Summary
פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.
Introduction
שחפת Mycobacterium, הסוכן סיבתי של שחפת (TB), היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם. Drug-רגיש TB היא מחלה שניתן לטפל הדורשת אנטיביוטיקה מרובה לתקופה של 6 חודשים. למרות היותו מחלה שניתן לטפל בה, תמותת TB נאמד ב -1.5 מיליון 2015 1. בשנת 10 השנים האחרונות, התרבו חששות השכיחים של שחפת עמידה לתרופות. Multidrug העמיד TB (MDR-TB) מוגדר TB כי הוא עמיד לפחות איזוניאזיד (INH) ו ריפמפיצין (RMP), ורוב זני MDR-TB הם עמידים גם לבחור סמי TB קו שני, ובכך להגביל את אפשרויות טיפול . ההשפעות של עמידות לתרופות ליצור אתגר גדול לטיפול בחולים במשותף נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV); 400,000 חולים ברחבי העולם מתו משחפת HIV הקשורים ב 2015 1. למרבה האכזבה, ארצות הברית המזון והתרופות Administיחס אישר תרופה חדשה TB אחד בלבד נגד MDR-TB, bedaquiline, ב 2 40 השנים האחרונות. מקדם במציאת טיפולי TB טובים יותר קצרים יותר יש צורך דחוף כדי להקדים במאבק נגד שחפת MDR-TB.
באופן מסורתי, מסכי סמי TB מבוצעים בתנאי גידול במבחנה במדיום גידול, לפיו תרכובות מתווספות תרבות גוברת והאפקטיביות שלהם בביעור מיקרואורגניזמים נקבעות על ידי ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU) על מדיום מוצק. כמו ספירת CFU הם עבודה אינטנסיבית, גוזל זמן יקר, שיטות עקיפות שונות פותחו כדי להקל על בעיה זו. שיטות אלו כוללות את assay הכדאיות הכחולה Alamar 3, קביעה של קרינה 4 מ חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או הארה 5 מחיידקים להביע בלוציפראז, ואת הערכת אדנוזין אדנוזין הכולל (אTP) 6, 7.
TB האופיינית מאופיינת זיהום שחפת של הריאות, שבו החיידקים מתגוררים ולשכפל בתוך phagosomes של מקרופאגים המכתשית 8. מסך פנוטיפי ב-מרק פשוט עשוי להתאים פתוגנים תאיים; עם זאת, בפרספקטיבה היסטורית, פגע תרכובות נגד שחפת מזוהה בשיטה זו לעיתים קרובות אינם מצליחים לעמוד בציפיות במהלך השלבים אימות במורד הזרם מודלים זיהום. אנו מציעים כי תרופת TB מבוצעת טוב מודל זיהום תא מארח תאי. עם זאת, מודלים תאיים בעלי חסמים טכנולוגיים ביולוגיים רבים לפיתוח הקרנת תפוקה גבוהה (HTS). מכשול גדול הוא המורכבות של תהליך ההדבקה, שהודגם על ידי צעדים רבים וההסרה המשוכללת של חיידקים תאיים על ידי ב-בין הכביסה. משוכה משמעותית שנייה היא מחדש הזמן הממושךquirements, כמו גילוי גידול, בדרך כלל נעשה על ידי CFU לספור על צלחות תרבות, הוא תהליך שלוקח מעל 3 שבועות כדי להשלים. פתרון אחד כדי להחליף ספירת CFU סופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי בשילוב עם חיידקים פלורסנט. עם זאת, פתרון זה דורש השקעה בציוד ראשונית כי הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. פשוט, בעלות נמוכה, ושיטת HTS הרלוונטית-מחלה היו מאוד לשפר את תהליך גילוי תרופות.
במחקר זה, אנו מדווחים מערכת HTS חדשה, מודולרי, המכוונת מתן מהיר, ו מדרגית, עדיין חסכוני, assay מתאים לקביעת הפעילות של תרכובות נגד שחפת תאיים. מערכת זו מורכבת משלושה מודולים: (i) תאי, (ii) רעיל לתאים, וכן (iii) מבחנים-מרק. התוצאה הסופית בשילוב מספקת תיאור מקיף של התכונות המתחמות, עם מידע נוסף לגבי מצב פוטנציאלי פעולה. SC זהreening מערכת נעשה שימוש במספר פרויקטים עם ספריות מתחמות שונות למקד במצב של פעולה, כוללים הניתוח של סינרגיה סמי 9, הגירוי של autophagy 10, ואת העיכוב של שחפת -secreted גורם ארסי (לא פורסם). תרכובות של מצב ידוע של פעולה גם נחקרו 11. גרסה שונה של שיטה זו אומצה גם על ידי שיתוף הפעולה עם התעשייה שלנו כשיטת ההקרנה העיקרית לזהות תרכובות חדשות נגד שחפת תאיים מ 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זן חיידקים וצמיחה בינוני
- הפוך דקסטרוז אלבומין פתרון מניות מלח (ADS) על ידי solubilizing 25 גרם של אלבומין בסרום שור, 10.0 גרם של דקסטרוז, ו 4.05 גרם של נתרן כלורי ב 460 מ"ל של מים ללא יונים. מסנן לעקר את המודעות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
- הפוך 7H9 מרק ידי הוספת 4.7 גרם של 7H9 אבקה 2 מ"ל של גליצרול כדי 900 מ"ל של מים מטוהרים. החיטוי מרק 7H9 ב 121 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך. הפוך 7H9ADST ידי הוספת 100 מ"ל של מודעות 0.5 מ"ל של Tween80 כדי 900 מ"ל של 7H9 מרק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשקול 50 מ"ג של סולפט kanamycin ו להתמוסס 1 מ"ל של מים ללא יונים; הריכוז הסופי הוא 50 מ"ג / מ"ל. מסנן לעקר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להוסיף 0.5 מ"ל של Kanamycin פתרון מניות לכל 1 ליטר של 7H9ADST.
הערה: בינוני זה צריך להיעשות טרי, כך לטפס על הכרכים כראוי בהתאם לגודל התרבות. - לגדול מ שחפת ב 7H9ADST בתוספת kanamycin בעמידת התרבות. Shake התרבות היומי לדלל אותו לפני OD600 מגיע 1.0 להימנע clumping.
הערה: זן שחפת המשמש לפיתוח שיטה זו H37Rv טרנספורמציה עם pJAK2.A פלסמיד 12. pJAK2.A הוא פלסמיד אינטגרטיבי המבוסס על וקטור pMV361, המאפשר ביטוי ברמה גבוהה של הגן בלוציפראז גחלילית מן האמרגן hsp60 וניתן לבחור באמצעות kanamycin.
2. THP-1 בינוני ותחזוקה
- להוסיף 50 מ"ל של סרום שור העובר חום מומת (FBS) ו 5 מ"ל של 200 מ"מ L- גלוטמין ל 500 מ"ל של RPMI 1640 כדי להפוך RPMI בינוני שלם (כ 10% FBS ו 2 גלוטמין מ"מ).
- לשמור על תרבית תאים THP-1 על פי פרוטוקול סטנדרטי 13. בקצרה, לגדל תאים THP-1 במדיום שלם RPMI תוך שמירה על צפיפות התאים שערכה 0.2 1 מיליון דולר מ"ל של מדיום בין pasחכם.
3. תפוקה גבוהה הקרנת תאיים באמצעות H37Rv שחפת להביע בלוציפראז
- מדוד את הצפיפות האופטית של השעיה חיידקי ומתרחבת ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר. חשב את צפיפות חיידקים באמצעות גורם המרה של 0.1 OD 600 = 3 x 10 7 חיידקים למ"ל.
- פיפטה את החיידקים מספיק ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10: 1 לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. גלולה ב 3000 XG במשך 10 דקות לשאוב את הנוזל. להוסיף 50 μL של בסרום אדם 450 μL של RPMI1640. סולם נפח לנכס ערכים לצורך הניסוי.
- כדי opsonize החיידקים, להשעות את הגלולה בצפיפות של 1 x 10 8 חיידקים לכל 500 μL של RPMI1640 המכילים 10% בסרום אדם. אפשר התערובת כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. קביעת צפיפות תרבית התאים THP-1 על ידי ספירה עם hemocytometer ו microsco הפוכהפ.
- גלולת התאים ב מבחנות צנטריפוגה סטריליים 100 XG ו 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות התאים RPMI שלם בצפיפות של 1 מיליון תאים למ"ל. להוסיף phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) לריכוז 40 ng / mL הסופי.
הערה: זה יהיה המכונה תמהיל הבידול. - מערבבים שחפת opsonized עם תערובת בידול THP-1 בכל פנים של 10: 1 ו aliquot התמהיל הסופי 100 μL לכל היטב צלחת לבנה 96-היטב שטוחה תחתונה. באופן קבוע ומערבבים את התערובת על מנת להבטיח אחידות. אפשר בידול וזיהומים להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2.
- לשטוף את הבארות פעמיים עם 100 μL של RPMI כל. הוספת תרכובות בדילול אל הריכוז הרצוי RPMI שלם דגירה במשך 3 ימים.
- לשאוב את המדיום מהבארות. להוסיף 50 μL של מגיב בדיקה לוציפראז היטב כל אחד. חותם את הצלחות עם tאיטום צלחת דבק ransparent. אפשר 5 דקות של דגירה על 22 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לקבל הודעה בתוך luminometer ב 1 s לכל היטב.
4. ניתוח Cytotoxicity שימוש 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) Assay 14
- למדו להבחין בתאי THP-1 ב RPMI בתוספת שלמה עם 40 ng / mL של PMA צלחות 96-היטב ברורות. לשמור על צפיפות התאים של 1 מיליון דולר מ"ל ו aliquot 100 μL לכל טוב. אפשר בידול כדי להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2.
- לשאוב את המדיום מבאר ולשטוף אותם פעמים עם RPMI 1640. הוספת תרכובות מדוללות RPMI שלמים אל הבארות. דגירה של 3 ימים.
- ממיסים 0.5 גרם של MTT ב 100 מ"ל של בופר פוספט (PBS) כדי להפוך את פתרון המניות של 5 מ"ג / מ"ל. מסנן וחנות סטריליים -20 ° C, הרחק מאור; עדיף לעשות את הפתרון הזה טרי.
- 2.5 h beforדואר תום תקופת הדגירה 3 ימים, להוסיף 25 μL של פתרון MTT היטב כל ולהשלים את תקופת הדגירה.
- הכן 50% N, לפוראמיד -dimethyl N (DMF) על ידי ערבוב 250 מ"ל של DMF עם 250 מ"ל מים ללא יונים.
- הכן חיץ החילוץ MTT כדלקמן: לשקול 100 גרם של SDS בבקבוק 500 מ"ל ולהוסיף 300 מ"ל של 50% DMF. החל חום נמוך כדי לאפשר SDS להתמוסס. להוסיף 10 מ"ל של חומצה אצטית טהורה 12.5 מ"ל של 1 M HCl. מלאו עד לציון 500 מ"ל עם 50% DMF; ההרכב הסופי של חיץ החילוץ הוא 50% DMF, 20% SDS, 2.5% חומצה אצטית, ו 2.5% 1 חומצה הידרוכלורית M.
- בתום תקופת הטיפול, להוסיף 100 μL של חיץ חילוץ (מחומם 45 מעלות צלזיוס כדי לפזר כל גבישים) זה טוב. אפשר תערובת כדי לדגור לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. קראו את הספיגה ב 570 ננומטר.
הערה: assay cytotoxicity מבוצע טוב במקביל עם intracellמסך ular שימוש באותן-אצווה וגיל של תאים THP-1.
5.-מרק ניתוח פעילות באמצעות 3 Assay Resazurin
- לגדול מ שחפת ב 7H9ADST לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - .8 OD 600). לדלל את התרבות עם 7H9ADST כדי 0.01 OD 600. לדלל את התרכובות ב 7H9ADST פי 2 ריכוזי בדיקות aliquot 100 μL של כל תרכובת מדוללת לתוך זה גם.
- העבר 100 μL של השעית החיידקים מדולל לתוך זה גם. אפשר הצלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עבור 5 ימים. ממיסים 10 מ"ג של resazurin ב 100 מ"ל של מים ללא יונים ולסנן סטרילית.
- להוסיף 30 μL של פתרון resazurin ולנטר את שינוי הצבע אחרי 48 h; התפתחות חיידקים מצוינת על ידי מרת צבע מכחול לורוד.
הערה: ניתוח כמותי יכול להתבצע גם על ידי מדידת גם את הקרינה בבית 590 ננומטר עם עירור ב 530 - 560ננומטר או את הספיגה ב 570 ננומטר ו 600 15 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תפוקה גבוהה הקרנה תאית באמצעות שחפת לבטא את הגן בלוציפראז
איור 2A ולוח 1 מכילים את הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי luminometer, המבוטא ביחידות זורחות יחסית (RLU), מראים את ההשפעה של ריכוז גדל והולך של ריפמפיצין סמי TB על שחפת בתוך תאי THP-1. איור 2 א היא פיזור עלילה של הארת הגלם נמדדת RLU עבור ריכוזים שונים של ריפמפיצין. הברים שגיאה מציינים את סטיית התקן של הממוצע (SEM). איור 2B מראה את הפחתת אחוז הארת בארות מטופלים לעומת בארות מטופל. מהנתונים עולה כי ריפמפיצין הוא מסוגל להפחית> 99.9% של RLU משחפת תאיים מ בריכוז של 0.1 מיקרוגרם / מ"ל. זהו בהתאם previously שפורסם MIC בין 0.1 לבין 0.4 מיקרוגרם / מ"ל 16. הארה מיוצר בכל טוב הוא אינדיקציה luciferase הכולל הביע ידי שחפת ולכן הוא אינדיקטור של המצב המטבולי של שחפת בתוך הבאר. זה נורמלי רמות זורחות גלם להשתנות בין ניסויים. ככזה, השוואה של נתונים גולמיים תעורר מסקנות לא אמינות. לפיכך, הנתונים צריכים להיות מנורמלים נגד כביקורת שלילית מוגדרת, אשר תהיינה הדגימות שטופלו DMSO בלבד. הערכים הנובעים יכול לבוא לידי ביטוי כמו הפחתת אחוז מ שחפת בארות (איור 2B).
ניתוח Cytotoxicity באמצעות מבחן MTT
מבחן MTT הוא assay ומבוססת על רעילות לתאים איקריוטיים. assay colorimetric זה מצביע תאים חיים באמצעות המרה של MTT (צהוב) כדיformazan סגול בצבע. Assay זה מבוצע ללא זיהום שחפת כי החיידקים מסוגלים חילוף חומרי MTT, אשר מפחית את הרעילות הנצפית של התרכובות. הצעה משותפת מבחן MTT היא להשתמש במדיה ללא פנול האדום pH אינדיקטור בשל הספיגה ב 570 17 ננומטר. עם זאת, מיצוי חיץ acidified המתוארים בשיטה זו הוא מסוגל למזער הפרעה הנגרמת על ידי פנול 17 אדום.
איור 3 ממחיש את רעילות לתאים הנגרם על ידי ריכוז גדל והולך של G1-1H מתחם מבחן מקודד. בדרך כלל, ריכוז מעכב 50% (IC 50) מועסק כדי לציין את רמת רעילות לתאים. במקרה של G1-1H, בריכוזים של 10 מיקרומטר ו 3 מיקרומטר הם בבירור מתחת ריכוז 50 IC.
In-מרק ניתוח פעילות לנוברישום כוזב של assay resazurin
את assay resazurin הוא נפוץ לניתוח רעיל לתאי תאים איקריוטיים, אבל זה יכול לשמש גם כדי לפקח חיידקים חיים במרק 3. את assay resazurin הוא assay מבוסס-חיזור דומה מבחן MTT. הוא מודד את רמות NADPH ופעילות NADPH דהידרוגנז דרך המרה של resazurin לתוך resorufin, A fluorophore אדום. הדרך הקלה והמהירה ביותר כדי לקבוע יעילות תרופה היא לחפש את ריכוז הטיפול הנמוך ביותר שבו הבארות להישאר בצבע כחולה. איור 4 מציג חלק צלחת 96-היטב המציגה את השפעות ריכוזים שונים של apramycin האנטיביוטי יש על resazurin המרה על ידי מ שחפת. את המיקרופון ב-מרק היה נחוש בדעתו להיות בין 2.5 ו 5 מיקרוגרם / מ"ל. זה גבוה במקצת מהערך שפורסם בעבר של 1.5 מיקרוגרם / מיליליטר 18, אבל זה עדיין טוב בתוך acceptabמגוון le. במקרים רבים, שינוי הצבע די הדרגתי, כך שקשה להכריע בטוח. בתנאים אלה, עדיף לכמת את הסכום בפועל של resazurin המרה באף ספיגת או פלואורסצנטי. בשל המאפיינים הספיגים הדומים של resazurin ו resorufin, נחישות MIC באמצעות ספיגה דורשת מדידות באמצעות שני אורכים גל שונים וחישובים מורכבים 15. לכן, השיטה הטובה ביותר היא למדוד קרינה באמצעות 530- ל 560 ננומטר אורכי גל עירור באורך גל פליטה 590 ננומטר, כמתואר בספרות היצרן 15.
איור 4 ממחיש מקור פוטנציאלי של חוסר עקביות הקשורים incubations multiday שיכול לשנות את תוצאות ההקרנה באופן דרסטי. בשל humidifying הפסולה של 37 מעלות צלזיוס החממה המשמשת בניסוי זה, בארות על הקצוות של p lates סבל באופן משמעותי יותר אידוי. כל 15 בארות שטופלו DMSO אמורים להיות זהים, אבל בארות בשולי שמאלה העליון הפחית כרכים. בארות אלה מופיעים גם לקבל בצבעים שונים מאשר בארות DMSO שטופלה האחרות באמצע הצלחת. אותו חוסר עקביות יכול להיות גם ציין 2.5 מיקרוגרם / מ"ל בארות apramycin שטופלו. במקרה זה, נפח מופחת גם יוביל קריאה כמותית על ידי ספקטרופוטומטר ו fluorometer. התאיידות הופכת משמעותית עבור כל הניסויים עם זמני דגירה ממושכים, ולכן יש להקפיד לשמור אינקובטורים היטב humidified להימנע מקור זה של חוסר עקביות.
איור 1: שרטוטי שיטה. תרשים המתאר שרטוטים assay עבור 3 מודולים נפרדים של מערכת הקרנת תפוקה גבוהה. "Target = '_upload / 55,273 / 55273fig1large.jpg _ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: נציג הנתונים לקוחים תאיים כדי לבחון את האפקטיביות של ריפמפיצין בחיסול שחפת בתוך THP-1 תאים. (א) גרף של ההארה מתכוונת לקרוא (ביחידות הארה יחסית) עבור כל ריכוז טיפול (ריפמפיצין). הברים שגיאה לציין את שגיאת התקן של הממוצע עבור כל בשלושה עותקים. (ב) גרף של הפחתת האחוז מחושב הארה נגרמה על ידי טיפול של ריפמפיצין, שבו ערכים גבוהים יותר מצביעים על יעילות רבה יותר. 90% ריכוז מעכבות (IC 90) במקרה זה הוא איפשהו בין 0.01 לבין 0.1 מיקרוגרם / מ"ל.nk "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: נציג נתונים מתוך Cytotoxicity (MTT) Assay כדי לבחון את ההשפעות הרעילות של G1-1H מתחם על Differentiated THP-1 תאים. גרף של ערכי "אחוזים מכלל שליטה" מחושב עבור כל ריכוז של G1-1H מתחם טיפול, שבו ערכים גבוהים יותר מצביעים על תאים THP-1 בריא. IC 50 במקרה זה הוא איפשהו בין 10 לבין 30 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: נציג נתונים מתוך Assay Resazurin לבדיקת Effectiveness של Apramycin מעכב M. שחפת In-מרק. נתונים איכותיים בלבד נאסף במקרה זה בשל מגבלות הציוד במעבדה 3 בטיחות ביולוגית ברמה (BSL3). התמונה מראה חלק צלחת 96-היטב המכיל שחפת שטופלה או DMSO או כמויות משתנות של apramycin. הבארות שטופל DMSO הציגו מרה של resazurin כדי resorufin, כפי שמצוין על ידי מרת הצבע מכחול לורוד. הדגימות שטופלו apramycin בבירור עברו המרה צבע מתחת 5 מיקרוגרם / מ"ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| [ריפמפיצין] | Rep1 | Rep2 | Rep3 | הפחתת% | |
| 4 מיקרוגרם / מ"ל | 184 | 190 | 210 | 195 | 100 |
| 1 מיקרוגרם / מ"ל | 244 | 215 | 159 | 206 | 100 |
| 0.1 מיקרוגרם / מ"ל | 1037 | 731 | 976 | 915 | 98 |
| 0.01 מיקרוגרם / מ"ל | 19,200 | 24,400 | 23,919 | 22,506 | 54 |
| 0 מיקרוגרם / מ"ל | 39,877 | 49,655 | 57,728 | 49,087 | 0 |
טבלה 1: נתונים גולמיים assay בלוציפראז עבור קביעת 90 IC תאיים של ריפמפיצין.
| [G1-1H] | A570 נציג 1 | A570 נציג 2 | A570 נציג 3 | A570 הממוצע | % של מטופל |
| 30 מיקרומטר | 0.056 | 0.056 | 0.055 | 0.056 | 7 |
| 10 מיקרומטר | 0.518 | 0.488 | 0.492 | 0.499 | 62 |
| 3 מיקרומטר | 0.652 | 0.638 | 0.656 | 0.649 | 80 |
| 0 מיקרומטר | 0.822 | 0.782 | 0.815 | 0.806 | 100 |
טבלה 2: נתונים גולמיים מבחן MTT עבור קביעת G1-1H Cytotoxicity של המבחן המתחם בבית DiffereNT ריכוזים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת HTS פשוטה וחסכונית באמצעות מודל זיהום תאיים אדם עבור שחפת. שחפת היא מחלה אנושית מתאפיינת הזיהום של מקרופאגים המכתשית ידי מ שחפת. בשל בעיות בטיחות ביולוגיות, המחקר מעורב מודלים ביולוגיים של שני החיידק ואת תאי המארח נעשה שימוש בעבר. עם זאת, הוכיח כי השימוש של חיידקים פונדקאיים ומודלים לא אנושיים הם מנבאים עניים של להיט-to-Lead הצלחה בפיתוח תרופה, המציין כי הקרנת תרופה נעשית בצורה טובה ביותר עם תאים אנושיים נגועים שבחפת מ 19, 20, 21, 22.
בשיטה זו, אנו מתקדמים המותאמים פרוטוקולי הקרנת המדינה- of-the-art נוכחיים עבור תא-קו THP-1 מקרופאג דמוי אדם. על מנת להשיג גבוהתפוקה, הצגנו שיפורים טכנולוגיים כמה פרוטוקול הזיהום. בראש ובראשונה, החלפנו את כל השלבים כרוכים נחישות CFU והחלפתי אותם עם מערכת כתב מבוסס luciferase. luciferase גחלילית הנבחר בשל assay סוף הנקודות הפשוטות, השפלה המהירה ידי אנזימי הליזוזום תא מארח, ואת דרישות ציוד המינימאליות. החלפה זו באופן יעיל בוטלה תקופת דגירה 30 יום, כמו גם את עלויות העבודה מתכלה הקשורים צעדי ציפוי מושבה-ספירה.
שיפור ניכר שני הצגנו היה יצווה עיבוד זיהום, אשר משפר עוד יותר את תפוקה עקבית בין הבארות עם פרוטוקול זיהום פשוט. על ידי שילוב של צעדי בידול זיהום לתוך אחד צעד, הצלחנו לקצר את הפרוטוקול על ידי יום אחד. במקביל, הצלחנו להפחית את שלושת סבבי כביסה כי שבדרך כלל מתרחשים בין דיפרנציאציה infection, המהווה מקור אובדן התא THP-1 אפשרי בשל ריחוק.
פרוטוקול זה פותח לסינון בתוך שורת התאים THP-1, אשר מקנה מספר יתרונות. THP-1, כמו שורת תאים הונצח, יכול להיות מתורבת מהימנה במבחנה במשך 20 פסקאות 23. זה חשוב במיוחד עבור קמפייני הקרנה גדולים, שבו זה יכול להיות מאתגר לשמור תאים מספיק כדי לספק התקנת תפוקה גבוהה. בנוסף, בדיקות THP-1 מספקות רקע גנטי הומוגני ממזער השתנות תוצאות. זה מועיל מאוד עבור תרכובות בדיקות המשפיעות תגובות תא מארחת 10. כבונוס נוסף, ביטוי גנים בקו תא THP-1 יכול להיות למטה מוסדר על ידי RNAs התערבות קטנה (siRNAs) 24. זה מספק כלי רב ערך עבור חקירות במורד למצב פעולה של תרכובות להיט. אמנם שיטה זו נועדה באמצעות שורת תאים THP-1, אותוניתן להתאים בקלות עבור תאים ראשוניים אדם, כגון תאי דם היקפיים mononuclear (PBMC), כפי שהוכח בעבר 10.
כדי טוב ביותר לחקות את האינטראקציה בפועל בין מקרופאגים המכתשית ו מ שחפת, פרוטוקול assay התאי כולל צעד opsonize החיידקים. Opsonization עם שחפת מעילים בסרום האדם ומקל כניסת התא באמצעות השלמה קולטן 3 (CR3) 25. חיידקי Naked נוטים יותר להיכנס מקרופאגים דרך קולטן לקטינים 8. בהתחשב בעובדה ידועה הנוזל ברונכואלוואולרית להכיל רכיבים של נסיוב אדם 25, opsonization, או היעדרה, עשויים להשפיע מהותית על תוצאות ההקרנה. עם זאת, כמה יכול לבחור לדלג על שלב זה על מנת להמשיך ולפשט את תהליך הזיהום 16, או שזה לא יכול להיות ריאלי להשיג בסרום אדם מספיק עקב גודלו של library שהוקרן 11.
את assay התאי כולל צעד להסיר את כל הנוזל המכיל חומר שאינו מחובר המבארות לפני התוספת של מגיב luciferase. צעד זה נועד להגדיל את יחס אות לרעש תוך הפחתת מגיב סכום המשמש לכל טוב. עם זאת, הכללת צעד זה עשויה ליצור נתונים חיוביים שגויים עבור תרכובות להרוג THP-1 אך לא M. שחפת, מאז מנותקת lysed THP-1 ו- "פנויות" שחפת יוסרו. לכן, הפרוטוקול של היצרן הציע להוסיף כמויות שווות של ריאגנט luciferase (100 μL) זה טוב, יש לפעול על מנת assay להישרדות מ שחפת בבארות המכילות תרכובות ציטוטוקסיות.
בניגוד למערכת בלוציפראז הגחלילית, מערכת לוקס החיידקים אינה מחייב ריאגנטים חיצוני עבור דור אות 26. למרות זאת,מערכת הגחלילית עדיפה על פני מערכת הלוקס מהסיבות הבאות: ראשית, מערכת החיידק עשויה להיות רעילה mycobacteria 26. שנית, מערכת כתב מורכבת יותר (5 גנים עבור לוקס לעומת 1 גן הגחלילית) היא רגישה יותר לאותת עיכוב על ידי תרכובות מבחן. לבסוף, ריאגנטים זמינים מסחרי עבור assay בלוציפראז הגחלילית לספק את התנאים הדרושים לייצור אותות אופטימלי. מצד השני, מערכת luciferase החיידקים מסתמכת על ייצור ATP ואת הקו-הפקטורים הנוכחים בתוך החיידקים לייצור אות. אלה יכולים להשתנות בין טיפולים שונים והם לא קלים כמו לשלוט. לכן, התוספת של מגיב luciferase למערכת גחלילית סטנדרטיזציה בתנאי התגובה ומספקת מדידות אמינות יותר של פעילות לוציפראז בכל הטיפולים.
נחישות CFU כבר מזמן להיות תקן הזהב עבור לכימות צפיפות חיידקים. בשנת חוזה, bioluminescence, כמו רוב הכתבים, אינו מהווה מדד ישיר של חיידקים. במקום זאת, RLU היא פונקציה של שני CFU והמדינה מטבולית של חיידקים. אחרים הדגימו את הקשר הליניארי בעיקר בין RLU ו CFU עבור mycobacteria bioluminescent בתנאים ספציפיים 5. בכל מקרה, הפחתה משמעותית של האות בדיקת לוציפראז, לא משנה את הבסיס של סיבה אחרת מאשר עיכוב בפועל של פעילות-יהיה אנזים luciferase מצביעים על ירידה של כושר מ שחפת בתוך התא המארח. לכן, תרכובות אלה תהיינה עניין מבחינת הקרנה בסמים ולא צריך להיות מחוץ בפיתוח שיטה.
חלופת פרוטוקול ההקרנה תאית מבוסס luciferase היא פלורסנט האוטומטי מיקרוסקופיה מבוסס בגישה 11, 27, 28, 29. בלוציפראזפלט assay נמדד על ידי luminometer, והנתונים המתקבלים הם כמוני, בעוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי מייצר תמונות כי הם איכותיים. עם זאת, באמצעות תכנות מחשב חכם, ניתן לנתח את התמונות כדי להפיק נתונים כמותיים. יתר על כן, מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר fluorophores מרובים כדי לשמש במקביל, וזה מאוד עוזר לאיסוף פרמטרים חשובים כגון כדאיות התא, ספירת תאי, וקצב בפועל של זיהום. כפי שניתן לחזות, היתרונות הללו באים עם כישלונות מסוימים. ההשקעה הראשונית על ציוד מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי היא פעמים רבות יותר מאשר העלות של luminometer או fluorometer ולכן הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. למי יש גישה לציוד, עיבוד המדגם חייב להיחשב לפני רכישת תמונה וניתוח נתונים. שני הצעדים האלה משפיעים על השקעת הזמן הכולל עם עליות בגודל ספרייה. הכללת תוויות ניאון נוספות בתאי מארח requirתיקון, צביעת es, וצעדי כביסה, דבר שיחייבו השקעות התערבות וזמן נוספות של משתמש. יתר על כן, איסוף וניתוח נתונים מיקרוסקופ פלואורסצנטי, למרות אוטומטיות, עדיין דורשים הרבה יותר זמן ומשאבים מאשר את הודעת בדיקה לוציפראז הפשוטה. לכן, luciferase כתב מבוסס שיטת ההקרנה התאית היא פשוט מסוגל תפוקה גבוהה יותר.
שיטת ההקרנה התאית מבוסס luciferase יש אחד מגבלה משמעותית בהשוואה לשיטות הקרנה מבוססת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. זאת בשל העובדה כי הבדיקה לוציפראז מספקת אין נתונים בדבר מצב בריאותו של מקרופאגים מארחים. תרכובות ציטוטוקסיות תגרומנה למותו של מקרופאגים, וכך חיידקים חיים עשויים להשתחרר לתוך בינוני כבר לא לתרום את אות בדיקה לוציפראז הסופית. כתוצאה מכך, תרכובות ציטוטוקסיות תופענה לגרום למותו של שחפת תאיים ובכך generatEA מספר רב של תוצאות חיוביות שגויות. כדי לטפל בבעיה זו, אנו משלימים את השיטה שלנו עם מבחן MTT להעריך את רעילות לתאים של תרכובות על מקרופאגים המארח. מודול זה של שיטת ההקרנה נותן לנו מידע נוסף על drugability של תרכובות של עניין ומאפשר הביטול המוקדם של מועמדי סמים פחות מ-אידיאלי.
לחלופין, אפשר גם להשתמש assay התאי מבוסס luciferase לפני ביצוע מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי. מסכי ספריות מתחם גדול, זה מאפשר הערכה מהירה ויעילה של האפקטיביות מתחם במודל זיהום מקרופאג. כתוצאה מכך, ניתן להזמין מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי עבור מחקרים מפורטים על מועמדים טובים יותר, כפי שמודגם על ידי מחקר שפורסם בעבר 11.
העלות הנמוכה והטבע פשוט של assay התאי מבוסס luciferase גם מאוד נהנו חוקרים המעוניינים לבחון קטןאה ספריות כימיות. בסך הכל, assay התאי מבוסס luciferase הוכיח להיות כלי גמיש מאוד עבור מעבדות מחקר של כל הקליברים וכן לסינון פרויקטים בגדלים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R5886 | |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | |
| Middlebrook 7H9 | Becton, Dickinson and Company | 271210 | |
| Tween80 | Fisher Scientific | T164 | |
| Albumin, Bovine pH7 | Affymetrix | 10857 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP350 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
| kanamycin sulfate | Fisher Scientific | BP906 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| N,N-Dimethylformamide (DMF) | Fisher Scientific | D131 | |
| 1 M Hydrocholoric acid (HCl) | Fisher Scientific | 351279212 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | 351269 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166 | |
| Resazurin | Alfa Aesar | B21187 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229 | |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
| M. tuberculosis H37Rv | |||
| 96-well flat bottom white plate | Corning | 3917 | |
| 95-well flat bottom clear plate | Corning | 3595 | |
| Transparent plate sealer | Thermo Fisher Scientific | AB-0580 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Biomate 3 | |
| Microplate spectrophotometer | Biotek | Epoch | |
| luminometer | Applied Biosystems | Tropix TR717 |
References
- WHO. Global tuberculosis report 2015. , WHO. (2016).
- USFDA. FDA news realease. , Available from: http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm (2012).
- Yajko, D. M., et al. Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).
- Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).
- Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence. J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).
- Mak, P. A., et al. A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis. ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).
- Pethe, K., et al. A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy. Nat Commun. 1, 57 (2010).
- Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis. Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).
- Ramon-Garcia, S., et al. Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen. Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).
- Lam, K. K., et al. Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 8, e1002691 (2012).
- Sorrentino, F., et al. Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62, 158-165 (2009).
- ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx (2016).
- Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).
- Invitrogen. AlamarBlue assay. , Invitrogen. (2008).
- Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction. Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).
- Riss, T. L., et al. Cell Viability Assays. , (2004).
- Meyer, M., et al. In vivo efficacy of apramycin in murine infection models. Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).
- Ballell, L., et al. Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis. ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).
- Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice. FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).
- Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).
- Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B. Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).
- Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. J Vis Exp. , e51960 (2014).
- Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid. Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).
- Andreu, N., et al. Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria. PLoS One. 5, e10777 (2010).
- Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. , e51114 (2014).
- Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5, e1000645 (2009).
- Pethe, K., et al. Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis. Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).
