Summary
Дифференциальная сканирующая калориметрия измеряет термическую температуру перехода (ы) и суммарное количество тепловой энергии, необходимой для денатурации белка. Полученные результаты используются для оценки термической стабильности белковых антигенов в вакцинных препаратах.
Abstract
По данным дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) представляет собой аналитический метод, который измеряет молярной теплоемкости образцов в зависимости от температуры. В случае образцов белка, профили ДСК дают информацию о термической стабильности, и в некоторой степени служит в качестве структурного "отпечатки пальцев", которые могут быть использованы для оценки структурной конформации. Это выполняется с помощью дифференциального сканирующего калориметра , который измеряет температуру термической перехода (температура плавления, Т м) и энергии , необходимой для разрушения взаимодействий стабилизирующие третичную структуру (энтальпию; & delta ; н) белков. Сравнения между рецептур, а также производственных партий, а также различия в полученных значениях указывают на различия в термической стабильности и структурной конформации. Данные, иллюстрирующие использование DSC в промышленных условиях для исследований стабильности, а также мониторинг ключевых производственных этапов представлены в качестве доказательства эффективности этой протокол. По сравнению с другими методами для оценки термической стабильности конформации белков, DSC является экономически эффективным, требует несколько шагов подготовки проб, а также обеспечивает полный профиль термодинамического процесса разворачивания белка.
Introduction
По данным дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) представляет собой экспериментальный метод , который непосредственно измеряет разницу в поглощении энергии тепла происходит в образце относительно эталона во время регулируемого изменения температуры 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Проведенная в дифференциальном сканирующем калориметре, способ включает в себя введение тепловой энергии в ячейку для образца и опорной ячейки одновременно в то время как одинаково увеличивая температуру обеих клеток в течение долгого времени 2, 13,14. Из - за разницы в составе образца и справки, различное количество энергии будет необходимо повышать температуру клеток 2, 12, 13. Таким образом, избыточное количество энергии , необходимой для компенсации разницы температур между клетками измеряют и непосредственно коррелирует с конкретными термодинамическими свойствами образца 1, 3.
В 1960 - е годы, MJ О'Нил и Е. Уотсон Perkin Elmer разработал первый дифференциальный сканирующий калориметр для измерения теплового потока твердых материалов 2, 3, 4. Параллельно с этим, П. Л. Привалов и DR Monaseldze EL Института физики, Республика Грузия (бывший СССР) создал уникальный дифференциальный адиабатический калориметр, который может быть использован FOг биохимические исследования 5, 6. Впоследствии команда Э. Л. Андроникашвили в Институте физики Республики Грузии, сообщает теплоемкость биомолекул , таких как волокнистые и глобулярных белков, ДНК и РНК с использованием DSC 7, 8, 9. Несколько команд во главе с Стертевант 10, 11, 12, 13, Brandts и Привалова 14, 15, 16 направлены на развитие теории и практического применения ДСК для исследования термодинамических деталей разворачивания белка. Значение ДСК при изучении крупных надмолекулярных структур , таких как фагов, хлоропласт, фосфолипидных жидкие кристаллы, и белки мяса также сообщалось 17 SUP>, 18, 19, 20.
DSC теперь стало обычным явлением в фармацевтических исследованиях и разработках для оценки термической стабильности биомолекул, особенно белки 1, 21, 22. В основном это связано с прогрессом с точки зрения чувствительности и автоматизации приборов , используемых для проведения эксперимента 23, 24. Здесь конечный результат ДСК эксперимента, а именно, молярной теплоемкости в зависимости от температуры, используется для оценки следующих термодинамических параметров (изменение теплоемкости (ΔCp), энтальпия (H), энтропией (& Dgr; S) , и свободная энергия Гиббса (ΔG)) с помощью уравнения ниже:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Там, где Cp измеряется теплоемкость; д представляет собой поток тепла в исследуемом материале; Т 0 и Т являются начальная и конечная температуры перехода соответственно 22, 25. Стоит также отметить , что приведенные выше уравнения применимы к однодоменных белков , которые могут пройти два-переход между состояниями и обратимое термическое разворачивание 22. Анализ более сложных белков (например, не с двумя состояниями белков и олигомеры) чпр сообщили Фрира и др. 26; Джонсон и др. 27; и Касимова и др. 28.
Для того, чтобы определить , подвергается ли белок с двумя состояниями переход или образует промежуточные продукты в процессе термической денатурации, экспериментально полученных энтальпию (& Dgr ; H, называемый также калориметрические энтальпией & delta ; н Cal) сравнивается с энтальпией , полученной с помощью уравнения Вант - Гофф , приводимому ниже (также упоминается как Вант - Гоффа энтальпией; & Dgr ; H VH):
(6)
Где T м является серединой температура перехода, R является идеальным газовая постоянная (1,987 кал моль -1 К -1) и Y представляет собой долю населения белка в разложенном состоянии 16, 29. Если& Dgr ; H VH равно Cal ; H; или & Dgr ; H VH / Cal & Dgr ; H равен 1, то белок подвергается "все или ничего" переход (т.е. с двумя состояниями перехода) 16, 25, 29. Тем не менее, если & Dgr ; H VH меньше Cal & delta ; H; или & Dgr ; H В.Х. / & Dgr ; H Кал меньше , чем 1, то белок подвергается не-двумя состояниями перехода 16, 25, 29. Отношение VH / delta ; H ; H Cal также соответствует доле белковой структуры , которая плавится как термодинамической кооперативной единицы или домена 26.
Термодинамические параметры, упомянутые выше, такие как ΔG и предоставить полезную; H информацию о термической стабильности белков, в том числе биопрепаратов 30. Тем не менее, акцент будет сделан на Т м и в этом ; H публикации, так как они являются приведенные значения для данного протокола. T м температура в средней точке перехода, где складывают и развернутые состояния белка находятся в равновесии (т.е. 0 DG =) 25, 31. Чем выше Т м белка, тем выше его термостабильность 31. & Dgr ; H соответствует площади под пиком (ами) Температурная зависимость теплоемкости графике (также известный как термограммы) генерируется в конце эксперимента DSC 16, 25. Это энергия , необходимая для денатурации белков и может быть использовано для оценки активной фракции (F A) в композиции белка (то есть, доля белков с активной конформации в образце) с использованием следующего уравнения:
jove_content ">
(7) Там , где & Dgr ; H является экспериментально получена энтальпия образца белка и Q является энтальпия определяется для хорошо охарактеризованного ссылки или стандартизированной белка 22. Оценка F A имеет большое значение для контроля стабильности в реальном масштабе времени продукции, а также проведение исследований устойчивости в стрессовых условиях в соответствии с требованиями руководящих принципов ICH 32. Сравнение также предоставляет delta ; H информацию о компактности третичной структуры конформации белка 31.
Этот протокол подробно процедура для оценки термической устойчивости белков в промышленных условиях и широко используется для разработки вакцин. Она была разработана с использованием автоматического дифференциального сканирующего калориметра, который генерирует воспроизводимые результаты Fили концентрации белка, как низко как 300 мкг / мл.
Protocol
1. Инструмент Запуск
- Включите Дифференциальный сканирующий калориметр и увеличения давления в клетках, чтобы подавить кипение образцов, а также предотвратить образование пузырьков при повышенных температурах. Это, как правило, достигается за счет подачи азота в систему.
- В зависимости от составляющего материала клетки (например, тантал, золото, платина и т.д.), регулировать давление подачи газообразного азота в соответствии с рекомендуемыми давлением производителя, чтобы не повредить клетки. Например, установите давление подачи газа азота до 45 фунтов на квадратный дюйм для инструмента, используемого для разработки этой процедуры, и давление выше 80 фунтов на квадратный дюйм может повредить клетку.
- Убедитесь, что все резервуары чистящее средство заполнены до требуемого объема. Чистящие средства, необходимые включают моющее средство и воду, чтобы мыть и чистить клетку, соответственно, после каждого образца прогона.
- Установите температуру фиксации образцов отсекадо подходящего значения, предпочтительно от 5 & deg; С, чтобы сохранить целостность образца до эксперимента.
2. Подготовка проб
- Диализировать образца против буфера, который будет использоваться в качестве эталона для эксперимента. В качестве альтернативы, можно использовать элюции буфер собирали на конечной стадии очистки белка (т.е. элюции колонки).
- Определить концентрацию образца белка с использованием наиболее подходящего метода определения концентрации белка , такие как метод Kjedahl 33 или 34 методом Лоури. Для объективного сравнения результатов, использовать тот же метод последовательно в рамках одного исследования. Требуемый диапазон концентраций может варьироваться в зависимости от модели прибора. Для прибора, используемого в данном протоколе, предпочтительный рабочий диапазон составляет 0,5 - 1 мг / мл.
- Дега образец и эталонный буфер в вакууме, чтобы избавиться от микропузырьков, которые могут вызвать объем inaccurНКД. Этот шаг может быть пропущен для новых моделей калориметра.
- С помощью микропипетки и стерильные наконечники в шкафу с ламинарным потоком биосдерживанию, загружать образцы и их соответствующий буфер в парах в 96-луночные планшеты, совместимых с данным инструментом. Заполните первые две пары скважин с буфером и последние две пары с водой для буфера-буфера и воды сканирования соответственно. Буфер-буфер сканирует проверки пригодности прибора перед измерением (т.е. оценка погрешности измерительных приборов), а также установить базовый уровень; в то время как вода сканирование выполняются, чтобы очистить клетки.
- Накройте 96-луночный планшет с уплотнительной пленкой, и убедитесь, что лунки должным образом запечатаны, прежде чем принимать пластины из кабинета биологической безопасности, чтобы избежать загрязнения образца.
- Поместите пластину в отсек фиксации образцов в правильной ориентации.
Настройка параметров 3. Экспериментальные
Примечание: В зависимости от Instrumentation, образцы могут быть загружены в клетку либо вручную, с помощью шприца, или автоматически с помощью пробоотборника. В этом случае (т.е. промышленных условиях), автоматический пробоотборник используется для экономии времени.
- С помощью программного обеспечения сбора, введите информацию об образце в порядке, планшет был загружен в соответствии с разделом 2.4. Введите концентрации если таковые имеются, в противном случае, введите значения концентрации в программное обеспечение для анализа до анализа данных (раздел 4.2).
- Выберите вариант, который обеспечивает очистку клеток с моющим средством перед каждым сканированием образца, который должны следовать несколько этапов ополаскивания водой, чтобы убедиться в отсутствии остатков моющего средства остается в клетках.
- Установка начальной температуры эксперимента до 20 ° С, но это может варьироваться в зависимости от предварительного знания образца. Для известных белков, предварительно определенной стартовой температуры можно использовать, в то время как ниже начальной температуры может быть применен для неизвестных образцов.
- Установить конечную температуруэксперимента, например , 100 ° С. Конечная температура может варьировать в зависимости от предварительного знания образца.
- Установите скорость сканирования эксперимента, например , 60 ° C / ч, что является типичным скорость сканирования. Тем не менее, скорость сканирования может изменяться в зависимости от предварительного знания образца, например , 90 ° C / час, или 120 ° C / ч. Желательно, чтобы сканировать неизвестные образцы при различных скоростях сканирования для оценки кинетики разворачивания.
- Пересканировать образцы для исследования обратимости тепловой разворачивания. Разворачивание белка считается обратимым, если энтальпия, полученные для второго сканирования составляет по меньшей мере 80% от энтальпий значения для первого сканирования.
- Установите после эксперимента термостат на 10 ° С, чтобы сохранить целостность клеток калориметр в.
- Убедитесь в том, что параметры настройки эксперимента являются правильными перед выполнением эксперимента. Если все в порядке, начать эксперимент.
4. Данныеalysis
- Получение исходных данных из эксперимента и выбрать один образец в то время для анализа. Вычтите опорного сканирования, то есть буфер, из сканирования образца.
Примечание: Ссылка вычитание осуществляется автоматически с помощью новых моделей DSC инструментов. - Введите значение концентрации образца, если она была опущена, как указано в разделе 3.1.
- Установить и вычесть базовую линию от приобретенной термограммы для учета различий в теплоемкостей свернутых и развернутых состояний белка, которое вызвано воздействием гидрофобных групп к воде на разворачивание. Линейные или кубической аппроксимации кривой может быть применен в зависимости от формы профиля DSC для образца. Для согласованности, тот же тип фитинга должен быть использован во время исследования, например , исследование стабильности в режиме реального времени. Этот шаг необходим для обработки кривой для пика интеграции для получения энтальпию перехода.
- Выполните пик интеграции с использованием нелинейных наименьших квадратов. На основе продуктазнания применяются в два состояния или не-модели двух состояний. Два состояния модель может быть использована для отдельных кооперативных тепловых переходов, а также для неизвестных белков, применять не-две модели государства до дальнейшего знания продукта не доступен. В случае необходимости, корректировать кривой с помощью итерационного подбора кривых функции программного обеспечения оборудования, пока Хи-квадрат значение остается постоянным.
- Полученные результаты будут показаны значения для средней точки переходных температур (Tm), калориметрической энтальпии (H) и Вант - Гоффа энтальпию (H) VH образца.
Representative Results
Необработанные данные от большинства экспериментов ДСК представлены в виде теплового потока в зависимости от температуры графика, так как на самом деле калориметр измеряет разницу в скорости теплового потока в раствор пробы и буфер 35. Таким образом, если обе клетки (например , образцы и опорные клетки) содержат идентичные решения в ходе эксперимента, необработанные данные от сканирования должна быть плоская линия без заметных пиков. Любой пик , наблюдаемый можно отнести к погрешности измерительных приборов (например , поврежденные или загрязненные клетки), поэтому выполняется сканирование буфера до анализа проб является адекватным тест пригодности системы. На рисунке 1 показан результат типичного сканирования буфера , указывающий , что калориметр находился в хорошем рабочем состоянии до анализа проб.
На рисунке 2 показано , исходные данные для эксперимента ДСК проводили на Diffразличны много двух образцов белка. Как следует из ранее, наблюдаемые пики являются различия в тепловом потоке образцов и их соответствующих буферов. Различия в концентрации образца может привести к изменению теплоемкости, записанного калориметра; Однако эти изменения нормированы в ходе анализа проб в соответствии с разделом 4.2 процедуры. Более высокие концентрации могут также выявить дополнительные термодинамические домены не способствует переходу на более низких концентрациях. Кроме того, каждый переход представляет собой термодинамическую домен , который может включать одну или несколько структурных доменов белка 36. В этом случае белок 1 имеет три структурных домена, которые плавятся кооперативно.
На рисунке 3 показаны результаты , полученные на основе анализа исходных данных для белка 1 и 2 , представленных на рисунке 2, т.е. после базового вычитания и итеративной кривой цчал. Полученные термограммы были нормированы на скорости сканирования (автоматически осуществляется с помощью заранее заданного алгоритма в программном обеспечении анализа) и концентрации; Таким образом, представляя результаты эксперимента в сопоставимой теплоемкости в зависимости от температуры графиков. Программное обеспечение для анализа использует данные из теплоемкости в зависимости от температуры графиков, таких как Т м и ΔCp, чтобы получить другие термодинамические параметры , используя вариации приведенных выше уравнений в зависимости от кооперативности разворачивания белка.
При тестировании неизвестных образцов, установив соответствующий температурный диапазон имеет решающее значение. В противном случае, неполные термограммы может привести, как показано на рисунке 4. Хотя Т м от таких профилей могут быть получены, & Dgr ; H не может быть точно определена. Таким образом, образец должен быть повторно с более широким диапазоном температур, чтобы полностью захватить термическому переходу. Некоторые белки также повторноadily образуют агрегаты после полной денатурации, что ведет к увеличению емкости после перехода тепла: это часто появляется как неполный термограмме , как показано на фигуре 2В. Тем не менее, повторное тестирование с более высокой конечной температуре может помочь подтвердить, есть ли возникновение конформационного перехода в этой области термограммы или это просто поглощающий тепло эффект белковых агрегатов.
Термическая стабильность является одним из наиболее важных физических свойств белков и белковых продуктов в промышленности 37. В фармацевтических препаратов, он используется для определения стабильности биопрепаратов в различных условиях, включая разработку буферов и факторов окружающей среды, таких как влажность и температура. Он также используется для контроля ключевой шаг изготовления (например, очищение и детоксикация) , чтобы обеспечить согласованность между конформационной производственных партий.
Рисунок 1: Buffer сканы. Сходство с градиентом каждого сканирования без заметных пиков указывает на то, что прибор находится в хорошем рабочем состоянии и генерируются воспроизводимые результаты.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Исходные данные , собранные из DSC экспериментов. Эти графики являются хорошими представлениями о непроанализированных (сырых) данных , полученных после опытов (т.е. до базового вычитания и подгонки кривой). Каждая строка представляет собой производственный участок. Белок 2 имеет тенденцию к агрегации более легко при нагревании, что приводит к увеличению теплоемкости выше 100 ° С в постпереходный области термограммы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Исследуемый DSC данных. Эти графики являются хорошими представления анализируемых данных ДСК (т.е. после базового вычитания и подгонки кривой). Синяя линия представляет термограмма после базового вычитания, в то время как красная линия представляет собой кривую с лучшей подгонки к термограмме. (А) Т м и & Dgr ; H для белка 1 Образец # 12 80.16 ° C и 1,69 х 10 6 кал / моль соответственно. (В) Тпл и & Dgr ; H для белка 1 Образец № 13 являются 80,15 ° C и 1,71 х 10 6 кал / моль соответственно. (С) Т м и & Dgr ; H для Протеин 2 Образец # 21 75,01 ° C и 4,08 х 10 6 кал / моль соответственно. (D) Т м и & Dgr ; H для Протеин 2 Образец # 22 75,67 ° С и 4,22 х 10 6 кал / моль соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобыпросмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Неполное термограмма. Исходные данные для сбора белка 1 анализировали в неадекватном диапазоне температур. Конечная температура эксперимента был установлен на 90 ° C, не размещения всего профиля перехода белка по сравнению с экспериментом на фигуре 2А , который был установлен на 120 & deg ; С. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Анализируются данные , показывающие влияние химического Detoxification на третичную структуру белка 1. (А) Белок 1 представляет собой токсин в его нативной конформации и гаS его T м при 56.84 ° C и при & Dgr ; H 2,57 × 10 5 кал / моль. (Б) детоксифицированный форма белка 1 (т.е. анатоксином) имеет Тт и значения & delta ; н от 81,01 ° С и 1,89 х 10 6 кал / моль соответственно. Таким образом, можно сделать вывод о том , что шаг детоксификации ввел некоторую форму изменения структурной конформации белка 1 , который придает большую стабильность (выше Т м) до его детоксицированного форме. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: анализируемые данные , показывающие эффект условиях хранения на конформацию белка 3. Эти графики иллюстрируют влияние температуры хранения (2 - 8 ° С) на стабильность и третичной структуры ProTein 3 более 30 недель. Тпл и значения & delta ; н на содержание белка 3 на 8 - й (А) и 38 - й недели (В) хранения, приведены в таблице 1 ниже. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Образец | Тт 1 (° С) | & Dgr ; H 1 (кал / моль) | Тт 2 (° С) | & Dgr ; H 2 (кал / моль) | Тт 3 (° С) | & Dgr ; H 3 (кал / моль) |
| Белок 3 хранят при температуре 2-8 ° С в течение 8 недель | 61.91 | 1,71 х 10 5 | 75.54 | 2,17 х 10 5 | 90.29 | 4,17 х 10 5 |
| 61.87 | 1,66 х 10 5 | 75,18 | 1,46 х 10 5 | 90.22 | 5,76 х 10 5 |
Таблица 1: Tm и значения для delta ; H белка 3 на 8 - й и 38 - й недели хранения при 2 - 8 ° C. Несмотря на то, т значений Т в обеих временных точках одинаковы, разница в величинах & delta ; н указывает на то, что третичная структура белка 3 деградировал в течение 30 недель при Заданные условия хранения.
Discussion
Эта процедура была успешно зарегистрирована в различных тестовых характеристик пакетов, включая стабильность и сопоставимость продукт исследований 21. В исследованиях стабильности в режиме реального времени, DSC используется для контроля Т м, а также оценить диафрагменное А биопрепаратов с течением времени , чтобы определить их срок годности. Что касается сопоставимости продукта, он используется для оценки влияния процесса и изменения объекта, а также влияние ключевых этапов производства по структурной конформации производимых партий. Это, как правило, включает в себя прямое сравнение произведенного; H лота к эталонным продуктом, который был назначен в качестве идеального продукта. Кроме того, DSC, оказалось полезным аналитическим инструментом для исследований 37 рецептуры продукта. Тпл белка в различных буферных растворах и при различных концентрациях могут быть использованы для определения формулировку, Протягивает наиболее стабильностьбелок.
Для обеспечения надежности этого метода и объективность его результатов, важно сохранить параметры тестирования в соответствии с запуска к запуску в рамках того же исследования (например, вакцина препарат исследования). Тем не менее, эта процедура может быть изменена, чтобы приспособить различия в физических свойствах различных белков. Пример модификации , которые могут быть сделаны изменяет частоту развертки эксперимента 38, 39. Белки , которые были склонны к образованию агрегатов при нагревании исследовали с более высокой скоростью сканирования (например, 120 ° С / ч) , чтобы избежать вклада агрегатов в термальный профиля перехода, а также закупоривать капилляры калориметра. Стоит отметить , что скорость сканирования может повлиять на результаты ДСК эксперимента 38. Уширение теплового перехода пика наблюдается при увеличении скорости сканирования в некоторых про; белки Тем не менее, T м оставалась довольно постоянной 38. Кроме того, диализ и дегазация шаги для подготовки образцов также очень важно для получения точных результатов 31. Диализ гарантирует, что единственное различие в составе образца и буфера является белок; Таким образом, все избыточное тепло, поглощаемая образцом можно отнести к теплоемкости белка. Дегазация обеспечивает точный анализ объема, так как экстраполяция термодинамического параметра предполагает , что разворачивание событие происходит при постоянном объеме и давлении 31. Постоянная часть давления в предположении объясняется воздействием давлени азота системы в соответствии с разделом 1.1 процедуры.
По сравнению с другими методами определения устойчивости конформации белков, таких как кругового дихроизма (КД) и флуоресцентной спектроскопии, ДСК предлагает ряд преимуществ в комустановка мерческий включая стоимость и экономию времени. Во - первых, адиабатическое конструкция дифференциального сканирующего калориметра позволяет измерять термостабильности с более высокой точностью температуры по сравнению с измерениями с аппаратурой для CD и флуоресцентной спектроскопии 6. Во- вторых, в отличие от компакт - диска, точность данных DSC не зависит от спиральности белка 39, 40; Тем не менее, CD содержит дополнительную информацию о развертывании вторичной структуры, которая будет дополнять ЦФК 41. Кроме того, повышение давления системы DSC позволяет испытывать с широким диапазоном температур без кипения образца; Таким образом, широкий спектр белков может быть проверена с помощью DSC.
В то время как DSC относительно быстрый и простой подход для определения термостабильности биопрепаратов, не без ограничений. Во-первых, базоваяшаг линии вычитания вводит некоторую форму человеческой непоследовательности в анализ необработанных данных; Таким образом, изменения в результатах могут наблюдаться у разных пользователей. Во-вторых, дифференциальные сканирующие калориметры имеют минимальные предельно допустимой концентрации, которые могут быть трудно достичь в объемном промышленном масштабе. В-третьих, & Dgr; H необратимой тепловой денатурации не является абсолютным; откуда следует, что полученный ΔG (показатель стабильности белка) в подобных сценариях может вводить в заблуждение. Кроме того, метод лучше всего работает для очищенных образцов. Наличие примесей может либо вызвать сдвиг в Т м , если есть взаимодействие с белком исследуемого или появление новых тепловых переходов , если не существует никакого взаимодействия. В любом случае эти дополнительные функции на термограмм могут быть ошибочно отнесены к образцам, тем самым влияя на интерпретацию результатов. Несмотря на эти ограничения, DSC остается надежный метод, который может предоставить подробную информацию о термодинамической гое белка процесс развертывания , если выполняется должным образом 42.
В заключение, DSC предлагает значительное преимущество в качестве конформационного инструмент для считывания продуктов вакцин и их промежуточных продуктов. Два параметра, Т м и & Dgr ; H, собранные для массива лотов одного и того же продукта может стать эмпирический базис , который может быть использован для изучения влияния изменений процесса, состава и условий хранения на третичной структуры и стабильности белка и вирусные антигены 21, 43.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками компании Санофи Пастер. Работа финансировалась Sanofi Pasteur, и плата за публикацию этого видео-статьи были оплачены Sanofi Pasteur. Авторы не имеют соответствующих организациях или финансовое участие с какой-либо организации или лица, имеющего финансовый конфликт с предметом или материалов, обсуждаемых в рукописи. К ним относятся рабочие места, консультантов, владения акциями или варианты, или лицензионные платежи.
Ни одна помощь запись не была использована в производстве этой рукописи.
Acknowledgments
Авторы очень благодарны Джозефа Манчини (ранее с компанией GE Healthcare), Pawel Czudec, Томас Кейджа (Malvern Instruments Limited) за их роль в установке и обучении по дифференциальной сканирующей калориметрии, Sasmit Дешмукх и Webster Magcalas для дискуссий.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
| Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
| 500 µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
| MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
| Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ - A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |
References
- Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).
- Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. Watson, E. S., O'Neil, M. J. , US3263484A 02 August (1966).
- O'Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).
- O'Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).
- Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).
- Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).
- Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).
- Andronikashvili, E. L., et al. Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).
- Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).
- Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).
- Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).
- Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
- Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).
- Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).
- Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).
- Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
- Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).
- Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).
- Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
- Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).
- Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).
- Jiskoot, W., Daan, C. Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, Springer Science & Business Media. (2005).
- Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).
- Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
- Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
- Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
- Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).
- Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).
- Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).
- Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
- Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).
- Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), current step. 4 (2003).
- Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. Differential Scanning Calorimetry. , Springer Science & Business Media. (2003).
- Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).
- Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
- Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).
- Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).
- Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).
- Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).
- Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).
