Summary
Aquí, se detalla el método de S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH), que permite el genoma de la cartografía de todo el intramolecular y intermolecular RNA-ARN interacciones in vivo . SPLASH puede ser aplicado para estudiar interactones de ARN de organismos incluyendo levaduras, bacterias y seres humanos.
Abstract
Saber cómo interactúan los ARN con ellos mismos y con otros es clave para entender la regulación de genes basada en ARN en la célula. Aunque se ha demostrado que los ejemplos de interacciones ARN-ARN, tales como las interacciones ARNm-ARNm, regulan la expresión génica, se desconoce hasta qué punto se producen las interacciones ARN en la célula. Los métodos anteriores para estudiar las interacciones de ARN se han centrado principalmente en subconjuntos de ARN que están interactuando con una proteína particular o especies de ARN. Aquí, detallamos un método llamado S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a todo el genoma de captura de ARN interacciones in vivo de manera imparcial. SPLASH utiliza reticulación in vivo , ligación de proximidad y secuenciación de alto rendimiento para identificar socios de unión de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares a nivel mundial. SPLASH puede aplicarse a diferentes organismos, incluyendo bacterias, levaduras y células humanas,S diversas condiciones celulares para facilitar la comprensión de la dinámica de la organización del ARN en diversos contextos celulares. Todo el protocolo SPLASH experimental tarda aproximadamente 5 días en completarse y el flujo de trabajo computacional tarda aproximadamente 7 días en completarse.
Introduction
Estudiar cómo las macromoléculas se pliegan e interactúan entre sí es la clave para entender la regulación genética en la célula. Aunque se ha centrado mucho esfuerzo en la última década en la comprensión de cómo el ADN y las proteínas contribuyen a la regulación de genes, se sabe relativamente menos sobre la regulación post-transcripcional de la expresión génica. El ARN lleva información tanto en su secuencia lineal como en su estructura secundaria y terciaria 1 . Su capacidad de base de pares con sí mismo y con otros es importante para su función in vivo . Los recientes avances en el sondaje de la estructura secundaria de ARN de alto rendimiento han proporcionado información valiosa sobre las ubicaciones de las regiones de doble y única hebra en el transcriptoma 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , howeVer información sobre los compañeros de interacción de emparejamiento sigue siendo en gran parte falta. Para determinar qué secuencia de ARN está interactuando con otra región de ARN en el transcriptoma, necesitamos información global de pares.
Mapear las interacciones de ARN en pares de una manera global e imparcial ha sido tradicionalmente un desafío importante. Mientras que los enfoques anteriores, tales como CLASH 9 , hiCLIP 10 y RAP 11 , se utilizan para identificar las interacciones de ARN a gran escala, estas técnicas típicamente mapa de ARN base de emparejamiento de un subconjunto de ARN que interactúan con una proteína particular o especies de ARN. Los desarrollos recientes en el estudio de las interacciones globales de ARN incluyen el método RPL 12 , que no estabiliza las interacciones de ARN in vivo y, por tanto, sólo puede capturar un subconjunto de interacciones in vivo . Para superar estos desafíos, nosotros y otros desarrollamos estrategias genéticamenteP ARN interactomas in vivo , utilizando versiones modificadas del reticulador psoraleno 13 , 14 , 15 . En este protocolo, se describen los detalles para realizar S equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido Hybridos (SPLASH), que utiliza biotinylated psoraleno a la cruz de enlace de base RNAs in vivo , seguido por la ligación de proximidad y de alto rendimiento de secuenciación a Identificar ARN base de apareamiento asociados genoma en todo ( Figura 1 ] [ 15] .
En este manuscrito, describimos los pasos para realizar SPLASH utilizando cultivos de células adherentes, en este caso las células HeLa. El mismo protocolo puede adaptarse fácilmente a las células de mamífero en suspensión ya las células de levadura y bacterias. En resumen, las células HeLa se tratan con psoraleno biotinilado y se irradian a 365 nm para reticular los pares de bases de ARN que interactúan in vivo. A continuación, los ARN se extraen de las células, se fragmentan y se enriquecen para reticular regiones usando esferas de estreptavidina. Los fragmentos de ARN que interactúan se ligan entonces juntos usando ligación de proximidad y se convierten en una biblioteca de cDNA para secuenciación profunda. Tras la secuenciación, los ARN quiméricos se asignan en el transcriptoma / genoma para identificar las regiones que interactúan con ARN que están emparejadas entre sí. Hemos utilizado exitosamente SPLASH para identificar miles de interacciones de ARN in vivo en levaduras y diferentes células humanas, incluyendo el emparejamiento de ARN intramolecular e intermolecular en diversas clases de ARNs, tales como snoRNAs, lncRNAs y mRNAs, para vislumbrar la organización estructural y los patrones de interacción De ARN en la célula.
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Protocol
1. Tratamiento de las células HeLa con Bioralina y Extracción de ARN Biotiniladas
- Cultivo de células HeLa en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina estreptomicina (PS) en una placa de 10 cm.
- Lavar las células HeLa dos veces con 5 mL de 1x PBS. Escurra el exceso de PBS completamente del plato colocando el plato verticalmente durante 1 minuto.
- Añadir 1 ml de PBS que contiene 200 μM de psoraleno biotinilado y 0,01% p / v de digitonina, a las células uniformemente e incubar a 37 ° C durante 5 min. Mientras que el psoraleno biotinilado puede entrar en la célula, su permeabilidad es mucho mayor cuando las células se exponen a bajas cantidades de digitonina (0,01%) durante 5 min
- Retire la tapa de la placa de 10 cm que contiene las células HeLa tratadas y coloque el plato sobre hielo. Irradiar el plato que contiene las células con 365 nm UV durante 20 minutos en hielo, a una distancia de 3 cm de los bulbos UV, utilizando el reticulador UV.
- AislarOtal de células HeLa por extracción de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo siguiendo el protocolo del fabricante. Añadir volumen 1: 1 de isopropanol para precipitar el ARN a temperatura ambiente durante 30 min.
Pause Point: El ARN se puede almacenar a -20 ° C en isopropanol indefinidamente. Se puede realizar una transferencia de puntos en este paso para comprobar que el psoraleno biotinilado ha entrado con éxito en las células y tiene ARN reticulados in vivo ( Figura 2 ). - Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 mL de etanol frío al 70% al sedimento de RNA para lavar el ARN.
- Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Se retira el sobrenadante y se seca al aire el gránulo durante 5 min a temperatura ambiente.
- Añadir nuclease de agua libre a la pastilla de ARN y cuantificar la concentración de ARN utilizando un espectrómetro UV.
Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de fCongelación de las pestañas en nitrógeno líquido.
2. Fragmentación del ARN
- Precaliente 15 μL de tampón de fragmentación de ARN 2x y 10 μL de la muestra de ARN (1 μg / μl) individualmente en tubos de PCR de 0,2 ml, a 95 ° C durante 1 min. Mezclar 10 μL del tampón de fragmentación de ARN 2x calentado con 10 μl de muestra de ARN pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar la muestra a 95 ° C durante 5 min. Detener la reacción por enfriamiento rápido de la reacción sobre hielo.
- Transferir y mezclar las 2 reacciones de fragmentación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 40 μl de agua libre de nucleasa a la reacción, 10 μl de acetato de sodio 3 M, 1 μl de glucógeno y 300 μl de etanol al 100% a la reacción de fragmentación. Incubar el ARN a -20 ° C durante al menos 1 h para precipitar el ARN.
- Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 min, eliminar el sobrenadante y lavar el ARN usando 1 mL de etanol al 70%.
- Centrifugar el ARN a 20.000 xg durante 15 min, remEl sobrenadante y disolver el ARN en 20 μl de agua libre de nucleasa.
3. Selección y elución del tamaño del ARN
- Añadir 20 μL de colorante de carga de ARN al ARN recuperado en el tubo de microcentrífuga. Calentar el ARN con el colorante de carga de ARN a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
- Añadir 3 μl de colorante de carga de ARN a 0,25 μL de escala de ADN de 10 nt en un tubo de microcentrífuga. Calentar la escalera a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
- Cargar la escala desnaturalizada y las muestras en un gel de urea TBE 8,6 cm x 6,8 cm 6% y fraccionar el tamaño por electroforesis durante 40 min a 180 V. Manchar el gel en 10 ml de tampón TBE que contiene 1: 10.000 de mancha de gel de ácido nucleico durante 5 Min en la oscuridad.
- Perfore un tubo de microcentrífuga limpio de 0,6 ml en la parte inferior usando una aguja de 24 G y colóquelo en un tubo de microflujo de 2 ml.
- Visualizar las bandas en el gel post-teñido usando un transiluminador y cortar una rebanada de gel correspondiente a 90-110 nt. Transfiera la rebanada de gel en el tubo de microcentrífuga perforado de 0,6 ml en el tubo de microcentrífuga de 2 ml. Esta selección de tamaños se realiza para permitir que los fragmentos quiméricos tengan una longitud mínima para mapear al transcriptoma y para distinguir entre productos ligados de proximidad frente a productos no ligados en etapas de selección de tamaño aguas abajo.
- Centrifugar las rebanadas de gel a 12.000 xg a temperatura ambiente durante 2 minutos para desmenuzar la rebanada de gel y recogerla en el tubo de microcentrífuga de 2 ml. Deseche el tubo de microcentrífuga vacío de 0,6 ml. Añadir 700 μl de tampón de elución a la rebanada de gel triturada en el tubo de microcentrífuga de 2 ml e incubar a 4 ° C durante la noche con rotación constante, para permitir la difusión de las muestras en el tampón.
- Transferir las rebanadas de gel y el tampón de elución a un filtro de tubo de centrifugación y centrifugar a 20.000 xg durante 2 min. Las rebanadas de gel quedarán atrapadas en el compartimiento superior del filtro. Deseche las rebanadas de gel y el compartimento superior.
- Añadir 1 μl de glucógeno y 700 mu l de isopropanol al 100% al filtrado en el tubo de microcentrífuga y precipitar el ARN a -20ºC durante al menos 1 h o durante la noche.
Punto de Pausa: El ARN puede precipitarse en isopropanol indefinidamente a -20 ° C. - Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ARN. Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C.
- Retire el tampón de lavado y añada 20 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el ARN. Cuantificar la concentración de ARN utilizando un espectrómetro UV.
Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido.
4. Enriquecimiento de regiones de reticulación de ARN
- Vortex streptavidina revestimiento de perlas magnéticas vigorosamente para resuspender las perlas de forma homogénea en el tubo. Transferir 100 μl de perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colocarlo sobre un imánDurante 1 minuto para permitir que las perlas se peguen al lado magnético del tubo. Retire cuidadosamente el tampón de almacenamiento de las perlas y saque el tubo del soporte del imán.
- Añadir 1 ml de tampón de lisis a las perlas en el tubo de microcentrífuga y pipetear hacia arriba y hacia abajo. Coloque la microcentrífuga que contiene perlas en el soporte magnético durante 1 min para separar las perlas del tampón de lavado. Repita esto para un total de 3 lavados.
- Retire el tampón de lavado de las perlas colocando la microcentrífuga que contiene perlas en el soporte magnético durante 1 minuto. Añadir el inhibidor de RNasa (1: 200) al tampón de lisis y añadir 100 μl de tampón de lisis a las perlas lavadas en el tubo de microcentrífuga.
- Añadir 2 ml de tampón de hibridación recién preparado, 1 ml de tampón de lisis suplementado, 1,5 μg de ARN fraccionado de tamaño y 100 μl de perlas resuspendidas a un tubo de centrifugación cónico de 15 ml. Vórtice el tubo suavemente.
- Incubar el tubo cónico de centrifugación de 15 mL a 37 ° C durante 30 min con rotación de extremo a extremo.Precalentar el tampón de lavado a 37 ° C.
- Coloque los tubos cónicos de centrifugación de 15 mL en un soporte magnético para tubos de 15 mL durante 2 min para separar las perlas del tampón. Pipetear cuidadosamente el tampón del tubo y desecharlo.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado precalentado a las perlas, pipetear hacia arriba y hacia abajo y transferir las perlas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar en las perlas a 37 ° C durante 5 min, con rotación de extremo a extremo.
- Centrifugar brevemente el contenido del tubo de microcentrífuga. Colocar las perlas lavadas de 1,5 ml en tubos de microcentrífuga sobre un soporte magnético para tubos de 2 ml durante 1 min, para separar las perlas del tampón de lavado. Retire el tampón de las perlas pipeteando suavemente el tampón fuera del tubo de microcentrífuga.
- Añadir 1 ml de tampón de lavado precalentado a las perlas y pipetear hacia arriba y hacia abajo para repetir el lavado. Realizar un total de 5 lavados. Al final del 5º lavado, retire el tampón de lavado colocando la microfuga que contiene perlas en el soporte del imán para1 minuto.
5. Ligadura de Proximidad
- Añadir 1 ml de tampón de polinucleótido quinasa T4 (PNK) frío a las perlas lavadas e incubar las perlas durante 5 min a 4ºC, con rotación de extremo a extremo. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene las perlas en la banda magnética durante 1 min y retire suavemente el tampón T4 PNK. Repita este paso para un total de 2 lavados y retire el tampón T4 PNK después del último lavado.
- Añadir tampones a las cuentas, de acuerdo con la Tabla 1 . Para permitir que los extremos 3 'del fragmento de ARN se liguen a los adaptadores 3' a continuación, incubar las perlas en el tampón a 37 ° C durante 4 h con agitación constante para convertir el grupo fosfato cíclico 3 'al final del ARN a 3 'OH.
- Añadir tampones a la reacción anterior, de acuerdo con la Tabla 2 . Para permitir que el extremo 5 'de los fragmentos de ARN sea capaz de ligar, incubar la reacción a 37ºC durante 1 h con agitación constante en presencia de ATP, Para convertir 5 'OH en el ARN a 5' fosfato.
- Añadir tampón a la reacción anterior para realizar la ligación de proximidad, de acuerdo con la Tabla 3 . Incubar la reacción a 16 ° C durante 16 h, con agitación constante,
- Colocar la microcentrífuga que contiene el ARN ligado en un soporte magnético durante 1 minuto. Retire cuidadosamente el sobrenadante y agregue 1 ml de tampón de lavado a temperatura ambiente a las perlas. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Coloque el tubo de microcentrífuga sobre el soporte del imán durante 1 minuto y retire cuidadosamente el tampón de lavado. Realice un total de 2 lavados y retire el tampón de lavado de las perlas al final del segundo lavado.
- Añadir 100 μl de RNA PK Buffer a las perlas y resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Calentar las muestras a 95 ° C durante 10 minutos en un bloque de calor.
- Se enfría la muestra en hielo durante 1 min y se añaden 500 μl de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo a la muestra. Mezclar vorticialmente vigorosamente durante 10 s. Incubar la mezclaA temperatura ambiente durante 10 min.
Punto de Pausa: El ARN se puede almacenar en tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo a -80 ° C durante un par de meses. - Añadir 100 μl de cloroformo a las muestras extraídas de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. Vórtice vigorosamente durante 10 s. Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
- Transferir 400 μl de la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 800 μl (2 volúmenes) de etanol al 100% y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
- Transferir la solución de ARN a las columnas de limpieza de ARN y recuperar el ARN siguiendo las instrucciones del fabricante, asegurando que incluso los ARN pequeños se conservan. Eluir el ARN en 100 μl de agua libre de nucleasa.
Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido.
6. Reticulación inversa de Psoralen Biotinilado
- Transferir los 100 μl de las muestras eluidas en un pocillo de 24 pocillos plComió Quitar la cubierta e irradiar la muestra a UV 254 nm, durante 5 min en hielo.
- Transferir la muestra reticulada inversa a un tubo de microcentrífuga limpio. Añadir 10 μl de acetato de sodio, 1 μl de glucógeno y 300 μL de etanol al 100% y precipitar el ARN a -20 ° C durante al menos 1 h o durante la noche.
Pause Point: El ARN puede precipitarse indefinidamente en etanol a -20 ° C. - Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ARN.
- Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. Se retira el tampón de lavado y se añaden 4,25 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el ARN. Transferir el ARN a un tubo PCR de 0,2 ml.
Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido.
7. Transcripción inversa y Circularización de cDNA
- Añadir 0,75 μLDel conector de ARN (0,5 mu g / mu L) a la muestra resuspendida en el tubo de PCR y calentar a 80ºC durante 90 s. Colocar la muestra en hielo durante 2 min.
- Añadir los tampones a la muestra desnaturalizada para la ligación 3 'adaptador, de acuerdo con la Tabla 4 . Incubar la reacción a 25 ° C durante 2,5 h.
- Transferir la reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 90 μl de agua libre de nucleasa a la reacción, seguido de 10 μl de acetato de sodio, 1 μl de glucógeno y 300 μl de etanol al 100%. Precipitar el ARN a -20 ° C durante al menos 1 h o toda la noche.
Pause Point: El ARN puede precipitarse indefinidamente en etanol a -20 ° C. - Centrifugar el ARN precipitado a 20.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ARN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ARN.
- Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 g durante 15 minutos a 4 ° C. Quitar el tampón de lavado resuspender el gránulo en 5 μl de n libre de nucleasaAter
- Añadir 5 μL de colorante de carga de ARN al ARN recuperado en el tubo de microcentrífuga. Calentar el ARN con el colorante de carga de ARN a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
- Añadir 3 μl de colorante de carga de ARN a 0,25 μL de escala de ADN de 10 nt en un tubo de microcentrífuga. Calentar la escalera a 95 ° C durante 3 min y colocarlo en hielo durante 2 min.
- Realizar el fraccionamiento del tamaño utilizando gel de urea TBE de 8,6 cm x 6,8 cm 6% como en los pasos 3.3 y 3.4.
- Visualizar el gel teñido con tinción de ácido nucleico utilizando el transiluminador y cortar una rebanada de gel correspondiente a 110-140 nt en la escalera. Transfiera la rebanada de gel en el tubo de microcentrífuga perforado de 0,6 mL en el tubo de microcentrífuga de 2 mL y siga el protocolo de los pasos 3.6- 3.9.
- Añadir 5 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el sedimento de ARN. Transferir el ARN a un tubo PCR de 0,2 ml.
Pause Point: El ARN se puede almacenar a -80 ° C después de la congelación rápida en nitrógeno líquido. - Añadir 1 μl de cebador RT a 1,2581; M al ARN en el tubo de PCR y el calor a 80 ° C durante 2 min. Colocar la muestra en hielo durante 2 min.
- Añadir los tampones para la transcripción inversa de acuerdo con la Tabla 5 . Incubar la reacción a 50 ° C durante 30 min.
- Añadir 1,1 μl de NaOH 1 N a la reacción y calentar a 98 ° C durante 20 min. Colocar la reacción sobre hielo.
- Transferir la reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 90 μl de agua libre de nucleasa a la reacción, seguido de 10 μl de acetato de sodio, 1 μl de glucógeno y 300 μl de etanol al 100%. Precipitar el ADN a -20 ° C durante al menos 1 h o toda la noche.
Punto de Pausa: El ADN puede precipitarse en etanol indefinidamente a -20 ° C. - Centrifugar el ADN precipitado a 20.000 g durante 30 minutos a 4 ° C para recuperar el ADN. Se retira el sobrenadante y se añade 1 ml de etanol frío al 70% para lavar el sedimento de ADN. Centrifugar el sedimento lavado a 20.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. Quitar el tampón de lavado resuspender el pelDejar entrar 5 μl de agua libre de nucleasa.
- Realizar el fraccionamiento del tamaño utilizando gel de urea TBE de 8,6 cm x 6,8 cm 6% como en los pasos 3.3 y 3.4.
- Visualizar el gel post-teñido usando el transiluminador y cortar una rebanada de gel correspondiente a 200-240 nt en la escalera. El ADNc transcripto inverso es ahora 96 bases más largo que el fragmento de ARN debido a la adición del cebador RT de 96 bases. Transfiera la rebanada de gel en el tubo de microcentrífuga perforado de 0,6 ml en el tubo de microcentrífuga de 2 ml.
- Centrifugar las rebanadas de gel a 12.000 xg a temperatura ambiente durante 2 minutos para desmenuzar la rebanada de gel y recogerla en el tubo de microcentrífuga de 2 ml. Deseche el tubo de microcentrífuga vacío de 0,6 ml.
- Añadir 700 μl de tampón de elución a la rebanada de gel desmenuzado en el tubo de microcentrífuga de 2 ml e incubar a 37 ° C durante 2 h con rotación constante. Siga el protocolo como se describe en los pasos 3.7- 3.8.
- Añadir 6 μl de agua libre de nucleasa para resuspender el sedimento de ADN. Transferir el ADN a un tubo PCR de 0,2 ml.
- Añadir los tampones a la reacción para la circularización de cDNA, de acuerdo con la Tabla 6 . Incubar la reacción a 60 ° C durante 1 h y calentar a 80 ° C durante 10 min para inactivar la reacción.
- Transferir la reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Purificar el cDNA circularizado usando una columna de limpieza de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante. Añadir 20 μL de agua libre de nucleasa a la columna para eluir el cDNA purificado.
Pause Point: El ADN se puede almacenar a -20 ° C durante un par de meses.
8. Amplificación por PCR (PCR a pequeña escala)
- Añadir los tampones a la reacción según la Tabla 7 para la amplificación por PCR para probar el número mínimo de ciclos necesarios para la amplificación de la biblioteca.
- Configure las condiciones de ciclo de PCR de acuerdo con la Tabla 8 . Detener la reacción y transferir 5 μl deLa reacción de PCR a 10, 15 y 20 ciclos, en tubos separados de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 1 μl de colorante de carga de gel de ADN 6x a cada una de las 5 μL de reacción de PCR en los diferentes ciclos. Realizar electroforesis en gel en un gel de agarosa al 3%, a 120 V, durante 1 h para visualizar los productos de PCR.
- Utilice el número más bajo de ciclos de PCR (Y) que muestren una amplificación de alrededor de 250 bases (en la Figura 3 , hay una banda fuerte a 15 ciclos de amplificación y una banda débil a 10 ciclos. Generan suficiente material para la secuenciación profunda ya que la cantidad de cDNA utilizado es 10 veces la de la amplificación por PCR a pequeña escala).
9. Amplificación por PCR (PCR a gran escala) y purificación
- Añadir los tampones a la reacción de acuerdo con la Tabla 9 para la amplificación por PCR para PCR a gran escala.
- Configurar las condiciones de ciclo de PCR segúnTabla 10 .
- Añadir 5 μL de colorante de carga de gel de ADN 6x a los 25 μL de reacción de PCR y cargar en un pocillo de un gel de agarosa al 3%. Cargue 1 kb más la escalera de ADN en un pozo separado. Realizar electroforesis en gel a 100 V, durante 1,5 h.
- Visualice el gel completo usando un transiluminador UV.
- El tamaño extrae una rebanada de gel que contiene productos de PCR de 200 a 300 bases y transfiera el gel a un tubo de microcentrífuga limpio de 2 ml.
- Añadir 1 ml de tampón de solubilidad en gel, de un kit de extracción de gel de ADN, a la rebanada de gel e incubar a temperatura ambiente durante 30 min, o hasta que el gel se disuelva, con agitación constante.
- Añadir 200 μl de isopropanol al gel disuelto y mezclar bien por pipeteado. Transferir 700 μL de la muestra a una columna de limpieza de extracción de ADN en gel y centrifugar a 13.000 xg durante 30 s. Mantener la transferencia de la muestra disuelta en la columna hasta que toda la muestra se ha cargado en la columna.
- Añadir 500 μl de tampón de solubilidad en gel,Seguido de 700 μl de tampón de lavado de columna, a la columna, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Añadir 12 μl de agua libre de nucleasa al centro de la columna para eludir el ADN. Pause Point: El ADN se puede almacenar a -20 ° C.
- Cuantificar la concentración del ADN utilizando la cuantificación fluorométrica. Si se construyen varias bibliotecas y se agrupan juntas para la secuenciación, añada la misma cantidad de cada muestra al conjunto, para una secuenciación de alto rendimiento.
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Representative Results
La figura 1 muestra el esquema del flujo de trabajo SPLASH. Tras la adición de psoraleno biotinilado en presencia de 0,01% de digitonina y reticulación UV, se extrae el ARN total de las células y se realiza una transferencia de puntos para asegurar que la reticulación del biotinilado al ARN se ha producido de manera eficiente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controles positivos para titular la cantidad de psoraleno biotinilado a añadir a las células, de manera que aproximadamente 1 en cada 150 bases están reticuladas.
A medida que más eventos de duplicación de PCR tienden a ocurrir con ciclos de amplificación amplificados PCR, realizamos una amplificación de PCR a pequeña escala utilizando diferentes ciclos de PCR para determinar el menor número de ciclos de amplificación que proporcionará suficiente material para la secuenciación profunda. En un eficiente proceso de preparación deCapaces de amplificar una biblioteca de secuenciación de ADNc a partir de 1,5 μg de tamaño seleccionado de entrada de ARN en menos de 15 ciclos de amplificación por PCR ( Figura 3 ). La biblioteca se secuenció después usando lecturas de 2 x 150 pares de bases en una máquina de secuenciación de alto rendimiento y las lecturas de secuenciación se procesan entonces de acuerdo con la tubería computacional de la Figura 4 . El resultado final es una lista de interacciones quiméricas filtradas que incluye interacciones ARN-ARN intramoleculares e intermoleculares en el transcriptoma ( Tabla 11 ).
Figura 1 : Esquema del flujo de trabajo experimental de SPLASH 15 . Las interacciones de ARN en pares en el interior de la célula se reticulan usando psoraleno biotinilado bajo luz UV a 365 nm. El ARN reticulado es elExtraído y fragmentado a alrededor de 100 bases. Las regiones de interacción que contienen los reticulados de psoraleno biotinilados se enriquecen por unión a perlas de estreptavidina y se ligan entre sí. Tras reticulación inversa bajo luz UV a 265 nm, los ARN quiméricos se clonan a continuación en una biblioteca de cDNA para secuenciación profunda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ensayo de la eficacia de reticulación biotinilada mediante transferencia de puntos 15 . Dot blot de ARN reticulado de psoraleno biotinilado in vivo en presencia de digitonina al 1%. Diferentes concentraciones de ARN reticulado (20-2.000 ng) se manchan en la membrana. Diferentes concentraciones de 20 bases biotiniladasOligo se manchan como controles positivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Amplificación de la biblioteca en pequeña escala para SPLASH. 1 μ l de cDNA de la reacción RT se utiliza para la PCR a pequeña escala. Las reacciones se toman a los ciclos 10, 15 y 20 y se ejecutan en un gel de agarosa al 3% para determinar el número mínimo de ciclos de amplificación requeridos para la generación de la biblioteca. En este ejemplo específico, 10 ciclos de amplificación utilizando 10 μl de cDNA en una reacción de PCR a gran escala generarán suficientes amplicones para la secuenciación profunda.
| Reactivos | Volumen (μL) | Final |
| Nuclease libre de agua | 64 | |
| Tampón 10x T4 PNK | 8 | 1x |
| Inhibidor de la Rnasa (20 U / μl) | 4 | 1 U / μL |
| T4 PNK (10 U / μl) | 4 | 0,5 U / μl |
| Total | 80 |
Tabla 1: Reactivos para la reparación del extremo 3 '.
| Reactivos | Volumen (μL) | Final |
| Reacción de PNK | 80 | |
| Nuclease libre de agua | 3 | |
| Tampón 10x T4 PNK | 2 | 1x |
| 10 mM de ATP | 10 | 1 mM |
| T4 PNK (10 U / μl) | 5 | 0,5 U / μl |
| Total | Cien |
Tabla 2: Reactivos para la reparación del extremo 5 '.
| Reactivos | Volumen (μL) | Final |
| Reacción de PNK | 100 | |
| Tampón de ligasa de ARN 10x T4 | 6 | 1x |
| 10 mM de ATP | 6 | 1 mM |
| El inhibidor de la Rnasa (20 U / μl) | 4 | 0,5 U / μl |
| T _ {4} R _ {n1} (10 U / mu L) | 40 | 2,5 U / μL |
| Nuclease freE agua | 4 | |
| Total | 160 |
Tabla 3: Reactivos para la ligación de proximidad.
| Componente | Cantidad por reacción (μl) | Final |
| ARN y enlazador | 5 | |
| T4 Rnl _ {2} tampón (10x) | 1 | 1x |
| PEG 8000 (50%, p / v) | 3 | 15% (p / v) |
| El inhibidor de la Rnasa (20 U / μl) | 0,5 | 1 U / μL |
| T _ {4} Rn _ {2} (tr) (200 U / mu L) | 0,5 | 10 U / muL |
| Total | 10 |
Tabla 4: Reactivos para la ligadura del adaptador.
| Componente | Cantidad por reacción (μl) | Final |
| Ligadura y primer | 6 | |
| Membrana de primera cadena (5x) | 2 | 1x |
| DNTPs (10 mM) | 0,5 | 0,5 mM |
| DTT (0,1 M) | 0,5 | 5 mM |
| El inhibidor de la Rnasa (20 U / μl) | 0,5 | 1 U / μL |
| La transcriptasa inversa (200 U / μl) | 0,5 | 10 U / μL |
| Total | 10 |
Tabla 5: Reactivos para la transcripción inversa.
| Componente | Cantidad por reacción (μl) | Final |
| ADNc de primera cadena | 6 | |
| El tampón de ADN ligasa de cadena sencilla (10x) | 1 | 1x |
| Betaína (5 M) | 2 | 1 M |
| MnCl $ ₂ $ (50 mM) | 0,5 | 2,5 mM |
| DNA ligase de cadena sencilla (100 U / μl) | 0,5 | 5U / μL |
| Total | 10 |
Tabla 6: Reactivos para la circularización de cDNA.
| Componente | Cantidad por reacción (μl) | Final |
| Producto de ADN ligado | 1 | |
| Nuclease libre de agua | 10,5 | |
| Mezcla principal de ADN-polimerasa de alta fidelidad 2x | 12,5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 mu M |
| Índice (X) Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 mu M |
| Total | 25 |
Tabla 7: Reactivos utilizados para la PCR a pequeña escala.
| Paso | Temperatura | Hora | Ciclos |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | |
| Recocido | 65 ° C | 30 s | 25 |
| Extensión | 72 ° C | 30 s | |
| Extensión Final | 72 ° C | 5 minutos | |
| Sostener | 4 ° C | ∞ |
Tabla 8: Condiciones utilizadas para la PCR a pequeña escala.
| Componente | Cantidad por reacción (μl) | Final |
| Producto de ADN ligado | 5 | |
| Nuclease libre de agua | 6.5 | |
| Mezcla principal de ADN-polimerasa de alta fidelidad 2x | 12,5 | 1x |
| Universal PCR Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 mu M |
| Índice (X) Primer (10 μM) | 0,5 | 0,02 mu M |
| Total | 25 |
Tabla 9: Reactivos utilizados para la PCR a gran escala.
| Paso | Temperatura | Hora | Ciclos |
| Desnaturalización inicial | 98 ° C | 30 s | 1 |
| Desnaturalización | 98 ° C | 10 s | |
| Recocido | 65 ° C | 30 s | Y |
| Extensión | 72 ° C | 30 s | |
| Extensión Final | 72 ° C | 5 minutos | |
| Sostener | 4 ° C | ∞ |
Tabla 10: Condiciones utilizadas para la PCR a gran escala.
Tabla 11: Salida de análisis de la tubería computacional. "SAM flag split read 1" = 0 indica que la lectura se correlaciona con la cadena positiva del transcriptoma. "Identidad del ARN 1" se refiere a la identidad del ARN de la izquierda de la quimera. "Posición inicial ARN 1" se refiere a la posición inicial a la que se le asigna la lectura a lo largo del ARN 1. La expresión "posición final ARN 1" se refiere a la posición final a la que se le asigna la lectura a lo largo del ARN 1. La " A la puntuación de mapeo de la lectura que se asignó a ARN 1. "Cigar split leer 1"Indica el número de bases que fueron recortadas de la lectura "S" y el número de bases que se asignó a la lectura "M". "Split read 1" indica la secuencia que se asignó al ARN 1. La misma nomenclatura se utilizó para el lado derecho de la quimera, que se denomina RNA 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Discussion
Aquí, describimos en detalle el flujo de trabajo experimental y computacional para SPLASH, un método que nos permite identificar par-wise RNA interacciones en un genoma de ancho manera. Hemos utilizado exitosamente SPLASH en bacterias, levaduras y cultivos humanos y anticipamos que la estrategia puede ser ampliamente aplicada a diversos organismos bajo diferentes estados celulares. Uno de los pasos críticos en el protocolo es comenzar con al menos 20 μg de ARN reticulado para tener material adecuado para los procesos posteriores. El ARN se fragmenta a continuación a 100 bases y se selecciona el tamaño de PAGE. Estos pasos son importantes para nosotros para enriquecer preferentemente para quimeras ligadas, en lugar de monómeros durante el proceso de generación de la biblioteca. Normalmente recuperamos alrededor de 1,5 μg de ARN después de la fragmentación y la primera selección de tamaño, y el ARN se convierte a continuación en una biblioteca de cDNA de acuerdo con el flujo de trabajo de SPLASH. Encontramos que esta cantidad de ARN inicial nos permite generar suficiente material para hUna secuencia de alto rendimiento utilizando menos de 15 ciclos de amplificación por PCR. A medida que el número de eventos de duplicación de PCR aumenta de forma espectacular con el aumento de los ciclos de PCR, mantener el número de ciclos de amplificación baja es fundamental para poder extraer quimeras útiles y únicas en el análisis de aguas abajo.
A diferencia de otras estrategias basadas en psoraleno basadas en el genoma, SPLASH utiliza una versión biotinilada de psoraleno para reticular fragmentos de ARN en pares de bases entre sí. A medida que titulamos la cantidad de reticulación a aproximadamente un reticulado por ciento cincuenta bases, podemos enriquecer para regiones de ARN reticuladas usando esferas de estreptavidina después de la fragmentación del ARN. Además, realizar reacciones enzimáticas mientras que los ARN están unidos a perlas también nos permitió realizar intercambios de tampón y se lava convenientemente. Sin embargo, una de las limitaciones de la estrategia es que el psoraleno biotinilado es menos eficiente al penetrar en las células que el psoraleno o el 4'-aminometil-triOxsalen (AMT). Como tal, es crítico asegurar que el psoraleno biotinilado ha entrado en las células y reticulado los ARN de manera eficiente. Realizamos rutinariamente transferencias de puntos en ARNs reticulados, extraídos, junto con oligos biotinilados como controles positivos, para asegurar que nuestros RNAs están adecuadamente reticulados. En el caso de que la reticulación sea débil, se pueden usar estrategias para permear la membrana celular, tales como la adición de concentraciones bajas de digitonina (al 0,01%) durante 5 min, para permitir que el psoraleno biotinilado entre eficientemente en las células. Como el psoraleno absorbe a la misma longitud de onda que los ácidos nucleicos (UV 260 nm), utilizamos típicamente sistemas de cuantificación fluorométricos, en lugar de la absorción UV para la cuantificación de RNA reticulados.
Una limitación de las estrategias de reticulación basadas en psoraleno es que el psoraleno se reticula preferentemente en las uridinas (U). Como tal, regiones de emparejamiento de bases que son U pobres podrían ser perdidas durante la reticulación. Por tanto, mientras se detecta un evento de reticulación bY entre dos hilos proporcionan evidencia de que se está produciendo una interacción, la falta de reticulación no equivale a una falta de interacción. En nuestro protocolo SPLASH, capturar muy poco microRNA-mRNA interacciones, y bajas cantidades de interacciones lncRNA. Como mRNAs ARNm ligados a microRNA es probable que sea downregulated en la expresión génica y lncRNAs son típicamente poco expresado, su mala representación en nuestros datos se debe principalmente a la profundidad de secuenciación insuficiente. Normalmente secuenciamos al menos 200 millones de lecturas de extremo emparejadas por biblioteca de transcriptoma humano para cada replicación. A esta profundidad, la mayoría de nuestras lecturas de secuenciación caen sobre RNAs bastante abundantes. Anticipamos que el uso de estrategias de enriquecimiento para poblaciones específicas de ARN mejorará en gran medida la señal para estos ARN abundantes relativamente bajos. Otro desafío que observamos al analizar los datos quiméricos es distinguir entre verdaderos eventos quiméricos interactivos versus quimeras que se generan a partir del empalme. Para prevenir la contaminaciónF empalme lee en nuestra lista quimérica, filtramos lejos todas las lecturas que están cerca de los sitios de empalme anotados conocidos en el transcriptome. Anticipamos que con anotaciones de empalme más completas, la lista final de quimeras será aún más precisa.
Diferente de las estrategias anteriores que se centraron en las interacciones de ARN que son específicos de una sola especie de ARN o una única proteína de unión a ARN, la capacidad de SPLASH para mapear las interacciones ARN-ARN en todo el genoma de todos los ARNs nos permite estudiar a gran escala RNA Interacción y para identificar nuevas interacciones intramoleculares e intermoleculares ARN por primera vez. Utilizando SPLASH, hemos obtenido miles de interacciones intramoleculares e intermoleculares en los transcriptomas humanos y de levadura, lo que nos permite vislumbrar la organización y la dinámica del ARN interactome in vivo . Es probable que los avances en la integración de estos datos de interacción de ARN de largo alcance en los algoritmos de modelado de estructura de ARNRefinar nuestros modelos actuales de la organización del ARN in vivo . La incorporación de SPLASH en algoritmos de predicción de ARN intermoleculares, como los programas de predicción snoRNA, también puede mejorar la precisión de estas predicciones. Anticipamos que los usos futuros de SPLASH en otros organismos complejos y sistemas dinámicos seguirán arrojando luz sobre las complejidades de la regulación de genes basados en ARN en biología.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Wan y al laboratorio de Nagarajan por las discusiones informativas. N.Nagarajan es apoyado por el financiamiento de A * STAR. Y.Wan cuenta con el apoyo financiero de A * STAR y Society in Science-Branco Weiss Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb Plus DNA Ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10787026 | DNA ladder |
| 10 bp DNA ladder | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10821-015 | DNA ladder |
| 20% SDS solution | First BASE | BUF-2052-1L | |
| 20x SSC | First BASE | BUF-3050-20X1L | |
| 3.0 M Sodium Acetate Solution | First BASE | BUF-1151-1L-pH5.2 | Required for nucleic acid precipitation |
| 40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1 | Bio-Rad | 1610145 | TBE Urea gel component |
| Ambion Buffer Kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM9010 | |
| Ammonium Persulfate, Molecular Grade | Promega | V3131 | TBE Urea gel component |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| Chloroform | Merck | 1.02445.1000 | RNA extraction |
| Single strand DNA ligase | Epicentre | CL9025K | CircLigase II ssDNA Ligase |
| Centrifuge tube filters | Sigma-Aldrich | CLS8160-96EA | Costar Spin-X centrifuge tube filters |
| D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE | Sigma-Aldrich | D5628-1G | For cell treatment |
| Dark Reader Transilluminator | Clare Chemical Research | Dark Reader DR89X Transilluminator | Blue light transilluminator |
| DNA Gel Loading Dye (6x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | R0611 | Required for agarose gel electroporation |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Pan BioTech | P04-03500 | For Hela cell culture |
| Streptavidin magnetic beads | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 65002 | Dynabeads MyOne Streptavidin C1 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12301D | DynaMag-15 |
| Magnetic stand for 15 mL tubes | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 12321D | DynaMag-2 |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5382 000.015 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Biotinylated psoralen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 29986 | EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin |
| F8T5/BL | Hitachi | F8T5/BL | 365 nm UV bulb |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10270106 | Components of Hela medium |
| Formamide | Promega | H5052 | Component in hybridization buffer |
| G8T5 | Sankyo-Denki | G8T5 | 254 nm UV bulb |
| Glycogen | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 10814010 | Required for nucleic acid precipitation |
| Nanodrop | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Nanodrop 2000 | Spectrophotometer for nucleic acidquantification |
| Nuclease free water | First BASE | BUF-1180-500ml | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15140122 | Components of Hela medium |
| High-Fidelity DNA polymerase (2x) | Life Technologies Holdings Pte Ltd | F531L | Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x) |
| Primers Set 1 | New England Biolabs | E7335L | PCR primers |
| DNA Gel Extraction Kit | QIAgen | 28106 | QIAquick Gel Extraction Kit |
| Fluorometric Quantification kit | Life Technologies Holdings Pte Ltd | Q32854 | Qubit dsDNA HS Assay Kit |
| RNA clean up kit | Qiagen | 74106 | RNeasy Mini Kit Silica-membrane column |
| Rnase Inhibitor | Life Technologies Holdings Pte Ltd | AM2696 | SUPERase In |
| Reverse transcriptase | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 18080400 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix |
| Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies Holdings Pte Ltd | S11494 | SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | End repair enzyme |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | Enzyme for proximity ligation |
| T4 RNA Ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373L | Enzyme for adaptor ligation |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | TBE Urea gel component |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform | Life Technologies Holdings Pte Ltd | 15596018 | TRIzol® Reagent for RNA extraction |
| Urea | First BASE | BIO-2070-5kg | |
| UV crosslinker | Stratagene | 400072 | UV Stratalinker 1800 |
| UV Transilluminator | UVP | 95-0417-01 | For visualizing of bands |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | X4126-10G | |
| DNA cleanup it | Zymo Research | D4004 | Zymo DNA concentrator-5 |
| List of software required | |||
| FastQC software | 0.11.4 | http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ | |
| SeqPrep software | 1.0.7 | https://github.com/jstjohn/SeqPrep | |
| BWA software | 0.7.12 | http://bio-bwa.sourceforge.net/ | |
| SAMTOOLS software | 1.2.1 | http://www.htslib.org/ | |
| PULLSEQ software | 1.0.2 | https://github.com/bcthomas/pullseq | |
| STAR software | 2.5.0c | https://github.com/alexdobin/STAR | |
| rem_dups.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| find_chimeras.py PYTHON script | PYTHON 2.7.11 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| pickJunctionReads.awk AWK script | AWK GNU 4.1.2 | https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src | |
| Buffer composition | |||
| Elution buffer | |||
| 0.3 M sodium acetate | |||
| Lysis Buffer | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| 1% SDS | |||
| Always add Superase-in fresh before use except when washing beads | |||
| Proteinase K Buffer | |||
| 100 mM NaCl | |||
| 10 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 0.5% SDS | |||
| Hybridization Buffer | |||
| 750 mM NaCl | |||
| 1% SDS | |||
| 50 mM Tris-Cl pH 7.0 | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 15% formamide (store in the dark at 4 °C) | |||
| Always add Superase-in fresh before use | |||
| 2x SSC Wash Buffer | |||
| 2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock) | |||
| 0.5% SDS | |||
| 2x RNA fragmentation buffer | |||
| 18 mM MgCl2 | |||
| 450 mM KCl | |||
| 300 mM Tris-Cl pH 8.3 | |||
| 2x RNA loading Dye | |||
| 95% Formamide | |||
| 0.02% SDS | |||
| 0.02% bromophenol blue | |||
| 0.01% Xylene Cyanol | |||
| 1 mM EDTA | |||
| 3' RNA adapter sequence: 5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC |
|||
| RT primer sequence: AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG |
|||
References
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