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Genetics

ターゲットを絞りました doi: 10.3791/55263 Published: January 26, 2017

Introduction

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4つのコアヒストンタンパク質H2A、H2B、H3、およびH4は、真核生物の染色体の締固め、組織、および機能において中心的な役割を果たしています。これらのヒストンのそれぞれの二組は、最終的にヌクレオソーム1の形成をもたらす、ヒストン八量体、自身の周囲のDNAの〜147塩基対の折り返しを指示する分子スプールを形成します。ヌクレオソームは、そのような遺伝子転写の調節および染色体全体のユークロマチンとヘテロクロマチンの形成と染色体ベースのプロセスの様々な積極的な参加者であり、そのように、過去数十年にわたって集中的な研究の焦点となっています。これらの機構は、ヒストン残基、ATP依存的ヌクレオソームのリモデリング、およびATP非依存性ヌクレオソーム再編成の翻訳後修飾を含む - の機構の数がヌクレオソームは、特定のプロセスの実行を容易にすることができる方法で操作することができるによって記載されています及び組立/分解2,3。

出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエは、真核生物におけるヒストンの機能を理解するために、特に強力なモデル生物です。これは主に遺伝的および生化学的実験の様々なドメイン真核生物および酵母の従順を通して、ヒストンタンパク質の進化的保存の高度に帰することができる4に近づきます。酵母における逆遺伝的アプローチは広くクロマチン生物学のさまざまな側面に関する特定のヒストン変異の影響を研究するために使用されてきました。実験のこれらのタイプのためには、自律的なプラスミドからの発現は、ヒストンタンパク質の異常な細胞内レベルにつながることができますように(これは細胞内でのプラスミドの様々な数に)、変異型ヒストンが母国のゲノム遺伝子座から発現される細胞を使用することが好ましいことが多いとクロマチンアンの同時変更最終的には結果の解釈を混乱することができvironments、。

ここでは、ゲノム中の残りの外因性DNA配列せずに所望の変異(複数可)の生成にクローニングステップと結果を必要としないそれらの天然ゲノム位置でのヒストン遺伝子の標的突然変異誘発を可能にするPCRベースの技術が記載されています。この技術は、酵母内で効率的な相同組換え系を利用し、他のグループによって開発された他の同様の技術と共通のいくつかの機能があります-最も顕著Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム(SSG)突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子を代替法5、6、7。しかし、私たちが説明する手法は、特にヒストン遺伝子の突然変異誘発のために非常に適しせる側面を持っています。半数体酵母細胞では、4つのコアヒストンの各々は、二つの非Aによりコードされますllelicと相同性の高い遺伝子は、たとえば、ヒストンH3はHHT1HHT2遺伝子によってコードされ、そして2つの遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)は、シーケンス内の90%以上同一です。相同性のこの高度に特異的突然変異誘発のための2つのヒストンをコードする遺伝子のいずれかを標的とするように設計された実験を複雑にすることができます。上述の方法は、多くの場合、相同組換えを駆動するために、標的遺伝子のORF内の少なくともいくつかの配列の使用を必要とするのに対し、ここで説明する技術は、のために(非常に少ない配列相同性を共有する)ヒストン遺伝子のORFに隣接する配列を利用します組換え工程は、所望の遺伝子座に突然変異誘発の成功した標的化の可能性を高めます。また、再結合を駆動相同領域は、さらに効率的な標的相同組換えに貢献し、非常に広範であることができます。

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Protocol

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注: その場ヒストン遺伝子の突然変異誘発において標的するための実験戦略は、( 図1にまとめた)いくつかのステップを含んでいます。これらの手順は、(1)URA3遺伝子と標的ヒストン遺伝子の置換を、所望の変異を保有するプライマーを用いて標的ヒストン遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントに対応するPCR産物(2)の生成、精製、(3 )融合統合のためにフルサイズのPCR産物を得るための2つの部分的に重複する断片のPCR、フルサイズのPCR産物と骨格プラスミドの(4)同時形質転換し、プラスミド上のマーカーの選択、(5)画面5-FOA耐性形質転換体、(6)5-FOA耐性コロニーの精製および骨格プラスミドの損失、および(7)分子は、突然変異対立遺伝子を適切に統合するためのアッセイに分析しています。

図1
その場突然変異誘発ターゲットを絞った戦略の概要。この例では、標的遺伝子はHHT2であるが、他のコアのヒストン遺伝子はまた、この方法を使用して突然変異誘発することができます。図に示すように、(A)半数体酵母細胞が配置された二つのヒストンH3をコードする遺伝子(HHT1HHT2)と2つのヒストンH4をコードする遺伝子(HHF1HHF2)を保有する(HHT1HHF1遺伝子は染色体IIとHHT2上に配置されていますそしてHHF2遺伝子は染色体XIVに配置されている-それぞれの場合において、矢印は転写の方向を指します)。手順の最初のステップでは、HHT2遺伝子のORFはhht2Δ:: URA3株を生じさせる、URA3遺伝子と置換されています。 (B)第1部では、ゲノムDNA試料からHHT2遺伝子の野生型コピー属には、2つのPCR反応のテンプレートとして使用され遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントをTE。最初の反応のためのリバースプライマーは、ゲノム中に導入される所望の突然変異(単数または複数)に対応する(赤い円で示される)は、1つ以上のミスマッチのヌクレオチドを含みます。第二の反応のためのフォワードプライマーは(も赤い丸で示す)の逆相補的な構成で同等の不一致があります。フルサイズのPCRの世代にこの結果パート2に示した2つのPCR部1で生成された製品(製品AおよびB)、その後の方法で二つのプライマーアニーリングの製品にABを使用して、融合PCRのテンプレートとして使用されています製品(パート3の生成物c)所望の変異(複数可)を保有します。 (C)hht2Δは:: URA3株は、その後で同時形質転換欠く培地上で(フルサイズのPCR産物及び骨格プラスミド(HIS3-この例でプラスミドを表示)で、細胞がプラスミドの存在のために選択されます時間この例ではistidine)。形質転換体を5-FOA抵抗性に関してスクリーニングする-耐性細胞は、図示のように、URA3遺伝子のPCR産物および切除の統合をもたらす相同組換え事象を受けた候補です。有糸分裂細胞分裂によって骨格プラスミドのその後の損失は、最終的な所望のヒストン変異株をもたらします。我々は、骨格プラスミドの選択は、主に自発的なURA3変異を獲得した細胞を識別し、5-FOAプレート上で直接選択、と比較して、正しい組込み事象の識別のはるかに高い周波数では5-FOA抵抗性の結果を得るためのスクリーニングに続いていることを発見しました。 (この図は、基準14から変更されています)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

URA3とターゲットヒストン遺伝子の1交換遺伝子

  1. URA3遺伝子8、9でターゲットヒストン遺伝子のORFを交換する標準的なPCR媒介ワンステップの遺伝子破壊を実行します。
    注:この変異は、このようにURA3遺伝子8にPCR産物の統合を回避し、全体の内在性URA3 ORFを除去するようura3Δ0を有する酵母細胞の使用が推奨されます。それはS.セレビシエ中で機能的であるが、S。cerevisiaeのURA3遺伝子を有するのみ部分的な配列相同性を有するあるいは、K.ラクティスURA3遺伝子は、任意のURA3バックグラウンドでヒストン置換を生成するために有効に利用することができます株はまた、(本プロトコールのステップ4を参照)形質転換実験における骨格プラスミドの選択を可能にする少なくとも一つの化合物に対して栄養要求性であるべきです。 ターゲットヒストンgeneΔ:: URA3場合は、この手順は必要ありません株はすでに利用可能です。

2.生成および所望の変異を保有するプライマーを用いて、ターゲットヒストン遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントに対応するPCR産物の精製(複数可)

  1. 標的ヒストン遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントに対応するPCR産物を生成します。
    1. 次のように2つのPCR反応を準備します。
      1. 1μlの鋳型DNA、5μl10μMフォワードプライマー、5μl10μMリバースプライマー、0.5μlの(1.25 U)熱安定性:以下の反応を設定する遺伝子( 図1Bの製品A)の最初の半分に相当するPCR産物を生成するにはDNAポリメラーゼ、10μlの5×ポリメラーゼバッファー、5μlののdNTP混合物(各2mM)、および23.5μlののdH 2 O.
        注:鋳型DNAは、標準的なプロを使用して単離し、標的ヒストン遺伝子のための株を野生型由来のゲノムDNAをすることができます10を cedures。 DNA濃度と異なるゲノム製剤中の不純物のレベルの変動を説明するために、それが希釈されていないDNAまたはゲノムの製剤の異なる希釈のいずれかを使用して反応を最適化することが推奨される( 例えば、1時10分および1:100)。フォワードプライマーは、標的遺伝子の上流領域にアニールすべきです。逆方向プライマーは、ORF内のアニーリング長さが〜40ヌクレオチドであり、かつ(例については、 図1B-1および代表的な結果のセクションを参照してください)どこかの途中で所望の変異(複数可)を含める必要があります。高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、PCR産物の合成中に望ましくない変異の割合を低減するために推奨されます。
      2. 2.1.1.1であるが、異なるプライマーを用いて示されているように遺伝子( 図1Bにおける製品B)の第二の半分に相当するPCR産物を生成するには、反応を設定します。
        注:前方のpriマーは、ORF内でアニールする必要があります〜40ヌクレオチド長であること、そしてどこかの真ん中に所望の変異(複数可)を含有します。このプライマー中の変異(複数可)は、ステップ2.1.1.1で逆方向プライマー中の変異(複数可)の逆相補であることに注意してください。リバースプライマーは、標的遺伝子の下流領域にアニールする必要があります(例については、 図1B-1および代表的な結果のセクションを参照してください)。
    2. 次の設定でサーモサイクラーで反応を置き:94℃で30秒;次の設定の30サイクル:98℃で10秒、60℃5秒、72℃1.5分。そして72℃で10分。
      注:PCRパラメータの最適化は、特定のプライマーセットのために必要とヒストン遺伝子を標的とすることができます。
  2. 89 mMのトリス塩基、89mMのホウ酸、2.5 mMのEDTA(TBE)緩衝液中の0.9%低融点アガロースゲル上でPCR反応から材料50μlの - 20を実行します。
  3. PCR PRを含む切断アガロースゲル切片きれいなメスまたはカミソリ刃を用いてゲルからoductsを1.5 mlマイクロチューブにそれぞれを移します。使用する準備ができるまで-20℃でのPCR産物を含むアガロースのセクションを保管してください。

統合のためのフルサイズPCR産物を得るために、2つの部分的に重複断片の3融合PCR

  1. PCR反応のためのテンプレートを準備
    1. 5分間65℃のヒートブロックセット内のマイクロチューブを配置することによって、ステップ2.3からのアガロースゲル切片を融解(または完全に溶融するまで)。ボルテックスチューブ毎に1 - 溶融工程を容易にするために、2分間。
    2. 各試料からアガロース溶融の設定量を転送し( 例えば 、50μlの各、100μlの合計)は、単一のマイクロ遠心チューブに、ボルテックスにより混和します。融合PCR反応におけるテンプレートとしてこれを使用してください。使用する準備ができるまで-20℃でチューブを置きます。
  2. フルサイズのPCR産物を大量に増幅する(製品C)図1Bの
    1. 6 PCR反応を設定し、次のコンポーネントを持つ各:2μlの鋳型DNA、10μlの10μMのフォワードプライマー、10μlの10μMのリバースプライマー、1μlの(2.5 U)耐熱性DNAポリメラーゼ、20μlの5倍DNAポリメラーゼ緩衝液、10μlのdNTP混合物(各2mM)、および47μlののdH 2 O
      注:反応の数は、PCRの効率に応じて変更することができます。鋳型DNAは、(3.1.2を参照)溶融するまで、65℃に加熱し、ボルテックスにより混合し、PCR反応混合物に最後に添加されるべきです。一度に加え、この溶液をピペットで数回上下穏やかに、しかし完全に混合します。異なる試料中のDNA濃度の変動を考慮するために、それは最初に希釈されていないテンプレートまたはテンプレートの異なる希釈のいずれかを使用して反応を最適化することが推奨される( 例えば、1:10〜1:100)。病気などの標的遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントにアニーリングべき使用二つのプライマー図1B-2にustratedと(例については、代表的な結果のセクションを参照)、最終的なPCR産物は、相同組換えのステップを駆動するURA3 ORFに隣接する領域に両側相同で少なくとも40塩基対を有するように設計されます。高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、PCR産物の合成中に望ましくない変異の割合を低減するために推奨されます。
    2. 次の設定でサーモサイクラーにチューブを入れる:94℃で30秒;次の設定の30サイクル:98℃で10秒、50℃15秒、72℃1.5分。そして72℃で10分。
      注:PCRパラメータの最適化は、特定のプライマーセットと標的ヒストン遺伝子のために必要とされてもよいです。

プラスミド上のマーカー4.フルサイズのPCR製品とバックボーンプラスミドの同時形質転換、および選択

  1. PCR産物の濃度
    1. プールの単一のマイクロ遠心チューブにステップ3.2.2から九PCR反応(600μlの合計)とボルテックスで混和します。
    2. マイクロ遠心チューブ内の3200μlのアリコートにサンプルを分割します。 3Mの酢酸ナトリウム(pH5.2)20μlの100%エタノール550μLを添加することによって、各チューブにDNAを沈殿させます。溶液を十分に混合し、少なくとも15分間氷上に置きます。 10分間〜14,000×gで遠心分離することによってDNAを回収し、70%エタノール、および空気乾燥200μlでペレットをすすぎます。
    3. dH 2 O25μlの中に各DNAペレットを再懸濁し、(75μlの合計)は、単一のチューブにプールします。
  2. 酵母共形質転換
    1. 酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)11媒液中のセクション1で生成された株の一晩培養物の10ミリリットルを準備します。
    2. 翌朝、飽和一晩培養物の8ミリリットルでYPD液体培地の400ミリリットルを接種し、振盪することによりインキュベート4のため30℃で - 5時間後、細胞が対数増殖期に入ることを可能にします。
    3. 、10分間〜3,220×gでの遠心分離によって細胞を収集し、液体培地を捨て、そして10mMのトリス-HCl(pH8.0)の1体積で細胞を再懸濁し、1mMのEDTA、0.1 M酢酸リチウム溶液(TE / LiAc形質) 。
    4. 10分間〜3220×gの遠心分離により細胞を収集し、TE / LiAc形質を捨てます。
    5. 1ミリリットルTE / LiAc形質で細胞を再懸濁します。
    6. ステップ4.2.5からの細胞の800μlを、ゆで10 mg / mlでサケ精子DNA、バックボーンプラスミドDNAの12.5μgの合計、そして濃縮PCR産物75μlの40μlの:マイクロ遠心チューブに以下の反応カクテルを設定しますステップ4.1.3から。
      注:サケ精子DNAを5分間煮沸し、反応に使用する前に少なくとも5分間氷上に置くべきです。追加された骨格プラスミドDNAの総容量は最小(〜80μlあるいはそれ以下)に維持されるべきです。バックボーンプラズマの例については、代表的な結果のセクションを参照してくださいID。
    7. 徹底的に一定分量に均等に8マイクロ遠心チューブ( - 8チューブ1)にカクテルチューブを混ぜます。
    8. 以下の二つの制御変換反応チューブを設定します。
      1. チューブ9(なしPCR産物コントロール):ステップ4.2.5からの細胞100μl、ゆで10 mg / mlでサケ精子DNA(5分間煮沸し、ステップ4.2.6を参照してください。注)を5μl、1.56μgの合計バックボーンプラスミドDNA及びPCR産物を添加しました。
      2. チューブ10(無DNAコントロール):ステップ4.2.5からの細胞100μl、ゆでの10mg / mLのサケ精子DNAの5μLは(ステップ4.2.6を参照してください。注)、何の骨格プラスミドDNAを添加していない、と何のPCR産物を添加していません。
      3. 上下に数回ピペッティングすることにより穏やかに、しかし完全に両方の管を混ぜます。
    9. 30分間30℃にて10チューブをインキュベートします。
    10. 各チューブに、TE / LiAc形質40%ポリエチレングリコール1.2mlの(PEG 3350)を追加します。溶液が均一になるまで、P-1000ピペットを用いて完全に混合。
    11. 30時10チューブをインキュベート30分間°C。静かに上下にピペッティングにより溶液を混合した後、15分間42℃でチューブをインキュベートします。
    12. 30秒間〜14,000×gで微量にチューブを回転させることによって細胞を収集します。液体を捨て、無菌のdH 2 O 1mlに細胞を再懸濁
    13. 30秒間〜14,000×gで微量にチューブを回転させることによって細胞を収集します。液体を捨て、無菌のdH 2 O500μlの細胞を再懸濁
    14. プール管1から8まで一緒に(合計4ミリリットルの容量)とピペッティングにより完全に混和します。
    15. プレート骨格プラスミドの選択のための20の完全な最小限のドロップアウト培地プレート11(プレート1月20日)のそれぞれに上記混合物200μlの。
    16. 独自の選択プレート(それぞれのプレート21および22、)上のチューブ10からの混合物のチューブ9と200μlのそれぞれからの混合物のプレートを200μl。
    17. 5日 - 3のため30℃で22プレートをインキュベートプラスミド形質転換体を選択。
    18. インキュベーションの5日 - 3後に形質転換プレートを点検します。約5000個のコロニーをプレート1-21(例えば代表的な結果を参照)上に表示されなければならないとはコロニーは、プレート22上に存在してはなりません。

5-FOA耐性形質転換体5.画面

  1. プレートから細胞を移す1から20(および変換制御などのプレート21)5-フルオロオロ酸(5-FOA)プレート11にすることにより、レプリカメッキの統合の結果として、URA3遺伝子の損失をスクリーニングするために、12を所望の位置にPCR産物。
    1. プレートの蓋を外し、滅菌ベルベットのコロニーを含むプレートを押してください。ベルベットのプレートを押して、5-FOAプレートにベルベットから細胞を転送します。 2日間30℃で培養します。
  2. 2日間のインキュベーション後、慎重グラムのための5-FOAプレートを検査owth。
    注:候補統合イベントは小さな非対称で表される「押しつぶさ"コロニー5-FOAプレート上- 5-FOAプレート上で成長し、逆に、小さな乳頭は上のコロニーの成長中に発生した自発的なURA3変異の可能性が高い代表的なものです形質転換プレート、および(この点について、さらに精緻化のための代表的な結果セクション図3を参照し、いくつかの例のための)所望の組み込み事象を表現する可能性は低いです。

6. 5-FOA耐性コロニーの精製および骨格プラスミドの損失

  1. 滅菌つまようじを使用して、YPDプレート上に単一コロニーのためのステップ5.2とストリークに記載さ5-FOAプレートから候補コロニーを選択します。 30℃で3日間 - 2インキュベートします。
  2. インキュベーション後、レプリカ-新鮮なYPDプレートにプレート各YPD浄化プレート、ドロップアウトプレートウラシルを欠く損失をチェックしますURA3遺伝子 、及び第二のドロップアウトプレートの骨格プラスミドの有無を監視します。 30℃で2日間1 - インキュベートします。
  3. インキュベーション後、YPDプレート上で成長している各候補サンプルからコロニーを同定するがいずれかのドロップアウトプレート上で成長していない(そのようなコロニーは、組換え事象を介してURA3遺伝子を失っていると期待し、有糸分裂の間に骨格プラスミドを失われます細胞分裂)。新鮮なYPDプレート上のようなコロニーを画線。これらのコロニーは、統合候補であると、ステップ7でさらに分析されます。

変異対立遺伝子を適切に統合するためのアッセイ7.分子解析

  1. 標準的な手順10を使用して候補サンプルからゲノムDNAを分離します。
  2. 標的部位を含むゲノム領域を増幅します。
    1. 0.5μlの鋳型DNA、5μlの各サンプルについて、以下のPCR反応を設定します10μMのフォワードプライマー、5μlの10μMリバースプライマー、0.5μlの(2.5単位)のTaq DNAポリメラーゼ、5μlの10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、5μlののdNTP混合物(各2mM)、および29μlののdH 2 O
      注:テンプレートDNAは、候補サンプル由来のゲノムDNAです。元ヒストンgeneΔ由来のゲノムDNA :: URA3のテンプレートとして歪みやテンプレートとして野生型ヒストン株から別の用いてゲノムDNAを用いて、1:それは、2つのコントロール反応を含めることが推奨されます。 DNA濃度と異なるゲノム製剤中の不純物のレベルの変動を説明するために、それが希釈されていないDNAまたはゲノムの製剤の異なる希釈のいずれかを使用して反応を最適化することが推奨される( 例えば、1時10分および1:100)。確認することが重要であると推定される統合されたPCR産物に包含される領域の外側のDNA配列にこれらのプライマーのアニーリング-このように、これらのRでのPCR産物のサイズeactionsは、(例えば、 代表的な結果を参照)が正しいゲノム位置での製品の統合のための診断ツールとして使用することができます。
    2. 次の設定でサーモサイクラーで反応を置き:94℃3分;次の設定の30サイクル:94℃45秒、50℃45秒、72℃2分。 72℃で10分間。
      注:PCRパラメータの最適化は、特定のプライマーセットと標的ヒストン遺伝子のために必要とされてもよいです。
  3. PCR産物の処理
    1. 0.8%TBEアガロースゲル上の各反応から20μlのを実行します。
    2. URA3遺伝子がうまく推定変異したヒストン遺伝子により置換されているかどうかを判断するための基準としてDNA標準を使用して、PCR産物の大きさを評価する(例えば、代表的な結果を参照のこと)。
      注:特定の場合には、所望の突然変異(s)は、ヒストン遺伝子に導入されたいずれかの作成や座る制限を破壊します電子。この場合、正確な統合を示す大きさのPCR産物中の所望の変異の存在は、ゲル電気泳動分析に続いて、対応する制限酵素で消化した製品を供することによって評価することができる(例えば、代表的な結果を参照のこと) 。
    3. 所望の突然変異(単数または複数)の存在を確認し、追加の突然変異がゲノムに導入されていないことを確認するためにDNA配列決定に適切な統合を示す大きさの対象PCR産物。

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Representative Results

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私たちは、 その場での突然変異誘発戦略において標的の代表例として、グルタミン酸(H3-R53E変異体)にアルギニンから53位での置換を保有するヒストンH3変異体タンパク質を発現するhht2対立遺伝子の発生を記載しています。

私たちは、HHT2のORF全体がURA3遺伝子(プロトコールのステップ1を参照)に置換された菌株を生成しました。この株は、yAAD156は、また、細胞がヒスチジンに対して栄養要求性であることが原因とhis3Δ200対立遺伝子を、保有します。プロトコルのステップ2に示された手順に従い、我々はその後HHT2の2つの部分的に重複するフラグメントを生成しましたフォワードプライマー(OAD20):5 'GCGTTCATTATCGCCCAATGTG 3'及びリバースプライマー(R53Erev):5 'GTTCAGTAGATTTTTGGAATtcTCTAATTTCTCTCAAG 3'以下のプライマーを最初の断片のために使用しました。以下の広報フォワードプライマー(R53Efor):5 'CTTGAGAGAAATTAGAgaATTCCAAAAATCTACTGAAC 3'およびリバースプライマー(OAD21):5 'GCGCTTGATCAGCAGTTCATCG 3' imersは、第2のフラグメントのために使用しました。第二の反応で最初の反応でリバースプライマーとフォワードプライマーことに注意してください(小文字)は、所望の突然変異したヌクレオチドを含む - これは効率的なアニーリングを可能にするように、これらの変異したヌクレオチドが、野生型配列の2長いストレッチの間に囲まれています変異した位置でのミスマッチにもかかわらず、鋳型DNAへのプライマーの。また、これらの二つのプライマーで変異ヌクレオチドは互いに相補逆であり、最終的にコードされたタンパク質でR53E変異を生成するコドン変化を、GAAするAGAになるセンス鎖、中にAG GAへの突然変異を引き起こすことに注意してください。これらのPCR反応からの結果を図2Aに示されています。

ステップ3の手順を使用して、我々はその後、GENERフルサイズのPCR産物をated。使用したプライマーは、フォワードプライマー(OAD479):5'TATGGCTCGGTGTCAAAACA 3 '及びリバースプライマー(OAD480):5' CATGGTTTCTTGCCGGTTAT 3」。これらのプライマーを設計するとき、どちらかが、相同組換え反応を(相同性の領域より長く、より効率的かつ具体的な相同組換え事象がする駆動に終了に得られた融合PCR産物は、少なくとも40塩基対が含まれていることを確認することが重要です)です。我々の実験では、フルサイズのPCR産物は、それぞれ、HHT2 ORFの上流および下流の領域に195塩基対の領域と220塩基対の領域の相同を含有しました。これらのPCR産物の試料をアガロースゲル電気泳動( 図2B)により分析しました。

フルサイズのPCR産物は、その後HIS3-がプラスミドをマークしたプラスミドpRS413(セントロメアと一緒に同時形質転換しました。プロトコルのステップ4で説明したようにF "> 13)と形質転換体は、ヒスチジン(SC-彼のプレート)を欠いたプレート上で選択した。彼の+コロニーは、プロトコルのステップ5で説明した手順を以下の5-FOA抵抗性についてスクリーニングしました。 図3は、SC-彼のプレートからレプリカプレーティングを次の変換プレート(SC-HIS)及び5-FOAプレートの一例を示す図である。候補サンプルの例と同様に、所望の組み込み事象を表現しにくいサンプルはまた、図3に示されていますプロトコールのステップ6で説明したように。私たちの実験では、我々はスクリーニング〜90,000の形質転換体のうち12候補サンプルを同定した。これらの候補はその後、精製しました。

12候補は、それらが、変異体PCR産物とURA3遺伝子の本物の置換を反映するかどうかを評価するためのプロトコルのステップ7に記載のPCR分析に供しました。私たちのexperimenのためtは、我々は、PCR産物の組込み部位から下流の302塩基対をアニールするPCR産物の組込み部位とリバースプライマーから89塩基対上流にアニールする順方向プライマーを使用しました。軌跡は、URA3マーカー遺伝子によって占められている場合HHT2軌跡HHT2(または塩基対の置換を保有HHT2の変異バージョン)、またはサイズの2188塩基対のPCR産物により占有されている場合、これらのプライマーは、サイズが1217塩基対のPCR産物を生成します。フォワードプライマーの配列は、(OAD476)を使用している:5 'GAAACTATTGGCACGCCCTA及びリバースプライマーのそれは(OAD477)を使用している:5' CCTGCGAATCAACCGATACT 3」。我々が同定した12の候補のうち、4つ(例えば、 図4Aを参照)が正しい位置にPCR産物の統合を示しました。 GAへの変異AGは新たなEcoRI制限部位を生成するので最後に、我々はに成功した統合サンプルの1からPCR産物を受けます図4B参照)ゲノムに組み込まれていたことを実証することができました。しかし、我々は、過去の研究14HHT2変異の大規模な数を生成するために、これに非常に類似した手順を使用している:この特定のケースでは、追加の不要な変異がゲノムに組み込まれていないことを確認するために、PCR産物の配列を決定しませんでしたそして、統合された突然変異対立遺伝子の大半が希望するもの以外の変異を運ばないことがわかりました。

図2
2:PCR 産物保有の世代は、酵母ゲノムへの組み込みのための突然変異を希望します。 (A)PCR反応は、所望の変異を保有HHT2の部分的に重複するフラグメントを生成します。トップ:トンの漫画表現2 HHT2断片を(図1B-1を参照)を得た彼2つのPCR反応。赤い丸は、遺伝子のセンス鎖におけるAG GAに変異を導入するために使用されるプライマーのミスマッチヌクレオチドを表します。底:PCR産物AおよびB(それぞれレーン2および3)のゲル電気泳動分析。 DNA標準は、レーン1の酵母ゲノムへの組込みのためのフルサイズのPCR産物を生成するために(B)の融合PCR反応(図1B-2および3を参照)に示されています。上部:PCR反応の漫画表現と予想されるPCR生成物(生成物C)。 (A)に記載のように赤い円は、上記所望の突然変異を表します。底:PCR産物のC(レーン2)のゲル電気泳動分析。 DNA標準はレーン1に示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


図3: 同時形質転換実験及び5-FOA画面から代表的な結果。 左:代表的なSC-彼のプレートは、30℃で3日間のインキュベーション後に同時形質転換手順にかけ細胞を播種しました。約5,000個のコロニーを計数しました。ミドル:30℃で2日間のインキュベーション後のSC-彼の同時形質転換プレートからレプリカメッキ以下の代表的な5-FOAプレート。サンプル1および2は、それらの非対称形態に成功した組込み事象を経験してきたの候補と考えられました。 hht2対立遺伝子を有するURA3遺伝子の真の置換が結果として、形質転換された細胞は、SC-彼のプレート上にプレーティングされる前に発生する可能性が高い(または非常にすぐ後)であり、これは、その場所で生じることになる植民地であります排他的ではない場合は、主に5-FOA-RESISTANが含まれていますT細胞 - そのようなコロニーを、続いて5-FOAプレートにレプリカ培養されたそれは、プレート上の細胞の非対称に見えるパッチを生じさせる、押しつぶされます。逆に、自発的な コロニー形成中に発生する可能性がURA3遺伝子の変異は、コロニーの小さな領域内に閉じ込められる可能性が高く、かつ5-FOAプレートにレプリカがめっき時乳頭を生じるために、より可能性が高いです。右:30°Cで3日間のインキュベーション後のSC-彼の同時形質転換プレートからレプリカメッキ以下の異なる代表的な5-FOAプレート。追加候補(サンプル3)と同様に二つの小さな乳頭がこの板の上に表示されます(サンプル4および5) -インキュベーションの3日以上後に最もはっきりと見えるような乳頭は、自発的なURA3変異を表す可能性が高いとされません希望の統合イベント。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。

図4
図4: 候補統合サンプルの分子解析。成功した組込み事象を識別するための(A)PCRアッセイ。トップ:ゲノムにhht2変異対立遺伝子の統合を成功さを評価するために使用されるPCR反応の漫画表現。底:HHT2野生型株由来のゲノムDNA(対照として使用し、レーン2)、株yAAD156が(レーン3コントロールとして使用)hht2Δ:: URA3置換を保有を用いたPCR反応のゲル電気泳動分析、候補積分サンプル(レーン4)、および5-FOA耐性乳頭サンプル(および正しい組込み事象を表現することが難く、レーン5)。 DNA標準は、候補統合サンプルのPCR産物のサイズはconsisteあることレーン1注記に示されていますNT統合成功のイベントと、乳頭サンプルのPCR産物のサイズはそのままhht2Δ:: URA3遺伝子座と一致しているのに対し。 (B) のEco RI消化変異対立遺伝子の存在を確認します。トップ:野生型HHT2遺伝子または変異hht2対立遺伝子のいずれかを含むPCR産物のエコ RI消化反応から誘導されると予想消化断片の漫画表現。下:野生型HHT2株由来のPCR産物の消化反応物のゲル電気泳動分析(レーン2、パネルAのレーン2で用いたものと同じ試料に由来し、ここで使用されるPCR産物)と候補積分サンプル(レーン3;ここで使用されるPCR産物は、パネルAのレーン4で使用したのと同じ試料から得られました)。 DNA標準は、消化パターンがAG GAへの変異が正常候補のゲノムに導入されたことを確認することがレーン1注記に示されています積分サンプル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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一倍体S.セレビシエ細胞における4つのコアヒストンタンパク質のそれぞれのコードは、具体的突然変異誘発のための2つの遺伝子のいずれかをターゲットにする研究者のための挑戦を表すことができる2つの非対立遺伝子間の配列相同性の高レベル。以前は頻繁に依存し、Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム(SSG)突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子交換方法5、6、7、ならびにより最近の酵母CRISPRベースの技術15を含む、酵母の突然変異誘発法を説明少なくとも部分的には、最終的に最終的な変異対立遺伝子を生成するために、所望のゲノム部位への組換えまたは修理機械を募集する標的遺伝子のORF内の配列に。一方、ここで提示した戦略はhomologoを駆動するための標的ORFに隣接するDNA配列を利用します私たちの組換え事象変異の統合に必要な、そして、その結果として、高度に相同性のORFを持つ二つの遺伝子にもかかわらず、他の上の遺伝子のより特異的なターゲティングを可能にします。この機能は、我々の戦略は、特にヒストン変異誘発のために十分に最適です。しかし、この戦略はまた、酵母ゲノムにおける他の遺伝子の変異誘発のために適合させることができます。

当社の戦略のその他の機能は、変異遺伝子の相同組換えを駆動領域の長さは、このように標的ゲノム位置での組み込みの効率を増大させる、非常に広範であるように設計され、所望の変異に加えて(複数可こと可能であることの事実を含んで)追加のDNA配列がゲノムに導入されていません。このシステムのさらなる利点は、URA3を有する特定のヒストン遺伝子の置換を保有する株が構築されたら、それはその特定のHISTの任意の変異体バージョンの生成に使用することができることです一つの遺伝子。したがって、例えば、要求に応じて研究コミュニティに利用可能である株yAAD156は、 デノボhht2Δ:: URA3対立遺伝子を構築する必要なしに、任意の所望のhht2変異を作製するために使用することができます。最後に、適切に設計されたPCRプライマーを用いて、この戦略はまた、それらが比較的互いに近くにあるように(例えば、我々はhht2アレルエンコードANを生成し、内部欠失を有する又は複数のコドンで突然変異を有する、ヒストン対立遺伝子を生成するために使用することができますH3-K56R、この戦略を使用してL61W二重変異体タンパク質)。

具体的には、突然変異誘発のための2つの高度に相同なヒストン遺伝子の1を標的とする能力は、異なる実験設定の数に有用であり得ます。 HHT1-HHF1遺伝子HHT2-HHF2遺伝子 16と比較して異なるレベルで発現されているので、例えば、特定のH3またはH4変異ジを与えるかどうかを決定することは興味深いかもしれませんそれはから発現された遺伝子に応じてfferent表現型。別の例では、研究者は、両方の対応するヒストン遺伝子の特定のヒストン変異体を発現する一倍体細胞を生成することを希望するシナリオである - これは、最初の2つの異なる系統で独立して各遺伝子の変異誘発、その後クロスを通して二重変異体の一倍体細胞を得ることによって達成することができますそして所望の減数分裂の製品のその後の単離。さらに別の例は、ヒストンH2AとH2Bの突然変異誘発に関する:各タンパク質のわずかに異なる2つのアイソフォームが、対応する非対立遺伝子セットによってコードされているという事実を考えると、研究者は、特定のH2AまたはH2B変異での効果を評価することができますいずれかのアイソフォームのコンテキスト。 (それぞれ、H2AおよびH2Bをコードする)HTA1HTB1遺伝子座を変異誘発するための実験を設計する場合、研究者は、私が(hta1-htb1)を有する株Δのみ生存可能であることを示す最近の知見に注意する必要がありますこれは、結果の解釈を複雑にし得るようF彼らは、小さな円形の第17染色体の生成を介して(だけでなく、近くのHHT1-HHF1座 )HTA2-HTB2遺伝子座を増幅しています。

我々は最近、通常、アミノ酸ロイシン14によって占められている位置61で全ての可能なアミノ酸置換を発現するヒストンH3タンパク質を生成するために、このヒストン変異誘発戦略のバージョンを使用しています。これらの実験のために、代わりに突然変異誘発のための出発株としてyAAD156を使用して、我々はURA3およびTRP1栄養マーカー(だけでなくURA3の)両方とHHT2 ORFの交換を保有株yADP106を使用しました。両方のマーカー遺伝子の存在は、candidatとして、5-FOA画面と精製工程(プロトコル5および6ステップ)以下の変異体PCR産物の統合候補の識別を容易にTrp +表現-自発的URA3変異は裏を有する細胞が得られたのに対し、 -およびTrp - esが表現型浦になりました。 yADP106はユニットとして増幅し、本明細書に記載された戦略を使用して他のヒストン遺伝子の突然変異誘発のために使用することができたURA3-TRP1カセットの系列であるとして、要求に応じても利用可能です。

この戦略を使用して所望のヒストン変異体を得ることができないことは、積分ステップまたは同時変換ステップを次形質転換体の数が不足するために使用されるフルサイズのPCR産物の量が不十分などの理由が考え、数に起因する可能性があります。後者の問題は、同時形質転換実験において骨格プラスミドのより高い量を使用することによって解決することができたのに対し、前者の問題は、一緒にPCR反応の大きいセットをプールすることにより、または生成物のより高い収量を生産する異なるプライマーセットを設計することによって対処することができます。 Althoうーん、先に示したような1つ、2つまたはそれ以上のアミノ酸置換を保有ヒストン変異体を生成するために、この手順を使用することができ、それぞれのコドンは、同じプライマー分子内に位置する必要があるため、標的アミノ酸は、互いに比較的近くでなければなりません。したがって、この方法は、容易にタンパク質の長さにわたって互いに離れて位置する複数の変異を有するヒストンを生成するために適合させることができません。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 kb DNA Ladder (DNA standards) New England BioLabs N3232L
Agarose  Sigma A5093-100G
Boric Acid Sigma B0394-500G
dNTP mix (10 mM each) ThermoFisher Scientific R0192
EDTA solution (0.5 M, pH 8.0) AmericanBio AB00502-01000
Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific 16-100-824
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E4884-500G
Lithium acetate dihydrate Sigma L6883-250G
MyCycler Thermal Cycler BioRad 170-9703
Poly(ethylene glycol) (PEG) Sigma P3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase)  and 5x buffer Fisher Scientific 50-443-960
Salmon sperm DNA solution ThermoFisher Scientific 15632-011
Sigma 7-9 (Tris base, powder form) Sigma T1378-1KG
Sodium acetate trihydrate Sigma 236500-500G
Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) AmericanBio AB00985-00100
Taq Polymerase and 10x Buffer New England BioLabs M0273X
Toothpicks Fisher Scientific S67859
Tris-HCl (1 M, pH 8.0) AmericanBio AB14043-01000
a-D(+)-Glucose Fisher Scientific AC170080025 for yeast media
Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 for yeast media
Peptone Fisher Scientific DF0118-07-2 for YPD medium
Yeast Extract Fisher Scientific DF0127-17-9 for YPD medium
4-aminobenzoic acid Sigma A9878-100G for complete minimal dropout medium 
Adenine Sigma A8626-100G for complete minimal dropout medium 
Glycine hydrochloride Sigma G2879-100G for complete minimal dropout medium 
L-Alanine Sigma A7627-100G for complete minimal dropout medium 
L-Arginine monohydrochloride Sigma A5131-100G for complete minimal dropout medium 
L-Asparagine monohydrate Sigma A8381-100G for complete minimal dropout medium 
L-Aspartic acid sodium salt monohydrate Sigma A6683-100G for complete minimal dropout medium 
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma C7880-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamic acid hydrochloride Sigma G2128-100G for complete minimal dropout medium 
L-Glutamine Sigma G3126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Histidine monohydrochloride monohydrate Sigma H8125-100G for complete minimal dropout medium 
L-Isoleucine Sigma I2752-100G for complete minimal dropout medium 
L-Leucine Sigma L8000-100G for complete minimal dropout medium 
L-Lysine monohydrochloride Sigma L5626-100G for complete minimal dropout medium 
L-Methionine Sigma M9625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Phenylalanine Sigma P2126-100G for complete minimal dropout medium 
L-Proline Sigma P0380-100G for complete minimal dropout medium 
L-Serine Sigma S4500-100G for complete minimal dropout medium 
L-Threonine Sigma T8625-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tryptophan Sigma T0254-100G for complete minimal dropout medium 
L-Tyrosine Sigma T3754-100G for complete minimal dropout medium 
L-Valine Sigma V0500-100G for complete minimal dropout medium 
myo-Inositol Sigma I5125-100G for complete minimal dropout medium 
Uracil Sigma U0750-100G for complete minimal dropout medium 
Ammonium Sulfate Fisher Scientific A702-500 for complete minimal dropout medium 
Yeast Nitrogen Base Fisher Scientific DF0919-07-3 for complete minimal dropout medium 
5-Fluoroorotic acid (5-FOA) AmericanBio AB04067-00005 for  5-FOA medium

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References

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ターゲットを絞りました<em&gt;その場で</em出芽酵母におけるヒストン遺伝子の&gt;突然変異誘発
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Duina, A. A., Turkal, C. E. Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (119), e55263, doi:10.3791/55263 (2017).More

Duina, A. A., Turkal, C. E. Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (119), e55263, doi:10.3791/55263 (2017).

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