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Genetics

目标 doi: 10.3791/55263 Published: January 26, 2017

Introduction

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四个核心组蛋白H2A,H2B,H3和H4中的压实,组织,和真核染色体的功能发挥中心作用。两套各这些组蛋白的形成的组蛋白八聚体,即指示本身周围的DNA的〜147碱基对的环绕一个分子卷轴,最终导致核小体1的形成。核小体是在各种基于染色体过程,如基因转录的调节和常染色质的形成和异跨染色体积极参与者,因此已经深入研究在过去几十年的过程中的焦点。已经描述了许多机制由核小体可以在方法,可以方便特定进程的执行被操纵 - 这些机制包括组蛋白残基的翻译后修饰,依赖ATP的核小体重构,和ATP依赖性核重组和装配/拆卸2,3。

在芽殖酵母是组蛋白功能的真核生物的理解一个特别强大的模型生物。这在很大程度上归因于整个域真核生物高度组蛋白的进化保守的和酵母的各种遗传和生化实验的方法顺从4。在酵母反向遗传方法已被广泛用于研究染色质生物学的各个方面的具体组蛋白突变的影响。对于这些类型的实验,常常优选使用,其中所述突变体组蛋白从其天然基因组位点表达的细胞,如从自主质粒表达可导致组蛋白的异常细胞内水平(由于细胞不同质粒的数量),并染色质恩伴随变更vironments,它可以混淆最终结果的解释。

在这里,我们描述了一种基于PCR的技术,其允许在不需要在所需突变的生成而不在基因组中剩余的外源DNA序列的克隆步骤和结果其天然基因组的位置的组蛋白的基因的靶向诱变。这种技术利用了有效的同源重组系统的在酵母和具有几个共同的特征与其它组开发的其他类似的技术-尤其是在Delitto普菲 ,位点特异性基因组(SSG)诱变和克隆-自由基于PCR的等位基因替换方法5,6,7。然而,我们描述的技术存在,使得它特别适合于组蛋白基因的突变的一个方面。在单倍体酵母细胞中,每四个核心组蛋白是由两个非一个编码llelic和高度同源的基因:例如,组蛋白H3由HHT1HHT2基因编码,而两个基因的开放阅读框(ORFs)在序列90%以上相同。这种高度的同源性可以变得复杂设计成特异性靶向诱变两个组蛋白编码基因中的一个实验。而上述的方法通常要求使用的靶基因的ORF内的至少一些序列来驱动同源重组,我们在这里描述的技术利用侧翼组蛋白基因的开放阅读框(共用少得多的序列同源性)序列的的重组步骤,从而增加至所需的轨迹诱变成功定位的可能性。此外,驱动重组同源区可以是非常广泛的,从而进一步提高效率的有针对性的同源重组。

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Protocol

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注:有针对性的原位组蛋白基因突变实验策略包括以下几个步骤( 图1中总结)。这些步骤包括:(1)与URA3基因的靶组蛋白基因的置换,(2)产生与对应于两个使用引物携带所需突变(s)时,目标组蛋白基因的部分重叠的片段的PCR产物的纯化(3 )这两个部分重叠的片段的融合的PCR,以获得充分的大小的PCR产物为一体,(4)的全尺寸的PCR产物和骨架质粒共转化,并选择对质粒的标记,(5)画面5-FOA抗性转化体,(6)5-FOA抗性菌落的纯化和骨架质粒的损失,和(7)的分子分析,以测定为突变等位基因的适当整合。

图1
在原地突变在芽殖酵母基因组蛋白的战略概述。在这个例子中,靶基因是HHT2的,但任何其它核心组蛋白基因也可使用这种策略诱变。 (A)的单倍体酵母细胞怀有布置在两个组蛋白H3编码基因(HHT1HHT2)和两个组蛋白H4编码基因(HHF1HHF2)如该图所示(该HHT1HHF1基因位于第II染色体和HHT2HHF2基因位于染色体XIV -在每种情况下,箭头指向在转录的方向上)。在该过程的第一步骤中,HHT2基因的ORF被替换为URA3基因,从而产生一种hht2Δ:: URA3菌株。 (B)在部分1中,从基因组DNA样本的HHT2基因的野生型拷贝用作模板两个PCR反应到属TE上基因的两个部分重叠的片段。用于第一反应中的反向引物包括一个或多个错配的核苷酸(用红色圆圈表示)对应于被引入到基因组中的期望的突变。用于第二反应的正向引物具有在反向互补构造(也用红色圆圈表示)相当于不匹配。在部分1中产生的两个PCR产物(产物ab)随后被用作使用在部分2中示出退火在时尚产品ab这导致全尺寸的PCR产生两种引物用于融合PCR的模板产品(产品C在第3部分)携带所需突变。 (C)hht2Δ:: URA3应变然后共转化与全尺寸的PCR产物和骨架质粒(一个HIS3-标记在本实施例中的质粒),以及细胞被选择用于质粒的存在(在缺乏媒体H在本实施例istidine)。然后转化体进行筛选5-FOA抗性-抗性细胞是已经历同源重组事件导致URA3基因的PCR产物和切除的一体化,如图候选者。通过有丝分裂细胞分裂的骨架质粒的后续丧失导致最终所需组蛋白突变体菌株。我们已经找到了骨架质粒的该选择,然后在的正确整合事件的识别相比,对5-FOA平板直接选择,这主要是标识已获得自发URA3突变的细胞的高得多的频率筛选5-FOA抗性的结果。 (这个数字已经从14参考修改)。 请点击此处查看该图的放大版本。

1.目标组蛋白基因的置换与URA3基因

  1. 执行标准PCR介导的一步法基因破坏与URA3基因8,9更换靶组蛋白基因的ORF。
    注:建议使用携带ura3Δ0酵母细胞作为这种突变将删除整个内源性URA3的ORF,从而避免了PCR产物整合到URA3基因座8。可替代地, 乳酸克鲁维酵母URA3基因可有效地用于组蛋白替换的产生中的任何的ura3背景,因为它是在酿酒酵母中的功能,但具有与酿酒酵母URA3基因仅部分序列同源性应变也应为至少一种化合物,这将允许在转化实验(见本协议的步骤4)的骨架质粒的选择是营养缺陷型。这一步是没有必要的,如果目标蛋白geneΔ:: URA3菌株已经可用。

2.生成和使用的引物携带所需突变对应于目标组蛋白基因的两个部分重叠的片段的PCR产物的纯化(S)

  1. 生成对应于该目标组蛋白基因的两个部分重叠的片段的PCR产物。
    1. 准备两个PCR反应如下:
      1. 产生对应于该基因( 图1B a)产物的前半部分,设置了下面的反应的PCR产物:1微升模板DNA,5μl10μM正向引物,5μl10μM反向引物,0.5微升(1.25 U)的热稳定DNA聚合酶,10微升5×聚合酶缓冲液,5微升dNTP混合液(2毫每个),和23.5微升的dh 2 O
        注意:模板DNA可以是来自菌株的野生型目标组蛋白基因的基因组DNA使用标准亲分离cedures 10。考虑到在DNA浓度和在不同基因组制备杂质水平的变化,则建议通过使用未稀释的DNA或基因组制剂的不同稀释度,以优化反应( 例如,1:10和1:100)。正向引物应当退火到的区域中的靶基因的上游。反向引物应在长度的ORF内退火,是〜40个核苷酸,并含有所需的突变某处它的中间(参见图1B-1和代表结果为实施例部分)。使用高保真DNA聚合酶,以减少对PCR产物的合成过程中不希望的突变率,建议。
      2. 产生对应于该基因(产物B图1B)的第二半的PCR产物,如在2.1.1.1但使用不同的引物表示设置了反应。
        注:远期PRI聚体应在长度的ORF内退火,是〜40个核苷酸,并且包含在它的中间某处的所需突变。注意,在此引物的突变(s)是在步骤2.1.1.1在反向引物的突变的反向互补。反向引物应退火到靶基因的下游区域(参见实施例图1B-1和代表结果部分)。
    2. 放置在热循环仪反应使用以下设置:94℃30秒;的下列设置30个循环:98℃10秒,60℃5秒,72℃1.5分钟;和72℃10分钟。
      注:可能需要特异性引物PCR组参数的优化和目标组蛋白基因。
  2. 从在89毫摩尔Tris碱,89毫硼酸,2.5毫摩尔EDTA(TBE)缓冲液上0.9%的低熔点琼脂糖凝胶对PCR反应50微升材料 - 运行20。
  3. 含有PCR PR切下的琼脂糖凝胶切片使用干净的手术刀或刀片和从凝胶oducts每个转移到1.5ml微量离心管中。存储包含PCR产物的琼脂糖节,在-20℃,直到准备使用。

3.融合两个部分覆盖片段的PCR获取全尺寸PCR产品进行整合

  1. 准备PCR反应模板
    1. 通过在65℃放置离心管中的热块组5分钟熔融来自步骤2.3琼脂糖凝胶切片(或直至完全熔化)。涡流管每1 - 2分钟,以促进熔化过程。
    2. 从每个样品转移的熔融的设定量琼脂糖( 例如 ,每50微升,总共100微升)到单个的离心管,并通过涡旋混合。使用它作为在融合PCR反应的模板。发生在-20℃的管待用。
  2. 扩增全尺寸的PCR产物的量大(产品C在图1B)
    1. 设立六个PCR反应中,每个由以下部分组成:2微升模板DNA,10微升10μM的正向引物,10微升10μM反向引物,1微升(2.5 U)的耐热性DNA聚合酶,20微升5×聚合酶缓冲液,10微升的dNTP混合物(2mM的各)和47微升的dh 2 O.
      注意:可以根据PCR效率来改变反应的数量。模板DNA(参见3.1.2)应该被加热到65℃直到熔化,通过涡旋混合,最后加入PCR反应混合物中。添加后,通过移液上下几次轻轻混匀,但彻底。考虑到在不同样品中的DNA浓度的变化,建议通过使用未稀释的模板或模板的不同稀释度的第一优化反应( 例如,1:10和1:100)。用于应退火到靶基因作为病的两个部分重叠的片段两个引物ustrated 图1B-2和被设计成使得最终PCR产物将具有在任一侧同源的区域侧翼的URA3 ORF将驱动同源重组步骤(参见实施例代表结果部分)的至少40个碱基对。使用高保真DNA聚合酶,以减少对PCR产物的合成过程中不希望的突变率,建议。
    2. 放置在热循环管具有以下设置:94℃30秒;的下列设置30个循环:98℃10秒,50℃15秒,72℃1.5分钟;和72℃10分钟。
      注:可能需要特定的引物组和目标组蛋白基因的PCR参数的优化。

全尺寸PCR产品和骨架质粒4.共转化,与选择标记质粒

  1. 的PCR产物的浓度
    1. 池在S九PCR反应从步骤3.2.2成一个单一的离心管(600微升总),并通过涡旋混合。
    2. 拆分样品到离心管三块200微升等分。通过加入3M醋酸钠20微升(pH5.2)和550微升的100%乙醇沉淀在每个管中的DNA。充分搅拌溶解并在冰上放置至少15分钟。收集在〜14000 xg离心离心DNA 10分钟,用200μl70%乙醇,和空气干燥冲洗沉淀。
    3. 重悬每个DNA沉淀到25微升的dh 2 O,并汇集成一个单一的管(总共75微升)。
  2. 酵母共转化
    1. 在酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YPD)液体培养基11准备好10毫升部分1产生的应变的过夜培养。
    2. 第二天早晨,接种400毫升YPD液体培养基的用8ml饱和过夜培养物,并通过摇动孵育在30℃下为4 - 5小时,以允许细胞进入对数生长期。
    3. 收集通过离心将细胞以〜3,220×g离心10分钟,丢弃该液体介质,和重悬细胞于1体积的10mM的Tris-HCl(pH值8.0),1mM EDTA中的,0.1M醋酸锂溶液(TE /醋酸锂) 。
    4. 收集在〜3,220 xg离心的细胞离心10分钟,并弃去的TE /醋酸锂。
    5. 悬浮细胞在1毫升的TE /醋酸锂。
    6. 设置以下反应鸡尾酒在一个离心管中:从步骤4.2.5 800微升的细胞,将40μl煮沸10毫克/毫升鲑鱼精子DNA的,共骨架质粒DNA 12.5微克和75微升浓PCR产物从步骤4.1.3。
      注:鲑鱼精子DNA应煮沸5分钟,在反应中使用之前,在冰上放置至少5分钟。加入骨架质粒DNA的总体积应保持在最低限度(〜80微升或更小)。见代表性的成果部分骨干血浆的例子ID。
    7. 调匀鸡尾酒管均匀地分装成八离心管(管1 - 8)。
    8. 设置以下两个控制转化反应管:
      1. 管9(无PCR产物对照):细胞100μl的从步骤4.2.5,5微升煮沸10毫克/毫升鲑鱼精子DNA的(煮沸5分钟;参见步骤4.2.6注),总共1.56微克的骨干质粒DNA和无PCR产物加入。
      2. 管10(无DNA对照):细胞100μl的从步骤4.2.5煮沸10毫克/毫升鲑鱼精子DNA(见步骤4.2.6注)5微升,无骨架的质粒DNA,并将无PCR产物加入。
      3. 移液器向上和向下几次轻轻但调匀都管。
    9. 在30℃下进行30分钟孵育的十个管。
    10. 向每个管中,于TE /醋酸锂添加1.2毫升40%的聚乙二醇(PEG 3350)。调匀利用P-1000吸管直到溶液是均匀的。
    11. 孵育十管30°下进行30分钟。轻轻吹打上下混合溶液中,然后在42℃孵育管15分钟。
    12. 通过在〜14000 xg离心纺丝管在微量30秒收集细胞。丢弃液体和重悬细胞于1ml无菌卫生署2 O的
    13. 通过在〜14000 xg离心纺丝管在微量30秒收集细胞。丢弃液体和悬浮细胞在500微升无菌卫生署2 O的
    14. 池管1 - 8一起(为4ml总体积),并通过上下抽吸调匀。
    15. 板200微升上为二十完整最小丢包介质板11(板1-20)为骨架质粒的选择的上述混合物组成。
    16. 板从管9 200微升混合物和从管子10各200μl的混合物在其自己的选择板(板21和22,分别地)。
    17. 孵育22板在30℃,3 - 5天选择质粒转化。
    18. 孵化5天 - 3后检查转变板。大约5000菌落应该在1-21板(参见例子代表性的成果),可见没有殖民地应该存在于板22。

5.屏幕5-FOA抗性转化

  1. 从板传递细胞1 - 20(与转化板21作为对照)至5-氟乳清酸(5-FOA)板11由复制品镀以筛选URA3基因的损失的积分的结果,12 PCR产物在所需的位置。
    1. 取下盖板,按含在无菌天鹅绒殖民地板。按盘上的丝绒转移细胞从绒到5-FOA板上。在30℃下2天孵育板。
  2. 继为期2天的孵化,仔细检查GR 5-FOA平板owth。
    注:考生整合活动将通过一个小的非对称“挤压”殖民地在5-FOA板来表示-相反,小乳头5-FOA平板上生长都是自发URA3突变可能代表菌落上生长期间出现变换板,并因此不可能代表所需的整合事件(参见图3中有关此点进一步阐述代表性的结果部分和用于一些例子)。

6.净化5-FOA抗性菌落和骨干质粒的损失

  1. 用无菌牙签,从在步骤5.2和条纹为单个菌落描述到YPD平板5-FOA平板挑候选菌落。在30℃C 3天 - 孵育2。
  2. 孵育后,副本-每个板块YPD净化板新鲜YPD板,辍学板缺乏尿嘧啶检查损失URA3基因,以及第二分出出板的监测为骨架质粒的存在或不存在。在30℃下反应2天 - 孵育1。
  3. 孵育后,确定从不断增长的YPD板,但没有成长在任辍学板的每个候选样本的殖民地(如殖民地有望通过重组事件已经失去了URA3基因和有丝分裂过程中丢失的骨架质粒细胞分裂)。 Restreak新鲜YPD平板这样的殖民地。这些菌落的整合候选人,将在第7步进一步分析。

7.分子分析为测定突变等位基因的适当整合

  1. 隔离用标准方法10所述候选样本基因组DNA。
  2. 扩增基因组区域包含目标站点。
    1. 设置每个样品的下述PCR反应:0.5微升模板DNA,5微升10μM的正向引物,5μl的10μM反向引物,0.5微升(2.5单位)Taq DNA聚合酶,5微升10×Taq DNA聚合酶缓冲液,5微升dNTP混合液(2毫各)和29微升的dh 2 O
      注意:模板的DNA是从候选样本得到的基因组DNA。建议还包括两个对照反应:一种使用来自原始组蛋白geneΔ的基因组DNA :: URA3菌株作为模板,并从野生型组蛋白菌株为模板另一个使用基因组DNA。考虑到在DNA浓度和在不同基因组制备杂质水平的变化,则建议通过使用未稀释的DNA或基因组制剂的不同稀释度,以优化反应( 例如,1:10和1:100)。以确保重要的是这些引物退火到DNA序列的推定集成PCR产物所包围的区域的外侧 -这样,PCR产物在这些r中尺寸eactions可以用作在正确的基因组位置,为产品的集成的诊断工具(参见,例如代表性结果 )。
    2. 放置在热循环仪反应使用以下设置:94℃3分钟;的下列设置30个循环:94℃45秒,50℃45秒,72℃2分钟;和72℃10分钟。
      注:可能需要特定的引物组和目标组蛋白基因的PCR参数的优化。
  3. PCR产物的加工
    1. 从在0.8%TBE琼脂糖凝胶上各反应运行20微升。
    2. 评估使用DNA标准作为参考,以确定是否URA3基因已被推定的突变蛋白的基因被成功取代PCR产物的大小(参见,例如代表性结果)。
      注意:在某些情况下,所期望的突变引入到组蛋白基因创建或销毁限制性坐即如果是这样的情况下,在指示正确整合的大小的PCR产物所需突变的存在可以通过产品经受消化与相应的限制酶,随后通过凝胶电泳分析来评估(见,例如代表结果) 。
    3. 指示正确整合的大小,以DNA测序的主题的PCR产物以确认所期望的突变的存在,并且,以确保没有另外的突变已引入基因组中。

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Representative Results

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我们描述一个hht2等位基因表达组蛋白H3突变蛋白从精氨酸作为靶向原位诱变策略的代表性例子窝藏在53位的取代为谷氨酸(H3-R53E突变体)的产生。

我们产生其中HHT2的完整ORF被URA3基因(见协议的步骤1)代替的菌株。该菌株,yAAD156,也藏着his3Δ200等位基因,这将导致细胞是营养缺陷型组氨酸。以下在该协议的步骤2所述的程序,我们再生成HHT2的两个部分重叠的片段以下引物用于在第一片段:正向引物(OAD20):5'GCGTTCATTATCGCCCAATGTG 3'和反向引物(R53Erev):5'GTTCAGTAGATTTTTGGAATtcTCTAATTTCTCTCAAG 3'。下面公关imers被用于第二个片段:正向引物(R53Efor):5'CTTGAGAGAAATTAGAgaATTCCAAAAATCTACTGAAC 3'和反向引物(OAD21):5'GCGCTTGATCAGCAGTTCATCG 3'。注意,反向引物在第一反应和正向引物在第二反应含有所需突变的核苷酸(小写) - 这些突变核苷酸在两者之间长的野生型序列的延伸坐落,因为这允许有效退火的引物与模板DNA尽管在突变位置的失配。还要注意,在这两个引物的突变的核苷酸是反向彼此互补,并导致在有义链的AG对GA突变,这导致在一个AGA到GAA密码子改变,这最终产生在所编码的蛋白质的R53E突变。从这些PCR反应的结果示于图2A。

步骤3使用过程中,我们再根儿 ated全尺寸的PCR产物。所用的引物是正向引物(OAD479):5'TATGGCTCGGTGTCAAAACA 3'和反向引物(OAD480):5'CATGGTTTCTTGCCGGTTAT 3'。当设计这些引物,它以确保所得到的融合PCR产物包括至少40个碱基对在任结束以驱动同源重组反应(同源性的区域中的时间越长,更有效和特定的同源重组事件将是非常重要的是)。在我们的实验中,将全尺寸的PCR产物分别含有一个195个碱基对区和220个碱基对的区域同源的上游区域和HHT2 ORF的下游这些PCR产物的样品用琼脂糖凝胶电泳( 图2B)进行分析。

全尺寸的PCR产物然后用质粒pRS413(着丝粒沿共转化,HIS3-标记质粒F“> 13)并转化为在该协议的步骤4中描述的缺乏组氨酸(SC-他的板)的平板上挑选出来的。然后他+菌落筛选5-FOA抗性下列协议中的第5步中描述的方法。 图3示出一个转换板(SC-他的)和下列副本镀自SC-他的板。候补样品以及样品不可能代表所需的积分事件实施例5-FOA平板的例子在图3中还提出了在我们的实验中,我们确定了12的候选样本中筛选出来〜90000的转化,作为该协议的步骤6中所述然后纯化这些候选人。

那么十二名候选人经受协议的步骤7中所述,以评估他们是否反映了突变的PCR产物URA3基因的正宗替代PCR分析。对于我们experimenT,我们使用一个正向引物退火89个碱基对的上游从PCR产物的整合位点和反向引物下游退火302个碱基对从PCR产物的整合位点。这些引物产生的在大小1217个碱基对的PCR产物,如果HHT2轨迹由HHT2(HHT2的突变版本窝藏碱基对取代),或在大小2188个碱基对的PCR产物占领如果轨迹是由URA3标记基因占用。的正向引物的序列中使用(OAD476)为:5'GAAACTATTGGCACGCCCTA并且该反向引物的使用(OAD477)为:5'CCTGCGAATCAACCGATACT 3'。我们已经确定了十二个候选人中,4例显示PCR产物整合在正确的位置(参见例子图4A)。最后,由于将AG对GA突变产生一个新的EcoRⅠ限制性位点,我们进行的PCR产物从成功整合样品之一到一个图4B)。在这种特殊情况下,我们没有测序的PCR产物,以确保额外的不利的突变没有被并入基因组:然而,我们已经使用了一个过程非常类似于此,以产生在一个过去研究14大量HHT2突变,并且发现,大多数的集成突变等位基因的携带不超过所需的之外的其它突变。

图2
2:PCR 产物窝藏生成所需的集成突变引入酵母基因组。 (A)PCR反应,以产生HHT2的部分重叠片段携带所需突变。上图:的t卡通代表他两个PCR反应,以获得两个HHT2片段(参见图1B-1)。红色圆圈表示上用于引入的基因的有义链的AG对GA突变的引物的错配核苷酸。底部:PCR产物AB(泳道2和3,分别地)的凝胶电泳分析。 DNA标准品示于泳道1(B)中的融合PCR反应,以产生整合入酵母基因组全尺寸的PCR产物(参见图1B-2和3)。顶部:PCR反应的卡通表示和预期的PCR产物(产物C)。红色圆圈表示如上(A)中描述的所需的突变。底部:PCR产物Ç凝胶电泳分析(泳道2)。 DNA标准泳道1所示,请点击此处查看该图的放大版本。


图3: 从共转化实验和5-FOA屏幕代表性的成果。 左:代表SC-他的镀板在30℃3天的潜伏期后经受共转化过程小区。大约5000菌落计数。中东:以下,在30℃的2天的潜伏期后,从SC-他共转化板副本镀代表性的5-FOA板。样品1和2是由于其不对称的形态考虑候选人通过成功整合的事件已经不见了。这是因为,一个真正的替代URA3基因与hht2等位基因很可能发生之前(或之后不久)的转化细胞被铺在所述SC-他的板,并且作为结果,将在该位置出现的集落将包含大部分,如果不是全部,5-FOA-resistanT细胞 - 当这样的菌落是随后复制铺板到5-FOA平板它将被压扁,从而引发细胞在平板上的不对称的前瞻性补丁。相反,自发性 在能够在集落形成产生的URA3基因的突变更可能被一个菌落的小区域内密闭,并因此更可能产生乳头时复制铺板到5-FOA板上。右:不同代表性的5-FOA板下在30℃3天的潜伏期后,从SC-他共转化板副本电镀。一个附加的候选(样品3),以及两个小乳头上该板(样品4和5)可见-例如乳头,这是后培养3天或更多天最清晰可见,可能代表自发URA3突变和未所需积分事件。 请点击这里查看一个更大的版本这个数字。

图4
图4: 候选集成样品的分子分析。 )PCR检测,以确定成功的整合事件。顶部:用于评估hht2突变等位基因入基因组的成功整合PCR反应的卡通表示。底部:使用,应变yAAD156窝藏hht2Δ:: URA3置换(用作对照,泳道3)从HHT2野生型菌株的基因组DNA(作为对照,泳道2)的PCR反应的凝胶电泳分析,候选集成的样品(泳道4),和一个5-FOA抗性乳头样品(并且因此不太可能代表一个正确整合事件,泳道5)。 DNA标准品示于泳道1.注意PCR产物为候选集成样品的尺寸是consistent的一个成功的整合事件,而PCR产物为乳头样本的大小是具有完整hht2Δ:: URA3轨迹是一致的。 (B)的EcoRⅠ消化以证实突变等位基因的存在。顶部:从含有或野生型HHT2基因或突变hht2等位基因的PCR产物的一个的EcoRⅠ消化反应得到预期的消化片段的卡通表示。底部:从野生型HHT2菌株的PCR产物的消化反应的凝胶电泳分析(泳道2;这里使用从相同的样品作为在面板A的泳道2中使用分别得到的PCR产物)和候选集成样品(泳道3;这里使用从相同的样品,推导出作为在面板A的泳道4中使用)的PCR产物。 DNA标准品示于泳道1.注意消化模式确认AG获得的GA突变已经被成功导入到候选的基因组整合的样本。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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序列同源性的高水平的两个非等位基因,对于每个在单倍体酿酒酵母细胞中的四个核心组蛋白的代码可以表示谁希望特异性靶向两个基因诱变之一调查一个挑战之间。先前描述的酵母诱变方法,包括Delitto普菲 ,位点特异性基因组(SSG)诱变和自由克隆基于PCR的等位基因替换方法5,6,7,以及更近的酵母基于CRISPR的技术15,通常依赖至少在上的靶基因来招募重组或修理机器到所需的基因组位点的ORF中的序列部分以最终产生最终的突变等位基因。另一方面,我们在这里提出的策略是利用DNA序列的侧翼有针对性的ORF以驱动homologo要求我们重组事件的突变的融合,并且,其结果是,允许在另一个尽管具有高度同源的ORF两个基因的基因的更具体的定位。这一特性使得我们的战略,特别适合组蛋白突变。然而,这种策略也可适于在酵母基因组中的其他基因的诱变。

我们的策略的其他功能包括以下事实驱动该突变基因的同源重组可设计的区域的长度是非常广泛的,从而增加了整合的效率在靶基因组位置,并且,除了所需突变(S )没有额外的DNA序列引入基因组中。该系统的另一个优点是,一旦携带置换URA3特定组蛋白基因的菌株已被构成,它可用于该特定HIST的任何期望的突变版本的生成一个基因。因此,例如,应变yAAD156,这是可用于研究社会要求,可用来进行任何所需hht2突变,而无需构建从头hht2Δ:: URA3等位基因。最后,通过使用适当设计的PCR引物,这种策略也可用于产生具有内部缺失,或在多个密码子的突变蛋白的等位基因,只要它们相对彼此接近(例如,我们已经产生编码的hht2等位基因H3-K56R,使用这种策略L61W双突变体蛋白)。

特异性靶向的两个高度同源的蛋白的基因用于诱变一项所述的能力可能是在若干不同的实验设置是有用的。例如,由于HHT1-HHF1基因在不同的水平表达相比HHT2-HHF2基因16,它可能是感兴趣的,以确定一个特定H3或H4突变是否赋予二取决于fferent表型在其基因是从表达。另一例子是在其中一个研究者希望产生表达来自两个相应组蛋白基因的特定组蛋白突变体单倍体细胞的方案 - 这可以通过首先在两个不同的菌株独立诱变每一个基因,然后通过交叉获得双重突变体单倍体细胞来实现和所需的减数分裂产物的随后分离。又一实例涉及组蛋白H2A和H2B的诱变:鉴于两个略有不同的各蛋白质的同种型由相应的非等位基因基因组编码,调查员可能希望评估一个特定H2A或H2B突变的影响任一异构体的情况下。当设计实验来诱变HTA1HTB1位点(分别编码H2A和H2B,),调查人员应该知道最近的调查结果显示,株携带一个(hta1-htb1)Δ都是可行的只有我˚F它们扩增通过一个小圆形染色体17的产生HTA2-HTB2轨迹(和附近HHT1-HHF1轨迹以及),因为这可能对结果的解释复杂化。

我们最近使用的版本与组蛋白的诱变策略产生表达所有可能的氨基酸取代在位置61,这通常是由氨基酸的亮氨酸14占用组蛋白H3蛋白质。对于这些实验,而不是使用yAAD156作为诱变的起始菌株,我们使用应变yADP106,该港口的URA3TRP1营养标记(而不是仅URA3)兼具更换HHT2 ORF的。两个标记基因的存在促进了候选的识别为以下的5-FOA屏幕和纯化步骤(步骤5和协议的6)突变PCR产物的集成,这样candidatES成为表型浦-和Trp - ,而自发URA3突变导致与浦细胞-色氨酸+表型。 yADP106也可根据要求,因为是URA3-TRP1盒,这可能被放大作为一个单元和用于使用本文所述的策略的其他组蛋白基因诱变的序列。

不能获得使用此策略可能是归因于许多可能的原因,包括量的用于整合步骤或之后的共转化步骤数量不足的转化的全尺寸的PCR产物不足所需的蛋白的突变体。前者的问题可以通过集中在一起较大套PCR反应或通过设计产生产物的产率提高不同的引物组来解决,而后者的问题可以通过在共转化试验使用较高量骨架质粒的解决。本书虽然是啊,如前面所指出的,人们可以使用该过程来产生的组蛋白的突变体携带两个或更多个氨基酸取代,所述的靶向氨基酸必须由于各密码子需要位于相同的引物分子内相对彼此接近。因而,这种策略不能容易地适于与位于遥远彼此跨越蛋白质的长度的多个突变组蛋白的产生。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb DNA Ladder (DNA standards) New England BioLabs N3232L
Agarose  Sigma A5093-100G
Boric Acid Sigma B0394-500G
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192
EDTA solution (0.5 M, pH 8.0) AmericanBio AB00502-01000
Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific 16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E4884-500G
Lithium acetate dihydrate Sigma L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler BioRad 170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5x buffer Fisher Scientific 50-443-960
Salmon sperm DNA solution ThermoFisher Scientific 15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form) Sigma T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate Sigma 236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) AmericanBio AB00985-00100
Taq Polymerase and 10x Buffer New England BioLabs M0273X
Toothpicks Fisher Scientific S67859
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) AmericanBio AB14043-01000
a-D(+)-Glucose Fisher Scientific AC170080025 for yeast media
Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 for yeast media
Peptone Fisher Scientific DF0118-07-2 for YPD medium
Yeast Extract Fisher Scientific DF0127-17-9 for YPD medium
4-aminobenzoic acid Sigma A9878-100G for complete minimal dropout medium 
Adenine Sigma A8626-100G for complete minimal dropout medium 
Glycine hydrochloride Sigma G2879-100G for complete minimal dropout medium 
L-Alanine Sigma A7627-100G for complete minimal dropout medium 
L-Arginine monohydrochloride Sigma A5131-100G for complete minimal dropout medium 
L-Asparagine monohydrate Sigma A8381-100G for complete minimal dropout medium 
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate Sigma A6683-100G for complete minimal dropout medium 
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamic acid hydrochloride Sigma G2128-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamine Sigma G3126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma H8125-100G for complete minimal dropout medium 
L-Isoleucine Sigma I2752-100G for complete minimal dropout medium 
L-Leucine Sigma L8000-100G for complete minimal dropout medium 
L-Lysine monohydrochloride Sigma L5626-100G for complete minimal dropout medium 
L-Methionine Sigma M9625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Phenylalanine Sigma P2126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Proline Sigma P0380-100G for complete minimal dropout medium 
L-Serine Sigma S4500-100G for complete minimal dropout medium 
L-Threonine Sigma T8625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tryptophan Sigma T0254-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tyrosine Sigma T3754-100G for complete minimal dropout medium 
L-Valine Sigma V0500-100G for complete minimal dropout medium 
myo-Inositol Sigma I5125-100G for complete minimal dropout medium 
Uracil Sigma U0750-100G for complete minimal dropout medium 
Ammonium Sulfate Fisher Scientific A702-500 for complete minimal dropout medium 
Yeast Nitrogen Base Fisher Scientific DF0919-07-3 for complete minimal dropout medium 
5-Fluoroorotic acid (5-FOA) AmericanBio AB04067-00005 for  5-FOA medium

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References

  1. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, (6648), 251-260 (1997).
  2. Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
  3. Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Genetics. 190, (2), 351-387 (2012).
  4. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197, (1), 33-48 (2014).
  5. Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
  6. Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7 (2004).
  7. Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7, (12), 1174-1183 (1997).
  8. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14, (2), 115-132 (1998).
  9. Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  10. Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  11. Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
  12. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63, (3), 399-406 (1952).
  13. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122, (1), 19-27 (1989).
  14. Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5, (5), 741-749 (2015).
  15. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, (7), 4336-4343 (2013).
  16. Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8, (2), 945-954 (1988).
  17. Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443, (7114), 1003-1007 (2006).
目标<em&gt;原位</em&gt;组蛋白突变的基因在芽殖酵母
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Duina, A. A., Turkal, C. E. Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (119), e55263, doi:10.3791/55263 (2017).More

Duina, A. A., Turkal, C. E. Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (119), e55263, doi:10.3791/55263 (2017).

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