Summary
Den här artikeln innehåller detaljerad metod för att identifiera och kvantifiera funktionella T-lymfocyter delmängder finns inom mus njure, aorta och lymfkörtlar genom intracellulär färgning och flödescytometri. Modellen av angiotensin II hypertoni valdes för att förklara, steg-för-steg, förfaranden och grundläggande principer för flödescytometri och intracellulär färgning.
Introduction
Nya bevis visar att det adaptiva immunsystemet, särskilt T-lymfocyter, spelar en avgörande roll i utvecklingen av flera kardiovaskulära sjukdomar 1,2,3,4,5. Till exempel, i modellen av angiotensin Il-inducerad hypertoni, en ackumulering av T-celler i kärlen och njurar från möss har beskrivits 6. Den vaskulära ansamling är främst i adventitia och perivaskulära fett. I njuren, T-celler ackumulerar i både märgen och njurbarken. Beroende på vilken undergrupp är involverad, är dessa T-celler ger upphov till olika cytokiner som kan påverka kärl- och njurfunktionen och leder till utveckling av patologi (översikt av McMaster et al. 6).
CD4 + T-hjälparce lymfocyter kan indelas i flera undergrupper: T-hjälparce 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, T regulatoriska (Treg) celler, och T follikulära hjälpar (TFH) celler baserat på deras funktioner och signatur cytokines 7. På samma sätt kan CD8 + cytotoxiska T-celler klassificeras som TC1, TC2 Tc17 eller TC9 8. Det finns också dubbelnegativa T-celler (dvs celler som inte uttrycker CD4 och CD8 T-cellmarkörer). En undergrupp av dessa celler har en alternativ gamma delta T-cellreceptorn (i stället för de klassiska alfa- och beta-receptorer) och därför hänvisas till som gamma delta-T-celler. Multiparameteranalys med flödescytometri av ytmarkör, cytokin och transkriptionsfaktor utgör det bästa sättet att identifiera dessa celler. Även om denna metod används i stor utsträckning inom området för immunologi, är det mindre väl beskrivna i fasta organ och i fastställandet av kardiovaskulära sjukdomar.
Historiskt sett var identifieringen av lymfocyter i vävnader begränsad till immunohistokemi eller RT-PCR-metoder. Även immunohistokemi och immunofluorescens är kraftfulla metoder för att bestämma vävnadsfördelningen av ett antigen av interest, de är otillräckliga för att fenotypiskt identifiera undergrupper är inblandade. Dessutom medan RT-PCR-analys är användbar för att detektera mRNA-expression av antigener, cytokiner eller transkriptionsfaktorer, det tillåter inte detektion av multipla proteiner samtidigt på nivån för enskilda celler.
Tillkomsten av flödescytometri, särskilt i kombination med intracellulär färgning att upptäcka cytokiner och transkriptionsfaktorer, ger utredarna med en kraftfull teknik som möjliggör identifiering och kvantifiering på enskild cellnivå av immuncellundergrupper i fasta organ. Vi har optimerat en intracellulär färgning analys för att identifiera med flödescytometri de stora T-cell-underuppsättningar som finns inom murint njure, aorta och aorta dränerande lymfkörtlar i en modell av angiotensin Il-inducerad hypertoni. Optimeringen av varje steg: vävnad matsmältningen, ex vivo aktivering, permeabilization och yta och intracellulär färgning resulterar i en mycket reproducerbar analys som kan tillämpas på andra modeller kardiovaskulära och njursjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vanderbilt University Institutional Animal Care och användning kommittén har godkänt de förfaranden som beskrivs häri. Möss är inrymt och vårdas i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur (National Academies Press. Reviderade 2010).
1. Isolering av aorta dränerande lymfkörtlarna, Kidney och Aorta från möss
- Euthanize möss genom CO 2 inandning. Spraya bröstet med 70% etanol och öppna försiktigt huden och bröstväggen med en sax för att exponera hjärtat.
- Att perfundera vaskulaturen, utför ett litet snitt i det högra förmaket och stadigt injicera minst 10 ml kall PBS (ca 1 ml / sek) i spetsen av den vänstra ventrikeln med användning av en 21 eller 23 G-nål. BEGJUTA tills alla organ har blancheras. Hjärtat blanches först. Blanche av levern indikerar att perfusion har väl utfört.
- Med små pincett och fina saxar, försiktigt skära bort och dra ut tarmarna,mage, mjälte, bukspottkörtel och lever för att bättre visualisera aorta.
OBS: Detta steg måste göras mycket exakt som skador på mag-tarmkanalen kan framkalla förorening. - Klipp ut och ta bort varje lunga med sax. Skölj brösthålan med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med användning av en nållös spruta. Ta bort överflödigt blod och vätska med steril gasbinda.
- Ta bort de abdominal aortic dränerande lymfkörtlar med fin dissekera pincett. Se till att inte spräcka kapseln. Avlägsna kvarvarande fett på ytan av varje lymfkörtel med dissekera pincett. Klipp ut båda njurarna med fina saxar.
- Dissekera hela aorta (bröstkorg och bukaorta) med fina, böjd sax. Börja vid nivån för hjärtat och noggrant dissekera bort från matstrupen och kotorna ner till nivån för höftbifurkationen och se till att hålla den omgivande perivaskulära fett fäst till aortan.
OBS: Ytterligare dissektion av aorta Remove omgivande strukturer kan göras under ett mikroskop. Specifikt bort arteriella grenarna (halspulsåder, subclavia artärer, celiac, mesenteriska, och njurartärerna) och lymfkörtlar. Ska hålla en konsekvent lager av perivaskulär fett runt varje aorta eftersom det är en plats där många inflammatoriska celler bor i fastställandet av högt blodtryck. Placera varje vävnad i separata rör innehållande kall PBS.
2. Framställning av Enkelcellsuspensioner från varje vävnad
- njur~~POS=TRUNC
OBS: Njuren kan dissocieras till en enkelcellsuspension genom att kombinera mekanisk dissociation plus enzymatisk digestion.- Förbereda njuren uppslutningslösningen genom tillsats av kollagenas D (2 mg / ml) och DNas I (100 | j, g / ml) till RPMI 1640-medium (kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS)). Förbered 10 ml per njure prov.
- Använd pincett för att överföra båda njurarna i en dissociation rör innehållande 10 ml njure smältajonlösning.
- Utför mekanisk dissociation med hjälp av en halvautomatisk dissociator anordningen enligt tillverkarens anvisningar.
- Efter mekanisk dissociation, lossa slangen från enheten och utföra den enzymatiska nedbrytning. Inkubera proverna under 20 min vid 37 ° C under kontinuerlig rotation. Omedelbart stoppa den enzymatiska digestion genom tillsats av kallt RPMI 1640-medium kompletterat med 5% FBS.
- Överför lösningen genom pipettering in i ett 50 ml koniskt rör efter filtrering genom ett 40 | j, m sil. Retas den återstående vävnaden isär genom pressning med kolven i en 1 ml spruta. Pellets cellerna (500 xg, 8 min, 4 ° C).
- Resuspendera pelleten i 3 ml 36% densitetsgradientcentrifugering media. Överför suspensionen till ett 15 ml koniskt rör. Försiktigt tillsätt 3 ml 72% densitetsgradientcentrifugering media under cellsuspensionen 3 ml 36% utan avbrott. Centrifug (1000 x g utan broms, 20 min, 4 ° C). </ Li>
- Immuncellerna kommer att vara placerad vid gränsytan. Ta bort det översta gulaktigt skikt innehållande cellrester och sedan bringa volymen upp till 15 ml med hjälp av kall PBS. Skaka väl att bryta gradienten. Snurra cellerna (300 xg, 8 min, 4 ° C) och återsuspendera pelleten i 3 ml RPMI med 5% FBS. Räkna antalet levande celler på en hemocytometer med användning av trypanblått uteslutning.
- aorta
- Förbereda aorta uppslutningslösningen genom tillsats av kollagenas A (1 mg / ml), kollagenas B (1 mg / ml), och DNas I (100 | j, g / ml) till RPMI 1640-medium (kompletterat med 5% FBS).
- Med fin pincett, överföra aorta i en 2 ml rör innehållande 1 ml av aorta matsmältningen lösning. Finhacka hela aorta i mycket små bitar med fina saxar i en ml uppslutningslösningen. Håll på is. Inkubera proverna under 30 min vid 37 ° C under kontinuerlig rotation.
- Överför lösningen till en vävnadsodlingsskål och stoppa enzymatic digestion genom tillsats av 5 gånger volymen av kall RPMI med 5% FBS.
- Överför lösningen genom pipettering in i ett 50 ml koniskt rör efter filtrering genom ett 40 | j, m sil. Retas kvarvarande vävnaden sönder i en enkelcellsuspension genom att trycka med kolven av en 1 ml spruta. Spola silen och pellets cellerna (300 xg, 8 min, 4 ° C).
- Tvätta pelleten genom att tillsätta 10 ml av RPMI med 5% FBS. Snurra cellerna (300 xg, 8 min, 4 ° C) och återsuspendera pelleten i 3 ml RPMI med 5% FBS. Räkna antalet levande celler på en hemocytometer med användning av trypanblått uteslutning.
- Aorta dränerande lymfkörtlar
- Placera en 40 | j, m sil i en vävnadsodlingsskål (60 mm x 15 mm). Placera lymfkörtlarna på silen och reta dem isär i en enkelcellsuspension genom att trycka med kolven av en 1 ml spruta. Spola silen med 2 ml av RPMI med 5% FBS. Samla upp cellerna i skålen.
- Överföracellerna i en 15 ml Falcon-rör och pellets cellerna (300 xg, 8 min, 4 ° C). Återsuspendera pelleten i 500 | il RPMI med 5% FBS. Räkna antalet levande celler på en hemocytometer med användning av trypanblått uteslutning.
3. Ex vivo stimulering för Cytokine Detection med flödescytometri
- Förbereda cellodlingsmedia: RPMI med 5% FBS, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 50 | iM β-merkaptoetanol och 1% penicillin / streptomycin.
- Centrifugera varje cellsuspension som erhållits från njure, aorta och lymfkörtlar (300 xg, 8 min, 4 ° C). Återsuspendera varje pellet med cellodlingsmediet vid en koncentration av 1 x 10 6 celler per ml.
- Stimulera celler genom att tillsätta 2 pl av cellaktivering cocktail (innehållande forbol-12-myristat-13-acetat (PMA), kalcium jonofor ionomycin och Golgi-hämmaren Brefeldin A) för varje 1 ml cellkultur.
OBS: Den slutliga koncentrationens av varje komponent är: 81 nM PMA, 1,33 | iM av jonomycin och 5 | ig / ml av Brefeldin A. Behandling med PMA och jonomycin aktiverar celler att producera cytokiner. Cytokiner är utsöndrade proteiner som måste fångas i cellerna som skall detekteras. Brefeldin A orsakar ansamling av normalt utsöndrade proteiner i det endoplasmatiska nätverket och Golgi-apparaten. Således, den teknik som beskrivs här ökar detekterbarheten av cytokin-producerande lymfocyter genom flödescytometri. - Plattan 1 till 2 miljoner celler i en 12-brunnars (aorta eller njur) eller 24-brunn (lymfkörtel) med låg vidhäftningsplattor. Placera plattan i en 37 ° C fuktad CO2 inkubator under 3 timmar.
OBS: Antalet strukna cellerna kan vara lägre i lymfkörtlar från kontrollmöss. Dessutom har tiden för stimulans för att bestämmas empiriskt för varje cellpopulation och cytokin studeras. I fallet med T-celler som isolerats från aorta, njure eller lymfkörtlar, rekommenderar vi stimulerande för 3-4 timmar. En längre stimulering wsjuk inte öka cytokinutsöndring och kommer att leda till en ytterligare nedreglering av flera T-cellytan markörer som CD3, CD4 och CD8. (Observera att även en 3-4 tim stimulans kommer att framkalla någon nedreglering av dessa markörer.)
4. ytfärgning
- Överföra celler till en polystyren FACS-rör och centrifugera (300 xg, 8 min, 4 ° C). Tvätta cellerna två gånger med FACS-buffert (Ca2 + och Mg + fri PBS innehållande 4% FBS och 2 mM EDTA) och delar upp cellsuspensionen lika i olika FACS rör baserade på antalet paneler antikropps önskade och antalet kontrollrör som behövs ( se nedan).
- För att utföra ersättning för varje panel, förbereda ofärgade kontrollrören och enskilda färgade rör för varje vävnadstyp och antikroppspanel. Dessutom förbereder fluorescens minus ett (FMO) kontrollrör för varje antikropp panel genom att lägga till alla utom en av antikropparna.
- Justera volymen på varje rör till 2 ml med FACSBuffert. Centrifugera cellsuspensionen (300 xg, 8 min, 4 ° C), avlägsna supernatanten och blockera Fc-receptorer genom inkubering av cellerna med 0,5 | j, g av anti-CD16 / CD32-antikroppar per miljon celler under 10 min på is.
OBS: CD16 är låg affinitet IgG Fc-receptor III (FcR III) och CD32 är FcR II. CD16 / CD32 uttrycks på granulocyter, mastceller, monocyter / makrofager, naturliga mördarceller, B-celler, dendritiska celler och vissa aktiverade mogna T-celler. - Utföra viabilitetsfärgning: Tvätta cellerna med 1 x PBS, centrifug (300 xg, 8 min, 4 ° C) och återsuspendera i 1000 ^ il 1 x PBS. Tillsätt 1 pl av en cell-impermeant amin-reaktivt färgämne (viabilitet fläck). Inkubera i 15 minuter vid 4 ° C skyddade från ljus.
- Under inkubationen, förbereda cocktail av antikroppar (för ytfärgning) i en lämplig volym av FACS-buffert. Tvätta cellerna två gånger med 1-2 ml FACS-buffert, centrifugera (300 xg, 8 min, 4 ° C) och återsuspendera varje pellet med 100 plav blandningen antikropp. Inkubera i 30 min vid 4 ° C, skyddat från ljus.
OBS: För varje flödescytometri antikropp är det lämpligt att bestämma den optimala mängden av antikropp som behövs genom att utföra en dostitrering kurva. - Tvätta cellerna två gånger med 2 ml FACS-buffert och pelletera cellerna (300 xg, 8 min, 4 ° C).
5. Fixering, Permeabilization och intracellulär färgning
- Utför intracellulär färgning med en fixering och permeabilisering kit innehållande lämpliga buffertar genom att följa tillverkarens instruktioner. Fixa och permeabilisering av cellerna genom att återsuspendera dem i lämplig buffert. Inkubera prov i 40 minuter vid 4 ° C skyddade från ljus.
- Tillsätt 1 ml 1x permeabilisering och tvättbuffert direkt till de fasta och permeabiliserade celler. Centrifug (500 xg, 8 min, 4 ° C) och avlägsna supernatanten. Resuspendera pelleten med 2 ml 1x tvättbuffert.
- Förbered blandningar av AntibOdies (för endast intracellulär färgning) i en lämplig volym av 1x tvättbuffert (vanligen 100 ^ per rör).
OBSERVERA: Såsom beskrivits ovan behöver den optimala antikroppskoncentration som skall bestämmas för varje antikropp i panelen. Till exempel, för antikroppar mot IL-17A eller IL-17F, använder vi en utspädningsfaktor på 1:30, men för antikroppar mot IFNy och T-bet, använder vi en utspädningsfaktor på 1: 100. - Centrifugera cellerna (500 xg, 8 min, 4 ° C) och återsuspendera varje pellet med 100 pl av antikroppblandningen. Inkubera i 40 minuter vid 4 ° C skyddade från ljus.
- Tvätta cellerna två gånger med 2 ml 1x tvättbuffert och pelletera cellerna (500 xg, 8 min, 4 ° C). Suspendera pelleten med 300 ul av 1 x tvättbuffert och analysera på en flödescytometer med lämpliga filter.
- För kvantifiering av det totala antalet celler per vävnadsprov, använda räknings pärlor. Före förvärvet, tillsätt den rekommenderade volymen / antal räkna pärlor till varje rör.
6. Kompensation, slussning, normalisering och tips
- Ersättning och grind
- Kör ofärgade och enkla färgade kontrollrör för ersättning till justera för spektral överlappning.
OBS: Användning av ersättnings pärlor snarare än cellbaserade kontroller ersättning är nödvändig i fall där antigenet av intresse eller cellpopulation i ett prov är närvarande vid så låga nivåer som kompensation användning av celler kommer att bli svårt. Värt att notera, vid användning av tandem färgämnen, är det lämpligt att förbereda ersättningar för varje experiment eftersom tandem färgämnen varierar mycket till parti och med varje dag. - Kör fluorescens minus en kontroller (FMO) för alla fluoroforer i panelen när du startar en ny multi experiment.
OBS! FMO kontrollerna är prover som innehåller alla antikropparna i panelen utom en. Dessa kontroller medger noggrann diskriminering av positiva kontra negativa signaler för den utelämnade antikropp att korrekt justert grindarna. Dessa kontroller är särskilt viktigt när uttrycksnivåerna är låga eller när separationen av målgruppen är dålig (till exempel, när målet är en cytokin eller transkriptionsfaktor). Även om det inte alltid är nödvändigt i vissa fall, isotypkontrollerna kan vara att föredra i stället för FMO kontroller eftersom de ger en korrekt ersättning för antikroppen isotyp och fluoroforen konjugat utan specificiteten av antigenet. - Ställ in den primära porten: justera Forward Scatter Area (FSC-A) och sidospridning Area (SSC-A) spänning för att detektera leukocytpopulationen.
- Uteslut de döda cellerna.
OBS! Bärkraft fläcken reagerar med fria aminer närvarande på både ytan och det inre av cellerna. I motsats till levande celler, döda celler (med komprometterade membran) tillåta färgämnet att träda in i cytoplasman, vilket ökar mängden av proteinmärkning. Således kommer döda celler vara ljusare än levande celler möjliggör enkel diskriminering. Grind på levandeceller.
OBS: Viabiliteten hos cellsuspensioner från aorta och njurarna kan vara lägre än viabiliteten hos cellsuspension från lymfkörtlarna på grund av den ytterligare uppslutningssteget. - Plot Forward Scatter Area (FSC-A) [y-axel] och Forward Scatter Höjd (FSC-H) [x-axeln]. Sing visas som en diagonal på denna punktdiagram. Gate på denna diagonal att utesluta dubbletter. rita sedan SSC-A [y-axel] och CD45 [x-axeln].
- CD45 + leukocyter befolkningen kan lätt identifieras. Gate på denna patientgrupp. Efterföljande populationer kan identifieras från denna population.
- Kör ofärgade och enkla färgade kontrollrör för ersättning till justera för spektral överlappning.
- Normalisering av cellräkningar
- Räkna pärlor har egenskaper som resulterar i lågt FSC och hög SSC. Till exempel, om 50.000 pärlor tillsätts i 300 fil av enkelcellsuspension, ekvationen för beräkning av det absoluta antalet av någon ge celltyp per rör är som följer:
Antal celler per rör = (50000 / antalet kulor räknas av flödescytometern) x antal celler räknade.
Med användning av denna beräkning, kan det absoluta antalet av någon given celltyp per rör bestämmas. Baserat på hur många rör genererades från varje organ, kan antalet celler per organ beräknas.
OBS: Se till att alla celler och reagens vid 4 ° C under protokollet. Undvik kraftig virvelbildning, eftersom det kan skada celler. Använd minimala krafter för att pelletera cellerna. Undvik att bubblor i FACS röret eftersom det kan fälla celldöd. Låt inte pellets torka ut när som helst.
- Räkna pärlor har egenskaper som resulterar i lågt FSC och hög SSC. Till exempel, om 50.000 pärlor tillsätts i 300 fil av enkelcellsuspension, ekvationen för beräkning av det absoluta antalet av någon ge celltyp per rör är som följer:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det protokoll som beskrivits medger identifiering av yt- och intracellulära markörer i T-celler som isolerats från murina njure, aorta och aorta dränerande lymfkörtlar i en modell av angiotensin Il-inducerad hypertoni. Representativa resultat presenteras nedan.
Figur 1 visar gating strategi som används för att identifiera T-cellpopulationen i en enkelcellsuspension framställd från aorta av en WT mus infunderas med angiotensin II för att inducera hypertoni. En liknande strategi används i njurarna och lymfkörtlar. Forward Scatter Area (FSC-A) och sidospridning Area (SSC-A) spänningen justerades för att detektera leukocytpopulationen (G1) och för att utesluta skräp. De levande celler (G2) är negativa för livskraft markör konjugerad med Pacific blå. Levande celler sedan gated på Forward Scatter Höjd (FSC-H) och Forward Scatter Area (FSC-A) till gate endast påsing befolkningen (G3). Leukocyter selekterades sedan genom grind på SSC-A och CD45 (G4). CD45 är konjugerad med AmCyan i detta exempel. Slutligen är T-celler gated som CD45 + CD3 + population (G5). CD3 är konjugerad med PerCP-Cy5.5 i detta exempel.
För att bestämma närvaron av IL-17A och IL-17F producerande T-celler inom murint njure och aorta i denna modell ades enskilda cellsuspensioner färgades för IL-17A och IL-17F. Figur 2 visar fluorescens minus en kontroller (FMO) för IL-17A och IL-17F färgning i en njure prov (konjugerad med FITC och APC, respektive). FMO kontroller är prover som innehåller alla antikroppar i en panel med undantag för en. Som förväntat, mycket få celler är positiva för IL-17A (figur 2A) eller IL-17F (Figur 2B) i FMO kontrollerna. Dessa kontroller medger noggrann diskriminering av positiva kontra negativa signaler till ordentligt adjUST portarna för att identifiera cellerna positiva för IL-17A eller IL-17F i experimentella prover.
Figur 3 ger ett exempel på intracellulär färgning av T-celler som isolerats från njure (figur 3A) och aorta (figur 3B) av WT möss infunderade med vehikel (Sham) eller angiotensin II (Ang II). I själva verket kan en delmängd av T-celler som uttrycker IL-17A eller IL-17F detekteras i båda vävnaderna i denna modell.
Figur 4 illustrerar intracellulär färgning av T-celler inom de aorta dränerande lymfkörtlar i denna modell (figur 4A). CD8 + T-cellerna först gated (Figur 4B). Därefter uttrycket av två TC1 markörer, cytokinen IFNy eller transkriptionsfaktorn T-bet, kvantifierades från cellunderuppsättning CD8 + T. Figur 4C illustrerar FMO för IFN47; och T-bet färgning i lymfkörtelprover (konjugerad med FITC och PE-Cy7, respektive). Figur 4D visar att i aorta dränerande lymfknutor WT möss infunderas med angiotensin II, kan en population av CD8 + IFNy + och CD8 + T-bet + celler identifieras.
Figur 1: Flödescytometri grind strategi för att identifiera T-celler. Leukocyter först gated på en framåtspridning / sidospridning (FSC-A / SSC-A) punktdiagram (G1) och levande celler selekteras (G2). Cellerna sedan gated på sing (FSC-A / FSC-H) (G3). Celler från G3 kännetecknas vidare av uttrycket av CD45 (G4). Slutligen T-celler gated på CD45 + CD3 + dubbla positiva celler (G5). Denna enkelcellsuspension framställdes från hela aorta isolerad från en vildtyp (WT) mus infunderas med angiot ensin II för att inducera hypertoni. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fluorescence minus en kontroller (FMO) för IL-17A och IL-17F. (A) En enda cellsuspension isoleras från en angiotensin II behandlade mus njure prov färgades med användning av en fastställbara livskraft markör (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) och IL-17F (APC). Antikroppen för IL-17A utelämnades för att bestämma den rätta grind för IL-17A. (B) En enda cellsuspension isoleras från en angiotensin II behandlade mus njure prov färgades med användning av en fastställbara livskraft markör (Pacific Blue), CD45 (AmCyan), CD3 (PerCP-Cy5.5) och IL-17A (FITC). I detta fall antikroppen för IL-17F utelämnas.urce.jove.com/files/ftp_upload/55266/55266fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Intracellulär färgning av T-celler som isolerats från mus njure och aorta för IL-17A och IL-17F. Flödescytometri dot grafer som visar IL-17A och IL-17F-expression i T-celler från njure (A) och aorta (B) från WT möss infunderade med vehikel (Sham) eller angiotensin II (Ang II) och tidigare gated på CD45 + CD3 + celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Intracellulär färgning av T-cell s isolerad från murina aorta dränerande lymfkörtlar. (A) Makroskopiska framträdanden av två ländryggen aorta dränerande lymfkörtlar i en WT mus. (B) Representativa flödescytometri punktdiagram av CD4 + och CD8 + T-celler isolerade från fyra aorta dränerande lymfkörtlar isolerade från en WT mus infunderas med angiotensin II och tidigare gated på CD45 + CD3 + celler. (C) En enda cellsuspension isoleras från lymfkörtlar färgades med hjälp av en lönsamhets markör (Pacific Blue), CD3 (PerCP-Cy5.5), CD4 (APC-Cy7), och CD8 (APC). FMO kontroller visas i vilken antikroppen för IFNy (FITC) eller T-bet (PE-Cy7) uteslöts för att bestämma den rätta gating. (D) Flödescytometri dot tomter visar positiv IFNy och T-bet-uttryck i CD8 + lymfkörtel T-celler genom att använda portarna bestäms av FMO kontrollerna.g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MSM stöds av ett bidrag från Gilead Cardiovascular Sciences.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en American Heart Association Fellowship Award (16POST29950007) till FL, en utbildningsstipendium från National Institutes of Health (NIH T32 HL069765) till BLD, en American Heart Association Fellowship Award (14POST20420025) MA Saleh, och en NIH K08 utmärkelse (HL121671) till MSM. MSM stöds också av ett forskningsbidrag från Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1x Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1x | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O'Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
