Summary
Denne artikel giver detaljeret metode til at identificere og kvantificere funktionelle T lymfocyt delmængder stede i murine nyre, aorta og lymfeknuder ved intracellulær farvning og flowcytometri. Modellen af angiotensin II-induceret hypertension blev valgt til at forklare, trin-for-trin, de procedurer og grundlæggende principper for flowcytometri og intracellulær farvning.
Introduction
De seneste oplysninger viser, at den adaptive immunsystem, især T-lymfocytter, spiller en afgørende rolle i udviklingen af flere hjerte-kar-sygdomme 1,2,3,4,5. For eksempel i modellen af angiotensin II-induceret hypertension, en akkumulering af T-celler i karrene og nyrer fra mus er blevet beskrevet 6. Det vaskulære akkumulation er overvejende adventitia og perivaskulær fedt. I nyrerne T-celler akkumulerer i både medulla og renal cortex. Afhængigt af hvilken delmængde er involveret, disse T-celler giver anledning til forskellige cytokiner, der kan påvirke vaskulære og nyrefunktion og føre til udvikling af patologi (gennemgået af McMaster et al. 6).
CD4 + T-hjælper-lymfocytter kan opdeles i flere delmængder: T hjælper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, T regulerende (Treg) celler og T follikulær hjælper (TFH) celler baseret på deres funktioner og underskrift cytoKines 7. På samme måde kan CD8 + cytotoksiske T-celler klassificeres som Tc1, TC2, Tc17 eller TC9 8. Der er også dobbelt negative T-celler (dvs. celler, som ikke udtrykker CD4 eller CD8 T-cellemarkører). En undergruppe af disse celler besidder en alternativ gamma delta T-cellereceptor (i stedet for de klassiske alfa- og beta-receptorer) og er derfor benævnt gamma delta T-celler. Den multi-parameter analyse ved flowcytometri af overfladen markering, cytokin og transskriptionsfaktor udgør den bedste fremgangsmåde til at identificere disse celler. Selv om denne metode i udstrakt grad anvendes inden for immunologi, er det mindre godt beskrevet i faste organer og i fastsættelsen af cardiovaskulære sygdomme.
Historisk set blev identifikationen af lymfocytter i væv begrænset til immunhistokemi eller RT-PCR fremgangsmåder. Selvom immunhistokemi og immunofluorescens er stærke metoder til at bestemme vævsfordelingen af et antigen af intpåløbne, de er utilstrækkelige til fænotypisk identificere undergrupper involverede. Derudover, medens RT-PCR-analyse er nyttig til at detektere mRNA-ekspression af antigener, cytokiner eller transkriptionsfaktorer, den tillader ikke påvisningen af multiple proteiner samtidigt ved de enkelte celler.
Fremkomsten af flowcytometri, især ved kombination med intracellulær farvning til påvisning af cytokiner og transkriptionsfaktorer, giver undersøgere med en kraftfuld teknik, der tillader identifikation og kvantificering på enkelt celle niveau af immuncelleundergrupper i faste organer. Vi har optimeret en intracellulær farvning assay til at identificere ved flowcytometri de store T-celle-undergrupper til stede i murin nyre, aorta og aorta drænende lymfeknuder i en model for angiotensin II-induceret hypertension. Optimeringen af hvert trin: vævsfordøjelse, ex vivo-aktivering, permeabilisering, og overfladen og intracellulære farvningsresultater i et stærkt reproducerbart assay, der kan anvendes på andre kardiovaskulære og renale sygdomsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University Institutional Animal Care og brug Udvalg har godkendt procedurerne beskrevet heri. Mus er opstaldet og plejes i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (National Academies Press. Revideret 2010).
1. Isolering af aorta drænende lymfeknuder, nyre og Aorta fra mus
- Aflive musene ved CO2 inhalation. Spray brystet med 70% ethanol og omhyggeligt åbne huden og brystvæggen med en saks for at blotlægge hjertet.
- At perfundere vaskulaturen, udføre et lille snit i højre atrium og støt injicere mindst 10 ml kold PBS (ca. 1 ml / sek) i spidsen af den venstre ventrikel ved anvendelse af en 21 eller 23 G nål. Perfundere indtil alle organer er blancheret. Hjertet blanches først. Blanchering af leveren indikerer, at perfusionen er blevet godt udført.
- Brug små pincet og fine sakse, forsigtigt skåret væk og træk tarmene,mave, milt, pancreas og lever bedre at visualisere aorta.
BEMÆRK: Dette trin skal gøres meget nøjagtigt som skader på mave-tarmkanalen kan inducere kontaminering. - Klip og fjerne hvert lunge med en saks. Skyl brysthulen med phosphatbufret saltvand (PBS) under anvendelse af en injektionssprøjte uden nål. Fjern overskydende blod og væske under anvendelse af steril gaze.
- Fjern de abdominale aorta drænende lymfeknuder hjælp fine Dissecting pincet. Sørg for ikke at briste kapslen. Fjern de resterende fedt på overfladen af hver lymfeknude med dissekere pincet. Klip de to nyrer med fine saks.
- Dissekere hele aorta (thorax og abdominale aorta) med fine, buede saks. Start på niveau med hjertet og omhyggeligt dissekere væk fra spiserøret og hvirvlerne ned til niveauet for bækkenforgreningen og Sørg for at holde den omgivende perivaskulær fedt knyttet til aorta.
BEMÆRK: Yderligere dissektion af aorta til Remove omgivende strukturer kan gøres under et mikroskop. Konkret fjerne arterielle grene (halspulsårer, subclavia arterier, cøliaki, mesenteriske og renale arterier) og lymfeknuder. Må holde en konsistent lag af perivaskulær fedt omkring hver aorta, da dette er et sted, hvor mange inflammatoriske celler bor i fastsættelsen af hypertension. Placer hvert væv i separate rør indeholdende kold PBS.
2. generation af enkeltcellesuspensioner fra Hver Tissue
- nyrerne
BEMÆRK: nyre kan adskilles i en enkelt celle suspension ved at kombinere mekanisk dissociation plus enzymatisk fordøjelse.- Forbered nyrerne fordøjelse ved tilsætning collagenase D (2 mg / ml) og DNase I (100 ug / ml) til RPMI 1640-medium (suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS)). Forbered 10 ml pr nyre prøve.
- Brug pincet til at overføre de to nyrer i en dissociation rør indeholdende 10 ml nyre fordøjeion-opløsning.
- Udfør den mekaniske dissociering under anvendelse af en halvautomatisk dissociator indretning ifølge producentens instruktioner.
- Efter mekanisk dissociation, afmontere røret fra enheden og udføre den enzymatiske fordøjelse. Inkubér prøverne i 20 min ved 37 ºC under kontinuerlig rotation. Straks stoppe enzymatisk fordøjelse ved tilsætning kold RPMI 1640-medium suppleret med 5% FBS.
- Overfør opløsningen ved pipettering i en 50 ml konisk rør efter filtrering gennem en 40 um si. Drille resterende væv fra hinanden ved at trykke med stemplet i en 1 ml sprøjte. Pelletere cellerne (500 xg 8 min, 4 ºC).
- Pellet resuspenderes i 3 ml 36% densitetsgradientcentrifugering medier. Suspensionen overføres et 15 ml konisk rør. Forsigtigt tilsættes 3 ml 72% densitetsgradientcentrifugering medier under cellesuspensionen 3 ml 36% uden afbrydelse. Centrifuge (1.000 xg uden bremse, 20 min, 4 ° C). </ Li>
- Immuncellerne vil blive placeret ved grænsefladen. Fjern det øverste gullige lag, som indeholder cellerester og derefter bringe lydstyrken op til 15 ml ved hjælp af kold PBS. Ryst godt til opdeling gradienten. Spin cellerne (300 xg 8 min, 4 ° C), og pellet resuspenderes i 3 ml RPMI med 5% FBS. Tæl antallet af levende celler på et hæmocytometer hjælp trypanblå eksklusion.
- aorta
- Forbered aorta fordøjelse ved tilsætning collagenase A (1 mg / ml), collagenase B (1 mg / ml), og DNase I (100 ug / ml) til RPMI 1640-medium (suppleret med 5% FBS).
- Brug af fine tænger, overføre aorta i en 2 ml rør indeholdende 1 ml aorta fordøjelse opløsning. Hakkekød hele aorta i meget små stykker med fine sakse i 1 ml fordøjelse opløsning. Hold på is. Inkuber prøverne i 30 minutter ved 37 ° C under kontinuerlig rotation.
- Overfør opløsningen til en vævskulturskål og stoppe enzymatic fordøjelse ved tilsætning 5 gange volumenet af kold RPMI med 5% FBS.
- Overfør opløsningen ved pipettering i en 50 ml konisk rør efter filtrering gennem en 40 um si. Drille resterende væv fra hinanden i en enkelt cellesuspension ved at trykke med stemplet i en 1 ml sprøjte. Skyl si og pelletere cellerne (300 xg 8 min, 4 ºC).
- Vask pelleten ved tilsætning af 10 ml RPMI med 5% FBS. Spin cellerne (300 xg 8 min, 4 ° C), og pellet resuspenderes i 3 ml RPMI med 5% FBS. Tæl antallet af levende celler på et hæmocytometer hjælp trypanblå eksklusion.
- De aortiske drænende lymfeknuder
- Placer en 40 um si i en vævskulturskål (60 mm x 15 mm). Placer lymfeknuderne på sien og drille dem fra hinanden i en enkelt cellesuspension ved at trykke med stemplet i en 1 ml sprøjte. Skyl si med 2 ml RPMI med 5% FBS. Opsamle cellerne i skålen.
- Overførselcellerne i en 15 ml falcon rør og pelletere cellerne (300 xg 8 min, 4 ºC). Pellet resuspenderes i 500 pi RPMI med 5% FBS. Tæl antallet af levende celler på et hæmocytometer hjælp trypanblå eksklusion.
3. Ex Vivo Stimulation for Cytokine Påvisning ved flowcytometri
- Forbered cellekulturmediet: RPMI med 5% FBS, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 50 pM β-mercaptoethanol og 1% penicillin / streptomycin.
- Centrifuger hver celle suspension opnået fra nyre, aorta og lymfeknuder (300 xg, 8 min, 4 ºC). Resuspender hver pellet med celledyrkningsmediet i en koncentration på 1 x 10 6 celler pr.
- Stimulere celler ved tilsætning af 2 pi af celleaktivering cocktail (indeholdende phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), calcium ionophor ionomycin, og Golgi-inhibitoren Brefeldin A) for hver 1 ml cellekultur.
BEMÆRK: Den endelige koncentrations af hver komponent er: 81 nM PMA, 1,33 uM ionomycin og 5 ug / ml Brefeldin A. Behandling med PMA og ionomycin aktiverer celler til at producere cytokiner. Cytokiner udskilles proteiner, som skal blive fanget i cellerne, der skal detekteres. Brefeldin A forårsager ophobning af normalt secernerede proteiner i det endoplasmatiske reticulum og Golgi-apparatet. Således beskrives her teknik forøger findes spor af cytokin-producerende lymfocytter ved flowcytometri. - Plade 1 til 2 millioner celler i en 12-brønd (aorta eller nyre) eller 24 brønde (lymfekirtel) lav-adhærens plader. Pladen anbringes i en 37 ° C befugtet CO2 inkubator i 3 timer.
BEMÆRK: Antallet af udpladede celler kan være lavere i lymfeknuder fra kontrolmus. Også, tidspunktet for stimulering skal bestemmes empirisk for hver cellepopulation og cytokin undersøgt. I tilfælde af T-celler isoleret fra aorta, nyre eller lymfeknuder, anbefaler vi stimulerende i 3 til 4 timer. En længere stimulation wsyg ikke øge cytokinsekretion og vil inducere en yderligere nedregulering af flere T celleoverflademarkører såsom CD3, CD4 og CD8. (Bemærk, at selv en 3-4 timers stimulering vil inducere nogle nedregulering af disse markører.)
4. Overflade Farvning
- Overfør cellerne i en polystyren FACS rør og centrifugeres (300 xg, 8 min, 4 ° C). Vask cellerne to gange med FACS buffer (Ca 2+ og Mg + fri PBS indeholdende 4% FBS og 2 mM EDTA) og opdele cellesuspensionen ligeligt i forskellige FACS rør baseret på antallet af antistof-paneler ønskede og antallet af kontrolglassene nødvendige ( se nedenunder).
- For at udføre kompensation for hvert panel, forberede ufarvede kontrol rør og enkelte farvede rør til hver vævstype og antistof panel. Desuden forbereder fluorescens minus én (FMO) kontrol rør til hvert antistof panel ved at tilføje alle undtagen et af antistofferne.
- Juster lydstyrken på hvert rør til 2 ml med FACSPuffer. Centrifuger cellesuspensionen (300 xg, 8 min, 4 ° C), supernatanten fjernes og blokere Fc-receptorer ved at inkubere cellerne med 0,5 ug anti-CD16 / CD32-antistoffer per million celler i 10 min på is.
BEMÆRK: CD16 er lav affinitet IgG Fc-receptor III (FcR III) og CD32 er FcR II. CD16 / CD32 udtrykkes på granulocytter, mastceller, monocytter / makrofager, naturlige dræberceller, B-celler, dendritiske celler og nogle aktiverede modne T-celler. - Udfør levedygtighed farvning: Vask cellerne med 1x PBS, centrifugeres (300 xg, 8 min, 4 ° C) og resuspender i 1000 pi 1x PBS. Tilsæt 1 pi af en celle-impermeabel amin-reaktivt farvestof (levedygtighed plet). Der inkuberes i 15 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Under inkubationen, forberede cocktail af antistoffer (for overfladefarvning) i et passende volumen af FACS buffer. Vask cellerne to gange med 1-2 ml FACS buffer, centrifuge (300 xg, 8 min, 4 ° C) og resuspender hver pellet med 100 piaf antistoffet blandingen. Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys.
NB: For hver flowcytometri antistof, er det nyttigt at bestemme den optimale mængde antistof nødvendig ved udførelse af en dosis titreringskurven. - Vask cellerne to gange med 2 ml FACS buffer og pelletere cellerne (300 xg 8 min, 4 ° C).
5. Fastgørelse, Permeabilisering og intracellulære farvning
- Udfør den intracellulære farvning med en fiksering og permeabilisering kit indeholdende passende puffere ved at følge producentens instruktioner. Fix og permeabilisere cellerne ved resuspendering dem i passende buffer. Inkuber prøver i 40 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Der tilsættes 1 ml 1x permeabilisering og vaskebuffer direkte til de faste og permeabiliserede celler. Centrifuge (500 x g, 8 min, 4 ° C) og fjern supernatanten. Pellet resuspenderes med 2 ml 1X vaskebuffer.
- Forbered blandinger af Antibodies (kun til intracellulær farvning) i et passende volumen af 1X vaskebuffer (sædvanligvis 100 pi per tube).
BEMÆRK: Som beskrevet ovenfor, skal bestemmes for hvert antistof i panelet den optimale koncentration antistof. For eksempel, for antistoffer mod IL-17A eller IL-17F, bruger vi en fortyndingsfaktor på 1:30, men for antistoffer mod IFNy og T-bet, bruger vi en fortyndingsfaktor på 1: 100. - Centrifuger cellerne (500 xg 8 min, 4 ° C) og resuspender hver pellet med 100 pi af antistoffet blandingen. Inkuber i 40 minutter ved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Vask cellerne to gange med 2 ml 1X vaskebuffer og pelletere cellerne (500 xg 8 min, 4 ° C). Pelleten resuspenderes med 300 pi 1X vaskebuffer og analysere på et flowcytometer med passende filtre.
- Til kvantificering af det totale antal celler pr vævsprøve, bruge optælling perler. Forud for overtagelsen, tilføje det anbefalede volumen / antal tælle perler til hvert rør.
6. Kompensation, gating, normalisering, og tips
- Kompensation og gating
- Kør ufarvede og enkelt farvede rør til kompensation kontrol for at justere for spektral overlapning.
BEMÆRK: Brugen af erstatningsordninger perler frem cellebaserede kompensation kontrol er nødvendig i tilfælde, hvor antigenet af interesse eller celle population i en prøve er til stede på så lave niveauer, at kompensation ved hjælp af celler vil være vanskeligt. Også at bemærke, når du bruger tandem farvestoffer, er det tilrådeligt at forberede kompensation for hvert forsøg, da tandem farvestoffer varierer meget-til-parti og med hver dag. - Kør fluorescens minus én kontroller (FMO'er) for alle fluoroforer i panelet, når du starter en ny flerfarvet eksperiment.
BEMÆRK: FMO kontroller er prøver, der indeholder alle de antistoffer i panelet undtagen én. Disse kontroller tillader nøjagtig diskriminering af positive versus negative signaler for udeladt antistof til korrekt adjust portene. Disse kontroller er særlig vigtigt, når ekspressionsniveauerne er lav, eller når adskillelsen af målgruppen er fattige (for eksempel, når målet er et cytokin eller transkriptionsfaktor). Selv om det ikke altid er nødvendigt, i nogle tilfælde, isotypekontroller kan foretrækkes i stedet for FMO kontroller da de giver en ordentlig kompensation for antistofisotypen og fluorophor konjugat uden specificitet antigenet. - Opsæt den primære port: justere Forward Scatter Samarbejdsområde (FSC-A) og Side Scatter Samarbejdsområde (SSC-A) spænding for at opdage den leukocyt befolkning.
- Udelad de døde celler.
BEMÆRK: levedygtighed pletten reagerer med frie aminer til stede på både overfladen og det indre af cellerne. I modsætning til levende celler, døde celler (med kompromitterede membraner) tillade farvestoffet at træde ind i cytoplasmaet, at øge mængden af protein mærkning. Således vil døde celler være lysere end levende celler giver nem diskrimination. Gate på liveceller.
BEMÆRK: levedygtighed cellesuspensionerne fra aorta og nyren kan være lavere end levedygtigheden af cellesuspensionerne fra lymfeknuderne grund af den yderligere fordøjelse trin. - Plot Forward Scatter Samarbejdsområde (FSC-A) [y-aksen] og Forward Scatter Højde (FSC-H) [x-aksen]. Slåbrokker vises som en diagonal på denne dot plot. Gate på denne diagonal at udelukke dubletter. Derefter plot SSC-A [y-aksen] og CD45 [x-aksen].
- Den CD45 + leukocyt befolkning let kan identificeres. Gate på denne population. Efterfølgende populationer kan identificeres ud fra denne population.
- Kør ufarvede og enkelt farvede rør til kompensation kontrol for at justere for spektral overlapning.
- Normalisering af celletal
- Counting perler har egenskaber, der resulterer i lav FSC og høj SSC. For eksempel, hvis 50.000 perler tilsættes i 300 pi af enkelt cellesuspension, ligningen for beregningen af den absolutte antal af enhver giver celletype per rør er som følger:
Antal celler pER rør = (50.000 / antal perler tælles af flowcytometeret) x antal talte celler.
Ved hjælp af denne beregning, kan bestemmes det absolutte antal af enhver given celletype pr rør. Baseret på hvor mange rør blev genereret fra hvert organ, kan antallet af celler pr orgel beregnes.
BEMÆRK: Hold alle celler og reagenser ved 4 ° C under protokollen. Undgå kraftig vortexbehandling fordi det kan beskadige celler. Brug minimale kræfter til at bundfælde cellerne. Undgå at gøre bobler i FACS rør, da det kan fremskynde celledød. Lad ikke pillerne tørre ud når som helst.
- Counting perler har egenskaber, der resulterer i lav FSC og høj SSC. For eksempel, hvis 50.000 perler tilsættes i 300 pi af enkelt cellesuspension, ligningen for beregningen af den absolutte antal af enhver giver celletype per rør er som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet tillader identifikation af overflade- og intracellulære markører i T-celler isoleret fra murin nyre, aorta og aorta drænende lymfeknuder i en model for angiotensin II-induceret hypertension. Repræsentative resultater er vist nedenfor.
Figur 1 viser gating strategi anvendes til at identificere T-celle population i en enkelt celle suspension fremstillet fra aorta af en WT mus infunderet med angiotensin II til at inducere hypertension. En lignende strategi anvendes i nyrerne og lymfeknuder. Det fremadgående Scatter Area (FSC-A) og Side Scatter Area (SSC-A) spænding blev indstillet til at detektere leukocytpopulationen (G1) og til at udelukke snavs. De levende celler (G2) er negative for levedygtighed markør konjugeret med Pacific blå. Levende celler blev derefter gatet på Forward Scatter Højde (FSC-H) og Forward Scatter Area (FSC-A) til gate kun påsinglet population (G3). Leukocytter blev dernæst udvalgt ved gating på SSC-A og CD45 (G4). CD45 er konjugeret med AmCyan i dette eksempel. Endelig er T-celler gated som CD45 + CD3 + population (G5). CD3 konjugeres med PerCP-Cy5.5 i dette eksempel.
Til bestemmelse af tilstedeværelsen af IL-17A og IL-17F producerende T-celler i murin nyre og aorta i denne model, blev enkeltcellesuspensioner farvet for IL-17A og IL-17F. Figur 2 illustrerer fluorescens minus én kontroller (FMO'er) for IL-17A og IL-17F farvning i en nyre prøve (konjugeret med FITC og APC, henholdsvis). FMO kontroller er prøver, som indeholder alle antistofferne i et panel med undtagelse af en. Som forventet meget få celler positive for IL-17A (figur 2A) eller IL-17F (figur 2B) i FMO kontroller. Disse kontroller tillader nøjagtig diskriminering af positive versus negative signaler til korrekt adjUST portene til at identificere de celler, positive for IL-17A eller IL-17F i de eksperimentelle prøver.
Figur 3 giver et eksempel på intracellulær farvning af T-celler isoleret fra nyre (figur 3A) og aorta (figur 3B) af WT-mus infunderet med vehikel (Sham) eller angiotensin II (Ang II). Faktisk kan detekteres en delmængde af T-celler, der udtrykker IL-17A eller IL-17F i begge væv i denne model.
Figur 4 illustrerer intracellulær farvning af T-celler inden for de aortiske drænende lymfeknuder i denne model (Figur 4A). CD8 + -T-celler blev først gated (figur 4B). Derefter ekspressionen af to TC1 markører, cytokinet IFNy eller transkriptionsfaktoren T-bet, blev kvantificeret fra CD8 + T-celle delmængde. Figur 4C illustrerer FMO'er for IFN47; og T-bet farvning i lymfeknude prøver (konjugeret med FITC og PE-Cy7 henholdsvis). Figur 4D viser, at i de aorta drænende lymfeknuder af WT mus infunderet med angiotensin II, kan identificeres en population af CD8 + IFNy + og CD8 + T-bet + celler.
Figur 1: Flowcytometri gating strategi til at identificere T-celler. Leukocytter er først gated på en forward scatter / sidespredning (FSC-A / SSC-A) punktdiagram (G1), og levende celler er valgt (G2). Cellerne bliver derefter gatet på singletter (FSC-A / FSC-H) (G3). Celler fra G3 er yderligere karakteriseret ved ekspressionen af CD45 (G4). Endelig er T-celler gatet på CD45 + CD3 + dobbelt positive celler (G5). Denne enkelt cellesuspension blev fremstillet ud fra hele aorta isoleret fra en vildtype (WT) mus infunderet med angiot ensin II til at inducere hypertension. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fluorescens minus én kontroller (FMO) for IL-17A og IL-17F. (A) En enkelt cellesuspension isoleret fra en angiotensin II-behandlede murine nyre prøve blev farvet ved anvendelse af en fixable levedygtighed markør (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) og IL-17F (APC). Antistoffet til IL-17A blev udeladt for at bestemme den korrekte gating for IL-17A. (B) En enkelt cellesuspension isoleret fra en angiotensin II-behandlede murine nyre prøve blev farvet ved anvendelse af en fixable levedygtighed markør (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) og IL-17A (FITC). I dette tilfælde blev antistoffet til IL-17F udeladt.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Intracellulær farvning af T-celler isoleret fra murine nyre og aorta for IL-17A og IL-17F. Flowcytometri dot plots viser IL-17A og IL-17F-ekspression i T-celler fra nyre (A) og aorta (B) fra WT-mus infunderet med vehikel (Sham) eller angiotensin II (Ang II) og tidligere gatet på CD45 + CD3 + celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Intracellulær farvning af T-celle s isoleret fra murine aorta drænende lymfeknuder. (A) Makroskopisk forekomster af to lumbale aorta drænende lymfeknuder i en WT mus. (B) repræsentant flowcytometri dot plots af CD4 + og CD8 + T-celler isoleret fra fire aorta drænende lymfeknuder isoleret fra en WT mus infunderet med angiotensin II og tidligere gatet på CD45 + CD3 + celler. (C) En enkelt cellesuspension isoleret fra lymfeknuder blev farvet ved anvendelse af en levedygtighed markør (Pacific Blue), CD3 (PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7), og CD8 (APC). FMO kontroller er vist i hvilket antistoffet for IFNy (FITC) eller T-bet (PE-Cy7) blev udeladt for at bestemme den korrekte gating. (D) Flowcytometri dot plots demonstrerer positiv IFNy og T-bet udtryk inden for CD8 + lymfeknude T-celler ved hjælp af portene bestemt af FMO kontroller.g "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MSM er støttet af en bevilling fra Gilead Cardiovascular Sciences.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) til FL, en uddannelse bevilling fra National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) til BLD, en American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) til MA Saleh, og en NIH K08 award (HL121671) til MSM. MSM er også understøttet af en forskningsbevilling fra Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
