Summary
מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורט לזהות ולכמת תת T לימפוציטים תפקודית נוכח בתוך הכליה בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה על ידי מכתים תאיים cytometry הזרימה. המודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II נבחר להסביר, צעד אחר צעד, את הנהלים ואת עקרונות יסוד של cytometry זרימה מכתים תאי.
Introduction
עדויות עדכניות מוכיחות כי המערכת החיסונית אדפטיבית, במיוחד לימפוציטים מסוג T, לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של מחלות לב וכלי דם כמה 1,2,3,4,5. לדוגמא, במודל של יתר לחץ דם נגרמת השני אנגיוטנסין, הצטברות של תאי T על כלי דם הכליות של עכברים תוארה 6. ההצטברות של כלי הדם היא בעיקר בארצות adventitia ואת שומן perivascular. בכליה, תאי T להצטבר הן לשד ואת קליפת הכליה. תלוי באיזה משנה מעורב, תאי T אלו מעוררים ציטוקינים שונים שיכולים להשפיע על תפקוד כלי הדם ואת הכליות ואת להוביל להתפתחות של הפתולוגיה (נבדקה על ידי מקמאסטר et al. 6).
לימפוציטים עוזר CD4 + T ניתן לחלק תת כמה: 1 T מסייעים (Th1), Th2, Th9, TH17, Th22, הרגולציה T (Treg) תאים, עוזר הזקיקים T (TFH) תאים בהתבסס על תפקידיהם ציטומגלווירוס חתימהkines 7. באופן דומה, CD8 + T ציטוטוקסיים תאים ניתן לסווג Tc1, Tc2, Tc17 או Tc9 8. יש גם תאי T כפולים והפוכים (תאים כלומר אינו מבטאים את CD4 או CD8 סמני תא T). תת-קבוצה קטנה של תאים אלה יש קולטן תא T דלתא גמא חלופי (במקום קולטני אלפא ובטא קלאסית) ולכן מכונים תאי T דלתא גמא. הניתוח הרב-פרמטר ידי cytometry זרימת סמן משטח, ציטוקינים ו גורם שעתוק מהווה את הגישה הטובה ביותר כדי לזהות תאים אלה. אמנם שיטה זו נעשתה שימוש נרחב בתחום האימונולוגיה, היא מתוארת פחות טובה באיברים מוצקים על הרקע של מחלות לב וכלי דם.
מבחינה היסטורית, זיהוי של לימפוציטים ברקמות הוגבל אימונוהיסטוכימיה או גישות RT-PCR. למרות אימונוהיסטוכימיה ו immunofluorescence שיטות רבות עצמה כדי לקבוע את חלוקת הרקמות של אנטיגן של interest, הם אינם מספיקים phenotypically לזהות תת מעורב. בנוסף, בעוד ניתוח RT-PCR שימושי כדי לזהות ביטוי mRNA של אנטיגנים, ציטוקינים או גורמי שעתוק, היא אינה מאפשרת זיהוי של חלבונים מרובים בו זמנית ברמה של תאים בודדים.
הופעתו של זרימת cytometry, במיוחד בשילוב עם מכתים תאי לזהות ציטוקינים גורמי שעתוק, מספקת חוקרים עם טכניקה רבה עצמה המאפשרת זיהוי וכימות ברמת התא הבודדה של תת תאים חיסוניים איברים מוצקים. יש לנו אופטימיזציה ב assay מכתים תאיים לזהות על ידי זרימת cytometry תת תא T הגדולות נמצאות בכליות בעכברים, אבי העורקים ובלוטות לימפה ניקוז אבי העורקים במודל של יתר לחץ דם הנגרמת אנגיוטנסין II. אופטימיזציה של כל שלב: עיכול רקמות, לשעבר vivo הפעלה, permeabilization, ומשטח ותוצאות מכתימות תאיות בתוך ביותר מחדשassay הפקה כי ניתן ליישם מודלים למחלות לב וכלי דם כליות אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הטיפול בבעלי החיים המוסדיים של האוניברסיטה ונדרבילט ועדת השימוש אשרה את ההליכים המתוארים במסמך זה. עכברים הם שוכנו וטפלו בהתאם המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (הוצאת האקדמיה הלאומית. מתוקנים 2010).
1. ניתוק של ניקוז בלוטות הלימפה אבי העורקים, כליות ואבי העורקים מעכברים
- להרדים את העכברים משאיפת CO 2. תרסיס החזה עם 70% אתנול ו לפתוח בזהירות את העור ואת בית החזה עם מספריים כדי לחשוף את הלב.
- כדי perfuse כלי הדם, לבצע חתך קטן העלייה הימנית ולהזריק בהתמדה לפחות 10 מ"ל של קר PBS (כ 1 מ"ל / sec) לתוך איפקס של החדר השמאלי באמצעות מחט G 21 או 23. Perfuse עד שכל האיברים יש החוויר. הלב מחוויר ראשון. הלבנה של הכבד עולה כי זלוף שבוצע היטב.
- בעזרת מלקחיים קטנים מספריים בסדר, בעדינות לחתוך ולשלוף את המעיים,קיבה, טחול, לבלב וכבד לדמיין את אב העורקים טוב יותר.
הערה: שלב זה חייב להיעשות בדיוק רב כמו נזק מערכת העיכול יכול לגרום לזיהום. - לגזור ולהסיר כל ריאות במספריים. יש לשטוף את חלל החזה עם בופר פוספט (PBS) באמצעות מזרק ללא מחטים. הסרת עודפי דם ונוזלים באמצעות גזה סטרילי.
- הסר את בלוטות הלימפה בטן אאורטלי ניקוז באמצעות מלקחיים לנתח בסדר. ודא שלא לקרוע את הקפסולה. להסיר את השומן הנותר על פני השטח של כל צומת הלימפה עם מלקחיים לנתח. לגזור שתי הכליות עם מספריים בסדר.
- לנתח את אבי העורקים כולו (אבי העורקים החזי בטן) עם מספריים בסדר, מעוקל. התחל ברמה של הלב ובזהירות לנתח מן הוושט החוליות עד לרמה של הסתעפות הכסל והקפד לשמור את שומן perivascular שמסביב מצורף האאורטה.
הערה: לנתיחה נוספת של אב העורקים אל רמיve מבנים שמסביב ניתן לעשות זאת תחת מיקרוסקופ. באופן ספציפי, להסיר ענפים עורקים (עורקי ראש, עורקי subclavian, צליאק, mesenteric, ועורקי כליות) ובלוטות לימפה. האם לשמור על שכבה אחידה של שומן perivascular סביב כל האאורטה מאז זה הוא אתר שבו הרבה תאים דלקתיים מתגוררים ההגדרה של יתר לחץ דם. מניחים כל רקמת צינורות נפרדים המכיל PBS קר.
דור 2. השעיות תא בודדות מתוך כל רקמות
- הכליות
הערה: כליות ניתן ניתק לתוך ההשעיה תא בודד על ידי שילוב ניתוק מכני בתוספת עיכול אנזימטי.- הכן את הפתרון העיכול כליות ידי הוספת D collagenase (2 מ"ג / מ"ל) ו DNase אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) כדי RPMI בינוני 1640 (בתוספת 5% בסרום שור העובר (FBS)). כן 10 מיליליטר לדגימת כליות.
- שימוש במלקחיים להעביר את שתי הכליות לתוך צינור דיסוציאציה המכיל 10 מ"ל של כליות לעכלפתרון יון.
- בצע את הניתוק המכאני באמצעות מכשיר Dissociator אוטומטי למחצה על פי הוראות היצרן.
- לאחר ניתוק מכני, לנתק את הצינור מהמכשיר ולבצע את עיכול אנזימטי. דגירת הדגימות במשך 20 דקות ב 37 ºC תחת סיבוב רציף. מיד לעצור את עיכול אנזימטי על ידי הוספת בינוני קר RPMI 1640 בתוספת 5% FBS.
- מעבירים את הפתרון על ידי pipetting לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לאחר סינון דרך מסננת 40 מיקרומטר. להקניט את הרקמה הנותרת לגזרים על ידי לחיצה עם הבוכנה של מזרק 1 מ"ל. גלולת התאים (500 XG, 8 דקות, 4 ºC).
- Resuspend גלולה לתוך 3 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות 36%. מעבירים את ההשעיה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. בעדינות להוסיף 3 מ"ל של התקשורת צנטריפוגה שיפוע צפיפות 72% מתחת ההשעיה תא 3 מ"ל 36% ללא כל הפרעה. צנטריפוגה (1,000 XG ללא בלם, 20 דק ', 4 ° C). </ Li>
- התא החיסוני ימוקם על הממשק. הסר את השכבה העליונה צהבהב המכיל פסולת הסלולר ולאחר מכן להביא את נפח עד 15 מ"ל באמצעות PBS קר. לנער היטב להתמוטטות השיפוע. ספין התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל של RPMI עם FBS 5%. ספירת תאי חיים על hemocytometer באמצעות הרחקה כחולה Trypan.
- אבי העורקים
- הכן את הפתרון העיכול אבי העורקים על ידי הוספת collagenase (1 מ"ג / מ"ל), B collagenase (1 מ"ג / מ"ל), ו DNase אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) כדי RPMI 1640 בינוני (בתוספת 5% FBS).
- בעזרת מלקחיים בסדר, להעביר את אבי העורקים לתוך צינור 2 מ"ל המכילה 1 מ"ל של פתרון העיכול אבי העורקים. לרכך את אבי העורקים כולו לחתיכות קטנות מאוד עם מספריים בסדר בפתרון עיכול 1 מ"ל. שמור על הקרח. דגירת הדגימות במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס מתחת סיבוב רציף.
- מעבירים את הפתרון לצלחת בתרבית רקמה ולעצור את enzymaעיכול טיק ידי הוספת 5 פעמים את נפח קר RPMI עם 5% FBS.
- מעבירים את הפתרון על ידי pipetting לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל לאחר סינון דרך מסננת 40 מיקרומטר. להקניט את הרקמה הנותרת בנפרד לתוך ההשעיה תא בודד על ידי לחיצה עם הבוכנה של מזרק 1 מ"ל. שטוף את מסננת גלולת התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ºC).
- שטפו את הכדור על ידי הוספת 10 מ"ל של RPMI עם 5% FBS. ספין התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל של RPMI עם FBS 5%. ספירת תאי חיים על hemocytometer באמצעות הרחקה כחולה Trypan.
- בלוטות הלימפה לנקז אבי העורקים
- מניחים מסננת 40 מיקרומטר בצלחת בתרבית רקמה (60 מ"מ x 15 מ"מ). מניחים את בלוטות הלימפה על מסננת ומקניטים אותם בנפרד לתוך ההשעיה תא בודד על ידי לחיצה עם הבוכנה של מזרק 1 מ"ל. שטוף את מסננת עם 2 מ"ל של RPMI עם 5% FBS. אוספים את התאים בצלחת.
- לְהַעֲבִיראת התאים לתוך צינור בז 15 מ"ל ו גלולה התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ºC). Resuspend גלולה ב 500 μl של RPMI עם 5% FBS. ספירת תאי חיים על hemocytometer באמצעות הרחקה כחולה Trypan.
3. Ex Vivo גירוי עבור איתור ציטוקינים על ידי cytometry זרימה
- כן תקשורת תרבית תאים: RPMI עם 5 FBS%, 0.1 מ"מ של חומצות אמינו לא חיוניים, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
- צנטריפוגה כל ההשעיה תא המתקבל כליות, אבי העורקים ובלוטות לימפה (300 XG, 8 דקות, 4 ºC). Resuspend כל גלולה עם תקשורת תרבית תאים בריכוז של 1 x 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- לעורר תאים על ידי הוספת 2 μl של קוקטייל הפעלת התא (המכיל phorbol 12-Myristate 13-אצטט (PMA), את ionomycin ionophore סידן, מעכבי Golgi Brefeldin א) עבור כל 1 מ"ל של תרבית תאים.
הערה: הריכוז הסופיים של כל רכיב הם: 81 ננומטר של PMA, 1.33 מיקרומטר של ionomycin ו 5 מיקרוגרם / מ"ל של Brefeldin א טיפול עם PMA ו ionomycin מפעיל תאים לייצר ציטוקינים. ציטוקינים מופרשים חלבונים חייבים להיות לכוד בתוך התאים כדי להתגלות. Brefeldin גורמת להצטברות חלבון המופרש בדרך כלל במנגנון הרטיקולום ו Golgi endoplasmic. לכן, השיטה המתוארת כאן משפר את detectability של לימפוציטים המייצרים ציטוקינים על ידי cytometry הזרימה. - לוח 1 כדי 2 מיליון תאים בתוך 12 גם (אבי העורקים או בכליות) או 24 גם (קשרי לימפה) צלחות-דבקות נמוכה. מניחים את הצלחת CO 2 באינקובטור humidified 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
הערה: מספר תאים מצופים עשוי להיות נמוך בבלוטות הלימפה מעכברים שליטים. כמו כן, הזמן של גירוי צריך להיקבע באופן אמפירי עבור כל אוכלוסיית תא ציטוקינים למד. במקרה של תאי T מבודדים אב עורקים, בלוטות כליות או הלימפה, אנו ממליצים מגרים במשך 3 עד 4 שעות. גירוי יותר wחולה לא להגביר את הפרשת ציטוקינים ו יניעו downregulation נוספת של סמנים פני התא כמה T כמו CD3, CD4 ו CD8. (יש לציין כי אפילו גירוי 3-4 שעות יניע כמה downregulation של סמנים אלה.)
מכתים Surface 4.
- העברת התאים לתוך צינור קלקר FACS ו צנטריפוגות (300 XG, 8 דקות, 4 ° C). שוטפים את התאים פעמיים עם חיץ FACS (Ca 2 + ו Mg + FBS 4% חינם PBS המכיל ו 2 מ"מ EDTA) ולחלק את ההשעיה תא באופן שווה לתוך צינורות FACS שונים המבוססים על מספר לוחות נוגדן הרצוי ומספר צינורות מלאה הצורך ( ראה למטה).
- כדי לבצע פיצוי עבור כל פנל, להכין צינורות שליטה בלא כתם וצינורות צבעוניים אחת עבור כל סוג רקמת פנל נוגדן. בנוסף, להכין אחד מינוס קרינת צינורות מלאים (FMO) עבור כל פנל נוגדנים על ידי הוספה כל פרט לאחד את הנוגדנים.
- כוון את עוצמת הקול של כל צינור עד 2 מ"ל עם FACSבַּלָם. צנטריפוגה ההשעיה תא (300 XG, 8 דקות, 4 ° C), להסיר את קולטני supernatant ולחסום Fc ידי דוגרים את התאים עם 0.5 מיקרוגרם של נוגדנים נגד CD16 / CD32 למיליון תאים עבור 10 דקות על הקרח.
הערה: CD16 הוא נמוכה זיקה IgG Fc קולטן III (FCR III) ו CD32 הוא FCR השני. CD32 CD16 / באים לידי ביטוי על גרנולוציטים, תאים תורנים, מונוציטים / מאקרופאגים, תאי הרג טבעיים, תאי B, תאים דנדריטים וכמה תאי הבוגרים T מופעלים. - בצע מכתים הכדאיות: שוטפים את התאים עם 1X PBS, צנטריפוגות (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend ב 1,000 μl של 1x PBS. הוסף 1 μl של (כתם כדאי) צבען התגובה אמין תא-impermeant. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
- במהלך הדגירה, להכין את הקוקטייל של נוגדנים (עבור מכתים משטח) ב נפח מתאים של חיץ FACS. שוטפים את התאים פעמיים עם 1-2 מ"ל של חיץ FACS, צנטריפוגות (300 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend כל גלולה עם 100 μlשל תערובת נוגדנים. דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
הערה: עבור כל זרימת cytometry נוגדנים, כדאי לקבוע את הכמות האופטימלית של נוגדן צורך ידי ביצוע עקומת טיטרציה מנה. - שוטפים את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של חיץ FACS ו גלולה התאים (300 XG, 8 דקות, 4 ° C).
5. קיבוע, Permeabilization ו תאיים מכתים
- בצע את המכתים התאי עם ערכת קיבעון permeabilization המכילה מאגרים המתאים על פי ההוראות של היצרן. תיקון ו permeabilize התאים על ידי resuspending אותם למאגר המתאים. דגירה דגימות עבור 40 דקות ב 4 ° C מוגן מפני אור.
- הוסף 1 מ"ל של 1x permeabilization ולשטוף חיץ ישירות אל התאים קבועים permeabilized. צנטריפוגה (500 XG, 8 דקות, 4 ° C) ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה עם 2 מ"ל של חיץ 1x הכביסה.
- מכינים את תערובת של antibodies (עבור מכתים תאי בלבד) ב נפח מתאים של חיץ לשטוף 1x (בדרך כלל 100 μl לכל צינור).
הערה: כפי שתואר לעיל, ריכוז הנוגדן האופטימלי צריכה להיקבע עבור כל נוגדן בחלונית. לדוגמא, עבור נוגדני IL-17A או IL-17 ו, אנו משתמשים גורמים לדילול של 1:30, אבל נוגדני IFNγ ו- T-הימור, אנו משתמשים גורמים לדילול של 1: 100. - צנטריפוגה התאים (500 XG, 8 דקות, 4 ° C) ו resuspend כל גלולה עם 100 μl של תערובת נוגדנים. דגירה במשך 40 דקות ב 4 ° C המוגנים מפני אור.
- שוטפים את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של חיץ לשטוף 1x ו גלולה התאים (500 XG, 8 דקות, 4 ° C). Resuspend גלולה עם 300 μl של חיץ לשטוף 1x ולנתח על cytometer זרימה עם מסננים מתאימים.
- עבור כימות של המספר הכולל של תאים לכל דגימת רקמה, השתמש חרוזים והיד עוד נטויה. לפני הרכישה, להוסיף חרוזים נפח / מספר לספור מומלץ צינור אחד.
6. פיצויים, Gating, נורמליזציה, וטיפים
- פיצויים gating
- הפעילו צינורות שליטה מוכתמים בלא כתם היחידים לפיצוי להתאים עבור חפיפה ספקטרלית.
הערה: שימוש פיצוי חרוזים ולא שולט פיצוי מבוסס תאים יש צורך במקרים בם את האנטיגן של עניין או אוכלוסיית תאים במדגם נמצא ברמות נמוכות כך פיצוי באמצעות תא יהיה קשה. כן, יש לציין, כאשר באמצעות צבעים טנדם, רצוי להכין פיצויים עבור כל ניסוי מאז צבעי בד בבד להשתנות הרבה-אל-הרבה ועם כל יום. - הפעל קרינה מינוס אחד שולט (FMOs) עבור כל fluorophores בלוח בעת הפעלת ניסוי ססגוניות חדש.
הערה: פקדי FMO הם דגימות המכילות את כל הנוגדנים בלוח למעט אחד. בקרות אלה להתיר אפליה מדויקת של חיובים לעומת אותות שליליים על הנוגדן נמנע adjus כראויt השערים. בקרות אלה חשובות במיוחד כאשר רמות הביטוי נמוכות או כאשר ההפרדה של אוכלוסיית היעד היא עניה (למשל, כאשר היעד הוא ציטוקין או גורם שעתוק). אמנם לא תמיד הכרחי, במקרים מסוימים, שולטת אלוטיפ עשוי להיות מועדף במקום FMO שולטת כפי שהם מספקים פיצוי הולם עבור אלוטיפ נוגדן המצומד fluorophore ללא הספציפיות של אנטיגן. - הגדר את השער העיקרי: התאמת אזור פיזור קדימה (FSC-A) ושטח פיזור צד (SSC-A) מתח כדי לזהות את האוכלוסייה לויקוציטים.
- אל תכלול את התאים המתים.
הערה: כתם הכדאיות מגיב עם אמינים חינם נוכח משני פני השטח ואת הפנים של התאים. בניגוד לחיות תאים, תאים מתים (עם ממברנות שנפרצו) לאפשר לצבוע להיכנס לתוך הציטופלסמה, הגדלת כמות תיוג חלבון. לכן, תאים מתים יהיו בהירים יותר תאי חיים המאפשרים אפליה קלה. שער על החיתאים.
הערה: את הכדאיות של מתלי תא מאבי עורק ואת הכליות עשויה להיות נמוכה יותר את הכדאיות של מתלי התא מן הבלוטות הלימפה עקב צעד עיכול הנוסף. - פינת העלילה קדימה פיזור (FSC-A) [ציר y] ו גובה פיזור קדימה (FSC-H) [ציר x]. Singlets להופיע בתור באלכסון על עלילת נקודה זו. שער על אלכסוני זה להוציא כפילויות. ואז העלילה SSC-A [ציר y] ו CD45 [ציר x].
- אוכלוסיית CD45 + לויקוציטים ניתן לזהות בקלות. שער על אוכלוסייה זו. ניתן לזהות אוכלוסיות לאחר מקרב אוכלוסייה זו.
- הפעילו צינורות שליטה מוכתמים בלא כתם היחידים לפיצוי להתאים עבור חפיפה ספקטרלית.
- נורמליזציה של ספירת תאים
- יש חרוזי ספירת מאפיינים לגרום SSC FSC הגבוה הנמוך. לדוגמה, אם 50,000 חרוזים מתווספים לתוך 300 μl של ההשעיה תא בודד, המשוואה לחישוב המספר המוחלט של כל סוג תא לתת לכל צינור הוא כדלקמן:
מספר התאים pאה צינור = (50,000 / מספר החרוזים נספרו על ידי cytometer את הזרימה) x מספר התאים הספרתיים.
באמצעות חישוב זה, המספר המוחלט של כל סוג תא נתון לכל צינור ניתן לקבוע. בהתבסס על כמה צינורות נבעו כל איבר, מספר תאים לכל איבר ניתן לחשב.
הערה: שמור את כל התאים ריאגנטים על 4 מעלות צלזיוס במהלך הפרוטוקול. הימנע vortexing נמרץ כי זה יכול לגרום נזק לתאים. השתמש כוחות מינימאליים עד גלולת התאים. הימנע עושה בועות בצינור FACS שכן הוא יכול לזרז מוות של תאים. אל תתנו הכדורים להתייבש בכל עת.
- יש חרוזי ספירת מאפיינים לגרום SSC FSC הגבוה הנמוך. לדוגמה, אם 50,000 חרוזים מתווספים לתוך 300 μl של ההשעיה תא בודד, המשוואה לחישוב המספר המוחלט של כל סוג תא לתת לכל צינור הוא כדלקמן:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפרוטוקול מתואר היתרים לזיהוי סמני משטח ו תאי בתאי T שבודדו כליות בעכברים, אב עורקים ובלוטות לימפה ניקוז אב עורקים במודל של יתר לחץ דם אנגיוטנסין II מושרה. תוצאות נציג מוצגים להלן.
איור 1 מדגים את אסטרטגית gating המשמשת לזיהוי אוכלוסיית תא T ב השעית תא בודדת המוכנה מן האאורטה של עכבר WT חדורי אנגיוטנסין II לגרום ליתר לחץ דם. אסטרטגיה דומה משמשת בלוטות הכליות והלימפה. אזור פיזור קדימה (FSC-A) ושטח פיזור צד (SSC-A) מתח הותאם כדי לזהות את האוכלוסייה לויקוציטים (G1), ובו בזמן למנוע פסולת. תאי החיים (G2) הם שליליים עבור הסמן הכדאי מצומדות עם כחול פסיפיק. תאי חיים היו מגודרים ואילך גובה פיזור קדימה (FSC-H) ושטח פיזור קדימה (FSC-A) לשער רק עלאוכלוסיית גופייה (G3). לויקוציטים אז נבחרו על ידי gating על-A SSC ו CD45 (G4). CD45 הוא מצומדות עם AmCyan בדוגמה זו. לבסוף, תאי T הם מגודרים כמו אוכלוסיית CD45 + CD3 + (G5). CD3 הוא מצומדות עם PerCP-Cy5.5 בדוגמה זו.
כדי לקבוע את הנוכחות של IL-17A ו- IL-17 ו בייצור תאי T בתוך הכליה בעכברים ואבי העורקים במודל זה, השעיות תא בודד היו מוכתמים עבור IL-17A ו- IL-17 ו. איור 2 מדגים הקרינה מינוס אחד שולט (FMOs) IL-17A ו- IL-17 ו מכתים במדגם כליות (מצומדות עם FITC ו APC, בהתאמה). בקרות FMO הן דגימות המכילות את כל הנוגדנים בפנל למעט אחד. כצפוי, מעט מאוד תאים חיוביים עבור IL-17A (איור 2 א) או IL-17 ו (תרשים 2B) בבקרה FMO. בקרות אלה להתיר אפליה מדויקת של איתותים חיוביות לעומת שליליים adj כראויust השערים לזהות את התאים חיוביים עבור IL-17A או IL-17 ו בדגימות הניסוי.
איור 3 מספק דוגמא מכתימה התאי של תאי T מבודדים כליות (איור 3 א) ואב עורקים (איור 3 ב) של עכברי WT חדורים עם רכב (Sham) או אנגיוטנסין II (אנג שנייה). ואכן, קבוצת משנה של תאי T המבטאים IL-17A או IL-17 ו ניתן להבחין בשתי רקמות במודל זה.
איור 4 מדגים מכתים תאיים של תאי T בתוך בלוטות הלימפה לנקז אבי העורקים במודל זה (איור 4 א). תאי CD8 + T היו מגודרים ראשון (איור 4 ב). לאחר מכן, הביטוי של שני סמנים Tc1, ציטוקינים IFNγ או שעתוק גורם T-הימור, כומתו מן משנה תא CD8 + T. איור 4C ממחיש את FMOs עבור IFN47; והכתים T-הימור בדגימות בלוטת לימפה (מצומדות עם FITC ו- PE-Cy7, בהתאמה). איור 4D עולה כי בלוטות הלימפה לנקז אבי העורקים של עכברים WT חדורי אנגיוטנסין II, אוכלוסייה של CD8 + IFNγ + ו- CD8 + T-הימור + תאים ניתן לזהות.
איור 1: Cytometry זרימת אסטרטגית gating לזהות תאי T. לויקוציטים הם מגודרים ראשונים על פיזור פיזור / צד קדימה (FSC-A / SSC-A) עלילת נקודה (G1), ו תאי חיים נבחרים (G2). התאים אז מגודרים על singlets (FSC-A / FSC-H) (G3). תאי G3 מאופיינים עוד יותר על ידי ביטוי CD45 (G4). לבסוף, תאי T הם מגודרים על CD45 + CD3 + תאים חיוביים כפולים (G5). ההשעיה תא בודד זה הוכן מאבי העורקים כולו מבודד סוג בר (WT) העכבר חדורי angiot ensin השנייה כדי לגרום ליתר לחץ דם. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הקרינה מינוס בקרות אחד (FMO) IL-17A ו- IL-17 ו. (א) השעית תא בודדת המבודדת מדגימת כליות בעכברים שטופלה אנגיוטנסין II הוכתמה באמצעות סמן כדאי fixable (פסיפיק בלו), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) ו- IL-17 ו (APC). הנוגדן עבור IL-17A הושמט כדי לקבוע את gating הראוי IL-17A. (ב) השעית תא בודדת המבודדת מדגימת כליות בעכברים שטופלה אנגיוטנסין II הוכתמה באמצעות סמן כדאי fixable (פסיפיק בלו), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) ו- IL-17 א (FITC). במקרה זה, הנוגדן עבור IL-17 ו הושמט.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מכתים תאי של תאי T מבודדים כליות ואב עורקים בעכברים עבור IL-17A ו- IL-17 ו. Cytometry זרימה נקודה מגרשים מראה IL-17A וביטוי-17 ו IL בתאי T מ כליות (א) ואבי העורקים (B) מעכברים WT חדורים עם הרכב (Sham) או אנגיוטנסין II (אנג II) מגודרת בעבר על CD45 + CD3 + תאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מכתים תאי של תאי T שעות מבודד בלוטות הלימפה Murine ניקוז אבי העורקים. (א) הופעות מקרוסקופית של שתי בלוטות הלימפה המותני אבי העורקים ניקוז בתוך העכבר WT. (ב) תזרים נציג cytometry מגרשים נקודה של CD4 + ו- CD8 + T תאים מבודדים מארבע ניקוז בלוטות הלימפה אבי העורקים מבודד עכבר WT חדורי אנגיוטנסין II לנשלטים בעבר על CD45 + CD3 + תאים. (ג) השעית תא בודדת מבודדות בלוטות הלימפה הוכתמה באמצעות סמן כדאי (פסיפיק בלו), CD3 (PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7), ו CD8 (APC). בקרות FMO מוצגות שבו הנוגדן עבור IFNγ (FITC) או T-הימור (PE-Cy7) הושמט כדי לקבוע את gating הנכונה. (ד) זרימת cytometry dot מגרשים הוכחת IFNγ חיובית וביטוי T-הימור בתוך תאי T בלוטת לימפה CD8 + באמצעות השערים שקבע בקרות FMO."Target =" g _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MSM הוא נתמך על ידי מענק מטעם לב וכלי דם מדעי גלעד.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס אחוות איגוד הלב האמריקני (16POST29950007) כדי FL, מענק מערך ההדרכה של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH T32 HL069765) כדי BLD, פרס אחוות איגוד הלב האמריקני (14POST20420025) כדי MA סאלח, וכן NIH פרס K08 (HL121671) כדי MSM. MSM נתמכת גם על ידי מענק מחקר מן Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
