодействующих пар оснований РНК in vivo, РНК затем экстрагируют из клеток, фрагментируют и обогащают для сшивания областей, используя стрептавидиновые гранулы. Взаимодействующие фрагменты РНК затем лигируют вместе с использованием лигирования по близости и превращают в библиотеку кДНК для глубокого секвенирования. После секвенирования химерные РНК отображаются на транскриптом / геном, чтобы идентифицировать области взаимодействия РНК, которые спарены друг с другом. Мы успешно использовали SPLASH для идентификации тысяч взаимодействий РНК in vivo у дрожжей и различных человеческих клеток, включая внутримолекулярное и межмолекулярное спаривание РНК в различных классах РНК, таких как snoRNAs, lncRNAs и мРНК, чтобы заглянуть в структурную организацию и образцы взаимодействия РНК в клетке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Лечение клеток HeLa биотинилированным псораленом и экстракцией РНК
- Культурные клетки HeLa в модифицированной по Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) и 1% стрептомицином пенициллина (PS) в пластине диаметром 10 см.
- Промывают клетки HeLa дважды 5 мл 1х PBS. Слейте избыток PBS полностью из блюда, поставив блюдо вертикально на 1 мин.
- Добавить 1 мл PBS, содержащего 200 мкМ биотинилированного псоралена и 0,01% вес. / Об. Дигитонина, к клеткам равномерно и инкубировать при 37 ° С в течение 5 мин. Хотя биотинилированный псорален может проникать в клетку, его проницаемость намного выше, когда клетки подвергаются воздействию малых количеств дигитонина (0,01%) в течение 5 мин
- Снимите крышку 10-сантиметровой пластины, содержащей обработанные клетки HeLa, и поставьте блюдо на лед. Облучите блюдо, содержащее клетки, с 365 нм УФ в течение 20 минут на льду, на расстоянии 3 см от УФ-луковиц, используя УФ-сшиватель.
- Изолировать тОтальной РНК из клеток HeLa путем экстракции гуанидинием тиоцианат-фенолхлороформ в соответствии с протоколом изготовителя. Добавляют объем изопропанола 1: 1 для осаждения РНК при комнатной температуре в течение 30 мин.
Точка паузы: РНК может храниться при -20 ° C в изопропаноле неограниченно долго. На этом этапе можно провести дот-блот, чтобы проверить, что биотинилированный псорален успешно проник в клетки и имеет сшитые РНК in vivo ( рисунок 2 ). - Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалить супернатант и добавить 1 мл 70% холодного этанола в РНК таблетки для промывки РНК.
- Центрифугируют образцы при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Удалите надосадочную жидкость и высушите ее на воздухе в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавляют воду, свободную от нуклеазы, к РНК-гранулу и количественно определяют концентрацию РНК с помощью УФ-спектрометра.
Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после fЗамораживание ресниц в жидком азоте.
2. Фрагментация РНК
- Разогреть 15 мкл 2х РНК-фрагментационного буфера и 10 мкл образца РНК (1 мкг / мкл) индивидуально в 0,2 мл пробирках для ПЦР при 95 ° С в течение 1 мин. Смешайте 10 мкл нагретого фрагментации 2 РНК-буфера с 10 мкл образца РНК с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте образец при 95 ° С в течение 5 мин. Остановите реакцию путем быстрого охлаждения реакции на льду.
- Переносят и объединяют 2 реакции фрагментации в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. Добавьте к реакционной смеси 40 мкл свободной от нуклеазы воды, 10 мкл 3 М ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола. Инкубируйте РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч для осаждения РНК.
- Центрифуга выпадающая РНК при 20000 мкг в течение 30 мин, удалите супернатант и промыть РНК с использованием 1 мл 70% этанола.
- Центрифугируют РНК при 20000 мкг в течение 15 мин, бетСупернатант и растворяют РНК в 20 мкл свободной от нуклеазы воды.
3. Выбор и элюирование размера РНК
- Добавьте 20 мкл красящего красителя РНК к извлеченной РНК в микроцентрифужной пробирке. Нагревают РНК красителем для загрузки РНК при 95 ° С в течение 3 мин и помещают его на лед в течение 2 мин.
- Добавьте 3 мкл красящего красителя РНК к 0,25 мкл ДНК-лестницы 10 нт в микроцентрифужной пробирке. Нагревают лестницу при 95 ° С в течение 3 мин и помещают ее на лед в течение 2 мин.
- Загрузите денатурированную лестницу и образцы на 8,6 см х 6,8 см 6% -ный гель мочевины и гранулометрический состав с помощью электрофореза в течение 40 мин при 180 В. Окрасьте гель в 10 мл буфера TBE, содержащего 1:10 000 гель-окраски нуклеиновой кислоты, в течение 5 Мин в темноте.
- Проколите чистую пробирку для микроцентрифугирования на 0,6 мл на дне с помощью иглы 24 G и поместите ее в пробирку для микроцентрифуги 2 мл.
- Визуализируйте полосы на пост-окрашенном геле с помощью трансиллюминатора и нарежьте срез геля, соответствующий 90-110 нт. Перенесите срез геля в проколотую пробирку для микроцентрифугирования объемом 0,6 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл. Этот выбор размера выполняется, чтобы позволить химерным фрагментам иметь минимальную длину для сопоставления с транскриптомом и различать между лигированными продуктами близости и незагрязненными продуктами на этапах выбора размера ниже по потоку.
- Центрифуга гель разрезает на 12000 xg при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы нарезать ломтик геля и собрать его в 2 мл микроцентрифужной пробирке. Откажитесь от пустой пробирки для микроцентрифугирования 0,6 мл. Добавьте 700 мкл буфера для элюции к измельченному срезу геля в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл и инкубируйте при 4 ° С в течение ночи с постоянным вращением, чтобы обеспечить диффузию образцов в буфер.
- Перенесите ломтики геля и буфер для элюирования в центрифужный трубчатый фильтр и центрифугируйте при 20000 мкг в течение 2 мин. Ломтики геля будут захвачены в верхнем отсеке фильтра. Отбросьте ломтики геля и верхний отсек.
- Добавить 1 мкл гликогена и 700 мкл 100% изопропанола в фильтрат в микроцентрифужной пробирке и осаждают РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч или в течение ночи.
Точка паузы: РНК может быть осаждена в изопропаноле неопределенно при -20 ° C. - Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки РНК-таблетки. Центрифуга промывают осадок при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
- Удалите промывочный буфер и добавьте 20 мкл воды, свободной от нуклеазы, для ресуспендирования РНК. Количественное определение концентрации РНК с помощью УФ-спектрометра.
Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в жидком азоте.
4. Обогащение областей сшивания РНК
- Вихревые стрептавидиновые покрытые магнитные шарики энергично ресуспендируют шарики однородно в трубке. Перенесите 100 мкл шариков в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку и поместите ее на магнитIc выдерживают в течение 1 минуты, чтобы позволить шарикам прилипать к магнитной стороне трубки. Аккуратно выньте буфер хранения из бусинок и извлеките трубку из подставки для магнитов.
- Добавьте 1 мл буфера для лизиса к бусинам в микроцентрифужной пробирке и пипеткой вверх и вниз. Поместите шарики, содержащие микроцентрифуги, на магнитную подставку на 1 мин для отделения шариков от промывочного буфера. Повторите это для всего 3 моет.
- Удалите промывочный буфер с гранул, поместив микросферические гранулы на магнитную подставку на 1 мин. Добавить ингибитор РНКазы (1: 200) в буфер для лизиса и добавить 100 мкл буфера для лизиса к промытым гранулам в микроцентрифужной пробирке.
- Добавить 2 мл свежеприготовленного гибридизационного буфера, 1 мл добавленного буфера для лизиса, 1,5 мкг фракционированной фракции по размеру и 100 мкл ресуспендированных гранул в 15 мл коническую центрифужную пробирку. Вортекс пробирку осторожно.
- Инкубируйте 15 мл коническую центрифужную пробирку при 37 ° С в течение 30 мин при вращении от конца до конца.Предварительно подогревают промывочный буфер при 37 ° C.
- Поместите 15 мл конические центрифужные пробирки на магнитную подставку для 15 мл пробирок в течение 2 мин, чтобы отделить бусины от буфера. Тщательно выньте буфер из трубки и выбросьте его.
- Добавьте 1 мл предварительно нагретого промывочного буфера к шарикам, пипеткой вверх и вниз и перенесите бусины в пробирку для микроцентрифуги 1,5 мл. Инкубируйте на бусинах при 37 ° С в течение 5 мин, при вращении от конца до конца.
- Кратко центрифугируйте содержимое микроцентрифужной пробирки. Поместите промытые 1,5 мл шарики в микроцентрифужные пробирки на магнитную подставку для 2 мл пробирок в течение 1 минуты, чтобы отделить шарики от промывочного буфера. Удалите буфер из бусинок, осторожно выливая буфер из микроцентрифужной пробирки.
- Добавьте 1 мл предварительно нагретого промывочного буфера к шарикам и пипеткой вверх и вниз, чтобы повторить промывку. Выполните в общей сложности 5 стирок. В конце 5 -го мытья удалите промывочный буфер, поместив микросферические гранулы на магнитную подставку для1 мин.
5. Лигирование близости
- Добавьте 1 мл холодного буферного раствора полинуклеотидкиназы (PNK) T4 к промытым шарикам и инкубируйте шарики в течение 5 мин при 4 ° C с вращением от конца до конца. Поместите пробирку для микроцентрифугирования с шариками на магнитную полосу на 1 мин и аккуратно удалите буфер T4 PNK. Повторите этот шаг для всего двух стирок и удалите буфер T4 PNK после последнего стирки.
- Добавьте буферы в соответствии с таблицей 1 . Чтобы позволить 3'-концам фрагмента РНК лигировать с 3'-адаптерами ниже, инкубировать шарики в буфере при 37 ° С в течение 4 ч с постоянным перемешиванием для превращения 3 'циклической фосфатной группы в конце РНК в 3 'OH.
- Добавьте буферы к предыдущей реакции, согласно таблице 2 . Чтобы позволить 5'-концу фрагментов РНК быть компетентными для лигирования, инкубировать реакцию при 37 ° С в течение 1 ч с постоянным перемешиванием в присутствии АТФ, Чтобы превратить 5 'OH в РНК в 5' фосфат.
- Добавьте буфер к предыдущей реакции для выполнения лигирования близости, согласно таблице 3 . Инкубируйте реакцию при 16 ° С в течение 16 ч при постоянном перемешивании,
- Поместите микроцентрифугу, содержащую лигированную РНК, на магнитную подставку в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл буфера для промывки комнатной температуры. Ресуспендируют пипетированием вверх и вниз.
- Поместите пробирку для микроцентрифугирования на магнитную подставку на 1 мин и осторожно снимите промывочный буфер. Выполните в общей сложности 2 стирки и удалите промывочный буфер из бусинок в конце второй стирки.
- Добавить 100 мкл буфера РНК PK к бусинам и ресуспендировать пипетированием вверх и вниз. Нагрейте образцы при 95 ° C в течение 10 минут на тепловом блоке.
- Охладите образец на льду в течение 1 мин и добавьте 500 мкл гуанидиния тиоцианат-фенол-хлороформ к образцу. Перемешивают энергично в течение 10 с. Инкубируйте смесь.При комнатной температуре в течение 10 мин.
Точка паузы: РНК может храниться в гуанидиний-тиоцианат-фенол-хлороформ при -80 ° C в течение нескольких месяцев. - Добавить 100 мкл хлороформа к образцам, выделенным из гуанидиния-тиоцианат-фенол-хлороформ. Вихрь энергично в течение 10 с. Центрифугируют образцы при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
- Перенесите 400 мкл водного слоя в новую пробирку для микроцентрифуги на 1,5 мл. Добавить 800 мкл (2 объема) 100% этанола и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
- Перенесите раствор РНК в колонны очистки РНК и восстановите РНК в соответствии с инструкциями производителя, чтобы обеспечить сохранение даже малых РНК. Элюируют РНК в 100 мкл воды, свободной от нуклеазы.
Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в жидком азоте.
6. Обратное сшивание биотинилированного псоралена
- Передача 100 мкл элюированных образцов в лунку 24-луночного планшетаел. Снимите крышку и облучите образец при УФ 254 нм, в течение 5 минут на льду.
- Перенесите обратный сшитый образец в чистую микроцентрифужную пробирку. Добавить 10 мкл ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола и осадить РНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч или в течение ночи.
Точка паузы: РНК может быть осаждена в этаноле неограниченно при -20 ° C. - Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки РНК-таблетки.
- Центрифуга промывают осадок при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Удалите промывочный буфер и добавьте 4,25 мкл воды, свободной от нуклеазы, для ресуспендирования РНК. Перенесите РНК в пробирку для ПЦР на 0,2 мл.
Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в жидком азоте.
7. Обратная транскрипция и циркуляция кДНК
- Добавить 0,75 мкл(0,5 мкг / мкл) к ресуспендированному образцу в пробирке с ПЦР и нагреванию до 80 ° С в течение 90 с. Поместите образец на лед в течение 2 мин.
- Добавьте буферы к денатурированному образцу для 3 'лигирования адаптера, согласно таблице 4 . Инкубируйте реакцию при 25 ° С в течение 2,5 ч.
- Перенесите реакцию в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Добавьте к реакционной смеси 90 мкл воды, свободной от нуклеазы, затем 10 мкл ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола. Осаждают РНК при -20 ° C в течение не менее 1 часа или в течение ночи.
Точка паузы: РНК может быть осаждена в этаноле неограниченно при -20 ° C. - Центрифуга осажденной РНК при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения РНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки РНК-таблетки.
- Центрифуга промывают осадок при 20000 g в течение 15 мин при 4 ° C. Удалить промывочный буфер ресуспендируют осадок в 5 мкл без нуклеазы wАтер.
- Добавьте 5 мкл красящего красителя РНК к извлеченной РНК в микроцентрифужной пробирке. Нагревают РНК красителем для загрузки РНК при 95 ° С в течение 3 мин и помещают его на лед в течение 2 мин.
- Добавьте 3 мкл красящего красителя РНК к 0,25 мкл ДНК-лестницы 10 нт в микроцентрифужной пробирке. Нагревают лестницу при 95 ° С в течение 3 мин и помещают ее на лед в течение 2 мин.
- Выполните фракционирование по размеру с использованием 8,6 см х 6,8 см 6% TBE гель-мочевины, как на этапах 3.3 и 3.4.
- Визуализируйте гель, окрашенный пятном нуклеиновой кислоты, используя трансиллюминатор, и нарежьте полоску геля, соответствующую 110-140 нт на лестнице. Перенесите ломтик геля в проколотую пробирку для микроцентрифугирования объемом 0,6 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл и следуйте протоколу, указанному на шагах 3.6-3.9.
- Добавьте 5 мкл свободной от нуклеазы воды для повторного суспендирования РНК-гранул. Перенесите РНК в пробирку для ПЦР на 0,2 мл.
Точка паузы: РНК может храниться при -80 ° C после замораживания вспышкой в жидком азоте. - Добавить 1 мкл праймера RT при 1,2581; М к РНК в пробирке ПЦР и нагревают при 80 ° С в течение 2 мин. Поместите образец на лед в течение 2 мин.
- Добавьте буферы для обратной транскрипции в соответствии с Таблицей 5 . Инкубируйте реакцию при 50 ° С в течение 30 мин.
- Добавить 1,1 мкл 1 N NaOH к реакции и нагревать при 98 ° C в течение 20 мин. Поместите реакцию на лед.
- Перенесите реакцию в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Добавьте к реакционной смеси 90 мкл воды, свободной от нуклеазы, затем 10 мкл ацетата натрия, 1 мкл гликогена и 300 мкл 100% этанола. Осаждают ДНК при -20 ° С в течение по меньшей мере 1 ч или в течение ночи.
Точка паузы: ДНК может быть осаждена в этаноле неограниченно при -20 ° C. - Центрифуга осажденной ДНК при 20000 г в течение 30 мин при 4 ° С для извлечения ДНК. Удалите супернатант и добавьте 1 мл 70% холодного этанола для промывки ДНК-осадка. Центрифуга промывают осадок при 20000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С. Удалите промывочный буфер, ресуспендируйте егоВпустить в 5 мкл свободной от нуклеазы воды.
- Выполните фракционирование по размеру с использованием 8,6 см х 6,8 см 6% TBE гель-мочевины, как на этапах 3.3 и 3.4.
- Визуализируйте пост-окрашенный гель с помощью трансиллюминатора и нарежьте срез геля, соответствующий 200-240 нт на лестнице. Обратная транскрибированная кДНК теперь на 96 оснований длиннее, чем фрагмент РНК, благодаря добавлению праймера 96 оснований RT. Перенесите срез геля в проколотую пробирку для микроцентрифугирования объемом 0,6 мл в микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл.
- Центрифуга гель разрезает на 12000 xg при комнатной температуре в течение 2 минут, чтобы нарезать ломтик геля и собрать его в 2 мл микроцентрифужной пробирке. Откажитесь от пустой пробирки для микроцентрифугирования 0,6 мл.
- Добавить 700 мкл буфера для элюции в измельченный срез геля в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл и инкубировать при 37 ° С в течение 2 часов при постоянном вращении. Следуйте протоколу, как описано в шагах 3.7- 3.8.
- Добавьте 6 мкл воды, свободной от нуклеазы, для ресуспендирования ДНК-осадка. Перенесите ДНК в пробирку для ПЦР на 0,2 мл.
- Добавьте буферы к реакции для циркуляции кДНК, согласно таблице 6 . Инкубируйте реакцию при 60 ° С в течение 1 ч и нагревайте при 80 ° С в течение 10 мин для инактивации реакции.
- Перенесите реакцию в 1,5-мл микроцентрифужную пробирку. Очистите кольцевую кДНК, используя колонку для очистки ДНК, следуя инструкциям производителя. Добавьте 20 мкл воды, свободной от нуклеазы, в колонку для элюирования очищенной кДНК.
Точка паузы: ДНК может храниться при -20 ° C в течение нескольких месяцев.
8. ПЦР-амплификация (ПЦР с малым весом)
- Добавьте буферы к реакции согласно таблице 7 для ПЦР-амплификации, чтобы проверить минимальное количество циклов, необходимое для амплификации библиотеки.
- Настройте условия циклизации PCR в соответствии с таблицей 8 . Приостанавливают реакцию и переносят 5 мклРеакцию ПЦР при 10, 15 и 20 циклах, в отдельные пробирки для микроцентрифугирования объемом 1,5 мл.
- Добавьте 1 мкл 6x красящего ДНК-красителя к каждой из 5 мкл реакции ПЦР в разные циклы. Выполните гель-электрофорез на 3% агарозном геле при 120 В в течение 1 часа для визуализации продуктов ПЦР.
- Используйте наименьшее число циклов ПЦР (Y), которые показывают амплификацию на уровне около 250 оснований (на рисунке 3 имеется сильная полоса при 15 циклах амплификации и слабая полоса при 10 циклах). 12 циклов ПЦР большого размера вероятнее всего Генерируют достаточно материала для глубокого секвенирования, так как количество используемой кДНК в 10 раз больше, чем при ПЦР небольшого масштаба).
9. ПЦР-амплификация (крупномасштабная ПЦР) и очистка
- Добавьте буферы к реакции согласно таблице 9 для ПЦР-амплификации для крупномасштабной ПЦР.
- Настройте условия циклизации PCR в соответствии сТаблица 10 .
- Добавьте 5 мкл 6x красящего ДНК-красителя к 25 мкл реакции ПЦР и загрузите в лунку 3% агарозного геля. Загрузите 1 кб плюс лестницу ДНК в отдельную лунку. Выполните гель-электрофорез при 100 В в течение 1,5 ч.
- Визуализируйте законченный гель, используя УФ-трансиллюминатор.
- Размер экстракта гель срез, содержащий ПЦР-продуктов из 200-300 оснований и передачи гель чистую 2 мл микроцентрифужной трубки.
- Добавить 1 мл буфера для растворения геля из набора для экстракции ДНК-геля на срез геля и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин или до тех пор, пока гель не будет растворяться с постоянным перемешиванием.
- Добавить 200 мкл изопропанола в растворенный гель и хорошо перемешать с помощью пипетки. Передача 700 мкл образца в колонку для очистки ДНК гель-экстракции и центрифугирование при 13000 мкг в течение 30 с. Продолжайте перенос растворенного образца в колонку до тех пор, пока весь образец не будет загружен в колонку.
- Добавить 500 мкл буфера для гелеобразования,С последующим добавлением 700 мкл буфера для промывки колонки, в колонку, в соответствии с протоколом изготовителя. Добавьте 12 мкл воды, свободной от нуклеазы, в центр колонки, чтобы ускользнуть от ДНК. Точка паузы: ДНК может храниться при -20 ° C.
- Количественное определение концентрации ДНК с использованием флуориметрического количественного определения. Если несколько библиотек сконструированы и объединены вместе для упорядочивания, добавьте равное количество каждого образца в пул для последовательности высокой пропускной способности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана схема рабочего процесса SPLASH. После добавления биотинилированного псоралена в присутствии 0,01% дигитонина и УФ-сшивки из клеток экстрагируют общую РНК и проводят дот-блот, чтобы обеспечить эффективное сшивание биотинилированных с РНК ( фиг. 2 ). Мы используем биотинилированные 20 базовых олигонуклеотидов в качестве положительных контролей для титрования количества биотинилированного псоралена, добавляемого в клетки, так, чтобы приблизительно 1 из каждых 150 оснований сшивали.
Поскольку большее количество случаев дублирования ПЦР имеет тенденцию к увеличению циклов ПЦР-амплификации, мы проводим ПЦР-амплификацию малого масштаба с использованием разных циклов ПЦР, чтобы определить наименьшее число циклов амплификации, которое обеспечит достаточный материал для глубокого секвенирования. В процессе эффективной подготовки библиотеки мыСпособный амплифицировать библиотеку секвенирования кДНК из 1,5 мкг выбранного количества выбранной РНК менее чем в 15 циклах ПЦР-амплификации ( фиг. 3 ). Затем библиотека упорядочивается с использованием чтения 2x12 базовых пар на машине с высокой пропускной способностью, а затем последовательные считывания обрабатываются согласно расчетному конвейеру на рисунке 4 . Конечным результатом является список фильтрованных химерных взаимодействий, который включает как внутримолекулярные, так и межмолекулярные взаимодействия РНК-РНК в транскриптоме ( Таблица 11 ).
Рисунок 1 : Схема экспериментального рабочего процесса SPLASH 15 . Парные взаимодействия РНК внутри клетки сшивают с использованием биотинилированного псоралена под УФ-светом при 365 нм. Сшитая РНК является thEn извлечены и фрагментированы примерно до 100 оснований. Взаимодействующие области, которые содержат биотинилированные сшивки псоралена, обогащены связыванием со стрептавидиновыми шариками и лигированы вместе. После обратной сшивки в УФ-свете на 265 нм химерные РНК затем клонируют в библиотеку кДНК для глубокого секвенирования. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Тестирование эффективности биотинилированного сшивания методом дот-блоттинга 15 . Точечный блот биотинилированной псоралены сшитой РНК in vivo в присутствии 1% дигитонина. Различные концентрации сшитой РНК (20-2000 нг) замечены на мембране. Различные концентрации биотинилированного основания 20Олиго определяются как положительный контроль. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Маломасштабное библиотечное усиление для SPLASH. Для мелкомасштабной ПЦР используют 1 мкл кДНК из реакции RT. Реакции отбирают через 10, 15 и 20 циклов и пропускают на 3% агарозном геле для определения минимального количества циклов амплификации, необходимых для создания библиотеки. В этом конкретном примере 10 циклов амплификации с использованием 10 мкл кДНК в крупномасштабной ПЦР-реакции будут генерировать достаточное количество ампликонов для глубокого секвенирования.
| Реактивы | Объем (мкл) | окончательный |
| Свободная вода нуклеазы | 64 | |
| Буфер PNX 10x T4 | 8 | 1x |
| Ингибитор РНКазы (20 U / мкл) | 4 | 1 U / мкл |
| T4 PNK (10 U / мкл) | 4 | 0,5 Ед / мкл |
| Всего | 80 |
Таблица 1: Реагенты для 3'-конца ремонта.
| Реактивы | Объем (мкл) | окончательный |
| Реакция PNK | 80 | |
| Свободная вода нуклеазы | 3 | |
| Буфер PNX 10x T4 | 2 | 1x |
| 10 мМ ATP | 10 | 1 мМ |
| T4 PNK (10 U / мкл) | 5 | 0,5 Ед / мкл |
| Всего | 100 |
Таблица 2: Реагенты для 5'-конца ремонта.
| Реактивы | Объем (мкл) | окончательный |
| Реакция PNK | 100 | |
| 10x T4 РНК лигазный буфер | 6 | 1x |
| 10 мМ ATP | 6 | 1 мМ |
| Ингибитор РНК (20 Ед / мкл) | 4 | 0,5 Ед / мкл |
| T4 Rn1 (10 U / мкл) | 40 | 2,5 U / мкл |
| НуклеазельВода | 4 | |
| Всего | 160 |
Таблица 3: Реактивы для лигирования близости.
| Компонент | Количество на реакцию (мкл) | окончательный |
| РНК и линкер | 5 | |
| Буфер T4 Rnl2 (10x) | 1 | 1x |
| ПЭГ 8000 (50%, вес / объем) | 3 | 15% (мас. / Об.) |
| Ингибитор РНК (20 Ед / мкл) | 0,5 | 1 U / мкл |
| T4 Rnl2 (tr) (200 ед. / Мкл) | 0,5 | 10 U / μ, L |
| Всего | 10 |
Таблица 4: Реагенты для лигирования адаптеров.
| Компонент | Количество на реакцию (мкл) | окончательный |
| Лигирование и праймер | 6 | |
| Буфер первой нити (5x) | 2 | 1x |
| DNTP (10 мМ) | 0,5 | 0,5 мМ |
| DTT (0,1 М) | 0,5 | 5 мМ |
| Ингибитор РНК (20 Ед / мкл) | 0,5 | 1 U / мкл |
| Обратная транскриптаза (200 Ед / мкл) | 0,5 | 10 Ед / мкл |
| Всего | 10 |
Таблица 5: Реактивы для обратной транскрипции.
| Компонент | Количество на реакцию (мкл) | окончательный |
| Первичная кДНК | 6 | |
| Одноцепочечный ДНК-лигазный буфер (10х) | 1 | 1x |
| Бетаин (5 М) | 2 | 1 M |
| MnCl 2 (50 мМ) | 0,5 | 2,5 мМ |
| Одноцепочечная ДНК-лигаза (100 ед. / Мкл) | 0,5 | 5U / мкл |
| Всего | 10 |
Таблица 6: Реагенты для циркуляции кДНК.
| Компонент | Количество на реакцию (мкл) | окончательный |
| Лигированный продукт ДНК | 1 | |
| Вода без нуклеазы | 10,5 | |
| Высококачественная ДНК-полимераза 2x мастер-микс | 12,5 | 1x |
| Универсальный ПЦР-праймер (10 мкМ) | 0,5 | 0,02 мкМ |
| Индекс (X) Праймер (10 мкМ) | 0,5 | 0,02 мкМ |
| Всего | 25 |
Таблица 7: Реагенты, используемые для ПЦР малых размеров.
| шаг | температура | Время | циклы |
| Начальная денатурация | 98 ° C | 30 сек. | 1 |
| денатурация | 98 ° C | 10 с | |
| отжиг | 65 ° C | 30 с | 25 |
| расширение | 72 ° C | 30 с | |
| Окончательное расширение | 72 ° C | 5 мин | |
| Держать | 4 ° C | ∞ |
Таблица 8: Условия, используемые для ПЦР малых размеров.
| Компонент | Количество на реакцию (мкл) | окончательный |
| Лигированный продукт ДНК | 5 | |
| Вода без нуклеазы | 6,5 | |
| Высококачественная ДНК-полимераза 2x мастер-микс | 12,5 | 1x |
| Универсальный ПЦР-праймер (10 мкМ) | 0,5 | 0,02 мкМ |
| Индекс (X) Праймер (10 мкМ) | 0,5 | 0,02 мкМ |
| Всего | 25 |
Таблица 9: Реагенты, используемые для крупномасштабной ПЦР.
| шаг | температура | Время | циклы |
| Начальная денатурация | 98 ° C | 30 с | 1 |
| денатурация | 98 ° C | 10 с | |
| отжиг | 65 ° C | 30 с | Y |
| расширение | 72 ° C | 30 с | |
| Окончательное расширение | 72 ° C | 5 мин | |
| Держать | 4 ° C | ∞ |
Таблица 10: Условия, используемые для крупномасштабной ПЦР.
Таблица 11: Анализ результатов вычислительного конвейера. «Флаг SAM split split 1» = 0 указывает, что считывание отображается на положительную цепочку транскриптома. «Идентичность РНК 1» относится к идентичности РНК слева от химеры. «Начальная позиция РНК 1» относится к исходному положению, к которому считывается отображение вдоль РНК 1. «Конечное положение РНК 1» относится к конечному положению, к которому считывается отображение вдоль РНК 1. «Считывание с разбивкой по коду счета 1» относится К оценке соответствия считывания, которая была сопоставлена с РНК 1. «Разделение сигары на чтение 1»Указывает количество оснований, которые были отсечены от считанного "S", и количество оснований, которые были сопоставлены с считанным "M". «Разделить 1» обозначает последовательность, которая была сопоставлена с РНК 1. Та же номенклатура была использована для правой стороны химеры, которая получила название РНК 2. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы подробно опишем экспериментальный и вычислительный рабочий процесс для SPLASH, метод, который позволяет нам идентифицировать парные взаимодействия РНК в геномо-широкой манере. Мы успешно использовали SPLASH в бактериальных, дрожжевых и человеческих культурах и ожидаем, что эта стратегия может широко применяться к различным организмам в разных клеточных состояниях. Один из критических шагов в протоколе состоит в том, чтобы начать с по меньшей мере 20 мкг сшитой РНК для получения адекватного материала для последующих процессов. Затем РНК фрагментируют до 100 оснований и выбирают размер PAGE. Эти шаги важны для нас преимущественно обогащать лигированные химеры, а не мономеры в процессе создания библиотеки. Обычно мы восстанавливаем около 1,5 мкг РНК после фрагментации и выбора первого размера, а затем РНК преобразуют в библиотеку кДНК согласно технологическому процессу SPLASH. Мы обнаружили, что это количество исходной РНК позволяет нам генерировать достаточно материала для hС использованием менее 15 циклов ПЦР-амплификации. Поскольку число случаев дублирования ПЦР резко возрастает с увеличением циклов ПЦР, крайне важно сохранить количество циклов амплификации, чтобы иметь возможность извлекать полезные и уникальные химеры в анализе нисходящего потока.
В противоположность другим стратегиям, основанным на геномном псоралене, SPLASH использует биотинилированную версию псоралена для сшивания фрагментов РНК, связанных между собой, друг с другом. Когда мы титровали количество поперечной сшивки примерно до одной поперечной связи на сто пятьдесят оснований, мы можем обогатить для сшитых областей РНК с помощью стрептавидиновых гранул после фрагментации РНК. Кроме того, проведение ферментативных реакций, в то время как РНК связываются с шариками, также позволило нам проводить буферные обмены и промывать удобно. Однако одним из ограничений этой стратегии является то, что биотинилированный псорален менее эффективен при проникновении в клетки, чем псорален или 4'-аминометилтриOxsalen (AMT). Таким образом, крайне важно обеспечить, чтобы биотинилированный псорален проникал в клетки и эффективно сшивал РНК. Мы регулярно выполняем дот-блоттинг на сшитых экстрагированных РНК вместе с биотинилированными олигонуклеотидами в качестве положительных контролей для обеспечения правильной сшивки наших РНК. В случае слабого сшивания, можно использовать стратегии проникновения клеточной мембраны, такие как добавление низких концентраций дигитонина (до 0,01%) в течение 5 мин, чтобы биотинилированный псорален мог эффективно проникать в клетки. Поскольку псорален абсорбируется на той же длине волны, что и нуклеиновые кислоты (УФ 260 нм), мы обычно используем флуориметрические системы количественного определения, а не УФ-поглощение для количественного определения сшитых РНК.
Одним из ограничений стратегий сшивания на основе псоралена является то, что псорален предпочтительно сшивает в уридинах (U). Таким образом, пары спаривания оснований, которые являются бедными U, могут быть пропущены во время сшивания. Следовательно, при обнаружении события сшивания bМежду двумя прядими есть свидетельство того, что взаимодействие происходит, отсутствие сшивания не равнозначно отсутствию взаимодействия. В нашем протоколе SPLASH мы фиксируем очень мало взаимодействий микроРНК-мРНК и низких количеств взаимодействий lncRNA. Поскольку связанные с микроРНК мРНК, вероятно, подавляются в экспрессии генов, и lncRNAs обычно характеризуются низкой экспрессией, их слабое представление в наших данных обусловлено, главным образом, недостаточной глубиной секвенирования. Обычно для каждой репликации мы обычно упорядочиваем по меньшей мере 200 миллионов парных считываний на одну человеческую библиотеку транскриптомов. На этой глубине большая часть нашей последовательности считывания приходится на достаточно обильные РНК. Мы ожидаем, что использование стратегий обогащения для конкретных популяций РНК значительно усилит сигнал для этих относительно низких обильных РНК. Еще одна проблема, которую мы наблюдали при анализе химерных данных, состоит в том, чтобы отличать истинные взаимодействующие химерные события от химер, образующихся при сплайсинге. Для предотвращения загрязнения oF сплайсинга читается в нашем химерном списке, мы отфильтровываем все чтения, которые близки к известным сайтам с аннотированными сплайсингами в транскриптоме. Мы ожидаем, что с более полными аннотациями сплайсинга окончательный список химер станет еще более точным.
В отличие от предыдущих стратегий, которые фокусировались на взаимодействиях РНК, специфичных для одного вида РНК или одного связывающего РНК белка, способность SPLASH к картированию взаимодействия РНК-РНК в геномо-широкой манере для всех РНК позволяет нам изучать крупномасштабную РНК Взаимодействия и впервые выявить новые внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия РНК. Используя SPLASH, мы получили тысячи внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий в транскриптомах человека и дрожжей, что позволило нам заглянуть в организацию и динамику взаимодействия РНК in vivo . Успехи в интеграции данных о взаимодействии РНК большого радиуса в алгоритмы моделирования структуры РНК, вероятно,Уточнить наши текущие модели организации РНК in vivo . Включение SPLASH в алгоритмы предсказания межмолекулярной РНК, такие как программы предсказания сноРНК, также может улучшить точность этих предсказаний. Мы ожидаем, что в будущем использование SPLASH над другими сложными организмами и динамическими системами продолжит проливать свет на тонкости регуляции генов на основе РНК в биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим членов лаборатории Wan и лаборатории Nagarajan за содержательные обсуждения. Финансирование NNARARAN поддерживается A * STAR. Y.Wan поддерживается при финансовой поддержке A * STAR и Общества в науке - стипендии Бранко Вайсс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
- Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
- Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
- Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
- Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
- Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
- Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
- Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
- Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
- Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
- Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
- Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
- Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
- Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
- Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).
