Summary
Differentialscanningskalorimetri mäter termiska övergångstemperaturen (er) och den totala värmeenergi som krävs för att denaturera ett protein. Erhållna resultaten används för att bedöma den termiska stabiliteten hos proteinantigener i vaccinformuleringar.
Abstract
Differentiell svepkalorimetri (DSC) är en analytisk teknik som mäter den molära värmekapaciteten för proverna som en funktion av temperaturen. När det gäller proteinprover, DSC-profiler ger information om termisk stabilitet, och till viss del fungerar som ett strukturellt "fingeravtryck" som kan användas för att bedöma den strukturella konformation. Den utförs med användning av en differentiell avsökningskalorimeter som mäter termiska övergångstemperaturen (smälttemperatur, T m) och den energi som krävs för att störa interaktionerna som stabiliserar tertiärstrukturen (entalpi; AH) av proteiner. Jämförelser görs mellan formuleringar samt tillverkningssatser, och skillnader i beräknade värdena visar på skillnader i termisk stabilitet och strukturell konformation. Data illustrerar användningen av DSC i en industriell miljö för stabilitetsstudier samt övervakningsknapp tillverkningssteg tillhandahålls som ett bevis på effektiviteten i denna proprotokoll. I jämförelse med andra metoder för att bedöma den termiska stabiliteten av proteinkonformationer, är DSC kostnadseffektivt, kräver några provberedningsstegen, och ger också en fullständig termodynamisk profil av proteinet utspelas processen.
Introduction
Differentiell svepkalorimetri (DSC) är en experimentell metod som direkt mäter skillnaden i värmeenergi-upptag som äger rum i ett prov i förhållande till en referens under en reglerad temperaturändring 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Utförs i en differentiell avsökningskalorimeter, involverar metoden att införa värmeenergi i en provcell och en referenscell samtidigt medan identiskt ökning av temperaturen för båda cellerna över tiden 2, 13,14. På grund av skillnader i kompositionen av provet och referensen, kommer olika mängd energi att krävas för att höja temperaturen hos cellerna 2, 12, 13. Således är det överskjutande beloppet av energi som krävs för att kompensera för temperaturskillnaden mellan cellerna mäts och direkt korrelerad till specifika termodynamiska egenskaperna hos prov 1, 3.
På 1960-talet, MJ O'Neil och E. Watson av Perkin Elmer utvecklade den första differentialsvepkalorimeter för att mäta värmeflödet av fasta material 2, 3, 4. Parallellt PL Privalov och DR Monaseldze EL av Institute of Physics, Georgien (forna Sovjetunionen) skapat en unik differential adiabatisk kalori som kan användas for biokemisk forskning 5, 6. Därefter Andronikashvili team vid Institute of Physics, Georgien, rapporterade värmekapaciteten för biomolekyler, såsom fibrösa och globulära proteiner, DNA och RNA med hjälp av DSC 7, 8, 9. Flera grupper ledda av Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13, och Privalov 14, 15, 16 med fokus på utveckling av teori och praktiska tillämpningar av DSC för att undersöka de termodynamiska detaljer protein utspelas. Värdet på DSC i att studera stora supramolekylära strukturer såsom fager, kloroplast, fosfolipid flytande kristaller, och köttproteiner har också rapporterats 17 sup>, 18, 19, 20.
DSC har nu blivit vardagsmat i farmaceutisk forskning och utveckling för att bedöma den termiska stabiliteten hos biomolekyler, särskilt proteiner 1, 21, 22. Detta beror till största delen framsteg i termer av känslighet och automatisering av instrumentering som används för att utföra experimentet 23, 24. Här, det slutliga resultatet av DSC experiment, nämligen molar värmekapacitet som en funktion av temperaturen, används för att beräkna följande termodynamiska parametrar (förändring i värmekapacitet (ACp), entalpi (AH), entropi (AS) och Gibbs fria energi (AG)) med användning av ekvationen nedan:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Där Cp mäts värmekapacitet; q är värmeflödet in i testmaterialet; T 0 och T är de initiala och slutliga temperaturer övergången respektive 22, 25. Det är också värt att notera att ekvationerna ovan gäller enkeldomänproteiner som kan genomgå två-tillståndsövergång och reversibel termisk utspelas 22. Analys av mera komplexa proteiner (t.ex., icke-två-state-proteiner, och oligomerer) have rapporterats av Friere et al. 26; Johnson et al. 27; och Kasimova et al. 28.
För att bestämma huruvida ett protein genomgår två-tillståndsövergång eller bildar mellan under termisk denaturering, det experimentellt härledda entalpin (AH, även kallad kalorimetrisk entalpi AH Cal) jämförs med entalpin härleds med hjälp av van't Hoff ekvationen nedan (också kallas van't Hoff entalpi, AH VH):
(6)
Där Tm är mittpunkten temperatur övergången, R är idealisk gaskonstanten (1,987 cal mol -1 K -1) och Y är den del av proteinet befolkningen i ovikt skick 16, 29. OmAH VH är lika med AH Cal; eller AH VH / AH Cal är lika med ett, då proteinet genomgår en "allt-eller-inget" övergång (dvs två-tillståndsövergång) 16, 25, 29. Men om AH VH är mindre än AH Cal; eller AH VH / AH Cal är mindre än 1, proteinet undergår en icke-två-tillståndsövergång 16, 25, 29. Förhållandet AH VH / AH Cal motsvarar också den andel av proteinstrukturen som smälter som en termodynamisk kooperativ enhet eller domän 26.
De termodynamiska parametrar som nämns ovan, såsom AG och AH ge värdefull information om den termiska stabiliteten hos proteiner, inklusive biologiska 30. Dock kommer tyngdpunkten att läggas på Tm och AH i denna publikation, eftersom de är de rapporterade värdena för detta protokoll. Tm är den Mitttemperaturen för övergången, där den vikta och ovikta tillstånd hos proteinet är vid jämvikt (dvs AG = 0) 25, 31. Ju högre Tm för ett protein, desto högre är dess termiska stabilitet 31. AH motsvarar arean under toppen (er) i värmekapacitet som funktion av temperaturen grafen (även känd som termogram) som genereras vid slutet av DSC experiment 16, 25. Det är den energi som krävs för att denaturera proteiner och kan användas för att uppskatta den aktiva fraktionen (F a) i en formulering protein (dvs andelen av proteiner med aktiv konformation i ett prov) med användning av följande ekvation:
jove_content ">
(7) Där AH är den experimentellt härledda entalpin av proteinprovet och Q är entalpin bestämts för en väl karakteriserad referens eller standardiserade protein 22. Uppskattningen av Fa är viktig för att övervaka realtids stabilitet produkter samt genomföra stabilitetsstudier under stressförhållanden i enlighet med ICH riktlinjer 32. Jämförelse av AH ger också information om kompaktheten tertiärstrukturen konforma av ett protein 31.
Detta protokoll detaljer ett förfarande för bedömning av den termiska stabiliteten hos proteiner i en industriell miljö och har i stor utsträckning använts för formulering av vacciner. Det har utvecklats med en automatiserad differentialscanningkalorimeter som genererar reproducerbara resultat feller proteinkoncentrationer så låga som 300 mikrogram / ml.
Protocol
1. Instrument Uppstart
- Slå på differentiell avsökningskalorimeter och öka trycket i cellerna för att undertrycka kokning av proverna samt förhindra bildandet bubblor vid förhöjda temperaturer. Detta uppnås typiskt genom att tillföra kväve in i systemet.
- Beroende på det konstituerande material i cellen (t.ex. tantal, guld, platina, etc.), justera trycket i kvävgastillförseln i enlighet med tillverkarens rekommenderade tryck för att undvika skador på cellen. Till exempel ställa in trycket i kvävgastillförseln till 45 psi för det instrument som används för att utveckla denna procedur, och tryck över 80 psi kan skada cellen.
- Se till att alla rengöringsmedel reservoarer de är fyllda till önskad volym. Rengöringsmedel som krävs innefattar tvättmedel och vatten för att tvätta och rengöra cellen respektive efter varje provkörning.
- Ställ in temperaturen hos provet förvaringsbehållarentill ett lämpligt värde, företrädesvis 5 ° C, för att upprätthålla integriteten av provet före experimentet.
2. Provberedning
- Dialysera provet mot buffert som kommer att användas som referens för experimentet. Alternativt kan elueringsbuffert uppsamlas vid det slutliga steget i proteinrening (dvs. kolonneluering) användas.
- Bestämma koncentrationen av proteinprovet med användning av den mest lämpliga proteinkoncentrationen bestämningsmetoden såsom Kjedahl metod 33 eller Lowry-metoden 34. För objektiv jämförelse av resultaten, använda samma metod genomgående i samma studie. Den erforderliga koncentrationsområdet kan variera beroende på vilken modell av instrumentet. För instrument som används i detta protokoll, är det att föredra arbetsområde 0,5-1 mg / ml.
- Avgasa provet och referensbuffert i vakuum för att bli av med mikrobubblor som kan orsaka volym inaccurACY. Detta steg kan hoppas över för nyare kalorimeter modeller.
- Med användning av en mikropipett och sterila spetsar i ett laminärt flöde biologisk inneslutning skåp, ladda proven och deras respektive buffert i par in i plattor med 96 brunnar som är kompatibla med instrumentet. Fyll de första två paren av brunnarna med buffert och de sista två par med vatten för bufferten-buffert och vattnet scan respektive. Buffert-buffert skannar kontrollera lämpligheten av instrumentet före provmätning (dvs. bedömning av instrumentering fel) samt upprätta en baslinje; medan vatten skannar drivs för att rengöra cellerna.
- Täck 96-brunnar med en tätningsfilm, och se till att brunnarna är ordentligt tätade innan plattan ur biosäkerhet skåpet för att undvika kontamination.
- Placera plattan i provet förvaringsbehållaren i den korrekta orienteringen.
3. Experimentell Parameter Setup
Obs! Beroende på instrumentation kan prover laddas i cellen antingen manuellt med hjälp av en spruta, eller automatiskt med hjälp av en automatisk provtagare. I detta fall (det vill säga en industriell miljö) är en autosampler används för att spara tid.
- Med hjälp av förvärv programvara anger prov information i den ordning plattan laddades enligt avsnitt 2.4. Ange koncentrationer om möjligt, annars anger koncentrationsvärden i analysprogram före dataanalys (avsnitt 4.2).
- Välj det alternativ som säkerställer rengöring av celler med rengöringsmedel före varje prov scan, vilket bör följas av flera vattensköljning åtgärder för att säkerställa att inget tvättmedel rester finns kvar i cellerna.
- Ställa in starttemperatur av experimentet till 20 ° C, men detta kan variera beroende på tidigare kunskap om provet. För kända proteiner, kan förutbestämda starttemperatur användas, medan en lägre starttemperatur kan användas för okända prover.
- Ställ den slutliga temperaturenav experimentet, t ex 100 ° C. Sluttemperaturen kan variera beroende på tidigare kunskap om provet.
- Ställa in avsökningshastighet av experimentet, t ex 60 ° C / h, vilket är den typiska avsökningshastighet. Emellertid kan avsökningshastighet variera beroende på tidigare kunskap av provet, t ex 90 ° C / h, eller 120 ° C / h. Det är tillrådligt att skanna okända prover vid olika svephastigheter att bedöma kinetiken för utspelas.
- Återskannings prover för att undersöka reversibiliteten av den termiska utspelas. Den pågående av ett protein anses reversibel om entalpi erhålls för andra skanningen är åtminstone 80% av den entalpi värdet för den första skanningen.
- Ställa in post-experimentet termostat till 10 ° C för att bevara integriteten hos kalorimetern celler.
- Kontrollera att experimentet inställningsparametrar är korrekta innan du kör experimentet. Om allt är på plats, starta experimentet.
4. Data EnALYS
- Hämta rådata från experimentet och välj ett prov vid en tidpunkt för analys. Subtrahera referens scan, dvs buffert, från provskanningen.
OBS: Referens subtraktion utförs automatiskt av nyare modeller av DSC instrument. - Ange provkoncentrationsvärdet om det uteslöts enligt avsnitt 3.1.
- Montera och subtrahera baslinjen från det förvärvade termo att ta hänsyn till skillnader i värmekapaciteten hos de vikta och ovikta tillstånd av proteinet som orsakas av exponering av hydrofoba grupper till vatten vid utspelas. Linjär eller kubisk kurvanpassning kan tillämpas beroende på formen av den DSC-profil för provet. För enhetlighetens skull samma typ av koppling måste användas under en studie, t.ex. realtidsstabilitetsstudie. Detta steg krävs för att bearbeta kurvan för toppintegrering att erhålla entalpin av övergången.
- Utföra toppintegrering med användning av icke-linjär minsta kvadratanpassning. Grundar sig på produktkunskap tillämpas två stater eller icke-tvåstatsmodell. Tvåstatsmodell kan användas för enstaka kooperativa termiska övergångar och för okända proteiner, tillämpa icke-två tillståndsmodell tills vidare kunskap produkten är tillgänglig. I förekommande fall, justera kurvan montering med hjälp av iterativa kurvanpassningsfunktion utrustningens programvara tills Chi-värdet förblir konstant.
- Erhållna resultaten kommer att visa värden för mittpunkten av övergångstemperaturer (TM), kalorimetrisk entalpi (AH), och van't Hoff entalpi (AH VH) av provet.
Representative Results
Rådata från de flesta DSC experiment presenteras som ett värmeflöde mot temperatur diagram, som kalorimetern mäter faktiskt skillnaden i hastigheten för värmeflödet in i provlösningen och buffert 35. Därför, om båda cellerna (dvs. prov och referensceller) innehåller identiska lösningar under ett experiment, bör rådata från skanningen vara en rak linje utan observerbara toppar. Alla topp observeras kan hänföras till instrumentering fel (t.ex. skadade eller förorenade celler), vilket är anledningen till att köra buffert skannar före provanalysen är ett lämpligt system lämplighetstest. Figur 1 visar resultatet av en typisk buffert scan indikerar att kalori var i gott skick före provanalys.
Figur 2 visar rådata för ett DSC experiment utfördes på difftekniker när massor av två proteinprover. Såsom antytts tidigare, de observerade topparna är skillnaderna i värmeflödet av proven och deras respektive buffertar. Skillnader i provkoncentration kan orsaka variationer i värmekapacitet som registrerats av kalorimeter; men dessa variationer är normaliseras under provanalys enligt avsnitt 4.2 i förfarandet. Högre koncentrationer kan också avslöja ytterligare termodynamiska domäner inte bidrar till övergången vid lägre koncentrationer. Dessutom representerar varje övergång av en termodynamisk domän som kan innefatta en eller flera strukturella domäner av proteinet 36. I det här fallet, det protein 1 har tre strukturella domäner som smälter samarbete.
Figur 3 visar resultaten som genereras från analysen av rådata för protein ett och två som presenteras i Figur 2, det vill säga, efter baslinjesubtraktion och iterativ kurva fimma. De resulterande termo har normaliserats för att skanna hastighet (automatiskt utförs av en förinställd algoritm i analysprogram) och koncentration; därmed presentera resultaten av experimentet i jämförbara värmekapacitet jämfört med temperaturkurvor. Analysen Programvaran använder data från värmekapacitet jämfört med temperaturkurvor, såsom Tm och ACp, att härleda andra termodynamiska parametrar med variationer av ekvationerna ovan angivna beroende på kooperativitet protein utspelas.
Vid testning av okända prover, ställa in lämpligt temperaturområde är avgörande. Annars kan ofullständiga termogram resultera, såsom illustreras i figur 4. Även Tm från sådana profiler kan härledas, AH kan inte fastställas exakt. Därför måste provet testas med en större temperaturområde för att helt fånga den termiska övergången. Vissa proteiner re ocksåadily bilda aggregat efter fullständig denaturering, vilket resulterar i en ökande post-övergångsvärmekapacitet: denna visas ofta som en ofullständig termogram som visas i figur 2B. Emellertid kan testa om med en högre sluttemperatur hjälpa bekräfta om det finns en förekomst av en konformationsövergång vid det område av termogrammet eller det är bara det värmeabsorberande effekten av proteinaggregat.
Termisk stabilitet är en av de mest betydelsefulla fysikaliska egenskaper hos proteiner och proteinbaserade produkter i branschen 37. I läkemedel, används den för att bestämma stabiliteten av biologiska under olika förhållanden, inklusive formuleringsbuffertar och miljöfaktorer såsom fukt och temperatur. Det används också för att övervaka nyckeltillverkningssteg (t.ex. rening och avgiftning) för att säkerställa konforma överensstämmelse mellan produktionspartier.
Figur 1: Buffert Scans. Likheten i lutning varje avsökning med några observerbara toppar indikerar att instrumentet är i gott skick och genererade reproducerbara resultat.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: uppgifter som samlats in från DSC Experiment. Diagrammen är bra representationer av oanalyserade (råa) data som erhållits efter experimentella körningar (dvs före baslinjesubtraktion och kurvanpassning). Varje linje representerar en produktionssats. Protein 2 tenderar att aggregera lättare vid upphettning, vilket resulterar i en ökning av värmekapaciteten över 100 ° C i den post-övergångsområdet av termogrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Analyserade DSC data. Diagrammen är bra representationer av analyserade DSC-data (dvs. efter baslinjesubtraktion och kurvanpassning). Den blå linjen representerar termo efter baslinjesubtraktion, medan den röda linjen representerar kurvan med bäst anpassade till termo. (A) Den Tm och AH för Protein 1 Prov # 12 är 80,16 ° C och 1,69 x 10 6 cal / mol respektive. (B) Den Tm och AH för Protein 1 Prov # 13 är 80,15 ° C och 1,71 x 10 6 cal / mol respektive. (C) T m och AH för Protein 2 Prov nr 21 är 75,01 ° C och 4,08 x 10 6 cal / mol respektive. (D) T m och AH för Protein 2 Prov nr 22 är 75,67 ° C och 4,22 x 10 6 cal / mol respektive. Klicka här för atten större version av denna siffra.
Figur 4: En ofullständig termo. Rådata samla för Protein 1 analyseras vid en otillräcklig temperaturområde. Den slutliga temperaturen hos experimentet var inställd på 90 ° C som inte rymma hela övergångsprofil av proteinet jämfört med experimentet för figur 2A, som var inställd på 120 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: analyserade data som visar effekten av kemisk avgiftning på den tertiära strukturen av protein 1. (A) Protein 1 är ett toxin i sin nativa konformation och haär dess Tm vid 56,84 ° C och AH vid 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) Den detoxifierat formen av Protein 1 (dvs toxoid) har Tm och AH värden av 81,01 ° C och 1,89 x 10 6 cal / mol respektive. Således kan man dra slutsatsen att avgiftningssteget infört någon form av ändring av den strukturella konforma av protein ett som ger större stabilitet (högre Tm) till dess avgiftade formen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: analyserade data som visar effekten av Lagringsförhållanden på konformation av protein 3. Dessa kurvor visar effekten av lagringstemperatur (2-8 ° C) på stabiliteten och tertiära strukturen hos ProTEIN tre över 30 veckor. Tm och AH-värdena för Protein 3 vid 8: e (A) och 38: e veckan (B) i lagrings ges i tabell 1 nedan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Tm 1 (° C) | AH 1 (cal / mol) | Tm 2 (° C) | AH 2 (cal / mol) | Tm 3 (° C) | AH 3 (cal / mol) |
| Protein 3 förvaras vid 2-8 ° C under 8 veckor | 61,91 | 1,71 x 10 5 | 75,54 | 2,17 x 10 5 | 90,29 | 4,17 x 10 5 |
| 61,87 | 1,66 x 10 5 | 75,18 | 1,46 x 10 5 | 90,22 | 5,76 x 10 5 |
Tabell 1: Tm och AH Värden för Protein 3 på 8: e och 38: e veckan av lagring vid 2-8 ° C. Även om Tm-värdena vid båda tidpunkterna är likartade, skillnaden i AH-värden indikerar att den tertiära strukturen av protein 3 har brutits ned under 30 veckor under specificerade förvaringstillstånd.
Discussion
Detta förfarande har framgångsrikt införlivats i olika karakterisering testförpackningar, även stabilitet och produktjämförelsestudier 21. I realtid stabilitetsstudier är DSC används för att övervaka Tm, samt uppskatta Fa av biologiska över tiden för att bestämma deras hållbarhet. När det gäller produktjämförelse används den för att bedöma effekten av processen och anläggningen förändring samt effekten av viktiga tillverkningssteg på den strukturella konforma producerade partier. Detta innebär vanligtvis direkt jämförelse av AH producerad mycket att en referensprodukt som har utsetts till den perfekta produkten. Dessutom har DSC visat sig vara ett användbart analytiskt verktyg för produktformuleringsstudier 37. Tm för ett protein i olika buffertar och vid olika koncentrationer kan användas för att bestämma den formulering som visar istället det mest stabilitet vidproteinet.
För att säkerställa tillförlitligheten hos denna metod och objektivitet av dess resultat är det viktigt att hålla testparametrar konsekvent från körning till körning inom samma studie (t.ex. vaccinformulering studien). Emellertid kan förfarandet modifieras för att rymma skillnader i de fysikaliska egenskaperna hos olika proteiner. Ett exempel på en modifiering som kan göras är att förändra avsökningshastighet av experimentet 38, 39. Proteiner som var benägna att bilda aggregat vid uppvärmning undersöktes i en snabbare avsökningshastighet (t.ex. 120 ° C / h) för att undvika bidrag av aggregat till det termiska övergångs profil samt igensättning kapillärerna i kalorimetern. Det är värt att notera att scanningshastighet kan påverka resultatet av en DSC experiment 38. Breddning av den termiska omvandlingstopp har observerats med ökande rotationshastighet i vissa proproteiner; dock Tm förblev relativt konstant 38. Dessutom dialys och avgas steg för provberedning är också mycket viktigt för korrekta resultat 31. Dialys säkerställer att den enda skillnaden i kompositionen av provet och bufferten är proteinet; sålunda kan all överskottsvärme som absorberas av provet tillskrivas värmekapaciteten hos proteinet. Avgasning säkerställer exakt volymanalys, som en extrapolering av den termodynamiska parametern förutsätter att den pågående händelsen inträffar under konstant volym och tryck 31. Det konstanta trycket delen av antagandet utgörs av kväve trycksättning av systemet enligt punkt 1.1 i förfarandet.
I jämförelse med andra metoder för bestämning av stabiliteten av proteinkonformationer, såsom cirkulär dikroism (CD) och fluorescensspektroskopi, erbjuder DSC ett antal fördelar i en comkommersiell miljö inklusive kostnads- och tidsbesparingar. För det första, den adiabatiska utformningen av en differentiell avsökningskalorimeter möjliggör mätning av termisk stabilitet med bättre temperatur precision jämfört med mätningar med instrumentering för CD och Fluorescence spektroskopier 6. För det andra, till skillnad från CD, är noggrannheten i DSC-data inte beroende av helicitet av proteinet 39, 40; Men CD ger ytterligare information om den pågående av sekundärstrukturen, vilket skulle vara ett komplement till DSC 41. Dessutom möjliggör trycksättningen av DSC systemet för provning med ett brett temperaturområde utan kokning av provet; således kan ett stort antal olika proteiner testas genom DSC.
Medan DSC är en relativt snabb och okomplicerad metod för att bestämma den termiska stabiliteten av biologiska, är det inte utan begränsningar. Först, basenline subtraktion steg införs någon form av mänsklig inkonsekvens i rådataanalys; således kan variationer i resultaten observeras mellan olika användare. För det andra, differentialavsökande kalorimetrar har minimikoncentrationsgränser som kan vara svåra att uppnå på bulktillverkningsskala. För det tredje, den AH av irreversibel termisk denaturering är inte absolut; vilket innebär att härledd AG (en indikator på proteinstabilitet) i liknande situationer kan vara missvisande. Dessutom fungerar metoden bäst för renade prover. Närvaron av föroreningar kan antingen orsaka en förskjutning i T m om det finns en interaktion med proteinet under utredning, eller uppkomsten av nya termiska övergångar, om det inte finns någon interaktion. I varje fall dessa extra funktioner på termo kan felaktigt tillskrivas prover, vilket påverkar tolkningen av resultaten. Trots dessa begränsningar fortfarande DSC en tillförlitlig metod som kan ge detaljerad termodynamisk information om thE-proteinet utspelas process om de genomförs på rätt sätt 42.
Sammanfattningsvis erbjuder DSC avsevärd fördel som en konforma avläsning verktyg för vaccinprodukter och deras mellanhänder. De två parametrar, Tm och AH, som samlats för en rad partier av samma produkt kan bli en empirisk baslinje som kan användas för att undersöka effekterna av processförändringar, formulering och lagringsförhållanden på den tertiära strukturen och stabiliteten av protein och virala antigener 21, 43.
Disclosures
Alla författare är anställda vid Sanofi Pasteur. Arbetet har finansierats av Sanofi Pasteur, och publiceringsersättningar för video-artikeln betalades av Sanofi Pasteur. Författarna har inga relevanta tillhörighet eller finansiella engagemang med någon organisation eller företag som har en ekonomisk konflikt med ämnet eller material diskuteras i manuskriptet. Dessa inkluderar sysselsättning, konsulter, aktieinnehav eller alternativ, eller royalties.
Ingen skriv bistånd användes i produktionen av detta manuskript.
Acknowledgments
Författarna är mycket tacksamma till Joseph Mancini (tidigare med GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments Limited) för sin roll i installation och utbildning på differentialsvepkalorimeter, Sasmit Deshmukh och Webster Magcalas för sina diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
| Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
| 500 µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
| MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
| Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ - A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |
References
- Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).
- Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. Watson, E. S., O'Neil, M. J. , US3263484A 02 August (1966).
- O'Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).
- O'Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).
- Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).
- Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).
- Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).
- Andronikashvili, E. L., et al. Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).
- Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).
- Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).
- Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).
- Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
- Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).
- Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).
- Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).
- Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
- Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).
- Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).
- Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
- Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).
- Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).
- Jiskoot, W., Daan, C. Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, Springer Science & Business Media. (2005).
- Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).
- Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
- Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
- Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).
- Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).
- Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).
- Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
- Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).
- Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), current step. 4 (2003).
- Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. Differential Scanning Calorimetry. , Springer Science & Business Media. (2003).
- Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).
- Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
- Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).
- Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).
- Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).
- Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).
- Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).
