Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Differentialscanningskalometri - en metode til vurdering den termiske stabilitet og Kropsbygning af protein Antigen

Published: March 4, 2017 doi: 10.3791/55262

Summary

Differentiel scanningskalorimetri måler den termiske overgangstemperatur (er) og samlede varmeenergi kræves for at denaturere et protein. Opnåede resultater anvendes til at vurdere den termiske stabilitet af proteinantigener i vaccineformuleringer.

Abstract

Differentiel scanningskalorimetri (DSC) er en analytisk teknik, der måler den molære varmekapacitet af prøver som funktion af temperaturen. I tilfælde af proteinprøver, DSC profiler giver information om termisk stabilitet, og i nogen grad fungerer som en strukturel "fingeraftryk", der kan anvendes til at vurdere strukturelle konformation. Den udføres under anvendelse af et differential scanning kalorimeter, der måler den termiske overgangstemperatur (smeltetemperatur, Tm) og den nødvendige energi til at afbryde interaktionerne stabiliserende den tertiære struktur (enthalpi, AH) af proteiner. Sammenligninger er lavet mellem formuleringer samt produktions partier og forskelle i afledte værdier indikerer forskelle i termisk stabilitet og strukturelle kropsbygning. Data, der illustrerer brugen af ​​DSC i en industriel indstilling for stabilitets studier samt overvågning centrale faser i fremstillingsprocessen er tilvejebragt som bevis for effektiviteten af ​​denne proprotokol. I sammenligning med andre metoder til vurdering af den termiske stabilitet af protein konformationer, DSC er omkostningseffektivt, kræver få fremstillingstrin prøve, og også giver en komplet termodynamisk profil af proteinet udfoldningsprocessen.

Introduction

Differentiel scanningskalorimetri (DSC) er en eksperimentel metode, der direkte måler forskellen i varmeenergi optagelse finder sted i en prøve i forhold til en reference under et reguleret temperaturændring 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Udføres i et differential scanning kalorimeter involverer fremgangsmåden indføring varmeenergi i en prøvecelle og en reference celle samtidigt, mens identisk forøgelse af temperaturen af begge celler over tid 2, 13,14. På grund af forskellen i sammensætningen af prøven og referencen, vil forskellig mængde energi være påkrævet for at hæve temperaturen af cellerne 2, 12, 13. Således er den overskydende mængde energi, der kræves for at kompensere for temperaturforskellen mellem cellerne måles og direkte korreleret til specifikke termodynamiske egenskaber ved prøve 1, 3.

I 1960'erne, MJ O'Neil og E. Watson af Perkin Elmer udviklede den første differentialscanningkalorimeter at måle den varme strøm af faste materialer 2, 3, 4. Sideløbende PL Privalov og DR Monaseldze EL af Institut for Fysik, Republikken Georgien (tidligere USSR) skabt en unik differentieret adiabatisk kalorimeter, der kan bruges for biokemisk forskning 5, 6. Efterfølgende Andronikashvili team på Institut for Fysik, Republikken Georgien, rapporterede varmekapacitet af biomolekyler såsom fibrøse og kugleformede proteiner, DNA og RNA ved hjælp af DSC 7, 8, 9. Flere hold ledet af Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13, og Privalov 14, 15, 16 fokuseret på udviklingen af teorien og praktiske anvendelser af DSC til at undersøge de termodynamiske detaljer proteinudfoldning. Værdien af DSC i at studere store supramolekylære strukturer såsom fager, chloroplast, phospholipid flydende krystaller og kød-proteiner er også blevet rapporteret 17 sup>, 18, 19, 20.

DSC er nu blevet hverdagskost i farmaceutisk forskning og udvikling for vurderingen af den termiske stabilitet af biomolekyler, især proteiner 1, 21, 22. Dette skyldes hovedsagelig, at fremskridt med hensyn til følsomhed og automatisering af instrumentering anvendt til at udføre eksperimentet 23, 24. Her, det endelige resultat af DSC eksperiment, nemlig molære varmekapacitet som en funktion af temperaturen, der bruges til at estimere følgende termodynamiske parametre (ændring i varmekapacitet (ACp), entalpi (AH), entropi (AS) , og Gibbs fri energi (AG)) ved hjælp af nedenstående ligning:

eq1.jpg "/> (1)

ligning 2 (2)

ligning 3 (3)

ligning 4 (4)

ligning 5 (5)

Hvor Cp måles varmekapacitet; q er varmestrømmen i testmaterialet; T 0 og T er de indledende og afsluttende temperaturer overgangen henholdsvis 22, 25. Det er også værd at bemærke, at ligningerne ovenfor, gælder for single-domæne proteiner, der kan undergå to-stats overgang og reversibel termisk udfoldning 22. Analyse af mere komplekse proteiner (fx ikke-to-state-proteiner og oligomerer) have blevet rapporteret af Friere et al. 26; Johnson et al. 27; og Kasimova et al. 28.

For at afgøre om et protein gennemgår to-stats overgang eller danner mellemprodukter under termisk denaturering, den eksperimentelt afledt enthalpi (AH, også kaldet kalorimetriske entalpi AH Cal) sammenholdes med den enthalpi udledt ved hjælp af van't Hoff ligningen nedenfor (også benævnt van't Hoff enthalpi, AH VH):

ligning 6 (6)

Hvor T m er midtpunktet temperatur af overgangen, R er den ideelle gaskonstant (1,987 cal mol -1 K -1), og Y er den del af proteinet befolkning i udfoldet stand 16, 29. HvisAH VH er lig med AH Cal; eller AH VH / AH Cal er lig med 1, så proteinet undergår en "alt-eller-intet" overgang (dvs. to-stats overgang) 16, 25, 29. Men hvis AH VH er mindre end AH Cal; eller AH VH / AH Cal er mindre end 1, proteinet undergår en ikke-to-stats overgang 16, 25, 29. Forholdet AH VH / AH Cal svarer også til den del af proteinstrukturen, der smelter som en termodynamisk kooperativ eller -domænet 26.

De termodynamiske parametre nævnt ovenfor, såsom AG og AH give nyttige oplysninger om den termiske stabilitet af proteiner, herunder biologiske 30. Dog vil der blive lagt vægt på T m og AH i denne publikation, da de er de rapporterede værdier for denne protokol. T m er midtpunktet temperatur af overgangen, hvor den foldede og udfoldede tilstande af proteinet er ved ligevægt (dvs. AG = 0) 25, 31. Jo højere T m af et protein, desto højere er dens termiske stabilitet 31. AH svarer til arealet af den top (e) af varmekapacitet i forhold til temperatur graf (også kendt som termogram), der genereres ved udgangen af DSC eksperiment 16, 25. Det er den energi, der kræves til at denaturere proteiner og kan anvendes til at estimere den aktive fraktion (Fa) i et protein formulering (dvs. andelen af proteiner med aktiv konformation i en prøve) ved følgende ligning:

jove_content "> ligning 7 (7)

Hvor AH er den eksperimentelt afledte entalpi af proteinet prøven og Q er enthalpi bestemt for en velkarakteriseret reference eller standardiseret protein 22. Vurderingen af F a er væsentlig for at overvåge real-time stabilitet produkter samt udførelse stabilitetsundersøgelser under stress betingelser som kræves af ICH guidelines 32. Sammenligning af DH giver også oplysninger om kompakthed af den tertiære struktur konformation af et protein 31.

Denne protokol beskriver en procedure for vurdering af den termiske stabilitet af proteiner i en industriel indstilling og har været flittigt brugt til formulering af vacciner. Det blev udviklet under anvendelse af en automatiseret differential scanning kalorimeter, der genererer reproducerbare resultater feller proteinkoncentrationer så lave som 300 ug / ml.

Protocol

1. Instrument Opstart

  1. Tænd for differential scanning kalorimeter og øge trykket i cellerne til at undertrykke kogning af prøverne samt forhindre dannelse bobler ved forhøjede temperaturer. Dette opnås typisk ved at tilføre nitrogen ind i systemet.
  2. Afhængigt af konstituerende materiale af cellen (f.eks, tantal, guld, platin, etc.), justere trykket af forsyningen nitrogengas ifølge producentens anbefalede tryk for ikke at beskadige cellen. For eksempel indstille trykket af nitrogen gasforsyningen til 45 psi for instrumentet anvendes til at udvikle denne procedure, og tryk over 80 psi kan beskadige cellen.
  3. Sørg for, at alle reservoirer rensemidlet er fyldt til den ønskede volumen. Rengøringsmidler krævede inkluderer rengøringsmiddel og vand til at vaske og rense cellen henholdsvis efter hver prøve løb.
  4. Indstil temperaturen af ​​prøven holder kammertil en passende værdi, fortrinsvis 5 ° C, for at opretholde integriteten af ​​før eksperimentere prøven.

2. Prøvefremstilling

  1. Dialyseres prøven mod bufferen, der skal bruges som reference for eksperimentet. Alternativt kan anvendes elueringspuffer i det sidste trin af proteinoprensning (dvs. søjle eluering).
  2. Bestemme koncentrationen af proteinet prøven ved hjælp af den mest egnede proteinkoncentration bestemmelse metode, såsom Kjedahl metode 33 eller Lowry-metoden 34. Til objektiv sammenligning af resultater ved at bruge den samme metode konsekvent inden for samme undersøgelse. Den krævede koncentrationsinterval kan variere efter den model af instrumentet. For det instrument, der anvendes i denne protokol, det foretrukne arbejdsområde er 0,5-1 mg / ml.
  3. Afgasses prøven og reference buffer i vakuum for at slippe af mikrobobler, der kan forårsage volumen inaccurACY. Dette trin kan springes over for nyere kalorimeter modeller.
  4. Ved hjælp af en mikropipette og sterile tips i en laminar strømning biologisk indeslutning kabinet, indlæse prøverne og deres respektive buffer parvis i 96-brønds plader er kompatible med instrumentet. Fyld første to par brønde med buffer og de sidste to par med vand i bufferen-buffer, og vandskanning henholdsvis. Buffer-buffer scanninger kontrollere egnetheden af instrumentet før prøve måling (dvs. vurdering af instrumentering fejl) samt etablere en baseline; mens vand scanninger køres til at rense cellerne.
  5. Dæk 96-brønds plade med en forsegling film, og sikre, at brøndene er korrekt forseglet før du tager pladen ud af biosikkerhed kabinettet til at undgå forurening prøve.
  6. Pladen anbringes i prøven holde rummet i den rigtige retning.

3. Eksperimentel Parameter Setup

Bemærk: Afhængigt af instrumentation, prøver kan indlæses i cellen enten manuelt ved hjælp af en sprøjte, eller automatisk ved hjælp af en autosampler. I dette tilfælde (dvs. en industriel indstilling), er en autosampler bruges til at spare tid.

  1. Brug købet software, indtaste prøvens oplysninger i den rækkefølge pladen blev indlæst som pr afsnit 2.4. Indtast koncentrationer hvis tilgængelig, ellers Indtast koncentrationsværdier i analyse software før analyse af data (afsnit 4.2).
  2. Vælg den indstilling, der sikrer rengøring af celler med vaskemiddel før hver prøve scanning, som bør følges af flere vand skyl skridt til at sikre, at ingen vaskemiddel rester i cellerne.
  3. Indstil starttemperaturen af ​​eksperimentet til 20 ° C, men dette kan variere efter forudgående kendskab til prøven. For kendte proteiner, kan forudbestemt starttemperatur bruges, mens en lavere starttemperatur kan anvendes til ukendte prøver.
  4. Indstil den endelige temperaturaf eksperimentet, fx 100 ° C. Den endelige temperatur kan variere forudgående kendskab til prøven.
  5. Indstil scanningshastighed på eksperimentet, fx 60 ° C / h, hvilket er den typiske scanningshastighed. Dog kan scanningshastighed variere forudgående kendskab til prøven, fx 90 ° C / h, eller 120 ° C / time. Det er tilrådeligt at scanne ukendte prøver ved forskellige scan satser at vurdere kinetikken ved udfoldning.
  6. Genscanning prøver at undersøge reversibiliteten af ​​den termiske udfoldning. Udfoldelsen af ​​et protein anses reversibel såfremt resultatet for den anden scanning enthalpi er mindst 80% af den enthalpi værdi for den første scanning.
  7. Indstil post-eksperimentet termostat til 10 ° C for at bevare integriteten af ​​kalorimeteret celler.
  8. Kontroller, at eksperiment opsætningsparametre er korrekte, før du udfører forsøget. Hvis alt er på plads, skal du starte eksperimentet.

4. data AnANALYSE

  1. Hent rådata fra eksperimentet og vælge en prøve ad gangen til analyse. Subtrahere henvisning scanning, dvs. puffer, fra prøven scanning.
    BEMÆRK: Der henvises subtraktion udføres automatisk af nyere modeller af DSC instrumenter.
  2. Indtast prøve koncentration værdi, hvis det blev udeladt, da per afsnit 3.1.
  3. Passe og trække basislinie fra den erhvervede termogrammet at kompensere for forskelle mellem de varmekapaciteter af den foldede og ufoldede tilstande af proteinet, som er forårsaget af eksponering af hydrofobe grupper til vand ved udfoldning. Lineær eller kubisk kurvetilpasning kan anvendes afhængigt af formen af ​​DSC profilen for prøven. For konsistens, den samme type fittings skal anvendes i løbet af en undersøgelse, fx realtid stabilitet undersøgelse. Dette trin er nødvendigt for at behandle kurven for peak integration for at opnå enthalpi overgang.
  4. Udføre peak integration ved hjælp af ikke-lineær mindste kvadraters. Baseret på produktviden anvende to-stats eller ikke-to-stats model. To-state modellen kan anvendes til enkelte kooperative termiske overgange, og for ukendte proteiner, anvende ikke-to state model indtil videre produkt viden er tilgængelig. Hvis det er relevant, at justere kurve montering ved hjælp af den iterative kurvetilpasning funktion af udstyrets software indtil Chi-square værdi forbliver konstant.
  5. Opnåede resultater vil vise værdier for midtpunktet af overgangen temperaturer (TM), kalorimetriske enthalpi (AH), og van't Hoff enthalpi (AH VH) af prøven.

Representative Results

De rå data fra de fleste DSC forsøg er vist som en varmeflux mod temperatur graf, som kalorimeteret faktisk måler forskellen i hastigheden af varmestrømmen i prøveopløsningen og buffer 35. Derfor, hvis begge celler (dvs. prøve og referencepunkter celler) indeholder identiske løsninger under et eksperiment, bør de rå data fra scanningen være en flad linje uden observerbare toppe. Enhver højdepunkt observeret kan tilskrives instrumentering fejl (f.eks beskadiget eller forurenet celler), hvilket er grunden kører buffer scanninger før prøve analyse er et passende system egnethedstest. Figur 1 illustrerer resultatet af et typisk puffer scanning indikerer, at kalorimeteret var i god stand forud for prøveanalyse.

Figur 2 viser den rå data for en DSC eksperiment udført på different partier af to proteinprøver. Som antydet tidligere, de observerede toppe er forskellene i varmestrømmen af ​​prøverne og deres respektive buffere. Forskelle i koncentration prøven kan give variationer i varmekapacitet registreret af kalorimeter; men disse variationer er normaliseret i løbet af analysen i henhold til § 4.2 i proceduren. Højere koncentrationer kan også afsløre yderligere termodynamiske domæner ikke bidrager til overgangen ved lavere koncentrationer. Derudover har hver overgang betegner en termodynamisk domæne, der kan indbefatte et eller flere strukturelle domæner i proteinet 36. I dette tilfælde, protein 1 har tre strukturelle domæner, der smelter samvirkende.

Figur 3 viser resultaterne fra analysen af de rå data til protein 1 og 2 vist i figur 2, dvs. efter baseline subtraktion og iterativ kurve firg ø ring. De resulterende termogrammer er blevet normaliseret til scanning sats (automatisk udføres af en forudindstillet algoritme i analysen software) og koncentration; dermed præsentere resultaterne af forsøget i sammenlignelige varmekapacitet versus temperatur grafer. Analysen software anvender data fra varmekapacitet i forhold til temperatur grafer, såsom T m og ACp, at udlede andre termodynamiske parametre ved hjælp af variationer af ligningerne ovenfor givne afhængigt af kooperativitet af protein udfoldning.

Ved test ukendte prøver, indstilling af passende temperaturområde er afgørende. Ellers kan ufuldstændige termogrammer resultere, som illustreret i figur 4. Selvom T m fra sådanne profiler kan udledes, AH kan ikke bestemmes nøjagtigt. Derfor skal måles igen med en større temperaturområde til helt fange den termiske overgang. Nogle proteiner re ogsåadily danne aggregater efter fuldstændig denaturering, hvilket resulterer i en stigende post-overgangen varmekapacitet: det ofte viser sig som en ufuldstændig termogram som illustreret i figur 2B. Imidlertid genprøvning med en højere sluttemperatur kan hjælpe, bekræfte, om der er en forekomst af en konformationel overgang ved det område af termogram eller det blot er varmeabsorberende virkning af proteinaggregater.

Termisk stabilitet er en af de mest betydningsfulde fysiske egenskaber af proteiner og protein-baserede produkter i branchen 37. I lægemidler, er det anvendes til at bestemme stabiliteten af ​​biologiske lægemidler under forskellige betingelser, herunder formulering buffere og miljømæssige faktorer, såsom fugtighed og temperatur. Det anvendes også til at overvåge nøgle fremstillingstrin (fx oprensning og afgiftning) for at sikre konformationel overensstemmelse mellem produktionspartier. > 5 og 6 illustrerer brugen af DSC at undersøge virkningerne af kemiske afgiftning og opbevaringsforhold henholdsvis på stabiliteten og strukturelle kropsbygning af to forskellige proteiner. De store forskelle i Tm og AH indikerer konformationelle ændringer og protein nedbrydning henholdsvis. Desuden tabet af den tredje overgang i figur 6 illustrerer yderligere nedbrydning af et domæne, der blev bekræftet ved et fald i molekylvægt, når prøverne blev analyseret ved anvendelse af gelpermeationskromatografi med multi-vinkel-lysspredning (SEC-MALS) ( data ikke vist).

figur 1
Figur 1: Buffer scanninger. Ligheden i gradient af hver scanning uden observerbare toppe indikerer, at instrumentet er i god stand og genererede reproducerbare resultater.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Rå data indsamlet fra DSC Eksperimenter. Disse grafer er gode repræsentationer af unanalyzed (rå) data indhentet efter eksperimentelle kørsler (dvs. før baseline subtraktion og kurvetilpasning). Hver linje repræsenterer en produktionsparti. Protein 2 har tendens til at aggregere lettere ved opvarmning, hvilket resulterer i en stigning i varmekapacitet over 100 ° C i post-overgangsområde af termogrammet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Analyseret DSC data. Disse grafer er gode repræsentationer af analyserede DSC data (dvs. efter baseline subtraktion og kurvetilpasning). Den blå linje repræsenterer termogrammet efter baseline subtraktion, mens den røde linje repræsenterer kurven med den bedste pasform til termogrammet. (A) Tm og AH for Protein 1 Prøve # 12 er 80,16 ° C og 1,69 x 10 6 cal / mol henholdsvis. (B) T m og AH for Protein 1 Prøve # 13 er 80,15 ° C og 1,71 x 10 6 cal / mol henholdsvis. (C) Tm og AH for Protein 2 Prøve # 21 er 75,01 ° C og 4,08 x 10 6 cal / mol henholdsvis. (D) T m og AH for Protein 2 Prøve # 22 er 75,67 ° C og 4,22 x 10 6 cal / mol henholdsvis. Klik her for atse en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: en ufuldstændig Thermogram. Rådata indsamler til Protein 1 analyseret på et utilstrækkeligt temperaturområde. Den endelige temperatur eksperiment blev indstillet til 90 ° C, som ikke rumme hele overgang profil af proteinet i sammenligning med forsøget for figur 2A, som var indstillet til 120 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: analyserede data viser effekten af kemisk afgiftning på tertiære struktur af protein 1. (A) Protein 1 er et toksin i sin native konformation og has sin T m ved 56.84 ° C og AH ved 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) Den detoksificerede form af protein 1 (dvs. toxoid) har Tm og AH værdier på 81,01 ° C og 1,89 x 10 6 cal / mol henholdsvis. Således kan det konkluderes, at Afgiftningstrinnet indført en form for variation til det strukturelle konformation af protein 1, som bibringer større stabilitet (højere Tm) til dets afgiftet formular. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: analyserede data viser effekten af opbevaringsbetingelser på Kropsbygning af protein 3. Disse grafer viser effekten af opbevaringstemperatur (2 - 8 ° C) på stabiliteten og tertiære struktur af ProTEIN 3 over 30 uger. T m og AH værdier for Protein 3 ved 8 th (A) og 38 th uge (B) lagerplads er angivet i tabel 1 nedenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.

Prøve Tm 1 (° C) AH 1 (cal / mol) Tm 2 (° C) AH 2 (cal / mol) Tm 3 (° C) AH 3 (cal / mol)
Protein 3 opbevares ved 2-8 ° C i 8 uger 61,91 1,71 x 10 5 75,54 2,17 x 10 5 90,29 4.17 x 10 5
61,87 1,66 x 10 5 75,18 1,46 x 10 5 90,22 5,76 x 10 5

Tabel 1: Tm og AH Værdier for Protein 3 ved 8 th og 38 th uge for opbevaring ved 2 - 8 ° C. Selvom Tm værdier ved begge tidspunkter er ens, forskellen i AH værdier indikerer, at den tertiære struktur af protein 3 har nedbrudt i løbet af 30 uger under det angivne opbevaringen.

Discussion

Denne procedure er blevet indarbejdet i forskellige karakterisering testpakker, herunder stabilitet og produkt sammenligningsstudier 21. I realtid stabilitetsundersøgelser er DSC anvendes til at overvåge Tm, samt estimere F en af biologiske over tid for at bestemme deres holdbarhed. Med hensyn til produkt sammenlignelighed, er det bruges til at vurdere konsekvenserne af processen og anlæg forandring samt effekten af ​​de vigtigste fremstillingsprocesser trin på den strukturelle kropsbygning af producerede partier. Dette involverer typisk direkte sammenligning af AH af produceret meget for et referenceprodukt, der er blevet udpeget som det ideelle produkt. Derudover har DSC vist sig at være et nyttigt analytisk værktøj til produkt formulering undersøgelser 37. T m af et protein i forskellige puffere og ved forskellige koncentrationer kan anvendes til at bestemme den formulering, der virksomheden får mest stabilitet tilproteinet.

For at sikre pålideligheden af denne metode og objektivitet af resultaterne, er det vigtigt at holde test parametre konsekvent fra løb til at køre i den samme undersøgelse (f.eks vaccineformulering undersøgelse). Imidlertid kan fremgangsmåden modificeres til at rumme forskelle i de fysiske egenskaber af forskellige proteiner. Et eksempel på en modifikation, der kan gøres er ved at ændre scanningshastighed på eksperimentet 38, 39. Proteiner, der var udsat for danner aggregater ved opvarmning blev undersøgt i et hurtigere scanningshastighed (f.eks 120 ° C / h) for at undgå bidrag aggregater til den termiske overgang profil samt tilstopning kapillærer kalorimeteret. Det er værd at bemærke, at scanning sats kan påvirke resultatet af en DSC eksperiment 38. Udvidelse af den thermiske peak overgang er blevet observeret med stigende skannehastigheder i nogle proproteiner; Men T m været nogenlunde konstant 38. Desuden dialyse og afgasning skridt om prøveforberedelse er også meget afgørende for præcise resultater 31. Dialyse sikrer, at den eneste forskel i sammensætningen af ​​prøven og bufferen er det protein; Således kan alle de overskydende varme, der absorberes af prøven tilskrives varmekapacitet af proteinet. Afgasning sikrer præcis volumen analyse, som ekstrapolering af den termodynamiske parameter forudsætter, at udfoldelsen begivenheden optræder under konstant volumen og tryk 31. Den konstante del tryk antagelsen går til kvælstof tryksætning af systemet i henhold til § 1.1 i proceduren.

I sammenligning med andre fremgangsmåder til bestemmelse af stabiliteten af ​​protein konformationer såsom cirkulær dikroisme (CD) og fluorescens spektroskopier, DSC tilbyder en række fordele i et comkommerciel indstilling herunder omkostnings- og tidsbesparelser. Første den adiabatiske udformning af et differential scanning kalorimeter muliggør måling af termisk stabilitet med bedre temperatur præcision sammenlignet med målinger med instrumentering til CD og fluorescens spektroskopier 6. For det andet i modsætning til CD, nøjagtigheden af DSC data er ikke afhængig af helicitet af proteinet 39, 40; Men CD giver yderligere oplysninger om udfoldelsen af den sekundære struktur, som ville være gratis til DSC 41. Derudover tryk i DSC systemet giver mulighed for test med et stort temperaturområde uden kogning af prøven; Således kan en lang række proteiner testes ved DSC.

Mens DSC er en relativt hurtig og enkel metode til at bestemme den termiske stabilitet af biologiske, er det ikke uden begrænsninger. Først, basenline subtraktion trin introducerer en form for human inkonsistens i rå dataanalyse; således kan variationer i resultaterne observeret blandt forskellige brugere. For det andet, differential scanning varmemålere har minimum koncentrationsgrænser, som kan være vanskelig at opnå på bulk produktion skala. For det tredje, AH af irreversibel termisk denaturering er ikke absolut; hvilket indebærer, at afledt AG (en indikator for proteinstabilitet) i lignende scenarier kan være vildledende. Endvidere metoden fungerer bedst for oprensede prøver. Tilstedeværelse af urenheder kan enten forårsage en ændring i T m, hvis der er en interaktion med proteinet, der undersøges, eller fremkomst af nye termiske overgange, hvis der ikke er nogen interaktion. Under alle omstændigheder disse ekstra funktioner på de thermograms kan fejlagtigt tilskrives prøver, hvilket påvirker fortolkningen af ​​resultaterne. På trods af disse begrænsninger, DSC forbliver en pålidelig metode, der kan give detaljerede termodynamiske oplysninger om the protein udfoldning proces, hvis de gennemføres korrekt 42.

Afslutningsvis DSC giver en betydelig fordel, eftersom en konformationel udlæsning værktøj til vaccineprodukter og deres mellemprodukter. De to parametre, T m og AH, indsamlet for en bred vifte af partier af det samme produkt kan blive en empirisk baseline, der kan bruges til at undersøge effekten af procesændringer, formulering og opbevaringsbetingelser på den tertiære struktur og stabilitet af protein og virale antigener 21, 43.

Disclosures

Alle forfatterne er medarbejdere på Sanofi Pasteur. Arbejdet blev finansieret af Sanofi Pasteur, og offentliggørelse gebyrer for denne video-artikel blev betalt af Sanofi Pasteur. Forfatterne har ingen relevante tilhørsforhold eller økonomisk engagement med en organisation eller enhed, der har en finansiel konflikt med emnet eller materialer diskuteret i manuskriptet. Disse omfatter beskæftigelse, konsulentvirksomheder, kapitalandele eller optioner, eller royalties.

Ingen skriftlig bistand blev udnyttet i produktionen af ​​dette manuskript.

Acknowledgments

Forfatterne er meget taknemmelige for Joseph Mancini (tidligere med GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments begrænset) for deres rolle i installation og træning på differential scanning kalorimeter, Sasmit Deshmukh og Webster Magcalas for deres drøftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Differential Scanning Calorimeter Malvern Instruments Ltd 28428948 (Via GE Healthcare) Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100 Decon Laboratories Inc 1504 Dilute with water to 20% before use
500 µL Polypropylene round bottom 96 well plate Canadian Life Science ML072100 Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac  Malvern Instruments Ltd N/Ap provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet  Labconco Logic+ - A2 biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette Thermo Scientific 66810 or 66380 to equilibrate the sample and buffer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience. J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).
  2. Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. Watson, E. S., O'Neil, M. J. , US3263484A 02 August (1966).
  3. O'Neill, M. J. The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter. Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).
  4. O'Neil, M. J. Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry. Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).
  5. Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).
  6. Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).
  7. Andronikashvili, E. L., et al. Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor. Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).
  8. Andronikashvili, E. L., et al. Conformational Changes of Biopolymers in Solution. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).
  9. Andronikashvili, E. L. Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures. Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).
  10. Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).
  11. Sturtevant, J. M. Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).
  12. Sturtevant, J. M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).
  13. Jackson, W. M., Brandts, J. F. Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation. Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).
  14. Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin. Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).
  15. Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).
  16. Privalov, P. L., Potekhin, S. A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).
  17. Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).
  18. Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations. Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).
  19. Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).
  20. Oreshkin, E. F., et al. Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating. Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).
  21. Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens. Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).
  22. Jiskoot, W., Daan, C. Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals. 3, Springer Science & Business Media. (2005).
  23. Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. A new ultrasensitive scanning calorimeter. Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).
  24. Plotnikov, V. V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
  25. Freire, E. Differential scanning calorimetry. Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology. 40, 191-218 (1995).
  26. Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).
  27. Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor. Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).
  28. Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. The conformational equilibrium of human growth hormone. J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).
  29. Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states. Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).
  30. Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology. 490, 1-39 (2009).
  31. Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU). Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).
  32. Stability testing of new drug substances and products. Guideline, ICH Harmonised Tripartite. 1 (2), current step. 4 (2003).
  33. Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).
  34. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  35. HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. Differential Scanning Calorimetry. , Springer Science & Business Media. (2003).
  36. Porter, L. L., George, D. R. A thermodynamic definition of protein domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).
  37. Frokjaer, S., Daniel, E. O. Protein drug stability: a formulation challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).
  38. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).
  39. Chiu, M. H., Elmar, J. P. Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions. J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).
  40. Hirst, J. D., Charles, L. B. Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins. J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).
  41. Kirkitadze, M. D., et al. Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact. Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).
  42. Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics. Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).
  43. Wen, J., et al. Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC. J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).

Tags

Biochemistry differentiel scanningskalorimetri termisk stabilitet tertiær struktur proteinudfoldning Thermal overgangstemperatur entalpi proteinstabilitet
Differentialscanningskalometri - en metode til vurdering den termiske stabilitet og Kropsbygning af protein Antigen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, More

Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter