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Genetics

जीनोम एडिटिंग और hPSCs की निर्देशित भेदभाव मानव अग्नाशय विकास में वंश अवधारक पूछताछ के लिए

Published: March 5, 2017 doi: 10.3791/55267
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute
* These authors contributed equally

Summary

प्रोटोकॉल hPSC उत्परिवर्ती iCRISPR मंच का उपयोग कर लाइनों उत्पन्न करने के लिए और ग्लूकोज उत्तरदायी β-तरह की कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए वर्णित हैं। hPSC निर्देशित भेदभाव के साथ जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के संयोजन मानव विकास और रोग प्रगति में वंश निर्धारकों की भूमिका के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है।

Abstract

स्वयं renewing या मानव स्टेम कोशिकाओं फर्क (hPSCs) में पूछताछ जीन समारोह मानव विकास को समझने और एक थाली में रोग तंत्र विदारक की दिशा में एक बहुमूल्य मंच प्रदान करता है। इस संभावित आवेदन को भुनाने के लिए रोग से जुड़े जीन में hPSC म्यूटेंट, साथ ही इन विट्रो hPSC भेदभाव प्रोटोकॉल उत्पन्न करने के लिए रोग-प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं है कि निकट उनके vivo समकक्षों पुनरावृत्ति का उत्पादन करने के लिए कुशल जीनोम संपादन उपकरण की आवश्यकता है। ICRISPR नामित hPSCs के लिए एक कुशल जीनोम संपादन मंच AAVS1 लोकस में एक Cas9 अभिव्यक्ति कैसेट की TALEN की मध्यस्थता लक्ष्य-निर्धारण के माध्यम से विकसित किया गया है। इधर, inducible Cas9 hPSC एक रासायनिक परिभाषित मध्यम और एक फीडर मुक्त हालत में संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग कर लाइनों की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं। जीन पीटा या hPSCs में सटीक आनुवंशिक परिवर्तन के लिए iCRISPR प्रणाली का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रक्रिया है, या तो n के माध्यम सेपर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) या एक अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) टेम्पलेट का उपयोग कर सटीक न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन के माध्यम से, क्रमश: शामिल किए गए हैं। इन तकनीकी प्रक्रियाओं डिजाइन, उत्पादन का विवरण, और CRISPR गाइड आरएनए (gRNAs) के अभिकर्मक शामिल हैं; T7E1 या RFLP संसाधनों द्वारा CRISPR उत्परिवर्तन दर की माप; और स्थापना और प्रतिरूप उत्परिवर्ती लाइनों के मान्यकरण। अंत में, हम क्रॉनिकल विवो अग्नाशय भ्रूण के विकास में नकल उतार द्वारा ग्लूकोज उत्तरदायी अग्नाशय β-तरह की कोशिकाओं में hPSC भेदभाव के लिए प्रक्रियाओं। निर्देशित hPSC भेदभाव के साथ iCRISPR प्रौद्योगिकी का मेल अग्नाशय के विकास और मधुमेह रोग तंत्र के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए जीन समारोह का व्यवस्थित परीक्षा में सक्षम बनाता है।

Introduction

मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) करने की क्षमता है दोनों आत्म नवीकरण और तीन भ्रूण रोगाणु प्रजातियों के सभी डेरिवेटिव को जन्म दे। वे एक मानव विकास के संदर्भ में सेलुलर प्रक्रियाओं पुनरावृत्ति के लिए एक अनूठा मंच के रूप में सेवा करके सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करते हैं। उन्होंने यह भी स्केलेबल, उच्च throughput विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक कोशिकाओं का स्रोत रहे हैं। कुशल आनुवंशिक संशोधन उपकरणों की कमी है और एक संस्कृति डिश में जटिल भ्रूण विकास संबंधी कदम recapitulating में कठिनाई: हालांकि, प्रगति के कारण दो मुख्य चुनौतियों सीमित किया गया है।

आनुवंशिक संशोधन सामान्य विकास और रोग में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण है। हालांकि, जबकि शास्त्रीय जीन मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से दृष्टिकोण को लक्षित कर सिद्ध कर दिया है माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) में जीन समारोह काटना के लिए एक शक्तिशाली उपकरण 1, इस दृष्टिकोण होना करने के लिएजब hPSCs 2, 3 के लिए लागू बेहद अक्षम कर दिया गया है। प्रोग्राम, साइट विशेष प्रयोगशाला में प्रयोग करने के लिए प्रकृति से न्युक्लिअसिज़, जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS), और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CRISPR जुड़े सहित हाल के तेज परिग्रहण (कैस) सिस्टम 4, इसका मतलब है कि जीनोम इंजीनियरिंग जीवों और सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक बहुत आसान काम बन गया है hPSCs में भी शामिल है। ये जीन संपादन उपकरण तथ्य का लाभ लेने के लिए इस तरह के Cas9 endonuclease के रूप में chimeric न्युक्लिअसिज़ सक्रिय करने के लिए या तो गैर मुताबिक़, सटीक स्थानों पर डबल असहाय टूटता है (DSBs) उत्प्रेरण अंतर्जात डीएनए की मरम्मत मशीनरी ट्रिगर द्वारा आनुवंशिक संशोधन की एक पूरी श्रृंखला अनुमति कर सकते हैं कि अंत में शामिल होने के (NHEJ) या अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)। दोनों तंत्र eith उत्प्रेरण द्वारा आनुवंशिक हेरफेर के लिए शोषण किया जा सकता हैएर यादृच्छिक प्रविष्टि और विलोपन म्यूटेशन (indels; NHEJ के माध्यम से), frameshift उत्परिवर्तन है कि जीन alleles, या सटीक न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन (एचडीआर के माध्यम से) उठा देना बनाने के लिए, मानव रोग मॉडलिंग के लिए रोगी म्यूटेशन पुनरावृत्ति करने के लिए या जीन थेरेपी के लिए एक रोग के कारण उत्परिवर्तन सही करने के लिए ।

लगातार आरएनए निर्देशित Cas9 endonuclease डीएनए दरार और एक चर CRISPR आरएनए (crRNA) और ट्रांस-सक्रिय (tracrRNA) द्वैध के लिए आवश्यक है कि डीएनए लक्ष्य मान्यता निर्दिष्ट करता है: CRISPR / कैस की मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग के दो घटकों की आवश्यकता है। CrRNA / tracrRNA द्वैध एक भी कैमेरिक गाइड आरएनए (gRNA) है, जो और अधिक कुशलता से 5, 6, 7 काम मिल गया है के साथ बदला जा सकता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली सबसे प्रायोगिक जीवों और सेल लाइनों, वितरण और की Cas9 और gRNA काफी भिन्न होता है अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया है और जरूरत आगे achi करने के लिए अनुकूलित किया जानाhPSCs 8 सहित कई प्रणालियों, में पूर्व संध्या कुशल जीनोम संपादन। एक कुशल जीनोम संपादन मंच, iCRISPR, hPSCs 5 में स्थापित किया गया है। इस प्रणाली में, एक TALEN की मध्यस्थता दृष्टिकोण (TRE एक रिवर्स टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transactivator (M2rtTA) और एक टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व के साथ दूसरे के साथ पार, एक एलील में "ट्रांस्जीन सुरक्षित बंदरगाह ठिकाना" AAVS1 के दोनों alleles निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है ) hPSCs में Cas9 (iCas9 की अभिव्यक्ति) चला। स्थापित प्रतिरूप लाइनों (iCas9 hPSCs) में, Cas9 अत्यधिक डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के साथ व्यक्त किया है। इस बीच, अपने छोटे आकार की वजह से (100 NT), एकल या एकाधिक gRNAs आसानी से iCas9 hPSCs में उच्च दक्षता के साथ दिया जा सकता है और साइट विशेष दरार के लिए Cas9 प्रत्यक्ष कर सकते हैं, के रूप में एचडीआर की मध्यस्थता, कुशल NHEJ की मध्यस्थता जीन व्यवधान सक्षम करने के रूप में अच्छी तरह से लघु एकल असहाय डीएनए (ssDNA) दाता टेम्पलेट्स की उपस्थिति में सटीक न्यूक्लियोटाइड संशोधनों। iCRISPR प्रणाली हो सकता हैसफलतापूर्वक, 9 महत्वपूर्ण विकासात्मक जीन 5 में biallelic (homozygous या यौगिक विषमयुग्मजी) या विषमयुग्मजी नुकसान के समारोह के परिवर्तन के साथ रोग नकल उतार hPSC लाइनों के एक पैनल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया। जबकि समूहों की एक संख्या hPSCs में CRISPR / कैस का उपयोग कर कुशल जीन संपादन सूचना दी है, सफलता तकनीकी रूप से दक्ष प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या को सीमित रहता है। ICRISPR मंच अलग कौशल के स्तर के शोधकर्ताओं द्वारा दिनचर्या जीन संपादन के लिए एक कुशल अभी तक सरल समाधान प्रदान करता है, और यह पहले से ही हमारे समूह और दूसरों को 9, 10, 11, 12 के द्वारा प्रकाशित अध्ययन की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण भी दिया आगे dCas9-KRAB 13 की अभिव्यक्ति के आधार पर inducible मुंह बंद करने के लिए बढ़ा दिया गया है।

जीनोम संपादन तकनीकी में प्रगति के साथ-साथसना हुआ, महत्वपूर्ण सुधार भी hPSC रखरखाव और निर्देशित भेदभाव में हासिल किया गया है। HPSCs के लिए संस्कृति की स्थिति विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast (iMEF) फीडर पर निर्भर परिभाषित बाह्य मैट्रिक्स घटकों पर फीडर मुक्त परिस्थितियों को और जटिल मीडिया योगों से रासायनिक परिभाषित करने के लिए माध्यम की स्थिति 14 से विकसित किया है। इस तरह के सुधार iMEF तैयारी और नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट घटकों में बैच को बैच मतभेद के कारण hPSCs में परिवर्तनशीलता कम कर दिया है, और इस तरह hPSC भेदभाव के लिए एक अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वातावरण प्रदान करते हैं। इस बीच, उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग से मानव भ्रूण के विकास के शासी रास्ते, साथ ही खोजों संकेत का बेहतर ज्ञान, सुधार भेदभाव प्रोटोकॉल 15, 16, 17, 18 के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। इन प्रोटोकॉल और अधिक बारीकी से viv में नकलओ विकासात्मक कदम और सेल प्रकार है कि निकट उनके vivo समकक्षों पुनरावृत्ति उत्पन्न करते हैं। अग्नाशय के वंश में hPSC भेदभाव के लिए, प्रारंभिक प्रोटोकॉल जल्दी अग्नाशय विकास अपेक्षाकृत अच्छी तरह से लेकिन अंततः polyhormonal β कोशिकाओं है कि अपरिपक्व भ्रूण phenotypes के थे और ग्लूकोज उत्तेजना को खराब प्रतिक्रिया व्यक्त उत्पन्न मजाक उड़ाया। हाल की प्रगति 16, 17, 19, 20 ग्लूकोज उत्तरदायी अग्नाशय β कोशिकाओं की तरह है, जो हमें इस तरह के गठन और monohormonal β कोशिकाओं के आगे परिपक्वता के रूप में बाद की घटनाओं, जांच करने के लिए सक्षम हो जाएगा की पीढ़ी के लिए अनुमति दी है।

यहाँ, हम विस्तार से ग्लूकोज उत्तरदायी pancr की ओर hPSC आधारित इन विट्रो भेदभाव मंच के साथ iCRISPR प्रणाली के संयोजन से अग्नाशय के विकास के अध्ययन के लिए जीनोम संशोधित लाइनों के आवेदनeatic β कोशिकाओं की तरह। एक बेहतर hPSC भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ शक्तिशाली जीनोम संपादन उपकरण की इस युग्मन न केवल गति और पैमाने आवश्यक रोग करणीय मान्य करने के लिए बढ़ती मांग को पूरा करने के लिए प्रदान करता है, लेकिन यह भी सामान्य विकास और रोग 9 अंतर्निहित transcriptional नियंत्रण में आगे यंत्रवत जांच के लिए परिष्कृत आनुवंशिक जोड़तोड़ में सक्षम बनाता है ।

Protocol

इस प्रोटोकॉल hPSC लाइनों एच 1, HUES8, और मेल-1 रासायनिक परिभाषित और फीडर मुक्त हालत में (कृपया सामग्री और उपकरण तालिका देखें) के साथ अपने काम पर आधारित है। अन्य hPSC लाइनों या अलग-अलग संस्कृति की स्थिति में बनाए रखा hPSCs के लिए, आगे अनुकूलन की सिफारिश की है।

1. रासायनिक परिभाषित और फीडर मुक्त हालत में hPSC संस्कृति

  1. फीडर मुक्त हालत के लिए iMEF फीडरों पर hPSC संस्कृति को अपनाना। मामलों में जहां जमे हुए कोशिकाओं में अच्छी तरह से जीवित नहीं है जब सीधे फीडर मुक्त हालत में बरामद में, iMEF हालत में कोशिकाओं को ठीक पहले और उसके बाद फीडर मुक्त हालत के लिए अनुकूल।
    नोट: सामान्य में, यह iMEF फीडरों पर संवर्धित hPSCs के लिए 2 मार्ग लेता फीडर मुक्त हालत के लिए अनुकूलित किया जाना है।
  2. मध्यम हर दिन और बीतने के hPSCs जब कोशिकाओं ~ 80% confluency तक पहुँच चुके बदलें। सामान्य में, ~ 1 में पारित होने के hPSCs: 6 - 01:15 के अनुपात में हर 4 - 6 दिन। 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 क जोड़ेविगलन या कोशिकाओं passaging एन।
  3. कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे (आरटी) के लिए 5 माइक्रोग्राम / एमएल (1 एमएल / 10 सेमी 2) vitronectin (VTN) का छोटा पुनः संयोजक मानव फार्म के साथ hPSCs, पूर्व कोट संस्कृति बर्तन बोने से पहले। इसके अलावा, बेसल माध्यम में पूरक जोड़कर पूरा रासायनिक परिभाषित मध्यम तैयार करते हैं।
  4. संस्कृति के माध्यम से निकालें, सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने, और ~ 2 के लिए 0.5 मिमी EDTA के साथ कोशिकाओं का इलाज - आरटी पर 5 मिनट।
  5. EDTA Aspirate से पहले कालोनियों को अलग किया है। कोमल pipetting के साथ, छोटे टुकड़ों में hPSC कालोनियों फैलाने और पूरा मध्यम में कोशिकाओं resuspend।
  6. अलग hPSCs लीजिए और 5 मिनट के लिए 200 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन। पूरा मध्यम में pelleted hPSCs Resuspend और VTN में लिपटे प्लेटों पर कोशिकाओं बीज।

2. iCas9 hPSC लाइनों की पीढ़ी

  1. AAVS1-TALEN-एल, AAVS1 टी: आदेश और निम्न plasmids बढ़ानाAlen-आर, AAVS1-नव-M2rtTA, और AAVS1-Puro-iCas9।
    नोट: अप्रत्याशित पुनर्संयोजन घटनाओं से बचने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर परिवर्तन और plasmids के प्रवर्धन के लिए पुनर्संयोजन की कमी Stbl3 सक्षम कोशिकाओं का उपयोग करें।
  2. आमतौर पर, एक को लक्षित प्रयोग के लिए एक 10 सेमी पकवान (~ 1 10 x 7 कोशिकाओं यदि ~ 80% मिला हुआ) में hPSCs तैयार करते हैं।
    नोट: के बाद से आमतौर पर electroporation का कारण बनता महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु और TALEN की मध्यस्थता जीन AAVS1 लोकस में लक्षित एंटीबायोटिक चयन की आवश्यकता है, कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में सही ढंग से लक्षित कोशिकाओं की पहचान करने के लिए वरीयता प्राप्त किए जाने की जरूरत है। दवा सांद्रता के लिए अनुकूलन प्रत्येक कोशिका लाइन और प्रत्येक संस्कृति हालत के लिए सिफारिश की है।
  3. दिन -1 पर, (दिन electroporation से पहले), मीडिया परिवर्तन के दौरान 10 माइक्रोन रॉक अवरोध जोड़ें।
  4. दिवस 0, (electroporation के दिन) पर, अग्रिम में VTN में लिपटे प्लेटों तैयार करते हैं।
  5. एकल कक्षों में hPSCs अलग कर देना यूएसआईएनजी 1x हदबंदी अभिकर्मक (सामग्री और उपकरण टेबल कृपया देखें)। संक्षेप में, संस्कृति, मध्यम हटाने सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने, और ~ 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1x हदबंदी अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं का इलाज। हदबंदी अभिकर्मक Aspirate पहले कोशिकाओं को अलग किया है। कोमल pipetting के साथ, पूरा माध्यम से 10.5 एमएल में एक एकल कक्ष निलंबन में hPSCs फैलाने के।
  6. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग सेल संख्या गिनने के लिए 0.5 एमएल सेल निलंबन ले लो। 5 मिनट के लिए 200 XG पर hPSCs गोली और 12.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल में ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस में कोशिकाओं resuspend।
  7. Plasmids (1 टेबल देखें) 800-μL hPSC निलंबन (12.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) में जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। एक 0.4 सेमी electroporation क्युवेट करने के मिश्रण स्थानांतरण और ~ 5 मिनट के लिए बर्फ पर रहते हैं।
  8. 250 वी और 500 μF पर एक electroporation प्रणाली का उपयोग कोशिकाओं Electroporate; समय लगातार OBS13 एमएस - electroporation के बाद erved आम तौर पर 9 है।
  9. electroporation के बाद, पूर्व गर्म पूरा मध्यम के 5 एमएल के साथ एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण। उपयोग स्वस्थ proliferating hPSCs और, जब स्थानांतरित resuspending, और electroporation के बाद कोशिकाओं चढ़ाना बहुत धीरे कोशिकाओं संभाल: सफल लक्ष्य-निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण है।
  10. 5 मिनट के लिए 200 XG पर गोली कोशिकाओं। तीन VTN में लिपटे, 10 सेमी बर्तन में से प्रत्येक पर 10 माइक्रोन रॉक अवरोध और प्लेट 1, 2.5, और 5 x 10 6 कोशिकाओं के साथ पूरा माध्यम के 10 एमएल में कोशिकाओं Resuspend; यह सुनिश्चित करता है कि प्लेटों की कम से कम एक कॉलोनी चुनने के लिए एकल कोशिका प्रतिरूप घनत्व में पर्याप्त कालोनियों होगा।
  11. 1 दिन (electroporation के बाद दिन), मध्यम बदल जाते हैं।
  12. दिन 2 - 5, neomycin चयन शुरू जब कोशिकाओं ~ 60% मिला हुआ हैं। 500 माइक्रोग्राम / एमएल G418 सल्फेट के साथ दैनिक मध्यम बदलें; महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु के कारण selection आम तौर पर 2 दिनों G418 चयन के बाद मनाया जाता है।
  13. दिन 6 पर, एंटीबायोटिक चयन के बिना मध्यम बदल जाते हैं।
  14. दिन 7-9 पर, puromycin चयन शुरू करते हैं। 1 माइक्रोग्राम / एमएल puromycin dihydrochloride के साथ दैनिक मध्यम बदलें; महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु अगले दिन मनाया जाना चाहिए।
  15. व्यास में 2 मिमी - 10 दिन पर, एंटीबायोटिक चयन के बिना दैनिक मध्यम बदलने तक hPSC एकल कोशिका कालोनियों 1 तक पहुंचने लगते हैं।
    नोट: आमतौर पर, एक 10 सेमी डिश में 50 कालोनियों 2.5 x 10 6 hPSCs के साथ मनाया जाता है दिवस 0 पर चढ़ाया।
  16. एक stereomicroscope के तहत 24 कालोनियों - 12 उठाओ। यंत्रवत् छोटे टुकड़ों में hPSC कालोनियों disaggregate (~ कॉलोनी प्रति 10 टुकड़े) एक 23 जी सुई का उपयोग (200 μL pipet टिप भी ठीक है) और कोशिकाओं VTN लेपित 24 अच्छी तरह प्लेटों में सीधे हस्तांतरण।
  17. मध्यम दैनिक परिवर्तन जब तक कोशिकाओं मिला हुआ हो जाते हैं। पारित होने के 24 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं में6 अच्छी तरह से प्लेटों के कुओं नकली।
  18. कोशिकाओं 6 अच्छी तरह प्लेटों में मिला हुआ हो, एक जमे हुए शेयर और आगे लक्षण वर्णन के लिए जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए अच्छी तरह से एक दूसरे के लिए अच्छी तरह से इस्तेमाल करते हैं।
  19. विशेषताएँ और पीसीआर जीनोटाइपिंग, दक्षिणी सोख्ता, आर टी-qPCR विश्लेषण, karyotyping, और pluripotency परख द्वारा स्थापित iCas9 लाइनों को मान्य। झू एट अल का संदर्भ लें। विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए 21।

3. hPSC उत्परिवर्ती लाइनों की पीढ़ी iCRISPR प्रणाली का प्रयोग

  1. HPSC पीटकर लाइनों की पीढ़ी
    1. gRNA डिजाइन और उत्पादन
      1. जंगली प्रकार के प्रोटीन समारोह में खलल न डालें की संभावना को अधिकतम करने के लिए ब्याज की जीन में लक्ष्य क्षेत्रों का चयन करें। अच्छी तरह से एनोटेट जीनों के लिए, एक लक्ष्य क्षेत्र एक आवश्यक कार्यात्मक डोमेन के अपस्ट्रीम चुनें। वैकल्पिक रूप से, डिजाइन gRNAs एक क्षेत्र प्रारंभ कोडोन के बहाव के लक्ष्य के लिए। चुनें कम से कम 2 अलगब्याज की एक जीन के लिए क्षेत्रों के।
      2. डिजाइन ऑनलाइन CRISPR डिजाइन उपकरण (http://crispr.mit.edu) का उपयोग gRNAs। प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र के लिए, डिजाइन 3 कम संभावित लक्ष्यों बंद और प्रतिरूप उत्परिवर्ती लाइन 22 पैदा करने के लिए उच्चतम को निशाना दक्षता के साथ एक का उपयोग के साथ gRNAs।
        नोट: आदेश में उच्च जीनोम संपादन दक्षता प्राप्त करने के लिए, यह आरएनए ओलिगोस के बजाय अतीत के अनुभव में plasmids की तुलना में छोटे RNAs के उच्च अभिकर्मक दक्षता की वजह से प्लास्मिड डीएनए के रूप में gRNA वितरित करने के लिए सिफारिश की है।
      3. आदेश में 120 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) डीएनए T7 प्रमोटर अनुक्रम युक्त ओलिगोस, चर 20-NT crRNA मान्यता अनुक्रम (एन) 20 (पीएएम अनुक्रम में शामिल नहीं है), और निरंतर कैमेरिक गाइड अनुक्रम। DDH 2 हे में 100 माइक्रोन स्टॉक समाधान करने के लिए ओलिगोस पतला और समाधान के रूप में काम कर रहे 250 एनएम तैयार करते हैं।
        नोट: TAATACGACTCACTATAGGG (एन) के 20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. T7F और TracrR प्राइमरों का उपयोग ओलिगोस पीसीआर बढ़ाना (2 टेबल देखें) डबल असहाय डीएनए (dsDNA) gRNA इन विट्रो प्रतिलेखन (IVT) के लिए टेम्पलेट का उत्पादन। पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण (3 टेबल देखें) और पीसीआर चक्र की स्थिति के 50 μL का उपयोग करें (तालिका 4 देखें)।
      5. 20 μL में पीसीआर प्रवर्धित टेम्पलेट के साथ इन विट्रो gRNA प्रतिलेखन के लिए एक उच्च उपज T7 प्रतिलेखन किट का प्रयोग, इन विट्रो प्रतिलेखन gRNA मिश्रण (5 तालिका देखें) निर्माता के निर्देशों के अनुसार। निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिलेखन साफ-अप किट का उपयोग कर gRNA उत्पादों शुद्ध।
      6. क्षालन बफर के 100 μL में - (100 माइक्रोग्राम प्रति आमतौर पर ~ 50) Elute gRNAs निर्माता के निर्देशों के अनुसार उच्च throughput शुद्धि प्रोटोकॉल के बाद। -80 और 320 एनजी / μL (10 माइक्रोन) के संभव है जब और स्टोर करने के लिए एकाग्रता समायोजित# 176; उपयोग करें जब तक सी।
    2. पीसीआर और सेंगर अनुक्रमण प्राइमर डिजाइन
      1. डिजाइन और लक्ष्य क्षेत्र amplifying पीसीआर प्राइमरों मान्य, उत्पाद आकार आमतौर पर लेकर साथ से ~ 500 - 1,000 बीपी।
      2. डिजाइन सेंगर अनुक्रमण पीसीआर उत्पादों के लिए आंतरिक रूप से बाध्यकारी प्राइमरों शुद्धि के बिना पीसीआर उत्पादों के प्रत्यक्ष अनुक्रमण की अनुमति है।
    3. iCas9 hPSCs में gRNA अभिकर्मक
      1. दिन -1 पर, gRNA अभिकर्मक से पहले 24 एच 2 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन साथ iCas9 कोशिकाओं का इलाज।
      2. GRNA अभिकर्मक के दिन 0 के आधार पर अग्रिम में VTN में लिपटे प्लेटों तैयार करते हैं।
      3. 2.5 कदम के रूप में वर्णित, 1x हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग एकल कक्षों में iCas9 कोशिकाओं को अलग कर देना।
      4. 5 मिनट के लिए 200 XG पर hPSCs गोली और कम से कोशिकाओं resuspend ~ 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल पूरा मध्यम 2 माइक्रोग्राम / एमएल डॉक्सीसाइक्लिन और 10 माइक्रोन के रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरक है। प्लेट 0.5 24 अच्छी तरह से प्लेटों के अलग-अलग कुओं में resuspended कोशिकाओं के एमएल। के रूप में गैर ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण की सेवा के लिए अतिरिक्त कुओं तैयार करें।
      5. प्रत्येक gRNA के लिए, निम्न अभिकर्मक मिश्रण बनाने के लिए: कम सीरम माध्यम के मिश्रण एक, 50 μL + 1 gRNA (10 माइक्रोन) के के μL; मिक्स बी, कम सीरम मध्यम + 3 अभिकर्मक अभिकर्मक के μL के 50 μL।
      6. मिक्स एक मिश्रण है और बी 100 μL मिश्रण बनाने के लिए। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। 24 अच्छी तरह से प्लेटों के डुप्लिकेट कुओं में कोशिकाओं के लिए मिश्रण के 50 μL जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से।
      7. दिन 1 पर, एक दूसरे अभिकर्मक प्रदर्शन करता है, तो आगे को निशाना दक्षता बढ़ाने की जरूरत है। अन्यथा, डॉक्सीसाइक्लिन बिना मध्यम बदल जाते हैं।
      8. दिन 2 - 3, दैनिक मध्यम बदल जाते हैं।
      9. 4 दिन पर, प्रत्येक ट्रांसफ़ेक्ट और गैर ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग सेल के एक अच्छी तरह से जीनोमिक डीएनए निकाल सकते हैं। 50 एनजी / μ एकाग्रता समायोजितएल
      10. GRNA को निशाना दृश्यों flanking लक्ष्य क्षेत्रों पीसीआर बढ़ाना और जैसा कि पहले 5 में वर्णित है, T7 endonuclease मैं (T7EI) पाचन या प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (RFLP) परख का उपयोग संपादन दक्षता का अनुमान है।
    4. T7EI परख
      1. बनाया गया है और 3.1 कदम में मान्य प्राइमरों का उपयोग लक्ष्य क्षेत्र पीसीआर बढ़ाना।
      2. मिश्रण (6 तालिका देखें) तैयार है और डीएनए विकृतीकरण और टेबल 7 में उल्लिखित शर्तों का उपयोग पीसीआर उत्पादों के संकरण प्रदर्शन करते हैं।
        नोट: हमारे अनुभव के आधार पर, यह आम तौर पर आवश्यक नहीं है जब हमारे पीसीआर हालत का उपयोग कर T7EI परख के लिए पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करने के लिए है। हालांकि, शुद्धि अन्य परिस्थितियों में फायदेमंद हो सकता है।
      3. विकृत के 10 μL का उपयोग कर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक T7EI पाचन प्रदर्शन और पीसीआर उत्पाद और T7E1 के 0.2 μL (2 यू) (10 यू / μL) संकरित।
      4. निराकरणजेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा ई T7E1 पचा पीसीआर नमूने हैं। कटौती और काटा हुआ डीएनए के रिश्तेदार बैंड तीव्रता का निर्धारण करने के लिए ImageJ का प्रयोग करें। सूत्र का उपयोग INDEL आवृत्ति की गणना: (1 - (√ (1- (बी + ग)) / (ए + बी + ग))) x 100, जहां एक पचाया पीसीआर उत्पाद और बी और सी हैं की तीव्रता है T7E1-cleaved उत्पादों की तीव्रता।
    5. RFLP परख
      नोट: मामलों में जहां एक प्रतिबंध साइट करीब निकटता में है (<5 बीपी) एक Cas9 दरार साइट (3 बीपी 5 'पीएएम अनुक्रम की) करने के लिए, एक RFLP परख INDEL आवृत्ति यों करने के लिए किया जा सकता है।
      1. कदम 3.1.4.1 में वर्णित के रूप में एक ही पीसीआर उत्पादों का प्रयोग करें।
      2. प्रतिबंध एंजाइम है कि Cas9 दरार साइट के लिए करीब निकटता में एक प्रतिबंध साइट में शामिल है के साथ पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट।
      3. जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पचा पीसीआर नमूने संकल्प। कटौती और काटा हुआ डीएनए के रिश्तेदार बैंड तीव्रता का निर्धारण करने के लिए ImageJ का प्रयोग करें। INDEL की गणनासूत्र का उपयोग आवृत्ति: एक / (ए + बी + ग) x 100, जहां एक पचाया पीसीआर उत्पाद और बी और सी की तीव्रता है पचा उत्पादों की तीव्रता हैं।
    6. प्रतिरूप उत्परिवर्ती लाइनों की स्थापना
      नोट: gRNA अभिकर्मक के साथ iCRISPR प्रणाली का उपयोग कर hPSCs में जीनोम संपादन अत्यधिक कुशल है, और कोई एंटीबायोटिक चयन की जरूरत है। प्रतिरूप लाइनों की स्थापना करने के लिए, यह एक अपेक्षाकृत कम घनत्व पर कोशिकाओं बीज के लिए एकल सेल व्युत्पन्न कालोनियों के गठन को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है।
      1. उच्चतम संपादन दक्षता (T7EI या RFLP परख का उपयोग) के साथ और अच्छा सेल अस्तित्व के साथ gRNAs को पहचानें। प्रतिरूप उत्परिवर्ती लाइन स्थापना के लिए अच्छी तरह से इसी डुप्लिकेट का प्रयोग करें।
      2. 2.5 कदम के रूप में वर्णित, 1x हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन में hPSCs अलग कर देना। तीन VTN में लिपटे, 10 सेमी बर्तन में से प्रत्येक पर 500, 1,000, 2,000 और कोशिकाओं replate।
      3. मध्यम दैनिक यू बदलेंएकल कोशिका ntil कालोनियों तक पहुंचने के व्यास में ~ 2 मिमी।
      4. T7EI और / या RFLP परख द्वारा दक्षता को निशाना बनाने के आकलन पर निर्भर करता है, प्रत्येक gRNA के लिए 48 कालोनियों - 24 उठाओ। यंत्रवत् छोटे टुकड़ों में प्रत्येक कॉलोनी disaggregate (~ कॉलोनी प्रति 10 टुकड़े) एक 23 जी सुई का उपयोग (200 μL pipet टिप भी ठीक है) और डुप्लिकेट VTN में लिपटे, 96 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं replate। जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और सेंगर अनुक्रमण और आगे विस्तार के लिए अन्य थाली के लिए एक प्लेट का प्रयोग करें।
      5. 96 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं मिला हुआ बन गए हैं जब, जीनोमिक डीएनए (फिनोल / क्लोरोफॉर्म निकासी के बिना) निकालने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का उपयोग, नीचे के रूप में रेखांकित किया।
      6. मध्यम निकालें और सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। Lysis बफर के 50 μL (5 proteinase कश्मीर की μL (10 मिलीग्राम / एमएल), 5 पीसीआर की μL बफर 10x, और DDH 2 हे के 40 μL) एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें। प्लेट एक चिपकने वाला फिल्म और incuba का उपयोग कर सीलते रात भर में 55 डिग्री सेल्सियस।
      7. अगले दिन, सेल lysates एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में 99 डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में proteinase लालकृष्ण निष्क्रिय करने के लिए स्थानांतरण और 10 मिनट के लिए सेते
      8. T7EI या RFLP परख के लिए के रूप में ही प्राइमरों का उपयोग लक्ष्य क्षेत्र पीसीआर बढ़ाना, एक टेम्पलेट के रूप में सेल lysate के 1 μL का उपयोग कर।
      9. एक प्राइमर पीसीआर उत्पाद के लिए आंतरिक रूप से बाध्यकारी साथ सेंगर अनुक्रमण के लिए पीसीआर उत्पाद का 1 μL का प्रयोग करें।
      10. जमे हुए शेयरों के लिए frameshift INDEL परिवर्तन के साथ क्लोन बढ़ाना। इसके अलावा, एक ही लक्ष्य-निर्धारण प्रयोग से जंगली प्रकार के क्लोन के एक जोड़े को बढ़ाना आगे के प्रयोगों के लिए के रूप में isogenic नियंत्रण रेखा की सेवा के लिए।
  2. सटीक न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन के साथ उत्परिवर्ती लाइनों की पीढ़ी
    नोट: गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) द्वारा उत्पन्न पीटकर म्यूटेंट के साथ तुलना में, सटीक न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन डीएनए repai की उपस्थिति में अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकताआर टेम्पलेट्स। इस तरह की सटीक न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन जंगली प्रकार hPSCs में रोगी विशेष म्यूटेशन की पीढ़ी के लिए और रोगी व्युत्पन्न IPSCs में म्यूटेशन के सुधार के लिए अनुमति देते हैं।
    1. एक एचडीआर टेम्पलेट के रूप में ssDNA का डिजाइन
      1. कदम 3.1.1 में वर्णित के रूप में, एक रोगी विशेष उत्परिवर्तन के बहुत पास में 3 gRNAs - डिजाइन और 2 का उत्पादन।
      2. डिजाइन एक एकल असहाय डीएनए (ssDNA) रोगी विशेष उत्परिवर्तन द्वारा ~ 40 घिरे युक्त - एक एचडीआर टेम्पलेट के रूप में प्रत्येक पक्ष पर अनुरूपता के 80 NT।
      3. सही मरम्मत के बाद अतिरिक्त काटने को कम करने के लिए, gRNA मान्यता अनुक्रम के भीतर और पीएएम अनुक्रम के करीब निकटता में या पीएएम अनुक्रम में ही इस क्षेत्र में ssDNA टेम्पलेट के लिए एक मूक उत्परिवर्तन परिचय यदि संभव हो तो।
      4. यदि संभव हो तो, के रूप में अच्छी तरह से इतना है कि यह मरम्मत दक्षता RFLP परख का उपयोग अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक उपन्यास प्रतिबंध पाचन साइट शुरू करने की मूक उत्परिवर्तन डिजाइन।
      2. GRNA / ssDNA सह अभिकर्मक और प्रतिरूप लाइनों की स्थापना
      1. gRNA / ssDNA के सह अभिकर्मक, कदम 3.1.3 में वर्णित के रूप में अभिकर्मक मिश्रण ए और बी प्रत्येक gRNA और गैर ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण के लिए के साथ, iCas9 कोशिकाओं में प्रदर्शन करते 24 अच्छी तरह से प्लेटों के डुप्लिकेट कुओं में कोशिकाओं transfect। कम सीरम मध्यम + 1 gRNA की μL (10 माइक्रोन) के + 2 ssDNA की μL (10 माइक्रोन) के 50 μL: एक मिश्रण। मिक्स बी: कम हो सीरम मध्यम + 3 अभिकर्मक अभिकर्मक के μL के 50 μL।
      2. अभिकर्मक के बाद, प्रत्येक ट्रांसफ़ेक्ट और गैर ट्रांसफ़ेक्ट नियंत्रण सेल के एक अच्छी तरह से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए और मरम्मत दक्षता T7EI का उपयोग और / या RFLP परख का अनुमान है।
      3. उच्चतम मरम्मत दक्षता और अच्छा सेल अस्तित्व के साथ gRNA / ssDNA मिश्रण को पहचानें। प्रतिरूप उत्परिवर्ती लाइन स्थापना के लिए अच्छी तरह से इसी डुप्लिकेट का प्रयोग करें।
      4. 96 कालोनियों T7EI और / या RFLP गधा द्वारा लक्षित कर दक्षता के आकलन के आधार पर - 48 चुनेंप्र। सामान्य तौर पर, एचडीआर की मध्यस्थता उत्परिवर्तन की दक्षता में उत्परिवर्तन पीटकर से कम है और इस प्रकार अधिक कालोनियों उठाया जा करने की जरूरत है।
      5. अनुक्रम, विस्तार, और प्रतिरूप लाइनों को मान्य, कदम 3.1.6 में वर्णित है।

4. ग्लूकोज उत्तरदायी अग्नाशय β कोशिकाओं में इन विट्रो hPSC भेदभाव में

नोट: में रोग-प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं में hPSC म्यूटेंट की इन विट्रो भेदभाव एक थाली में रोग मॉडलिंग के लिए एक मंच प्रदान करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अग्नाशय विकास और मधुमेह के अध्ययन के 9, 16, 17 के लिए ग्लूकोज उत्तरदायी अग्नाशय β कोशिकाओं में hPSCs की इन विट्रो भेदभाव पर केंद्रित है।

  1. निश्चित एण्डोडर्म में hPSC भेदभाव
    1. , रासायनिक परिभाषित और फीडर मुक्त हालत में hPSC म्यूटेंट और जंगली प्रकार नियंत्रण लाइनों को बनाए रखने के रूप में वर्णनचरण 1 में घ।
    2. भेदभाव के लिए hPSCs तैयार करने के लिए, 1x हदबंदी अभिकर्मक का उपयोग hPSCs अलग कर देना और उन्हें पूरा मध्यम में एकल कक्ष निलंबन में फैलाने के।
    3. 5 मिनट के लिए 200 XG पर गोली कोशिकाओं और 10 माइक्रोन के रॉक अवरोध करनेवाला के साथ पूरा मध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। सेल संख्या की गणना और कोशिकाओं पर बीज ~ VTN में लिपटे प्लेटों पर 1.4 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी।
    4. बोने के बाद 24 घंटे के मध्यम बदलें।
    5. डे 0 पर, 48 घंटे के बाद भेदभाव शुरू, जब कोशिकाओं पर पहुँच गए हैं ~ 80% confluency।
      नोट:, उच्च अग्नाशय भेदभाव दक्षता प्राप्त करने के लिए 48 घंटे में बोने घनत्व और confluency के स्तर के अनुकूलन के लिए प्रत्येक व्यक्ति लाइन के लिए सिफारिश की है।
    6. HPSC मध्यम Aspirate और सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार कुल्ला।
    7. भेदभाव दिन 0 (D0) मध्यम करने के लिए मध्यम बदलें।
    8. दिन 1 पर - 2, di बदलमध्यम दैनिक fferentiation, टेबल 8 में व्यंजनों के अनुसार।
    9. दिन 3 पर, निश्चित एण्डोडर्म मार्कर SOX17, FOXA2, और CXCR4 immunofluorescent धुंधला द्वारा जांच करने और प्रवाह cytometry विश्लेषण।
  2. अग्नाशय के पूर्वज में निश्चित एण्डोडर्म भेदभाव
    1. दिन 3 - 9,, मध्यम दैनिक बदलकर अग्नाशय वंश की ओर निश्चित एण्डोडर्म भेदभाव जारी रखने के लिए टेबल 9 में व्यंजनों के अनुसार।
    2. 7 दिवस पर, जल्दी अग्नाशय के पूर्वज (PP1) immunofluorescent धुंधला द्वारा मार्कर Pdx1 की जांच और विश्लेषण के प्रवाह cytometry।
    3. दिन 10 पर, बाद में अग्नाशय के पूर्वज (PP2) मार्करों Pdx1 और NKX6.1 जांच करते हैं। इस बीच, अग्नाशय के अंत: स्रावी कोशिकाओं में आगे भेदभाव के लिए हवा तरल इंटरफेस को PP2 कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए तैयार करते हैं।
  3. अग्नाशय के अंत: स्रावी अलगहवा तरल इंटरफेस में entiation
    1. हदबंदी से पहले 4 घंटे 10 माइक्रोन के रॉक अवरोध करनेवाला के साथ PP2 कोशिकाओं को समझो।
    2. मध्यम निकालें और सीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार कुल्ला।
    3. एक 10 सेमी डिश में PP2 कोशिकाओं को 1x हदबंदी अभिकर्मक के 2 मिलीलीटर जोड़ने और 2 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं - 3 मिनट।
    4. हदबंदी अभिकर्मक Aspirate पहले कोशिकाओं को अलग किया है। BLAR माध्यम के 10 एमएल जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा एकल कक्षों में PP2 कोशिकाओं को फैलाने के।
    5. एकल कक्ष निलंबन लीजिए। 5 मिनट के लिए 200 XG पर सेल नंबर और गोली गणना।
    6. ~ 0.5 x 10 5 कोशिकाओं / μL में S5 भेदभाव माध्यम से सेल गोली Resuspend और 5 स्पॉट - एक transwell डालने फिल्टर पर हाजिर प्रति कोशिकाओं के 10 μL। एक 6 अच्छी तरह से डालने में 15 स्थानों और ~ 100 धब्बे एक 10 सेमी डालने में - 10 जगह।
    7. प्रत्येक transwell डालने के नीचे, ~ 6 अच्छी तरह से आवेषण के लिए 1.5 एमएल और ~ 8 एमएल एफ के लिए S5 मध्यम जोड़ेंया 10 सेमी सम्मिलित करता है।
    8. तालिका 10 में व्यंजनों के साथ दैनिक मध्यम बदलें।
    9. Immunofluorescent धुंधला द्वारा 34 दिन पर जांच अग्नाशय अंत: स्रावी मार्कर Pdx1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, इंसुलिन, और ग्लूकागन और विश्लेषण 17 प्रवाह cytometry।
    10. एक ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन के स्राव (GSIS) परख 16, 17 के साथ hPSC व्युत्पन्न β-तरह सेल समारोह जांच करते हैं।

Representative Results

hPSC रासायनिक परिभाषित और फीडर मुक्त संस्कृति अनुकूलन और रखरखाव

iMEF फीडरों पर संवर्धित hPSCs तेजी से फीडर मुक्त संस्कृति हालत में VTN में लिपटे प्लेटों लिए अनुकूलित किया जा सकता है। सामान्य iMEF फीडर संस्कृति के रूप में एक ही बंटवारे के अनुपात से अनुकूलन के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 1 ए एस आर-आधारित माध्यम में और फीडर मुक्त माध्यम में एक VTN लेपित सतह पर iMEF फीडरों पर hPSCs के विशिष्ट morphologies पता चलता है। चित्रा 1 बी एक ठेठ रूपात्मक परिवर्तन और अनुकूलन (4 दिन) के पहले पारित होने के दौरान hPSC कालोनियों की वृद्धि दर्शाता है। कोशिकाओं को आगे passaged या भविष्य के प्रयोगों के लिए जमे हुए किया जा सकता है। भेदभाव प्रयोगों शुरू करने से पहले अनुकूलन संस्कृति के 3 अंश - 2 बाहर ले। Karyotyping भी है, हालांकि हम कुपोषण असामान्यताएं अनुकूलन चरण के दौरान नहीं देखा है अनुकूलन के बाद सिफारिश की है।

"Fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> के माध्यम से iCas9 hPSC लाइनों की पीढ़ी TALEN की मध्यस्थता AAVS1 लक्ष्य निर्धारण

पहले से दिखाया गया है, hPSCs AAVS1 TALEN प्लास्मिड और Cas9 और M2rtTA plasmids 5 की एक जोड़ी के साथ electroporated थे। चित्रा 2A और बी विस्तृत दाता वेक्टर को निशाना डिजाइन और पूरी प्रक्रिया iCas9 hPSC प्रतिरूप लाइनों उत्पन्न करने से पता चलता है। एंटीबायोटिक चयन के बाद, एकल कोशिका व्युत्पन्न पर्याप्त आकार और ठेठ hPSC आकृति विज्ञान प्रदर्शित क्लोन उठाया जा करने के लिए तैयार थे (10 - 12 दिनों के electroporation के बाद, चित्रा -2)। आमतौर पर ~ क्लोन के 50% सही ढंग से यादृच्छिक एकीकरण के बिना, के रूप में दक्षिणी सोख्ता (चित्रा 2 डी) 5 द्वारा सत्यापित लक्षित कर रहे हैं। रैंडम एकीकरण डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के अभाव में Cas9 की टपकाया अभिव्यक्ति का कारण बन सकता है।

कुशल जेनेटिक एमiCRISPR प्लेटफार्म का उपयोग hPSCs में odification

स्थापित iCas9 hPSCs में, Cas9 डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के साथ व्यक्त किया है और ट्रांसफ़ेक्ट gRNAs, जहां यह DSBs उत्पन्न करके अपने लक्ष्य ठिकाना करने के लिए निर्देशित किया गया है। एक की मरम्मत टेम्पलेट के अभाव में, NHEJ के माध्यम से डीएनए की मरम्मत indels है, जो अक्सर जीन व्यवधान या नॉकआउट में परिणाम उत्पन्न करता है। एक की मरम्मत टेम्पलेट (जैसे, एक ssDNA दाता) की उपस्थिति में, एचडीआर इस तरह के एक जंगली प्रकार hPSC पृष्ठभूमि में एक रोगी विशेष उत्परिवर्तन पैदा करने या रोगी में रोग से जुड़े आनुवंशिक संस्करण को सही रूप में सटीक आनुवंशिक परिवर्तन, के लिए नियोजित किया जा सकता निकाली गई IPSCs (चित्रा 3 ए)। यह ~ लेता है 1 महीने iCRISPR प्रणाली का उपयोग प्रतिरूप उत्परिवर्ती लाइनों उत्पन्न करने के लिए। iCas9 प्रेरण और gRNA अभिकर्मक के बाद T7EI और / या RFLP assays Cas9 काटने की दक्षता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं बाद में कम घनत्व (कम 10 सेमी बर्तन में एकल कक्षों के रूप में वरीयता प्राप्त थे ~ 500 - 2, 000कोशिकाओं / 10 सेमी पकवान)। 10 - 12 दिन बाद, एकल कोशिका व्युत्पन्न क्लोन के विस्तार और आगे लक्षण वर्णन (यानी, जीनोटाइपिंग और पश्चिमी सोख्ता) (चित्रा 3 बी) के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में रखा गया था। चूंकि iCRISPR की मध्यस्थता जीन पीटा अत्यधिक कुशल है, कोई चयन प्रक्रिया शामिल है, और आमतौर पर 20 - 50% biallelic म्यूटेंट आसानी से (चित्रा 3 सी) 5 से हासिल किया जा सकता है। कुशल और सटीक आनुवंशिक परिवर्तन के लिए, gRNAs विशिष्ट अनुक्रम परिवर्तन (जीनोम अनुक्रम की एक छोटी लेकिन विशिष्ट परिवर्तन के लिए) ले जाने के लिए एक ssDNA दाता के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट हैं। अक्सर, संशोधित alleles में फिर से काटने को रोकने के लिए, यह करने के लिए या पीएएम अनुक्रम (चित्रा 3 डी) में करीब निकटता में एक मूक उत्परिवर्तन शामिल करने के लिए सिफारिश की है। इस प्रणाली के साथ, ~ दोनों alleles में अतिरिक्त परिवर्तन के बिना वांछित एचडीआर की मध्यस्थता जीनोम संशोधन को ले जाने के क्लोन का 10% प्राप्त कर रहे हैं (आंकड़े 3E)। तेजी से और पीiCRISPR मंच का उपयोग hPSC जीनोम के recise संशोधन हमें जल्दी से और कुशलता hPSC लाइनों है कि मानव विकास और रोग के अध्ययन के लिए मॉडल के रूप में काम करने के लिए अनुमति देता है।

ग्लूकोज उत्तरदायी β कोशिकाओं की तरह ओर hPSCs के कुशल भेदभाव

hPSC अग्नाशय भेदभाव में हाल ही में प्रगति प्रोटोकॉल है कि निकट अग्नाशय भ्रूण विकास पुनरावृत्ति के विकास की अनुमति दी है। अविभाजित hPSCs पहले, और अंत में ग्लूकोज उत्तरदायी β कोशिकाओं की तरह 16, 17, 19 में, 20 तो Pdx1 + जल्दी अग्नाशय पूर्वज (PP1) और Pdx1 + NKX6.1 + बाद में अग्नाशय के पूर्वज कोशिकाओं (PP2) में, निश्चित एण्डोडर्म में भेदभाव , 23, 24। ये protocOLS आगे मज़बूती Pdx1 + NKX6.1 + अग्नाशय progenitors और ग्लूकोज उत्तरदायी β कोशिकाओं की तरह 9 उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया गया। चित्रा -4 ए भेदभाव के हर चरण में इस्तेमाल किया विस्तृत रासायनिक तत्वों की खुराक से पता चलता है। आमतौर पर, ~ 80% confluency 2 दिन प्रारंभिक सेल चढ़ाना के बाद HUES8 hPSCs (चित्रा 4 बी) के भेदभाव को शुरू करने के लिए आदर्श है। कई अलग अलग बोने घनत्व परीक्षण अत्यधिक प्रत्येक विशेष सेल लाइन के लिए अनुकूलित हालत की खोज करने की सिफारिश की है। आम तौर पर कम से कम 75% FOXA2 + SOX17 + डे चरण और 40% Pdx1 + PP2 चरण में NKX6.1 + कोशिकाओं में कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 4C)। S5 चरण में, सेल कुल चारों ओर एक प्रभामंडल के आकार की तरह की उपस्थिति कोशिकाओं की अच्छी अस्तित्व है, जो NKX6.1 + CPEP + ग्लूकोज उत्तरदायी β कोशिकाओं की तरह (चित्रा 4D करने के लिए आगे भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है के लिए एक संकेत है )। इस प्रोटोकॉल मानव अग्नाशय डी का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है evelopment और एक थाली में रोग।

आकृति 1
चित्रा 1. hPSC रासायनिक परिभाषित और फीडर मुफ्त रखरखाव और iMEF भक्षण से संस्कृति अनुकूलन। (ए) hPSCs की छवियों प्रतिनिधि 4 दिन पर VTN iMEF फीडर पर या सुसंस्कृत, विभाजित किया जा करने के लिए तैयार है। (बी) के पहले एक iMEF फीडर से फीडर मुक्त संस्कृति में अनुकूलन के पारित होने के दौरान hPSCs की विशिष्ट आकृति विज्ञान। 4 दिन hPSCs iMEF फीडरों पर संवर्धित रॉक अवरोध करनेवाला के साथ रासायनिक परिभाषित मध्यम में विभाजित है और VTN में लिपटे प्लेटों पर चढ़ाया गया। बंटवारे के अनुपात iMEF फीडर की स्थिति में संवर्धन के लिए सामान्य बंटवारे अनुपात के रूप में ही किया गया था। मध्यम रॉक अवरोध के बिना हर दिन बदल गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ve_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
चित्रा 2. iCas9 hPSC लाइनों की पीढ़ी। (ए) iCas9 hPSC लाइनों की पीढ़ी के लिए रणनीति लक्ष्य निर्धारण। Puro-Cas9 दाता और नव-M2rtTA दाता AAVS1 TALENS की एक जोड़ी द्वारा मानव AAVS1 लोकस में निशाना बनाया गया। (बी) electroporation, एंटीबायोटिक चयन, कॉलोनी उठा और विस्तार, और सेल लाइन लक्षण वर्णन सहित पूरे लक्ष्य-निर्धारण की प्रक्रिया, के Schematics। Electroporation के बाद 12 दिन - (ग) प्रतिनिधि एकल कोशिका क्लोन तैयार लगभग 10 से उठाया जाएगा। (डी) के दो दाता plasmids के अतिरिक्त एकीकरण के बिना सही ढंग से लक्षित क्लोन की पहचान करने के लिए दक्षिणी धब्बा उदाहरण हैं। सही क्लोन लाल रंग में चिह्नित कर रहे हैं। (ए) और (डी) संदर्भ 5 से अनुकूलित किया गया, अनुमति के साथ।ig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. iCRISPR प्रणाली का प्रयोग hPSCs में कुशल आनुवंशिक संशोधन। (ए) जीन पीटा म्यूटेंट या सटीक जीन संशोधन iCRISPR प्रणाली का उपयोग करने की पीढ़ी के लिए Schematics। (बी) लक्ष्य निर्धारण की प्रक्रिया और प्रतिरूप लाइन स्थापना। (सी) जीन पीटा hPSCs 9 में NHEJ के माध्यम से दक्षता। (डी) एक विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड संशोधन को ले जाने के लिए एक ssDNA के डिजाइन। पी, लाल रंग में: रोगी विशेष उत्परिवर्तन; एक्स, हरे रंग में: मूक उत्परिवर्तन। (ई) एचडीआर की मध्यस्थता सटीक न्यूक्लियोटाइड संशोधन की दक्षता। एक सटीक R456C उत्परिवर्तन gata6 लोकस में (एक विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड सी> टी उत्परिवर्तन के कारण) iCRISPR प्रणाली का उपयोग कर पेश किया गया था।(और अधिक विस्तृत जानकारी के लिए संदर्भ के लिए 5 में देखें)। (सी) और (ई) संदर्भ 9 और संदर्भ 5, क्रमशः से अनुकूलित किया गया, अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. निर्देशित hPSC भेदभाव ग्लूकोज उत्तरदायी अग्नाशय β-तरह की कोशिकाओं में। (ए) विस्तृत भेदभाव प्रोटोकॉल का schematics, भेदभाव के हर चरण में पूरक रसायनों के साथ। संकेत दे रास्ते कि सक्रिय या भेदभाव के दौरान हिचकते हैं, हरे या लाल रंग में डाला जाता है क्रमशः। चीड़: GSK3 अवरोध; GDF8: विकास भेदभाव कारक 8 या Myostatin, एक TGF-बीटा प्रोटीन परिवार के सदस्य; HH: हाथी; डे: निश्चित एण्डोडर्म; PP1:Pdx1 + जल्दी अग्नाशय के पूर्वज; PP2: Pdx1 + NKX6.1 + बाद में अग्नाशय के पूर्वज। (बी) विशिष्ट confluency - hPSCs 48 का (70 से 80%) एच बोने के बाद जब भेदभाव दीक्षा के लिए तैयार है। (सी) प्रतिनिधि immunofluorescent धुंधला निश्चित एण्डोडर्म में सफल भेदभाव दिखा छवियों (डे) मंच (FOXA2 और SOX17 सह-धुंधला), अग्नाशय के पूर्वज मंच (PP2: Pdx1 और NKX6.1 सह-धुंधला), और ग्लूकोज संवेदनशील β- सेल मंच (NKX6.1 और सी-पेप्टाइड सह-धुंधला) की तरह। सामान्य में, β-तरह सेल चरण में 10% से अधिक NKX6.1 + CPEP + कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए कम से कम 75% FOXA2 + SOX17 + डे कोशिकाओं और 40% Pdx1 + NKX6.1 + PP2 कोशिकाओं इसी चरणों में आवश्यक हैं। (डी) हवा तरल इंटरफेस संस्कृति में एक डालने फिल्टर झिल्ली पर S5 स्तर पर एक सेल कुल की विशिष्ट आकृति विज्ञान। जीवित कोशिकाओं कुल (अंधेरे में) के केंद्र के लिए चले गए और किनारे पर एक आभा की तरह संरचना को छोड़ दिया है। (ए (डी) अनुमतियों के साथ संदर्भ 9 से अनुकूलित किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्लाज्मिड रकम
AAVS1-TALEN-एल 5 माइक्रोग्राम
AAVS1-TALEN-आर 5 माइक्रोग्राम
AAVS1-Puro-iCas9 40 माइक्रोग्राम
AAVS1-नव-M2rtTA 40 माइक्रोग्राम

तालिका एक

भजन की पुस्तक अनुक्रम
T7F TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR AAAAGCACCGACTCGGTGCC

सारणी 2

टेबल तीन

अंग रकम
DDH 2 हे 35.5 μL
5x पीसीआर प्रतिक्रिया बफर 10 μL
dNTP मिश्रण (25 मिमी) 0.5 μL
T7F (10 माइक्रोन) के 1.25 μL
TracrR (10 माइक्रोन) के 1.25 μL
T7-gRNA IVT टेम्पलेट (250 एनएम) 1 μL
डीएनए पोलीमरेज़ 0.5 μL
कुल पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण 50 μL
पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति
चक्र संख्या denature पानी रखना बढ़ाएँ
1 94 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट
2-31 94 डिग्री सेल्सियस, 20 S 60 डिग्री सेल्सियस, 20 S 72 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट
32 72 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट

तालिका 4

अंग
T7 एटीपी 2 μL
T7 सीटीपी 2 μL
T7 जीटीपी 2 μL
T7 UTP 2 μL
T7 10x बफर 2 μL
T7 एंजाइम मिश्रण 2 μL
पीसीआर प्रवर्धित टेम्पलेट 8 μL
कुल में इन विट्रो प्रतिलेखन gRNA मिश्रण 20 μL
रात भर के लिए 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते

तालिका 5

अंग राशि (μL)
Unpurified पीसीआर उत्पाद 8 बफर 2 10x 2
आसुत जल (DH 2 हे) 10

तालिका 6

डीएनए विकृतीकरण और संकरण साइकिल चालन की स्थिति
तापमान अवधि thermocycler की स्थिति
95 डिग्री सेल्सियस दस मिनट
85 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 2 डिग्री सेल्सियस / s पर 85 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप
75 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 0.3 डिग्री सेल्सियस / s पर 75 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप
65 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 0.3 डिग्री सेल्सियस / s पर 65 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप
55 डिग्री सेल्सियस </ Td> 1 मिनट 0.3 डिग्री सेल्सियस / s पर 55 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप
45 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 0.3 डिग्री सेल्सियस / s पर 45 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप
35 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 0.3 डिग्री सेल्सियस / s पर 35 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप
25 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 0.3 डिग्री सेल्सियस / s पर 25 डिग्री सेल्सियस के लिए रैंप
4 डिग्री सेल्सियस पकड़

टेबल 7

मंच दिन मीडिया परिशिष्ट
एस 1 D0 एस 1 GDF8
100 एनजी / एमएल 		चीड़-99021
3 सुक्ष्ममापी
डी 1 एस 1 GDF8
100 एनजी / एमएल 		चीड़-99021
0.3 माइक्रोन के
डी 2 एस 1 GDF8
100 एनजी / एमएल
एस 1 मीडिया: MCDB 131 + 1x एल glutamine पूरक + 0.5% बीएसए + 1.5 ग्राम / एल NaHCO 3 + 10 मिमी ग्लूकोज

तालिका 8

S3
मंच दिन मीडिया परिशिष्ट
S2 D3-D4 एस 1 ला
0.25 मिमी 		FGF7
50 एनजी / एमएल 		आईडब्ल्यूपी -2
2.5 माइक्रोन के
D5-डी 6 S3 ला
0.25 मिमी 		FGF7
50 एनजी / एमएल 		Sant-1
0.25 सुक्ष्ममापी 		आरए
1 माइक्रोन 		LDN
100 एनएम 		TPB
200 एनएम 		अपनी एक्स
1: 200
एस 4 D7-D9 S3 ला
0.25 मिमी 		FGF7
2 एनजी / एमएल 		Sant-1
0.25 सुक्ष्ममापी 		आरए
0.1 माइक्रोन के 		LDN
200 एनएम 		TPB
100 एनएम 		अपनी एक्स
1: 200 		आईडब्ल्यूपी -2
2.5 माइक्रोन के
S3 मीडिया: MCDB 131 + 1x एल glutamine पूरक + 2% बीएसए + 2.5 ग्राम / एल NaHCO 3 + 10 मिमी ग्लूकोज

टेबल 9

मंच दिन मीडिया परिशिष्ट
S5 D10-D12 S5 T3 1 माइक्रोन ALK5i द्वितीय 10 माइक्रोन Sant-1 0.25 सुक्ष्ममापी आरए 0.05 सुक्ष्ममापी LDN 100 एनएम अपनी एक्स 1: 200 ZnSO4 10 माइक्रोन हेपरिन 10 माइक्रोग्राम / एमएल
S6 d13- D19 S5 T3 1 माइक्रोन ALK5i द्वितीय 10 माइक्रोन GSiXX 100 एनएम LDN 100 एनएम अपनी एक्स 1: 200 ZnSO4 10 माइक्रोन हेपरिन 10 माइक्रोग्राम / एमएल
S7 d20- D33 S5 T3 1 माइक्रोन ALK5i द्वितीय 10 माइक्रोन एन Cys 1mm Trolox 10 माइक्रोन R428 2 माइक्रोन अपनी एक्स 1: 200 ZnSO4 10 माइक्रोन हेपरिन 10 माइक्रोग्राम / एमएल
S5 मीडिया: BLAR + 1x एल glutamine पूरक + 2% बीएसए + 1.5 ग्राम / एल NaHCO 3 + 20 मिमी ग्लूकोज

तालिका 10

Discussion

जनरेटिंग उत्परिवर्ती लाइन्स के लिए समय विचार

हालांकि हाल के जीनोम संपादन के लिए CRISPR / कैस सिस्टम पर आधारित दृष्टिकोण सफल लक्ष्य-निर्धारण करने के लिए नेतृत्व किया है, एक और अधिक प्रभावशाली और सार्वभौमिक मंच जीन समारोह का विश्लेषण करती है बड़े पैमाने पर करने के लिए बेहतर होगा। ICRISPR मंच ब्याज 5, 9 में से किसी के जीन के म्यूटेशन को पेश करने के लिए एक तेजी से और कारगर तरीका प्रदान करता है। सबसे पहले, पीसीआर आधारित gRNA संश्लेषण विधि समय लेने वाली क्लोनिंग कदम के बिना एक दिन में arrayed प्रारूप में gRNAs के सैकड़ों के उत्पादन की अनुमति देता है। दूसरा, iCas9 hPSCs में डॉक्सीसाइक्लिन-inducible Cas9 अभिव्यक्ति के साथ, gRNA अभिकर्मक से जुड़े कदम केवल काम की एक न्यूनतम राशि की आवश्यकता है, और इस तरह, कई gRNA को निशाना प्रयोगों समवर्ती आयोजित किया जा सकता है। तीसरा, उच्च लक्ष्य-निर्धारण के कारण क्षमता हमारी प्रणाली के विश्लेषण के साथ प्राप्य ~ 24 - ट्रांसफ़ेक्ट gRNA प्रति 48 कालोनियों suff होना चाहिएicient, एक जीन के लिए कई monoallelic और biallelic उत्परिवर्ती लाइनों की स्थापना करने के लिए हालांकि क्षमता लक्ष्य लोकस पर निर्भर करता है। चूंकि यह संभव है के लिए एक प्रशिक्षित व्यक्ति यंत्रवत्, एक ही बार में 384 कालोनियों (4 एक्स 96 अच्छी तरह प्लेटें) लेने जो एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ~ 4 घंटे के लिए ले जाना चाहिए करने के लिए, एक प्रशिक्षित व्यक्ति के भीतर 12 जीन को प्रभावित करने उत्परिवर्ती लाइनों उत्पन्न करने की उम्मीद की जा सकती है 12 महीने। एक कम समय में hPSC म्यूटेंट के सुव्यवस्थित पीढ़ी प्रतिलेखन कारक और / या संकेतन मार्ग घटक है कि एक दूसरे के साथ बातचीत, विकास की प्रक्रिया 9 को विनियमित करने की एक सरणी के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, कुशल मल्टिप्लेक्स जीन लक्ष्यीकरण भी आनुवंशिक बातचीत अंतर्निहित जटिल मानव के लक्षण की जांच करने के लिए दरवाजे खोलता है।

सटीक आनुवंशिक संशोधन की पीढ़ी

आसानी से सुलभ दैहिक कोशिका प्रकार से रोगी विशेष IPSCs की व्युत्पत्ति s और रोग-प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव की बीमारी से जुड़े म्यूटेशन के कार्यात्मक सत्यापन के लिए एक महान अवसर प्रदान करते हैं। हालांकि, व्यक्तियों के बीच आनुवंशिक पृष्ठभूमि में काफी परिवर्तनशीलता के कारण, रोगियों से IPSCs के बीच और स्वस्थ दाताओं से प्रत्यक्ष तुलना एक पृष्ठभूमि प्रभाव से रोग phenotypes भेद करने के लिए अनुमति नहीं हो सकती। इसलिए, यह रोग उत्परिवर्तन वापस जंगली प्रकार के अनुक्रम को सही करने से isogenic नियंत्रण IPSCs उत्पन्न करने के लिए या दूसरों के रूप में 25, 26 द्वारा प्रस्तावित है, एक जंगली प्रकार hPSC पृष्ठभूमि में रोगी विशेष म्यूटेशन लागू करने के लिए आवश्यक है। नुकसान के समारोह (शून्य) म्यूटेशन के अलावा, एक अब और अधिक ठीक रोग तंत्र एक रोगी विशेष अनुक्रम परिवर्तन की शुरूआत के माध्यम hPSCs में अंतर्जात ठिकाना, hypermorphic hypomorphic, neomorphic, या प्रमुख नकारात्मक रोगी सहित में काटना सकता है म्यूटेशन।

ntent "> सटीक आनुवंशिक संशोधन एक की मरम्मत टेम्पलेट की उपस्थिति में डीएसबी मरम्मत के लिए एचडीआर कार्यरत हैं। चूंकि यह NHEJ की मध्यस्थता डीएनए की मरम्मत की तुलना में काफी कम कुशल है, एक दाता रोगी विशेष उत्परिवर्तन, एक दवा चयन कैसेट, और अनुरूपता हथियार युक्त प्लाज्मिड पहले से मरम्मत टेम्पलेट 2 के रूप में इस्तेमाल किया गया है। दवा चयन और रोगी विशेष उत्परिवर्तन के सत्यापन के बाद, एक दूसरे चरण के लिए आम तौर पर दवा चयन कैसेट निकालने की जरूरत है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल Cre पर loxP और FLP-FRT सिस्टम पीछे छोड़ जब अंतर्जात ठिकाना में अवशिष्ट अनुक्रम, piggyBac transposon के उपयोग दवा चयन कैसेट 27 की निर्बाध हटाने के लिए अनुमति दी गई है। हाल ही में, कम ssDNA टेम्पलेट्स भी इंजीनियर डीएनए endonucleases 28 के साथ कुशल एचडीआर समर्थन करने के लिए दिखाया गया है। एक दाता प्लाज्मिड की तुलना , ssDNA सीधे संश्लेषित किया जा सकता है और इस तरह समय लेने वाली क्लोनिंग कदम गतिरोध उत्पन्न। यहाँ, यह हो गया हैएन पता चला है कि, सह transfecting gRNA और एक ssDNA टेम्पलेट अनुरूपता निर्देशित मरम्मत के लिए प्रेरित करने, iCRISPR उच्च दक्षता के साथ विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड संशोधनों के लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह केवल, लेकिन यह भी मानव रोग म्यूटेशन मॉडलिंग और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए इन रोग से जुड़े म्यूटेशन को सही करने के लिए प्रोटीन कार्यात्मक डोमेन के भीतर आवश्यक न्यूक्लियोटाइड की भूमिका विदारक नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। संवेदनशीलता लोकी की बड़ी संख्या है कि प्रत्येक एकाधिक अनुक्रम वेरिएंट के साथ जुड़े रहे हैं, मधुमेह जैसे जटिल और multigenic रोगों मॉडलिंग के कारण आनुवांशिकी के लिए एक चुनौती रहा है। जैसा कि iCRISPR मंच एक allelic श्रृंखला का तेजी से पीढ़ी के लिए या multiplexable जीन लक्ष्यीकरण के लिए अनुमोदक है, यह कई बीमारियों से जुड़े स्थलों की जांच की सुविधा कर सकते हैं, या तो व्यक्तिगत रूप से या isogenic पृष्ठभूमि के साथ संयोजन में।

क्षमता और बंद लक्ष्य प्रभाव लक्ष्य निर्धारण

हमारे पास है T7E1 और RFLP परख परिणाम और अनुक्रमण द्वारा की पहचान उत्परिवर्ती लाइनों की संख्या के बीच एक अच्छा संबंध पाया गया। इस प्रतिरूप लाइनों की स्थापना के साथ समानांतर में इन assays के प्रदर्शन के महत्व पर जोर दिया। सबसे एकल जीन को निशाना प्रयोगों में जीनोमिक लोकी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, प्राप्त कर ली को निशाना क्षमता, 20 जबकि - क्लोन का 60% दोनों alleles उत्परिवर्तित के साथ पाए गए (सहित और frameshift म्यूटेशन फ्रेम में) 9। मामलों में जहां मल्टिप्लेक्स जीन लक्ष्यीकरण प्रदर्शन किया गया था, 5-10% क्षमता के साथ ट्रिपल biallelic उत्परिवर्ती क्लोन 5 प्राप्त किया गया। 10% 5 - कई जीनों की ssDNA की मध्यस्थता एचडीआर भी homozygous प्राप्त करने तोड़े में 1 से लेकर क्लोन की क्षमता के साथ, सटीक आनुवंशिक परिवर्तन प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया। संभावित बंद लक्ष्य साइटों है कि एक ही gRNA लक्ष्य अनुक्रम का हिस्सा नहीं है में hPSCs में CRISPR / कैस के साथ कार्य करना, किसी भी म्यूटेशन अभी तक पता लगाया जा रहे हैंलड़की = "xref"> 5, 9, 12। पूरे जीनोम हाल के एक अध्ययन में प्रदर्शन किया अनुक्रमण भी CRISPR / कैस 29 का उपयोग कर उत्पन्न प्रतिरूप hPSC लाइनों में पर्याप्त बंद लक्ष्य म्यूटेशन की पहचान करने में नाकाम रही है। फिर भी, बंद लक्ष्य प्रभाव स्थलों पर म्यूटेशन द्वारा शुरू की phenotypes confounding के किसी भी संभावित प्रभाव को कम करने के लिए, यह कम से कम दो स्वतंत्र एक ही जीन के भीतर विभिन्न दृश्यों को निशाना gRNAs का उपयोग कर स्वतंत्र उत्परिवर्ती लाइनों उत्पन्न करने के लिए सुझाव दिया है। इसी तरह के कई लाइनों में मनाया phenotypes मुख्यतः संभावना है कि phenotype एक बंद लक्ष्य प्रभाव से आता शासन से बाहर कर सकता है अलग gRNAs का उपयोग कर उत्पन्न।

फीडर पर निर्भर बनाम स्वतंत्र संस्कृति और लक्ष्य निर्धारण

hPSC संस्कृति के लिए पारंपरिक तरीकों सीरम या सीरम रिप्लेसमेंट कि पशु ठेस शामिल युक्त मीडिया में फीडर कोशिकाओं पर उनके रखरखाव और विस्तार शामिलऐसे गोजातीय सीरम albumin के रूप में ठेस। फीडर कोशिकाओं, सीरम, सीरम रिप्लेसमेंट, और सभी एल्बुमिन जटिल, अपरिभाषित घटक होते हैं और काफी बैच परिवर्तनशीलता दिखा। फीडर से मुक्त और रासायनिक परिभाषित हालत के लिए अनुकूल काफी प्रयासों hPSC रखरखाव के लिए और अधिक महत्वपूर्ण बात, भेदभाव प्रयोगों की स्थिरता बढ़ जाती है कम कर देता है। वर्तमान में, वहाँ बहुत कुछ अध्ययनों कि पूरी तरह से परिभाषित संस्कृति की स्थिति में 30 में संवर्धित hPSCs पर जीनोम संपादन प्रक्रियाओं का वर्णन कर रहे हैं। हम उच्च CRISPR को निशाना क्षमता जब gRNA अभिकर्मक और प्रतिरूप बयान फीडर पर निर्भर संस्कृति की स्थिति की तुलना में फीडर मुक्त परिस्थितियों में प्रदर्शन किया गया पाया है। हम मानते हैं कि इस अभिकर्मक और कॉलोनी गठन के लिए एकल कोशिका बोने के बाद बढ़ सेल अस्तित्व के कारण है। इसके अलावा, फीडर कोशिकाओं पहले अभिकर्मक अभिकर्मकों एकांत में रहना है, जिससे अभिकर्मक दक्षता को कम दिखाया गया है।

संयोजननिर्देशित भेदभाव के साथ जीनोम एडिटिंग

पिछला भेदभाव प्रोटोकॉल केवल इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश सामने आए हैं, जिनमें से अधिकांश polyhormonal थे और भ्रूण कोशिकाओं अंत: स्रावी 23 मची। हाल ही में प्रगति और अधिक परिपक्व ग्लूकोज जिम्मेदार बीटा कोशिकाओं की तरह 16, 17, 19, 20 में hPSCs के भेदभाव की अनुमति दी है। हम नियमित रूप से HUES8 hPSCs 9 का उपयोग कम से कम 75% निश्चित एण्डोडर्म कोशिकाओं, 40% Pdx1 + NKX6.1 + अग्नाशय पूर्वज, और 20% के आसपास NKX6.1 + CPEP + ग्लूकोज जिम्मेदार बीटा कोशिकाओं की तरह प्राप्त कर सकते हैं। जब iCRISPR जीनोम संपादन प्रणाली के साथ संयुक्त, इस और अधिक मजबूत भेदभाव प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारक है कि अग्नाशय भेदभाव के अग्नाशय के पूर्वज और अंत: स्रावी चरणों के लिए महत्वपूर्ण हैं के विश्लेषण में मदद की है। यह कर देगायह संभव है, भविष्य के अध्ययनों में, तंत्र है कि मधुमेह 9 आबाद में कार्यात्मक सत्यापन और जांच के लिए उम्मीदवार रोग जीन की एक बड़ी संख्या को जांच करने के लिए।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश

हमारे iCRISPR प्रणाली ऐसी माध्यम संवाददाता alleles के निर्माण के रूप में और अधिक जटिल जीनोमिक संशोधनों की पीढ़ी की सुविधा हो सकती एचडीआर की मध्यस्थता जीन लंबे दाता डीएनए टेम्पलेट्स एन्कोडिंग प्रोटीन टैग या फ्लोरोसेंट संवाददाताओं 12 का उपयोग कर निशाना। हम जानते हैं कि पता चला है, उच्च CRISPR लक्षित प्रणाली में प्राप्त क्षमता के कारण, इस प्रक्रिया को आगे दवा चयन 12 के लिए आवश्यकता के बिना, hPSCs में प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके अलावा, मल्टिप्लेक्स जीन को निशाना अंतर्निहित जटिल मानव रोग आनुवंशिक बातचीत की जांच करने, के रूप में हमारे हाल के एक अध्ययन है, जो हमें विश्वास है कि इस तरह के काम 31 का पहला उदाहरण है में दिखाया इस्तेमाल किया जा सकता है। आईसीआरआईएसपीआर भी विलोपन बनाने के द्वारा या तो noncoding RNAs में या जीन में इस तरह के प्रमोटरों और enhancers के रूप में विनियामक क्षेत्रों, जीन नियामक नियंत्रण समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुशलतापूर्वक iCRISPR का उपयोग कर नियामक म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए, gRNAs सहित एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के बंधन साइट को बाधित करने के लिए तैयार किया जा सकता है, लेकिन बेसल ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी या एक ऊतक विशेष प्रतिलेखन कारक तक ही सीमित नहीं है। ssDNA टेम्पलेट की मध्यस्थता एचडीआर भी विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों रूप बदलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, हम परिकल्पना की गई है कि आगे अनुकूलन जब इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त pluripotency phenotypes या रोग phenotypes के उच्च throughput आनुवंशिक विश्लेषण के लिए hPSCs में iCRISPR मंच का उपयोग सक्षम होगा। ये iCRISPR की मध्यस्थता के अध्ययन के उम्मीदवार रोग से जुड़े जीन और उनके कार्यात्मक प्रासंगिकता के अध्ययन के लिए और अधिक तेजी से पहचान के लिए अनुमति हो सकती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम एनआईएच / NIDDK (R01DK096239) और न्यूयॉर्क राज्य स्टेम सेल साइंस (NYSTEM C029156) द्वारा वित्त पोषित में भाग गया था। ZZ स्लोअन केटरिंग संस्थान के स्टेम सेल बायोलॉजी के लिए केंद्र से NYSTEM postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemically defined medium (E8) Thermo Fisher Scientific A1517001 Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included
Truncated recombinant human form of vitronectin Thermo Fisher Scientific A14700
ROCK inhibitor Y-27632 Selleck Chemicals S1049
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563029 1x, animal origin free, recombinant enzyme
G418 Sulfate Thermo Fisher Scientific 10131035 Geneticin Selective Antibiotic
Puromycin dihydrochloride Sigma-Aldrich P8833 Puromycin Selective Antibiotic
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) Agilent Technologies 600679 PCR kit
MEGAshortscript T7 Transcription kit Thermo Fisher Scientific AM1354
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
Opti-MEM medium Thermo Fisher Scientific 31985062 Reduced Serum Medium
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 13778150
DNeasy Blood & Tissue Kit QIAGEN 69504 Genomic DNA extraction kit
Proteinase K Roche 3115879001
MCDB 131 medium Thermo Fisher Scientific 10372-019
BLAR medium Thermo Fisher Scientific Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014)
L-glutamine supplement (GlutaMAX) Thermo Fisher Scientific 35050061
NaHCO3 Thermo Fisher Scientific 144-55-8
Glucose Sigma-Aldrich G8769
BSA LAMPIRE Biological Laboratories 7500855 Fatty acid free
GDF8 PeproTech 120-00
CHIR-99021 Stemgent 04-0004 GSK-3 inhibitor
L-Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544 Vitamin C
FGF7 R&D Systems 251-KG
SANT1 Tocris Bioscience 1974 Hedgehog inhibitor
RA Sigma-Aldrich R2625 Retinoic acid
LDN Stemgent 04-0019 BMP inhibitor
IWP-2 Tocris Bioscience 3533 Wnt antagonist 
ITS-X Thermo Fisher Scientific 51500-056
TPB EMD Millipore 565740-1MG PKC activator
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
ALK5i II Enzo Life Sciences ALX-270-445 ALK5 inhibitor II
ZnSO4 Sigma-Aldrich Z0251
Heparin Sigma-Aldrich H3149
GSiXX EMD Millipore 565789 Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor
N-Cys (N-acetyl cysteine) Sigma-Aldrich A9165
Trolox EMD Millipore 648471 Vitamin E analogue
R428 Selleck Chemicals S2841 AXL receptor tyrosine kinase inhibitor
24 mm Transwell with insert Corning Life Sciences 3414
Gene Pulser Xcell Electroporation System Bio-Rad 1652660
0.4 cm Electroporation Cuvettes Bio-Rad 1652081
AAVS1-TALEN-L Addgene 59025
AAVS1-TALEN-R Addgene 59026
AAVS1-Neo-M2rtTA Addgene 60843
AAVS1-Puro-iCas9 Addgene 58409
T7 Endonuclease I NEB M0302L
Buffer 2 NEB B7002S NEBuffer 2
Long oligonucleotide Eton Bioscience or IDT
SOX17 antibody R&D Systems AF1924 1:500
FOXA2 antibody Millipore 07-633 1:100
CXCR4-APC antibody R&D Systems FAB170A 1:25
PDX1 antibody R&D Systems AF2419 1:500
NKX6.1 antibody DSHB F55A12 1:500
NKX2.2 antibody DSHB 74.5A5 1:100
NEUROD1 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-1084 1:100
Insulin antibody Dako A0564 1:2,000
C-peptide antibody DSHB GN-ID4-c 1:2,000
Glucagon antibody Sigma-Aldrich G2654 1:1,000

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References

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आनुवंशिकी अंक 121 CRISPR / Cas9 iCas9 जीनोम संपादन AAVS1 मानव स्टेम कोशिकाओं अग्नाशय भेदभाव ग्लूकोज उत्तरदायी β कोशिकाओं की तरह मधुमेह
जीनोम एडिटिंग और hPSCs की निर्देशित भेदभाव मानव अग्नाशय विकास में वंश अवधारक पूछताछ के लिए
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Shi, Z. D., Soh, C. L., Zhu, Z., Huangfu, D. Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development. J. Vis. Exp. (121), e55267, doi:10.3791/55267 (2017).

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