Summary
Cet article fournit une méthodologie détaillée pour identifier et quantifier les sous-ensembles de lymphocytes T fonctionnels présents dans les ganglions rénaux murin, l'aorte et lymphatiques par coloration intracellulaire et cytométrie de flux. Le modèle de l'angiotensine II hypertension induite a été choisi pour expliquer, étape par étape, les procédures et les principes fondamentaux de la cytométrie de flux et de coloration intracellulaire.
Introduction
Des données récentes démontrent que le système immunitaire adaptatif, en particulier les lymphocytes T jouent un rôle crucial dans le développement de plusieurs maladies cardiovasculaires 1,2,3,4,5. Par exemple, dans le modèle de l' angiotensine II , l' hypertension induite par une accumulation de lymphocytes T dans les vaisseaux et les reins de souris a été décrite 6. L'accumulation vasculaire est principalement dans l'adventice et la graisse périvasculaire. Dans le rein, les cellules T accumulent à la fois dans la moelle et le cortex rénal. Selon le type de sous - ensemble est en cause, ces cellules T donnent naissance à différentes cytokines qui peuvent affecter la fonction vasculaire et rénale et conduire au développement de la pathologie (revue par McMaster et al. 6).
Lymphocytes T auxiliaires CD4 + peuvent être divisés en plusieurs sous - ensembles: T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, TH22, (Treg) T régulatrices, et T helper folliculaire (TFH) des cellules en fonction de leurs fonctions et signature cytokines 7. De même, les cellules T cytotoxiques CD8 + peuvent être classés comme Tc1, Tc2, TC17 ou 8 TC9. Il existe également des cellules T doubles négatives ( par exemple des cellules qui ne manifestent pas les marqueurs CD4 ou des lymphocytes T CD8). Un sous-ensemble de ces cellules possèdent un récepteur alternatif gamma delta T cellulaire (au lieu des récepteurs alpha et bêta classiques) et sont donc appelées cellules T gamma delta. L'analyse multi-paramètres par cytométrie de flux de marqueur de surface, cytokine et facteur de transcription constitue la meilleure approche pour identifier ces cellules. Bien que cette méthode est largement utilisée dans le domaine de l'immunologie, il est moins bien décrite dans les organes solides et dans le cadre des maladies cardiovasculaires.
Dans le passé, l'identification des lymphocytes dans les tissus a été limitée à l'immunohistochimie ou des approches de RT-PCR. Bien que immunohistochimie et immunofluorescence des procédés puissants afin de déterminer la distribution tissulaire d'un antigène d'intEREST, ils sont insuffisants pour identifier les sous-ensembles phénotypique impliqués. En outre, alors que l'analyse par RT-PCR permet de détecter l'expression des ARNm des antigènes, des cytokines ou des facteurs de transcription, elle ne permet pas la détection de protéines multiples simultanément au niveau des cellules individuelles.
L'avènement de la cytométrie en flux, en particulier lorsqu'elle est combinée avec la coloration intracellulaire pour détecter des cytokines et des facteurs de transcription, donne des chercheurs ayant une puissante technique qui permet l'identification et la quantification au niveau de la cellule unique de sous-ensembles de cellules immunitaires dans des organes solides. Nous avons optimisé un essai de coloration intracellulaire pour identifier par cytométrie de flux les principaux sous-ensembles de cellules T présents dans le rein de souris, l'aorte et l'aorte ganglions lymphatiques drainant dans un modèle de l'angiotensine II, l'hypertension induite. L'optimisation de chaque étape: la digestion du tissu, ex vivo activation, perméabilisation, et la surface et les résultats de coloration intracellulaire dans un très nouveauproductible dosage qui peut être appliqué à d'autres modèles de maladies cardiovasculaires et rénales.
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Protocol
Comité des soins et l'utilisation institutionnelle des animaux de l'Université Vanderbilt a approuvé les procédures décrites ici. Les souris sont logés et soignés conformément au Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire (National Academies Press. Revised 2010).
1. Isolement de l'Aortic Vidange Adénopathies, Reins et Aorte de souris
- Euthanasier les souris par inhalation de CO 2. Pulvériser la poitrine avec 70% d'éthanol et ouvrir avec précaution la peau et la paroi thoracique avec des ciseaux pour exposer le cœur.
- Perfuser le système vasculaire, effectuer une petite incision dans l'oreillette droite et à injecter de façon constante au moins 10 ml de PBS froid (environ 1 ml / s) dans la pointe du ventricule gauche à l'aide d'une aiguille G 21 ou 23. Perfuser jusqu'à ce que tous les organes ont blanchies. Le cœur blêmit premier. Blanchir du foie indique que la perfusion a été bien effectué.
- En utilisant de petites pinces et ciseaux fins, couper doucement et retirer les intestins,estomac, la rate, le pancréas et le foie de mieux visualiser l'aorte.
REMARQUE: Cette étape doit être fait de façon très précise que les dommages à l'appareil gastro-intestinal peut induire une contamination. - Découpez et retirez chaque poumon avec des ciseaux. Rincer la cavité thoracique avec du tampon phosphate salin (PBS) en utilisant une seringue sans aiguille. Retirer le sang et l'excès de liquide en utilisant une gaze stérile.
- Retirer les aortiques ganglions lymphatiques drainants abdominale à l'aide de fines pinces à dissection. Assurez-vous de ne pas rompre la capsule. Enlever la graisse restant sur la surface de chaque ganglion lymphatique avec la pince à dissection. Découpez les deux reins avec des ciseaux fins.
- Disséquer l'ensemble de l'aorte (de l'aorte thoracique et abdominale) avec de fines, ciseaux courbes. Commencez au niveau du cœur et soigneusement disséquer loin de l'œsophage et les vertèbres vers le bas au niveau de la bifurcation iliaque en veillant à garder la graisse périvasculaire entourant attaché à l'aorte.
REMARQUE: outre la dissection de l'aorte à remocinq structures environnantes peuvent être effectuées sous un microscope. Plus précisément, enlever les branches artérielles (artères carotides, les artères sous-clavière, coeliaque, mésentériques, rénales et artères) et les ganglions lymphatiques. Gardez une couche uniforme de graisse périvasculaire autour de chaque aorte puisque c'est un site où de nombreuses cellules inflammatoires résident dans le cadre de l'hypertension. Placez chaque tissu dans des tubes séparés contenant du PBS froid.
2. Génération de cellule unique Suspensions de chaque tissu
- Les reins
NOTE: Le rein peut être dissocié en une suspension cellulaire unique en combinant dissociation mécanique ainsi que la digestion enzymatique.- Préparer la solution de rein de digestion par addition de la collagénase D (2 mg / ml) et de la DNase I (100 pg / ml) à un milieu RPMI 1640 (supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS)). Préparer 10 ml par échantillon de rein.
- L'utilisation de pinces pour transférer les deux reins dans un tube de dissociation contenant 10 ml de rein digérersolution ionique.
- Effectuer la dissociation mécanique à l'aide d'un dispositif semi-automatique dissociateur selon les instructions du fabricant.
- Après dissociation mécanique, détacher le tube de l'appareil et effectuer la digestion enzymatique. Incuber les échantillons pendant 20 min à 37 ° C sous rotation continue. Arrêtez immédiatement la digestion enzymatique en ajoutant froid du milieu RPMI 1640 additionné de 5% de FBS.
- Transférer la solution par pipetage dans un tube conique de 50 ml après filtration à travers un tamis de 40 um. Démêler le tissu restant en dehors en appuyant avec le piston d'une seringue de 1 ml. Pellet les cellules (500 xg, 8 min, 4 ºC).
- Remettre en suspension le culot dans 3 ml de 36% en gradient de densité milieu de centrifugation. Transférer la suspension dans un tube conique de 15 ml. ajouter doucement 3 ml de 72% de milieu à gradient de densité au-dessous de centrifugation de la suspension cellulaire 3 ml de 36% sans aucune interruption. Centrifugeuse (1000 xg sans frein, 20 min, 4 ° C). </ Li>
- Les cellules immunitaires sont situés à l'interface. Retirer la couche jaunâtre supérieure contenant les débris cellulaires, puis amener le volume jusqu'à 15 ml en utilisant du PBS froid. Bien agiter à la dégradation du gradient. Faites tourner les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C) et resuspendre le culot dans 3 ml de RPMI avec 5% de FBS. Compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant exclusion du bleu Trypan.
- l'aorte
- Préparer la solution de digestion de l'aorte par l'addition de collagénase (1 mg / ml), la collagénase B (1 mg / ml) et de la DNase I (100 pg / ml) à un milieu RPMI 1640 (supplémenté avec 5% de SBF).
- En utilisant une pince fine, transférer l'aorte dans un tube de 2 ml contenant 1 ml de solution aorte de digestion. Émincer l'ensemble aorte en très petits morceaux avec des ciseaux fins dans la solution 1 ml de digestion. Gardez sur la glace. Incuber les échantillons pendant 30 min à 37 ° C sous rotation continue.
- Transférer la solution dans une boîte de culture de tissus et d'arrêter le enzymatic digestion par addition de 5 fois le volume de RPMI froid avec 5% de FBS.
- Transférer la solution par pipetage dans un tube conique de 50 ml après filtration à travers un tamis de 40 um. Démêler le tissu qui se séparent en une seule suspension cellulaire en pressant avec le piston d'une seringue de 1 ml. Rincer la crépine et sédimenter les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C).
- Laver le culot par addition de 10 ml de RPMI avec 5% de FBS. Faites tourner les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C) et resuspendre le culot dans 3 ml de RPMI avec 5% de FBS. Compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant exclusion du bleu Trypan.
- Les ganglions lymphatiques de drainage de l' aorte
- Placer un tamis de 40 pm dans une boîte de culture tissulaire (60 mm x 15 mm). Placez les ganglions lymphatiques sur la crépine et les taquiner à part dans une suspension cellulaire unique en appuyant avec le piston d'une seringue de 1 ml. Rincer le filtre avec 2 ml de RPMI avec 5% de FBS. Recueillir les cellules dans le plat.
- Transfertles cellules dans un tube Falcon de 15 ml et le culot des cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C). Remettre en suspension le culot dans 500 pl de RPMI avec 5% de FBS. Compter le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre en utilisant exclusion du bleu Trypan.
3. Ex Vivo Stimulation pour Cytokine détection par cytométrie de flux
- Préparer le milieu de culture cellulaire: RPMI avec 5% de FBS, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 50 pM de β-mercaptoéthanol et 1% de pénicilline / streptomycine.
- Centrifuger chaque suspension cellulaire obtenue à partir des noeuds du rein, de l'aorte et des ganglions lymphatiques (300 x g, 8 min, 4 ° C). Remettre en suspension chaque culot avec les milieux de culture cellulaire à une concentration de 1 x 10 6 cellules par ml.
- Stimuler les cellules en ajoutant 2 pi du cocktail d'activation des cellules (contenant phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA), le ionomycine ionophore de calcium, et l'inhibiteur de Golgi Brefeldine A) pour chaque 1 ml de la culture cellulaire.
NOTE: La concentration finales de chaque composant sont: 81 nM de PMA, 1,33 uM de ionomycine et 5 ug / ml de Brefeldin A. Le traitement par PMA et ionomycine active les cellules à produire des cytokines. Les cytokines sont des protéines sécrétées qui doivent être piégées dans les cellules à détecter. Brefeldine A cause de l'accumulation de protéines normalement sécrétées dans l'appareil de Golgi et le reticulum endoplasmique. Ainsi, la technique décrite ici augmente la capacité de détection des lymphocytes produisant des cytokines par cytométrie de flux. - Planche 1 à 2 millions de cellules dans un 12 puits (aorte ou des reins) ou 24 puits (ganglionnaire) des plaques à faible adhérence. Placer la plaque dans un 37 ° C humidifié incubateur CO 2 pendant 3 heures.
NOTE: Le nombre de cellules ensemencées peut être plus faible dans les ganglions lymphatiques des souris témoins. En outre, le temps de la stimulation doit être déterminée empiriquement pour chaque population de cellules et cytokines étudiées. Dans le cas des lymphocytes T isolés à partir des nœuds aorte, reins ou lymphatiques, nous vous recommandons de stimuler pendant 3 à 4 heures. Une stimulation plus wmalade ne pas augmenter la sécrétion de cytokines et va induire une régulation à la baisse supplémentaire de plusieurs marqueurs de surface des cellules T telles que CD3, CD4 et CD8. (Notez que même une stimulation 3-4 h va induire une certaine régulation négative de ces marqueurs.)
4. Coloration de surface
- Transférer les cellules dans un tube de polystyrène et FACS centrifuge (300 x g, 8 min, 4 ° C). Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS (Ca 2+ et Mg + libre du PBS contenant 4% de FBS et 2 mM d' EDTA) et diviser la suspension cellulaire également dans différents tubes FACS en fonction du nombre de panneaux d'anticorps désirés et le nombre de tubes de contrôle nécessaires ( voir ci-dessous).
- Pour effectuer une compensation pour chaque panneau, préparer des tubes de contrôle non colorées et tubes colorés uniques pour chaque type de tissu et le panneau d'anticorps. En outre, de préparer des tubes de fluorescence moins une (FMO) de commande pour chaque panneau d'anticorps par addition de tous sauf un des anticorps.
- Réglez le volume de chaque tube à 2 ml avec FACSTampon. Centrifuger la suspension de cellules (300 x g, 8 min, 4 ° C), retirer le surnageant et bloquer les récepteurs Fc en incubant les cellules avec 0,5 pg d'anticorps anti-CD16 / CD32 par million de cellules pendant 10 minutes sur de la glace.
NOTE: CD16 est faible affinité du récepteur Fc des IgG III (FcR III) et CD32 est FcR II. CD16 / CD32 est exprimé sur les granulocytes, les mastocytes, monocytes / macrophages, les cellules tueuses naturelles, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et certaines cellules T matures activées. - Effectuer la viabilité coloration: Laver les cellules avec PBS 1x, centrifugeuse (300 xg, 8 min, 4 ° C) et remettre en suspension dans 1000 ul de PBS 1x. Ajouter 1 pi d'une amine réactive colorant (viabilité) tache de cellules-impermeant. Incuber pendant 15 min à 4 ° C à l'abri de la lumière.
- Au cours de l'incubation, préparer le cocktail d'anticorps (pour une coloration de surface) dans un volume approprié de tampon FACS. Laver les cellules deux fois avec 1-2 ml de tampon FACS, la centrifugeuse (300 x g, 8 min, 4 ° C) et remettre en suspension chaque culot avec 100 uldu mélange d'anticorps. Incuber pendant 30 min à 4 ° C à l'abri de la lumière.
NOTE: Pour chaque anticorps cytométrie en flux, il est utile de déterminer la quantité optimale d'anticorps nécessaire à l'exécution d'une courbe de titrage de la dose. - Laver les cellules deux fois avec 2 ml de tampon FACS et sédimenter les cellules (300 xg, 8 min, 4 ° C).
5. Fixation, perméabilisation et intracellulaires Coloration
- Effectuer la coloration intracellulaire avec un kit de fixation et perméabilisation contenant des tampons appropriés en suivant les instructions du fabricant. Fixer et perméabiliser les cellules en les remettant en suspension dans le tampon approprié. Incuber les échantillons pendant 40 min à 4 ° C à l'abri de la lumière.
- Ajouter 1 ml de 1x perméabilisation et laver le tampon directement aux cellules fixées et perméabilisées. Centrifugeuse (500 xg, 8 min, 4 ° C) et retirer le surnageant. Reprendre le culot avec 2 ml de 1x tampon de lavage.
- Préparer les mélanges de antibOdies (pour la coloration intracellulaire seulement) dans un volume approprié de 1x tampon de lavage (habituellement de 100 pi par tube).
Remarque: Comme cela est décrit ci-dessus, la concentration d'anticorps optimale doit être déterminée pour chaque anticorps dans le panneau. Par exemple, des anticorps anti-IL-17A ou IL-17F, on utilise un facteur de dilution de 1:30, mais pour des anticorps dirigés contre l'IFNy et T-bet, on utilise un facteur de dilution de 1: 100. - Centrifuger les cellules (500 xg, 8 min, 4 ° C) et remettre en suspension chaque culot avec 100 pi du mélange d'anticorps. Incuber pendant 40 min à 4 ° C à l'abri de la lumière.
- Laver les cellules deux fois avec 2 ml de tampon de lavage 1 fois et sédimenter les cellules (500 xg, 8 min, 4 ° C). Remettre en suspension le culot avec 300 pi de tampon de lavage 1 fois et analyser sur un cytomètre en flux avec des filtres appropriés.
- Pour la quantification du nombre total de cellules par échantillon de tissu, en utilisant des billes de comptage. Avant l'acquisition, ajouter le volume / nombre recommandé de comptage de perles dans chaque tube.
6. Rémunération, Gating, normalisation, et conseils
- Compensation et gating
- tubes de commande Exécuter et non colorées simples tachées de compensation pour régler le chevauchement spectral.
NOTE: L'utilisation de billes de compensation plutôt que des contrôles de rémunération à base de cellules est nécessaire dans les cas où l'antigène d'intérêt ou d'une population de cellules dans un échantillon est présent à ces faibles niveaux que la compensation en utilisant des cellules sera difficile. A noter également, lors de l'utilisation de colorants en tandem, il est conseillé de préparer des compensations pour chaque expérience puisque les colorants en tandem varient beaucoup à beaucoup et avec chaque jour. - Exécutez la fluorescence moins un contrôle (COM) pour tous les fluorophores dans le panneau lors du démarrage d'une nouvelle expérience multicolore.
REMARQUE: Les commandes FMO sont des échantillons qui contiennent tous les anticorps dans le panneau, sauf un. Ces contrôles permettent une discrimination précise de positif par rapport à des signaux négatifs pour l'anticorps omis de adjus correctementt les portes. Ces contrôles sont particulièrement importants lorsque les niveaux d'expression sont faibles ou lorsque la séparation de la population cible est faible (par exemple, lorsque la cible est une cytokine ou un facteur de transcription). Bien que pas toujours nécessaire, dans certains cas, les contrôles isotypiques peuvent être préférés à la place de FMO contrôle car ils fournissent une compensation adéquate pour l'isotype d'anticorps et fluorophore conjugué sans la spécificité de l'antigène. - Mettre en place la porte principale: régler Area Forward Scatter (FSC-A) et région Scatter Side (SSC-A) de tension afin de détecter la population leucocytaire.
- Exclure les cellules mortes.
REMARQUE: La coloration de viabilité réagit avec les amines libres présentes sur la surface et l'intérieur des cellules. Contrairement aux cellules vivantes, des cellules mortes (avec des membranes compromises) permettent au colorant de pénétrer dans le cytoplasme, augmentant ainsi la quantité de marquage des protéines. Ainsi, les cellules mortes seront plus lumineux que les cellules vivantes permettant la discrimination facile. Porte sur le livecellules.
REMARQUE: La viabilité des suspensions cellulaires à partir de l'aorte et le rein peut être inférieure à la viabilité des suspensions de cellules des ganglions lymphatiques en raison de l'étape de digestion supplémentaire. - Surface Forward Scatter (FSC-A) [y axe] et Forward Scatter Hauteur (FSC-H) [axe x]. Débardeurs apparaissent comme une diagonale sur ce tracé de points. Porte sur cette diagonale d'exclure doublets. Ensuite, tracer SSC-A [y-axe] et CD45 [axe x].
- Le CD45 + leucocytaire population peut être facilement identifié. Porte sur cette population. populations suivantes peuvent être identifiés à partir de cette population.
- tubes de commande Exécuter et non colorées simples tachées de compensation pour régler le chevauchement spectral.
- La normalisation de la numération
- perles de comptage ont des caractéristiques qui donnent lieu à faible SSC FSC et élevé. Par exemple, si 50.000 billes sont ajoutées dans 300 ul de la suspension cellulaire unique, l'équation pour le calcul du nombre absolu de tout type de cellules donné par tube est la suivante:
Nombre de cellules ptube er = (50.000 / nombre de billes comptées par le cytomètre de flux) x nombre de cellules comptées.
L'utilisation de ce calcul, le nombre absolu de tout type cellulaire donné par tube peut être déterminée. En fonction du nombre de tubes ont été générés à partir de chaque organe, le nombre de cellules par organe peut être calculé.
REMARQUE: Conservez toutes les cellules et les réactifs à 4 ° C au cours du protocole. Évitez tourbillonnement vigoureux, car il peut endommager les cellules. Utilisez forces minimales pour sédimenter les cellules. Évitez de faire des bulles dans le tube FACS car il peut précipiter la mort cellulaire. Ne laissez pas les granulés secs à tout moment.
- perles de comptage ont des caractéristiques qui donnent lieu à faible SSC FSC et élevé. Par exemple, si 50.000 billes sont ajoutées dans 300 ul de la suspension cellulaire unique, l'équation pour le calcul du nombre absolu de tout type de cellules donné par tube est la suivante:
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Representative Results
Le protocole décrit permet l'identification de marqueurs de surface et intracellulaires dans les cellules T isolées de rein de souris, de l'aorte et de l'aorte ganglions lymphatiques drainant dans un modèle de l'angiotensine II, l'hypertension induite. Les résultats représentatifs sont présentés ci-dessous.
La figure 1 illustre la stratégie de portillonnage utilisé pour identifier la population de lymphocytes T dans une suspension monocellulaire préparée à partir de l'aorte de souris WT imprégné de l' angiotensine II pour induire une hypertension. Une stratégie similaire est utilisée dans les ganglions lymphatiques et les reins. La zone Forward Scatter (FSC-A) et région Scatter Side (SSC-A) de tension a été ajusté pour détecter la population leucocytaire (G1) et d'exclure les débris. Les cellules vivantes (G2) sont négatifs pour le marqueur de viabilité conjugué avec le bleu du Pacifique. Les cellules vivantes ont ensuite été déclenchés sur Forward Scatter Hauteur (FSC-H) et région Scatter Forward (FSC-A) à la porte seulement sur lapopulation singlet (G3). Leucocytes ont ensuite été sélectionnés par gating sur SSC-A et CD45 (G4). CD45 est conjugué à AmCyan dans cet exemple. Enfin, les cellules T sont gated que la population CD45 + CD3 + (G5). CD3 est conjugué à PerCP-Cy5.5 dans cet exemple.
Pour déterminer la présence d'IL-17A et à produire des lymphocytes T de souris à l'intérieur du rein et de l'aorte dans ce modèle d'IL-17F, les suspensions cellulaires uniques ont été colorées pour l'IL-17A et IL-17F. La figure 2 illustre la fluorescence moins un témoin (COM) pour IL-17A et IL-17F coloration dans un échantillon de rein (conjugué à FITC et APC, respectivement). contrôles FMO sont des échantillons qui contiennent tous les anticorps dans un panneau, sauf un. Comme on s'y attendait, très peu de cellules sont positives pour l' IL-17A (figure 2A) ou IL-17F (figure 2B) dans les contrôles FMO. Ces contrôles permettent une discrimination précise des signaux positifs par rapport négatifs correctement adjust les portes pour identifier les cellules positives pour l'IL-17A ou IL-17F dans les échantillons expérimentaux.
La figure 3 donne un exemple de coloration intracellulaire des lymphocytes T isolés à partir du rein (figure 3A) et de l' aorte (figure 3B) des souris WT infusé avec un véhicule (Sham) ou de l' angiotensine II (Ang II). En effet, un sous-ensemble de cellules T qui expriment IL-17A ou IL-17F peut être détectée dans les tissus dans ce modèle.
La figure 4 illustre la coloration intracellulaire des cellules T dans les aortiques ganglions lymphatiques drainants dans ce modèle (figure 4A). Lymphocytes T CD8 + ont d' abord été déclenchés (figure 4B). Ensuite, l'expression de deux marqueurs Tc1, la cytokine IFN - y ou le facteur de transcription T-bet, ont été quantifiés à partir du sous - ensemble de cellules T CD8 +. Figure 4C illustre les FMO pour IFN47; et T-bet coloration dans les échantillons de ganglions lymphatiques (conjugué avec du FITC et PE-Cy7, respectivement). La figure 4D montre que dans les aortiques ganglions lymphatiques drainants de souris WT infusées avec l' angiotensine II, une population de cellules CD8 + IFNy + et CD8 + T-bet + cellules peuvent être identifiées.
Figure 1: La cytométrie en flux stratégie de portillonnage pour identifier les cellules T. Leucocytes sont d'abord déclenchés sur un avant scatter scatter / côté (FSC-A / SSC-A) dot plot (G1), et les cellules vivantes sont sélectionnées (G2). Les cellules sont ensuite gated sur singulets (FSC-A / FSC-H) (G3). Les cellules provenant de G3 sont en outre caractérisées par l'expression de CD45 (G4). Enfin, les cellules T sont gated sur CD45 + CD3 + cellules positives doubles (G5). Cette suspension cellulaire unique a été préparée à partir de l'ensemble de l'aorte isolée de type sauvage (WT) de la souris perfusée avec angiot ensin II pour induire une hypertension. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Fluorescence moins un contrôle (FMO) pour l' IL-17A et IL-17F. (A) Une suspension de cellule unique isolée d'un échantillon traité de rein de souris de l' angiotensine II a été coloré à l' aide d' un marqueur pouvant être fixé sur la viabilité (bleu Pacifique), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) et IL-17F (APC). L'anticorps pour l'IL-17A a été omis de déterminer le déclenchement approprié pour IL-17A. (B) Une seule suspension cellulaire isolée d'un échantillon traité de rein de souris de l' angiotensine II a été coloré à l' aide d' un marqueur pouvant être fixé sur la viabilité (bleu Pacifique), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) et IL-17A (FITC). Dans ce cas, l'anticorps pour IL-17F a été omis.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: coloration intracellulaire des lymphocytes T isolés à partir de souris du rein et de l' aorte pour l' IL-17A et IL-17F. La cytométrie en flux points sur des tracés représentant l' IL-17A et de l' expression d' IL-17F dans les cellules T provenant du rein (A) et de l' aorte (B) de souris WT perfusées avec le véhicule (Sham) ou de l' angiotensine II (Ang II) , et préalablement débloqué CD45 + CD3 + cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: coloration intracellulaire de cellules T s aorte isolée de ganglions lymphatiques drainant murins. (A) apparences macroscopiques de deux aortiques lombaires ganglions lymphatiques drainants dans une souris WT. (B) d'écoulement représentatif cytométrie tracés de points de CD4 + et CD8 + isolées à partir d' aorte de quatre noeuds lymphatiques drainant isolés à partir d' une souris WT infusé avec l' angiotensine II et préalablement bloquées sur CD45 + CD3 + cellules. (C) Une suspension de cellules individuelles isolées à partir des ganglions lymphatiques a été coloré en utilisant un marqueur de viabilité (Pacific Blue), CD3 (PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7) et CD8 (APC). les commandes sont indiquées FMO dans laquelle l'anticorps pour l'IFNy (FITC) ou T-bet (PE-Cy7) a été omis afin de déterminer le déclenchement approprié. (D) de cytométrie de flux dot parcelles démontrant IFNy positive et l' expression T-bet dans les cellules ganglionnaires de T CD8 + en utilisant les portes déterminées par les contrôles FMO.g "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Disclosures
MSM est soutenu par une subvention de Gilead Sciences cardiovasculaires.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par un prix de l'American Heart Association Fellowship (16POST29950007) FL, une bourse de formation de la National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) à BLD, un prix de l'Association Fellowship American Heart (14POST20420025) à MA Saleh, et une NIH K08 prix (HL121671) au MSM. MSM est également soutenu par une subvention de Gilead Sciences, Inc. recherche
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
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