Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Murino linfociti Etichettatura da Published: April 29, 2017 doi: 10.3791/55270

Summary

Seguendo la preparazione di un anticorpo monoclonale 64 Cu-modificata legandosi ad un recettore delle cellule T transgenico murino, cellule T sono radiomarcato in vivo, analizzati per la vitalità, funzionalità, stabilità etichettatura e apoptosi e adoptively trasferite in topi con una cannula ipersensibilità di tipo ritardato reazione per l'imaging non invasiva mediante tomografia a emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT).

Abstract

Questo protocollo illustra la produzione di 64 Cu e il chelante coniugazione / radiomarcatura di un anticorpo monoclonale (mAb) seguita da coltura cellulare linfociti murino e recettori 64 Cu-anticorpo di targeting delle cellule. Valutazione in vitro del prodotto radiomarcato e non invasivo nel monitoraggio delle cellule in vivo in un modello animale di una via aerea di tipo ritardato reazione di ipersensibilità (DTHR) PET / TC sono descritti.

In particolare, viene mostrata la coniugazione di un mAb con il chelante acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA). Seguendo la produzione di radioattivo 64 Cu, radiomarcatura del DOTA-coniugato mAb è descritto. Successivamente, l'espansione di ovalbumina di pollo (Cova) CD4 + -specific interferone (IFN) -γ-producendo cellule T helper (cova-TH1) e la successiva radiomarcatura delle cellule cova-TH1 sono raffigurati. Varie tecniche in vitro sono presentati per valutare l'effetti di 64 Cu-radiomarcatura sulle cellule, quali la determinazione della vitalità cellulare mediante trypan blu, la colorazione per apoptosi con annessina V per citometria a flusso, e la valutazione della funzionalità da IFN-γ saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) . Inoltre, la determinazione della captazione radioattivo nelle cellule e la stabilità etichettatura sono descritte in dettaglio. Questo protocollo descrive inoltre come eseguire studi di tracciamento delle cellule in un modello animale di una DTHR delle vie aeree e, di conseguenza, l'induzione di cova indotta DHTR acuta delle vie aeree a / c topi BALB è incluso. Infine, un robusto workflow / CT PET inclusa l'acquisizione delle immagini, ricostruzione, e l'analisi è presentato.

L'approccio di targeting recettore 64Cu-anticorpo con successiva internalizzazione recettoriale fornisce alta specificità e stabilità, ridotta tossicità cellulare, e tassi di efflusso bassi rispetto ai comuni PET traccianti per l'etichettatura di cellule, ad esempio 64 Cubis -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Infine, il nostro approccio consente non invasivo in cellule inseguimento vivo mediante PET / TC con un ottimo rapporto segnale-sfondo per 48 h. Questo approccio sperimentale può essere trasferito a diversi modelli animali e tipi di cellule con recettori di membrana che sono internalizzati.

Introduction

Inseguimento cella non invasiva è uno strumento versatile per monitorare la funzione cellulare, la migrazione e homing in vivo. Recenti studi di monitoraggio delle cellule mesenchimali si sono concentrati su 1, 2 o del midollo osseo di cellule staminali derivate 3 nel contesto della medicina rigenerativa, periferiche autologhe globuli bianchi a infiammazione o linfociti T in terapie cellulari adottivi contro il cancro 3, 4. La spiegazione dei siti di azione ei principi biologici sottostanti di terapie a base di cellule è di enorme importanza. I linfociti T citotossici CD8 +, geneticamente antigene recettore chimerico cellule T (CAR) o linfociti infiltranti il tumore (TIL) sono stati ampiamente considerato come il gold standard. Tuttavia, le cellule TH1 antigene-specifiche associati al tumore hanno dimostrato di essere un efficace opzione di trattamento alternativa 4, </ sup> 5, 6, 7.

Come attori chiave infiammazione, malattie autoimmuni organo-specifiche (ad esempio, l'artrite reumatoide o asma bronchiale), e le cellule di elevato interesse in immunoterapia del cancro, è importante caratterizzare la distribuzione e homing modelli temporali di cellule TH1. Invasiva imaging in vivo da PET presenta un metodo altamente sensibile quantitativa 8 per esaminare i modelli di migrazione cellulare, in vivo homing, ed i siti di azione delle cellule T e risposte durante l'infiammazione, allergie, infezioni o tumore rifiuto 9, 10, 11.

Clinicamente, 111 In ossina viene utilizzato per leucociti scintigrafia per la discriminazione di infiammazione e infezione 12, mentre 2-deossi-2- (18F) fluoro-D-glucosio (18 F-FDG) viene comunemente utilizzato per studi di localizzazione cellulare mediante PET 3, 13. Uno svantaggio principale di questo tracciante PET, tuttavia, è la breve emivita del radionuclide 18 F a 109,7 min e la bassa stabilità intracellulare che ostacola l'imaging in momenti successivi caricare trasferimento adottivo di cellule. A lungo termine studi in vivo inseguimento cellulare mediante PET, anche se instabile nelle cellule, 64 Cu-PTSM viene frequentemente usato per marcare le cellule non specifico 14, 15 con effetti dannosi minimizzati sulla vitalità delle cellule T e funzionamento 16.

Questo protocollo descrive un metodo per ridurre ulteriormente gli effetti svantaggiosi sulla vitalità delle cellule e la funzione utilizzando un recettore di cellule T (TCR) -specifica radiomarcato mAb. In primo luogo, la produzione del radioisotopo 64 Cu, la coniugazione del mAb KJ1-26 con the chelante DOTA, ed il successivo 64 Cu-radiomarcatura sono mostrati. In una seconda fase, l'isolamento e l'espansione delle cellule cova-TH1 di topi donatori DO11.10 e la radiomarcatura con 64 Cu-caricata DOTA-coniugato mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) sono descritte in dettaglio. La valutazione dei valori di assunzione e efflusso di radioattività con un calibratore di dosi e y-conteggio, rispettivamente, nonché la valutazione degli effetti di 64 Cu-radiomarcatura sulla vitalità cellulare mediante trypan blu e funzionalità con IFN-y ELISA sono rappresentati . Per non invasiva nel monitoraggio delle cellule in vivo, l'elicitazione di un modello murino di cova indotta acuta delle vie aeree e DTHR immagine acquisizione da PET / TC dopo trasferimento adottivo di cellule sono descritti.

Inoltre, questo approccio etichettatura può essere trasferito a diversi modelli di malattia, cellule T murine con differenti TCR o cellule generali di interesse con recettori di membrana o espressione markers sottostante membrana continua spola 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Norme di sicurezza: Durante la manipolazione radioattività, memorizzare 64 Cu dietro mattoni piombo 2 pollici di spessore e utilizzando rispettivo schermatura per le navi munite attività. Utilizzare gli strumenti adeguati per gestire indirettamente fonti non schermati per evitare il contatto diretto della mano e ridurre al minimo l'esposizione a materiale radioattivo. Indossare sempre distintivi di monitoraggio dosimetria delle radiazioni e dispositivi di protezione individuale e verificare se stessi e l'area di lavoro per la contaminazione per affrontare immediatamente. Eliminare potenzialmente contaminati dispositivi di protezione individuale prima di lasciare la zona in cui viene utilizzato materiale radioattivo. Memorizzare l'intera rifiuti radioattivi dietro piombo schermatura fino alla radioattivo 64 Cu è decaduto (circa 10 dimezzamento = 127 h) prima di un adeguato smaltimento.

1. 64 Cu Produzione

NOTA: Il radioisotopo 64 Cu è prodotta tramite il 64 Ni (p, n) 64Cu reazione nucleare utilizzando un PETTciclotrone gara in base ad un protocollo modificato di McCarthy et al. 18.

  1. Per 64 produzione Cu, Ni irradiare 64, che è elettrolitico su una piastra di platino / iridio (90/10), di 30 uA per 6 h con un fascio di protoni di 12,4 MeV.
  2. Riscaldare il bersaglio platino / iridio a 100 ° C in una camera polietereterchetone dedicato (PEEK) e incubare in 2 mL di HCl concentrato per 20 min per sciogliere 64 Cu / Ni 64.
  3. Aggiungere un altro 1 ml di HCl concentrato e incubare per 10 min.
  4. Far evaporare HCl utilizzando un flusso di argon e raffreddare la camera a temperatura ambiente.
  5. Sciacquare la camera con 3 mL di 4% 0,2 M HCl e 96% di metanolo (v / v) e trasferire tale soluzione ad una colonna di scambio ionico che è stato pre-condizionata 4% 0,2 M HCl in metanolo per almeno 15 min. Il flusso passante può essere utilizzato per riciclare 64 Ni.
  6. Lavare il 64 Cu trattenuto nella colonna con 4% 0,2 M HCl in metanolo.
  7. Eluire 64 Cu 70% 1.3 M HCl / 30% isopropanolo (v / v) in una fiala di raccolta, evaporare la soluzione in un flusso di argon e lasciare che la fiala raffreddare a temperatura ambiente.
  8. Sciogliere 64 Cu in 140-210 ml di 0,1 M HCl.

2. Anticorpo coniugazione con DOTA e successivi 64 Cu-radiomarcatura

NOTA: Il chelante DOTA sarà collegato ai gruppi amminici funzionali del mAb da N-idrossisuccinimmide (NHS) estere chimica e il coniugato sarà successivamente radiomarcati con 64 Cu 19.

  1. Regolare la concentrazione del KJ1-26-mAb a 8 mg / ml e diafiltrate 1 mL di soluzione di mAb contro 0,1 M Na 2 HPO 4 pH 7,5 trattata con 1,2 g / L di una resina a scambio ionico usando chelante un peso molecolare tagliato ( MWCO 30 kDa) unità filtro centrifugo. Applicare 3 successive fasi di lavaggio con 14 mL di tampone. Dopo l'ultimo lavaggio,concentrare la soluzione di nuovo per 1 ml. Quantificare la concentrazione di anticorpi da misure 280nm OD.
  2. Preparare una soluzione DOTA-NHS in ultrapura o acqua PCR-grade ad una concentrazione di 10 mg / mL immediatamente prima dell'uso. Lasciare che il flaconcino raggiunga la temperatura ambiente prima dell'apertura per evitare la formazione di condensa, e con attenzione rimuovere DOTA-NHS utilizzando una spatola di plastica. Aggiungere 216 ml di questa soluzione DOTA-NHS a 8 mg della soluzione diafiltrated KJ1-26-mAb, miscelare bene e incubare per 24 ore a 4 ° C su un agitatore caduta.
  3. Diafiltrate il DOTA-KJ1-26-mAb contro 0,25 M di acetato di ammonio, pH 7,0, trattata con 1,2 g / L di una resina a scambio ionico chelante, con un peso molecolare tagliare (MWCO 30 kDa) unità filtro centrifugo. Applicare 7 fasi di lavaggio. Concentrare il mAb ad un volume finale di 1 ml e di nuovo misurare la concentrazione di proteine mediante misurazioni 280nm OD.
  4. Prima radiomarcatura, cambiare il tampone di DOTA-KJ1-26-mAb di PBS mediante size-exccromatografia lusion utilizzando colonne di filtrazione di gel. Ciò elimina anche eventuali impurità piccole molecole.
  5. Preparare 100 MBq 64 CuCl 2 soluzione 10 mM HCl e regolare il pH a 6-7 con PBS 10x. Aggiungere 200 mg di DOTA-KJ1-26-mAb. Incubare per 60 minuti a 37 ° C.
  6. Per controllo di qualità, eseguire cromatografia su strato sottile con 0,1 M sodio citrato (pH 5) come fase mobile e analizzare mediante autoradiografia. Almeno il 90% dell'attività dovrebbe essere legato all'anticorpo e quindi essere rilevata nel punto di partenza. attività legato viene chelato con la fase mobile citrato-based e striature al fronte del solvente. Per un riferimento, si consiglia l'uso di 64 CuCl 2.

3. Pollo Ovoalbumina-specifica TH1 (Cova-TH1) isolamento delle cellule ed espansione

NOTA: La coltura di cellule TH1 è descritto secondo studi pubblicati in precedenza 16, 17.

  1. Isolare milza e dei linfonodi extraperitoneali (LNS) di topi DO11.10.
    1. Sacrifica il mouse secondo le norme federali. Disinfettare l'animale con il 70% di etanolo e fissare con nastro adesivo per la rimozione della milza e linfonodi. Eseguire un'incisione mediana e separare la cute dal peritoneo tirando lateralmente a ciascun sito.
    2. Individuare la cervicale, assiale, brachiale e LNs inguinali. Rimuovere con una pinza smussato e metterli in 1% siero di vitello fetale (FCS) / PBS.
    3. Aprire il peritoneo e individuare la milza. Separare la milza dal pancreas e del tessuto connettivo e posizionarlo in 1% tampone FCS / PBS. Per ulteriori indicazioni, vedi riferimenti 20,21.
  2. Tritare milza e linfonodi attraverso un filtro 40 micron in un 50 mL vite tubo cappuccio con lo stantuffo di una siringa. Risciacquare il filtro con 10 ml di 1% FCS / PBS-buffer.
  3. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Subsequently, effettuare la lisi degli eritrociti aggiungendo ammonio-cloruro di potassio (ACK) tampone di lisi (1,5 mL per donatore animale) per 5 min a temperatura ambiente. Aggiungere 8,5 ml di 1% FCS / PBS-tampone (per donatore animale).
  4. Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare le cellule in 10 ml di 1% FCS / PBS-tampone, centrifugare a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  5. Per la separazione cellulare magnetica, risospendere le cellule in 1% FCS / PBS-buffer e aggiungere CD4 + microsfere. Fare riferimento alle istruzioni del produttore per il volume di buffer e la quantità di CD4 + microsfere da usare.
  6. Incubare per 20 minuti a 4 ° C. Poi aggiungere 1% FCS / PBS-tampone fino a 50 mL, centrifugare le cellule a 400 xg per 5 min, e rimuovere il surnatante.
  7. Continuare con isolamento delle cellule T CD4 + usando colonne di separazione magnetica commerciali ed un rispettivo supporto magnetico secondo il protocollo del produttore. Regolare le cellule T CD4 + eluiti ad una concentration di 10 6 cellule / ml in Modified medio Dulbecco Eagle con 2,5% di penicillina / streptomicina, 1% tampone HEPES, acidi 10% FCS inattivato al calore, 1% MEM ammino, 1% sodio piruvato, e 0,2% 2-mercaptoetanolo e negozio li a 4 ° C.
  8. Raccogliere la scarica colonna in un tubo da 50 ml tappo a vite per preparare cellule presentanti l'antigene (APC). Centrifugare la colonna di scarico a 400 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  9. Aggiungere 10 mg / ml di anti-CD4 (clone: ​​Gk1.5), 10 mg / ml di anti-CD8 (clone: ​​5367,2) e 10 mg del mouse / mL anti-rat-mAb (MAR18.5) e 1,5 mL complemento di coniglio. Incubare per 45 minuti a 37 ° C.
  10. Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e aggiungere 3 ml di mezzo. Irradiare l'APC su una fonte γ-ray o raggi x con 30 Gy in totale. Successivamente, regolare le APC ad una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml.
  11. Aggiungere 100 ml di CD4 + T cellule e 100 l di APC su un 96 pozzetti plate insieme con 10 ug / mL cOVA 323-339-peptide, 10 ug / ml di anti-IL-4 mAb, 0.3 pM CPG1668-oligonucleotidi e 5 U / mL di IL-2.
  12. Aggiungere 50 U / mL di IL-2 ogni due giorni. Dopo 3 - 4 giorni, trasferire le cellule da piastre a 96 pozzetti a piastre da 24 pozzetti. Combinare 3-5 pozzi dalla piastra a 96 pozzetti in un pozzetto sulla piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 100 U / ml di IL-2 contenente il mezzo in un rapporto 1: 1.
  13. Dopo altri 2-3 giorni, trasferire le cellule dalla piastra a 48 pozzetti a 175 cm 2 palloni di coltura cellulare (1 x 48 pozzetti per bombola). Riempire con il mezzo in un rapporto 1: 1. Aggiungere 50 U / mL di IL-2 ogni due giorni.
  14. Dividere le celle in base alla densità cellulare e aggiungere 50 U / ml di IL-2 ogni due giorni. In questo modo, coltura le cellule per altri 10 giorni.

4. cova-TH1 cellule radiomarcatura

NOTA: Il 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb sarà applicata a cellule cova-TH1 coltivate per consentire marcatura radioattiva intracellulare.

  1. Per Cova-TH1 cell radiomarcatura, disegnare 37 MBq della radiomarcato 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in una siringa senza volume morto con un calibratore di dosi. Aggiungere 1 ml di soluzione salina per ottenere una soluzione di 37 MBq / mL.
  2. Sospendere cellule cova-TH1 in mezzo a 2 x 10 6 cellule / ml e aggiungere 0,5 ml della sospensione cellulare in ciascun pozzetto in una piastra a 48 pozzetti.
  3. Aggiungere 20 ml di preparate 37 MBq / ml 64 soluzione Cu-DOTA-KJ1-26-mAb a ciascun pozzetto della piastra a 48 pozzetti. Il rapporto finale per l'etichettatura è 0.7 MBq per 10 6 cellule in un volume di 520 microlitri. Incubare a 37 ° C e 7,5% di CO 2 a 30 min.
  4. Dopo l'incubazione, risospendere accuratamente le cellule in ciascun pozzetto e trasferire la sospensione cellulare dalla piastra a 48 pozzetti in un 50 mL vite provetta con tappo. Per ridurre al minimo la perdita di cellule, lavare ogni pozzetto con media pre-riscaldato.
  5. Centrifugare la sospensione cellulare cova-TH1 a 400 xg per 5 min scartare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di PBS preriscaldata. Rimuovere un aliquot di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule. Ripetere la fase di lavaggio.
  6. Contare le celle Cova-TH1 vitali in una diluizione appropriata con trypan colorazione blu.
  7. Regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 7 cellule / ml per intraperitoneale (ip) iniezione di 10 7 cellule in 200 microlitri di PBS.
  8. Ripetere i passaggi 4,3-4,5 per radiomarcato cellule cova-TH1 con quantità crescenti di attività, ad esempio, 1,4 MBq o 2,1 MBq per 10 6 cellule.
    1. Per radiomarcato le cellule con 1,4 MBq per 10 6 cellule, utilizzare 40 ml di 37 MBq / ml 64 soluzione Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e 60 microlitri di radiomarcatura con 2,1 MBq per 10 6 cellule. Eseguire i passaggi 4,3-4,7 con 0,7 MBq, 1.4 MBq e 2.1 MBq 64 Cu-PTSM ma aumentare il tempo di etichettatura per 3 ore per le indagini comparative 17.
    2. Procedere al passaggio 5 per determinare la quantità ottimale di attività.

5. In Vitro Valutazione dell'effetto del radiomarcato sulle Cellule Cova-TH1

NOTA: La caratterizzazione delle influenze di radiomarcatura sulle cellule TH1 avviene tramite saggio di esclusione del trypan blue per la vitalità, IFN-y ELISA per valutare la funzionalità e PE-annessina V colorazione per l'induzione di apoptosi 16, 17. Determinazione della captazione intracellulare e l'efflusso di radioattività è anche descritto di seguito. Come paragone, le cellule 64 Cu-PTSM marcato cova-TH1 possono anche essere utilizzati.

  1. Effetto sulla vitalità da trypan blu
    1. Regolare almeno 18 x 10 6 cellule cova-TH1 radiomarcati con 0,7 MBq / 10 6 cellule, 1,4 MBq / 10 6 cellule e 2,1 MBq / 10 6 cellule rispettivamente ad una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml ed eseguire operazioni 5.1. 2-5.1.7 per ogni dose di attività. Utilizzare non radioactigià KJ1-26-mAb etichettato cellule cova-TH1 e cellule cova-TH1 non etichettati come controlli.
    2. Pipettare 1 mL di soluzione di cellule in 9 pozzetti di una piastra da 24 pozzetti.
    3. Raccogliere il contenuto di 3 pozzi in 3 separati 15 mL vite provette con tappo, 3 ore dopo radiomarcatura iniziale.
    4. Sciacquare i pozzetti ora vuote con media pre-riscaldato per minimizzare la perdita di cellule e aggiungere il mezzo di rispettivi 15 mL vite provette con tappo dal punto 5.1.3.
    5. Centrifugare le provette da 15 ml a 400 xg per 5 min e risospendere il pellet cellulare risultante in 1 ml di terreno di pre-riscaldato.
    6. Contare le cellule sia vitali e morti in blu tripan separatamente per ciascun tubo 15 ml e calcolare la percentuale di cellule vitali.
    7. Ripetere i punti 5.1.3-5.1.6 24 e 48 ore dopo 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcatura.
  2. Effetti sulla funzionalità determinati da ELISA IFN-g
    NOTA: Per valutare l'effetto del 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb radiomarcato on productio IFN-γn come marcatore di funzionalità, eseguire un ELISA IFN-γ da un fornitore commerciale e si riferiscono riferimento 17 per ulteriori dettagli.
    1. Disperdere 10 5 cellule vitali in 100 ml di mezzo in una piastra con 96 pozzetti, 3 ore dopo 64 Cu-DOTA-KJ1-26 radiomarcatura delle cellule cova-TH1 con 0.7, 1.4 MBq MBq o 2.1 MBq. Utilizzare, non radioattivi o 64 Cu-PTSM-etichettati cellule cova-TH1 non etichettati KJ1-26-mAb-etichettati come controlli.
    2. Stimolare la produzione di IFN-γ in 10 5 cellule cova-TH1 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcato con 100 microlitri di media con 10 ug / ml di peptide cova, 5 U / mL di IL-2 e 5x10 5 cellule APC in 100 ml di terreno per 24 ore a 37 ° C e 7,5% di CO 2. Ulteriori controlli possono essere le altre condizioni senza l'aggiunta del peptide cova.
    3. Analizzare il surnatante tramite ELISA secondo le istruzioni del produttore.
    4. Ripetere il punto 5.2.2. a 5.2.3. a 24 e 48 ore dopo la procedura di etichettatura.
  3. Induzione di apoptosi determinato mediante PE-annessina V colorazione per citometria a flusso
    NOTA: Per determinare l'induzione dell'apoptosi da radiomarcato 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utilizzare un kit disponibile in commercio per citometria a flusso e preparare campioni di cellule secondo le istruzioni del produttore prima colorazione con Annessina V per fosfatidilserina esposizione sulla membrana cellulare .
    1. A 3, 24 e 48 ore dopo 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb radiomarcatura delle cellule cova-TH1, triplicato macchia con almeno 10 6 cellule cova-TH1 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcati con il kit annessina V in base alle istruzioni del produttore e analizzare entro la prossima ora. Utilizzare non radioattivi KJ1-26-mAb-marcati, 64 celle cova-TH1 non etichettati Cu-PTSM-etichettate come controlli. Si prega di fare riferimento al riferimento 17 per ulteriori dettagli.
  4. Assorbimento e efflusso
    NOTA: L'assorbimento del 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb nelle cellule viene misurata in un calibratore di dose e l'efflusso di radioattività è misurata in un saggio di γ-conteggio 0, 5, 24, e 48 ore dopo la radiomarcatura.
    1. Preparare dieci tubi γ-conteggio ciascuna per 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati cellule cova-TH1, corrisponde al surnatante e la fase di lavaggio.
    2. Trasferimento 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcato cellule cova-TH1 in 1 ml di terreno in ciascuna delle provette dieci γ-conteggio direttamente dopo la radiomarcatura. Per ciascuno dei punti di tempo 5, 24 e 48 h dopo la radiomarcatura, mantenere almeno 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati cellule cova-TH1 in terreno su piastre da 24 pozzetti di coltura cellulare in un incubatore a 37 ° C e 7,5% di CO 2.
    3. Centrifugare le provette γ-conteggio a 400 xg per 5 minuti e trasferire il surnatante in dieci nuovi tubi γ-conteggio.
    4. Lavare le cellule una volta in 1 ml di mezzo per rimuovere la frazione libera di 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und raccogliere il surnatante in dieci nuovi tubi γ-conteggio.
    5. Aggiungi 1 ml nuovo mezzo alle cellule Cova-TH1 e determinare il valore di assorbimento iniziale in un calibratore di dose. I tubi possono anche essere memorizzati in un incubatore a 37 ° C e il 7,5% di CO 2.
    6. Ripetere i passaggi da 5.4.2 a 5.4.5, dopo 5, 24 e 48 ore e misurare tutti i tubi in un γ-counter secondo il protocollo del produttore. Per correggere decadimento radioattivo e per l'analisi quantitativa, usare uno standard con una dose definita di radioattività.

6. OVA indotta acuta Airway DTHR

NOTA: La dinamica migratori e sulle caratteristiche di homing di cellule radiomarcata cova-TH1 adoptively trasferito ed al sito di infiammazione verrà visualizzata e quantificata in un modello animale di cova indotta vie aeree-DTHR 16, 17.

  1. Iniettare 8 settimane di età topi BALB / c IP con una miscela di 150 ml aluminum gel / 50 microlitri cova soluzione (10 mg in 50 microlitri di PBS) per immunizzare topi.
  2. Due settimane dopo l'immunizzazione, anestetizzare i topi con 100 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg xylazina mediante iniezione ip. Mettere i topi sperimentali sulle loro spalle e pipettare lentamente 100 mg Cova sciolto in 50 microlitri di PBS nelle narici degli animali. Gli animali saranno inalare il goccia a goccia soluzione.
  3. Ripetere dopo 24 ore. Per più forti induzioni vie aeree DTHR, ripetere nuovamente dopo 48 ore.
  4. Per analizzare la migrazione specifica delle cellule cova-TH1 trasferiti, indurre vie aeree-DTHR con tacchino o fagiano-OVA come controllo. Pertanto, ripetere i passaggi 6.1-6.3 utilizzando il rispettivo OVA-proteina.

7. In Vivo Imaging Utilizzando PET / CT

NOTA: imaging in vivo di 64 cellule cova-TH1 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati in cova-DTHR topi malati e controllo littermates dimostra l'homing specifico e la midinamica grazione delle cellule cova-TH1. Pertanto, acquisire scansioni PET statici e anatomiche TC sequenzialmente alberino trasferimento adottivo di cellule 3, 24 e 48 ore.

  1. Subito dopo radiomarcatura, regolare le Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettati cellule cova-TH1 64 a 5 x 10 7 cellule / ml per iniezione ip di 10 7 cellule in 200 microlitri.
  2. Utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 30 gauge, disegnare 200 microlitri della sospensione cellulare cova-TH1 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcato e iniettano le cellule IP nel animali cova-DTHR-malate tra il 4 ° e 5 ° capezzolo. Per determinare la quantità totale di radioattività iniettata, misurare la siringa in un calibratore di dosi prima e dopo l'iniezione.
  3. Anestetizzare i topi, 10 minuti prima del tempo di assorbimento desiderata, con 1,5% isoflurano in 100% di ossigeno (portata: 0,7 L / min) nel contenitore anestesia temperatura controllata.
  4. Nel frattempo, per facilitare la co-registrazionedi immagini PET e CT durante l'analisi dell'immagine, fissare capillari di vetro contenenti 64 soluzione Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o libera soluzione 64 CuCl 2 sotto il letto del mouse.
    1. Pertanto, preparare una soluzione di 0,37 MBq / mL e riempire capillari di vetro con un volume di 10 ml con questa soluzione. Poiché i segnali radioattività derivati ​​dalle cellule sono intrinsecamente debole, non utilizzare quantità elevate di attività per assicurarsi che i marcatori non interferiscano con i segnali derivati ​​dalle cellule nei topi.
  5. Dopo aver raggiunto la tolleranza chirurgica, come indicato dalla perdita del riflesso pedale ritiro degli arti posteriori, trasferire il mouse per un piccolo animale base compatibile-CT PET-e dotato di un sistema di tubi adatti per mantenere l'anestesia.
  6. Immobilizzare il mouse sul piccolo letto animale con tamponi di cotone e nastro chirurgico. Applicare una pomata oculare per evitare l'essiccamento degli occhi.
  7. Trasferire il letto del mouse allo scanner PET, centrare il campo visivo con un focus sui polmoni e acquisire una PET statico 20 min con una finestra di energia di 350-650 keV.
  8. Trasferire il letto del mouse allo scanner CT. Via esploratore vista, centrare il campo di vista sui polmoni. Acquisire un'immagine planare CT con 360 proiezioni durante una rotazione di 360 ° in modo "step e scatta" con un tempo di esposizione di 350 ms e categorizzazione fattore 4.

Analisi 8. Immagine

  1. Ricostruire i dati in modalità elenco PET applicando algoritmo iterativo 2D statistica ordinata sottoinsieme aspettativa massimizzazione (OSEM) e TC in un'immagine 3D con dimensioni pixel di 75 micron.
  2. Per un'immagine co-registrazione in un apposito software di analisi di immagine (ad esempio Inveon ricerca del posto di lavoro o Pmod), utilizzare lo strumento di co-registrazione automatica. Se ciò non riesce, utilizzare i capillari di vetro sotto il letto del mouse come guida di co-registrare le immagini PET e CT ricostruiti spazialmente in direzione assiale, coronale e sagittale.
  3. Correggere le immagini PETper decadimento radioattivo utilizzando la legge decadimento radioattivo e il primo tempo del radionuclide 64 Cu 12,7 h. Per immagine normalizzazione, scegliere un'immagine (A) come riferimento e regolare l'intensità della visualizzazione delle immagini nel rispettivo software di analisi dell'immagine.
    1. Utilizzando i valori appena impostati per l'immagine di riferimento (A), l'attività iniettata (A) e la dose iniettata per le altre immagini (X), normalizzare le altre immagini utilizzando la seguente equazione: (attività iniettata (X) / attività iniettata ( A)) x valori di intensità (A).
  4. Disegnare volumi 3D di interesse (VOI) sul segnale PET normalizzato dei LNS polmonari e perithymic.
  5. Determinare la dose iniettata percentuale per cm 3 (% ID / cm 3) mediante la seguente equazione: (media attività VOI / attività complessiva nel topo) x 100. Per ulteriori orientamenti relativi analisi dell'immagine, vedere i riferimenti 22, 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figura 1 riassume l'etichettatura di cellule cova-TH1 con il 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e il disegno sperimentale per l'in vitro ed in vivo contemplati in questo protocollo.

Figura 1
Figura 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb etichettatura Process & Experimental Design. (A) Rappresentazione schematica di marcatura delle cellule radioattivo con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. Il 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb si lega ai recettori cova-TCR sulla superficie cellulare delle cellule TH1 e viene internalizzata con il recettore entro 24 h. cova-TCR sono riespresso 24 ore dopo la radiomarcatura. (B), le cellule T CD4 + sono state isolate, espansi e radiomarcato con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb in vitro. I valori di assorbimento e di efflusso were determinata da un calibratore di dosi e γ-conteggio. Effetti dell'anticorpo radioattivo sulla vitalità cellulare sono stati valutati con trypan colorazione blu, sulla funzionalità con IFN-y ELISA, e induzione di apoptosi con ficoeritrina (PE) -Annexin V colorazione. (C) cova-vie DHTR è stata indotta in topi / c femmine BALB. 10 7 cellule TH1 sono stati trasferiti in adoptively cova-vie aeree DHTR-malato animali subito dopo radiomarcatura. immagini PET / TC sono stati acquisiti 3, 24 e 48 ore dopo trasferimento adottivo di cellule. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

L'etichettatura intracellulare successo delle cellule TH1 con il 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb è stata confermata mediante immunoistochimica (Figura 2A). Il 64 Cu-DOTA-KJ1-26 anticorpo (verde) è stato co-localizzato conCD3 alla cella a membrana 3 ore dopo la radiomarcatura, mentre il segnale del mAb sulla membrana cellulare era solo debole a 24 ore (giallo). A 48 h dopo la radiomarcatura, il complesso 64 Cu-DOTA-KJ1-26-TCR stata internalizzata mediante endocitosi con un forte segnale nel citoplasma delle cellule TH1. La dose radioattiva applicata di 0,7 MBq vitalità delle cellule TH1 ridotto solo 8%, mentre alte dosi di 1,4 MBq e 2.1 MBq 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb avuto effetti più pronunciati. Rispetto alla radiomarcatura con 64 Cu-PTSM, tuttavia, è stato osservato alcun vantaggio significativo del 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (Figura 2B). 64 Cu-anticorpo cellule radiomarcati mostrato poca perdita di funzionalità come mostrato dalla secrezione di IFN-γ (Figura 2C), efflusso di radioattività (Figura 2D) ridotta, e l'induzione di apoptosi (figura 2E) ridotto rispetto al 64 TH1 Cu-PTSM marcato le cellule.


Figura 2: Valutazione in vitro radioattivo TH1 cellule scrittura con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb. (A) La microscopia confocale dimostra l'assorbimento intracellulare di 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAbs (verde) in cellule COVA-TH1 (membrana cellulare; rosso) entro 24 h dopo marcatura iniziale (Questo dato è stato modificato dal riferimento 17) . (B) Titolazione di dosi marcatura radioattiva di 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o 64 Cu-PTSM rivelato un'influenza uguale sulla vitalità come rilevato mediante trypan blue esclusione 24 h dopo l'etichettatura. L'utilizzo di 0,7 MBq per marcatura delle cellule indotta menomazioni bassi della vitalità (media ± SD in percentuale,. Questa figura è stata modificata riferimenti 16, 17 (C) Titolazione di marcatura radioattiva fareses di 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o 64 Cu-PTSM rivelato una compromissione più forte della funzionalità dopo 64 Cu-PTSM etichettatura, come rilevato mediante IFN-y ELISA 24 h dopo l'etichettatura. Una dose crescente di 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb per l'etichettatura delle cellule non ha avuto influenza sulla funzionalità (media ± SD in percentuale; statistiche: test t; * p <0.05, ** p <0.01, ** * p <0,001; questa figura è stata modificata dai riferimenti 16, 17). Misurazioni (D) efflusso di cellule radiomarcati (γ-conteggio) hanno mostrato una maggiore stabilità di etichettatura 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb rispetto al 64 Cu-PTSM 5 ore e 24 ore dopo l'etichettatura (media ± SD in percentuale; statistiche : test t; *** p <0,001; questa figura è stato modificato da 17). (E) Rispettive citometria di flusso (PE-annessina V) diagrammi indicano un ap superioreinduzione optosis 24 h dopo 64 Cu-PTSM etichettatura rispetto ai 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-etichettatura (Questa figura è stata modificata riferimento 17). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo il trasferimento adottivo di cellule 10 7 64 cova-TH1 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb-marcati in animali cova-DTHR-malate e controlli non trattati, PET statica alta risoluzione e immagini CT anatomiche sono state acquisite. Per l'analisi di immagini, immagini sono state fuse nella vista coronale, assiale e sagittale con l'aiuto dei capillari di vetro contenenti una piccola quantità di 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb (Figura 3A). VOI state elaborate sulle LNs polmonari e perithymic sulle immagini decadimento-corretto e PET normalizzata per calcolare la percentuale di dose iniettata per cm 3(Figura 3B).

Figura 3
Figura 3: PET / CT-co-registrazione e analisi. Immagini (A) PET e CT sono stati co-registrate nel software di analisi dell'immagine. Se la registrazione automatica dal software fallito, le immagini sono state fuse una sovrapposizione dei segnali PET e CT di capillari di vetro (marcatori), riempito di radioattività e fissati sotto il letto animale. (B) VOI sono collocati sui segnali PET corretti e normalizzati dei LNs perityhmic e polmonari. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

la migrazione delle cellule Cova-TH1 è stato rintracciato alla LN polmonare e perithymic come siti Cova-presentazione in DTHR vie aeree. In vivo segnali PET derived da 64 celle cova-TH1 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marcati erano notevolmente superiori rispetto ai segnali provenienti da 64 celle Cu-PTSM marcate (Figura 4A). I valori di assorbimento cellulare cova-TH1 nei LNs polmonari e perithymic erano significativamente aumentati in DTHR-malati animali rispetto littermates controllo non trattate (Figura 4B).

Figura 4
Figura 4: cova-TH1 cellule inseguimento nel Airway DTHR modello in vivo PET / CT. (A) rispettive immagini PET / TC di adoptively trasferiti cellule cova-TH1, precedentemente etichettati con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb o 64 Cu-PTSM, in topi cova-DTHR-malate o non trattati. Le cellule cova-TH1 trasferiti homed alle LNs polmonari e perithymic. (B) Analisi quantitativa dei siti homing delle cellule cova-TH1 dimostrato un più alto homing ai tessuti infiammati (media ± SD; statistiche: test t; * p <0.05, ** p <0.01). L'etichettatura con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ha dimostrato una maggiore sensibilità (aumento% ID / cm 3) rispetto al 64 Cu-PTSM nei diversi siti di homing (media ± SD, le statistiche: Student t-test; # p <0,05, ## p <0,01, ### p <0.001). Questo dato è stato modificato dal riferimento 16, 17. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo protocollo presenta un metodo affidabile e facile da radiomarcato stabilmente cellule per il monitoraggio in vivo mediante PET. Utilizzando questo metodo, le cellule cova-TH1, isolate ed espanse in vitro da donatore topi, potrebbe essere radiomarcato con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e il loro homing è stato rintracciato alle LNs polmonari e perithymic come siti di presentazione Cova in un cova indotta DTHR vie respiratorie acute.

La modifica del mAb con il chelante richiede lavoro veloce ed efficiente e l'uso di soluzioni ultra-puri senza tracce di ammine. Le soluzioni sono state trattate con una resina a scambio ionico chelante per garantire la corretta coniugazione dell'estere attivo DOTA-NHS di ammina residui del mAb. Il mAb chelante coniugato come radiomarcato intracellulare ha diversi vantaggi rispetto l'uso di non-specifici agenti etichettatura cellule. In primo luogo, il mAb offre eccellente specificità che permette per l'etichettatura mirata di una popolazione di cellule definito. il mAbsé non è citotossico e non ha alcun effetto negativo sulla vitalità o funzionalità delle cellule. Successivamente, l'efflusso di radioattività dalle cellule era significativamente ridotta migliorare il rapporto segnale-sfondo delle immagini PET 17, 24. Con la scelta di un mAb con una specificità diversa, questo metodo è facilmente trasferibile ad altre popolazioni di cellule di interesse come CD8 + TIL o monociti CD14 +. Inoltre, questo approccio etichettatura delle cellule può essere utilizzato per gli studi di monitoraggio delle cellule in vari modelli animali di malattie infiammatorie umane (ad esempio, l'artrite reumatoide e asma bronchiale) o modelli animali per diversi tipi di cancro umano. Questo metodo di marcatura, tuttavia, è limitata ai recettori di membrana o differenziazioni marcatori come bersagli poiché mAbs non passivamente diffondono attraverso la membrana cellulare. L'internalizzazione attivazione indotta del bersaglio o, semplicemente, membrana-spola è vantaggioso. UNalta avidità tra il mAb e il bersaglio, tuttavia potrebbe anche essere sufficiente per l'imaging in vivo, possibilmente con un segnale ridotto rapporto sfondo.

La scelta di DOTA come chelante per i nostri esperimenti si è basata su primi lavori utilizzando 64 Cu 25. Tuttavia, nel frattempo DOTA ha mostrato di non essere un chelante ottimale per questo isotopo, portando a piuttosto elevato assorbimento attività nel fegato da transchelation di superossido dismutasi 26. Sebbene utilizzando l'anticorpo radiomarcato per l'etichettatura in vitro di cellule che vengono poi trasferiti adoptively dovrebbe ridurre il rischio di 64 Cu rilascio e trasporto al fegato, chelanti moderne ottimizzati per 64 Cu, come 1,4,7-triazaciclononano, acido 1-glutarico -4,7-acetico (NODAGA) o acido 1,4,7-triacetico triazaciclononano-(NOTA), può essere preferibilmente utilizzato con il nostro metodo per migliorare ulteriormente la specificità dei dati ottenuti 27 64 Cu (ad esempio N-clorosuccinimmide (NCS)) o altri isotopi, come 89 Zr (es desferroxamina;. DFO).

La scelta di 64 Cu come radioisotopo si basa sul fatto che nella migrazione cellulare vivo ed homing è un processo piuttosto lento rispetto ai cambiamenti metabolici solitamente ripresi dal PET. 64 Cu con un tempo di dimezzamento di 12,7 h permette l'imaging ripetuta di migrazione cellulare su post iniezione 48 h. Per 64 produzione Cu, è importante utilizzare soluzioni di alta qualità senza ioni metallici traccia per garantire la purezza del 64 Cu. Inoltre, la purezza di 64 Cu è di grande importanza per la radiomarcatura di DOTA-mAb dal impurezze ione metallico polivalente potrebbe portare a una ridotta attività specifica della soluzione 64 Cu a livelli che precludono la radiomarcatura di proteine e di conseguenza l'imaging. Sebbene 64 Cu si produce unpercentuale di gnificant altamente energetici, citotossici elettroni Auger quando decomposizione 28, una dose corretta del radioisotopo è ben tollerata dalle cellule come rappresentato da effetti minimi sulla vitalità e funzionalità e bassa induzione di apoptosi dopo radiomarcatura. Tuttavia, è chiaramente consigliabile titolare inizialmente alla dose di attività utilizzato per la radiomarcatura di altri tipi di cellule e regolare il protocollo radiomarcatura. Facile e veloce in metodi di valutazione in vitro sono stati dimostrati nel protocollo, compresa la determinazione della redditività da trypan blu e colorazione con PE-annessina V per la determinazione delle frazioni apoptotici delle cellule. Entrambi i metodi sono relativamente economici e utilizzano attrezzature di laboratorio facilmente accessibile. Combinando PE-annessina V colorazione con un colorante per la discriminazione delle cellule morte come 7-aminoactinomycin D (7-AAD) che vivono e consentirebbe per la determinazione della vitalità e apoptosi in una ste sperimentalep. Come alternativa per valutare la vitalità delle cellule T etichettati, bis (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT-) dosaggio 3- possono essere usate per valutare l'attività metabolica delle cellule. La valutazione dei valori di assorbimento e di efflusso con un calibratore di dosi e γ-counter sono più avanzati, ma ancora veloce ed economico da realizzare, poiché quasi tutti i laboratori si lavora con la radioattività ha il rispettivo hardware in loco. Sequenziamento del gene o metodi di microchip basati produrrebbe dati più dettagliati. Questi metodi, tuttavia, non sono sempre facilmente accessibili, hanno bisogno di competenze adeguate e sono più spesso legate a costi più elevati.

Sebbene PET non è in grado di raggiungere una risoluzione cellulare come le tecniche di imaging microscopiche 29, fornisce un'eccellente sensibilità nella picomolare per la rilevazione anche di piccole quantità di cellule all'interno animali o esseri umani 8. Rispetto ad altre tecniche di imaging non invasive come Optical imaging PET è quantitativa, non limitata profondità di penetrazione e fornisce immagini di alta qualità con tre risoluzioni dimensionali. Combinando l'elevata sensibilità della PET con la precisione anatomica della TC permette l'imaging per alta precisione della migrazione cellulare. Inoltre, i dati in vivo possono essere facilmente convalidati con vari metodi ex vivo compreso γ-conteggio per analisi biodistribuzione. Autoradiografia di criosezioni e successiva colorazione istologica dei criosezioni può essere sovrapposto per correlare la mappa di attività autoradiografica con i infiltrati di cellule immunitarie identificati da ematossilina ed eosina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant così come Natalie Altmeyer per il sostegno durante gli esperimenti e analisi dei dati. Questo lavoro è stato supportato dal Werner Siemens-Fondazione, la DFG attraverso lo SFB685 (progetto B6) e Fortune (2309-0-0).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber WKL Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 mL Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitroevaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30 G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µL VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , Springer. 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. Health Physics and Radiological Health. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Tags

Immunologia Piccolo di imaging animale l'etichettatura delle cellule non-invasiva PET / CT cellule TH1 T vie aeree ritardata reazione di ipersensibilità
Murino linfociti Etichettatura da<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-anticorpo recettore Targeting per<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Traffico da PET / CT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffmann, S. H. L., Maurer, A.,More

Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter